JPH05146299A - 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト - Google Patents
核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツトInfo
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- JPH05146299A JPH05146299A JP33987291A JP33987291A JPH05146299A JP H05146299 A JPH05146299 A JP H05146299A JP 33987291 A JP33987291 A JP 33987291A JP 33987291 A JP33987291 A JP 33987291A JP H05146299 A JPH05146299 A JP H05146299A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 標的核酸を簡便に増幅する。
【構成】 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）、該ヌクレオ
チド（Ａ）と少なくとも部分的に相補的な配列を有する
プライマー（Ｂ）または断片化した標的核酸配列（Ｄ）
および耐熱性ポリメラーゼ（Ｃ）を使用して、環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）にアニールしたプライマー（Ｂ）
または断片化した標的核酸配列（Ｄ）を伸長させること
により、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列
を繰り返した配列を有する一本鎖核酸配列を生成させ
る。
チド（Ａ）と少なくとも部分的に相補的な配列を有する
プライマー（Ｂ）または断片化した標的核酸配列（Ｄ）
および耐熱性ポリメラーゼ（Ｃ）を使用して、環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）にアニールしたプライマー（Ｂ）
または断片化した標的核酸配列（Ｄ）を伸長させること
により、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列
を繰り返した配列を有する一本鎖核酸配列を生成させ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸配列の増幅方法およ
びそのための試薬キットに関する。本発明は、特に塩基
配列が既知の核酸をその初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより遺伝病、癌、感染症などの診断を行うことが
容易となる。
びそのための試薬キットに関する。本発明は、特に塩基
配列が既知の核酸をその初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより遺伝病、癌、感染症などの診断を行うことが
容易となる。
【０００２】
【従来技術】ハイブリダイゼーションによる核酸配列の
検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な手
段として汎用されるようになってきた。標的とする塩基
配列は、対象となる核酸のほんの僅かな部分である場合
があり、非放射性標識プローブや末端を放射性同位体で
標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いた場合、感
度上の問題等によりその検出が困難である場合がある。
そのため、プローブ検出システムの感度を向上させるた
めの努力が多くなされている（ＷＯ８７／０３６２２な
ど）。また、感度向上の手段として、目的とする核酸配
列をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特開昭
６１−２７４６９７号公報；以下「ＰＣＲ」と略すこと
がある）が開示された。しかしこの方法では、複雑な温
度の調節が必要であり、専用の機器を必要とするという
欠点がある。ＤＮＡリガーゼを用いる核酸配列の増幅法
も開示された（ＷＯ８９／１２６９６、特開平２−２９
３４号公報など）。しかし、この方法ではＤＮＡリガー
ゼが平滑末端を連結する反応（blunt end ligation）が
起こる。これの回避法としてＷＯ８９／１２６９６では
３組以上のプローブを用いているがプローブ数が多くコ
スト高となってしまう。また、ＲＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは周知であり、
ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸配列の増幅を行う方法
も開示されている（ＷＯ８９／０１０５０）。しかしな
がら、この方法ではＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅
のみでは充分な増幅は困難である。従って、生成したＲ
ＮＡに再度逆転写酵素を作用させＤＮＡを生成させる操
作を実施している。一方、目的とする核酸配列にプロー
ブをハイブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズし
たプローブのみを増幅する方法（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＹ，ｖｏｌ．６，１１９７，１９８８）も知られ
ている。しかしこの方法では、非特異反応により結合し
たプローブも増幅され、ブランク値の上昇をきたすとい
う問題がある。
検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な手
段として汎用されるようになってきた。標的とする塩基
配列は、対象となる核酸のほんの僅かな部分である場合
があり、非放射性標識プローブや末端を放射性同位体で
標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いた場合、感
度上の問題等によりその検出が困難である場合がある。
そのため、プローブ検出システムの感度を向上させるた
めの努力が多くなされている（ＷＯ８７／０３６２２な
ど）。また、感度向上の手段として、目的とする核酸配
列をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特開昭
６１−２７４６９７号公報；以下「ＰＣＲ」と略すこと
がある）が開示された。しかしこの方法では、複雑な温
度の調節が必要であり、専用の機器を必要とするという
欠点がある。ＤＮＡリガーゼを用いる核酸配列の増幅法
も開示された（ＷＯ８９／１２６９６、特開平２−２９
３４号公報など）。しかし、この方法ではＤＮＡリガー
ゼが平滑末端を連結する反応（blunt end ligation）が
起こる。これの回避法としてＷＯ８９／１２６９６では
３組以上のプローブを用いているがプローブ数が多くコ
スト高となってしまう。また、ＲＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは周知であり、
ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸配列の増幅を行う方法
も開示されている（ＷＯ８９／０１０５０）。しかしな
がら、この方法ではＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅
のみでは充分な増幅は困難である。従って、生成したＲ
ＮＡに再度逆転写酵素を作用させＤＮＡを生成させる操
作を実施している。一方、目的とする核酸配列にプロー
ブをハイブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズし
たプローブのみを増幅する方法（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＹ，ｖｏｌ．６，１１９７，１９８８）も知られ
ている。しかしこの方法では、非特異反応により結合し
たプローブも増幅され、ブランク値の上昇をきたすとい
う問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
とする核酸配列を簡便に増幅させる方法を提供すること
である。
とする核酸配列を簡便に増幅させる方法を提供すること
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、ある種の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼには環状ＤＮＡを鋳型として比較的
高温で作用させた場合、合成を行ないながら鋳型を一周
した後、先に合成したＤＮＡを剥しながら合成し続ける
活性を有していることを発見した。この発見をもとに、
標的核酸（Ｄ）と少なくとも部分的に相補的な環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｃ）を用いることにより、上記課題が解決されること
を見出して、本発明を完成させるに到った。
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、ある種の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼには環状ＤＮＡを鋳型として比較的
高温で作用させた場合、合成を行ないながら鋳型を一周
した後、先に合成したＤＮＡを剥しながら合成し続ける
活性を有していることを発見した。この発見をもとに、
標的核酸（Ｄ）と少なくとも部分的に相補的な環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｃ）を用いることにより、上記課題が解決されること
を見出して、本発明を完成させるに到った。
【０００５】すなわち、本発明は環状一本鎖ヌクレオチ
ド（Ａ）、該環状一本鎖ヌクレオチドと少なくとも部分
的に相補的な配列を有するプライマー（Ｂ）および耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、該環状一本鎖ヌ
クレオチド（Ａ）にアニールした該プライマー（Ｂ）を
伸長させることにより、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）
と相補的な配列を繰り返した配列を有する一本鎖核酸を
生成させることにより核酸配列を増幅することを特徴と
する核酸配列の増幅方法である。また本発明は、検体試
料中の標的核酸配列（Ｄ）、該標的核酸配列（Ｄ）と少
なくとも部分的に相補的な配列を有する環状一本鎖ヌク
レオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）
を用いて、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）にアニールし
た標的核酸配列（Ｄ）をプライマーとして、環状一本鎖
ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列を繰り返した配列を
有する一本鎖核酸を生成させることにより核酸配列を増
幅することを特徴とする核酸配列の増幅方法である。さ
らに本発明の核酸配列を増幅するための試薬キットは、
検体試料中の標的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部分的に
相補的な配列を有する環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）およびデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸を含む核酸増幅用試薬キットであ
る。
ド（Ａ）、該環状一本鎖ヌクレオチドと少なくとも部分
的に相補的な配列を有するプライマー（Ｂ）および耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、該環状一本鎖ヌ
クレオチド（Ａ）にアニールした該プライマー（Ｂ）を
伸長させることにより、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）
と相補的な配列を繰り返した配列を有する一本鎖核酸を
生成させることにより核酸配列を増幅することを特徴と
する核酸配列の増幅方法である。また本発明は、検体試
料中の標的核酸配列（Ｄ）、該標的核酸配列（Ｄ）と少
なくとも部分的に相補的な配列を有する環状一本鎖ヌク
レオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）
を用いて、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）にアニールし
た標的核酸配列（Ｄ）をプライマーとして、環状一本鎖
ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列を繰り返した配列を
有する一本鎖核酸を生成させることにより核酸配列を増
幅することを特徴とする核酸配列の増幅方法である。さ
らに本発明の核酸配列を増幅するための試薬キットは、
検体試料中の標的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部分的に
相補的な配列を有する環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）およびデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸を含む核酸増幅用試薬キットであ
る。
【０００６】本発明で用いる環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）は、長さ、配列等に特に制限されない。また人工
的に合成した核酸でも、例えば、ウィルスＤＮＡやプラ
スミドＤＮＡに由来する天然の核酸であってもよい。標
的核酸配列（Ｄ）をプライマーとして利用する場合、環
状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）は、標的核酸配列（Ｄ）と
相補的なアニール部分が、長さ、６〜１００ヌクレオチ
ド、好ましくは１０〜４０ヌクレオチドのものが使用さ
れる。また大きさは一般的に５０〜１００００ヌクレオ
チド、好ましくは１００〜５０００ヌクレオチドであれ
ばよい。
（Ａ）は、長さ、配列等に特に制限されない。また人工
的に合成した核酸でも、例えば、ウィルスＤＮＡやプラ
スミドＤＮＡに由来する天然の核酸であってもよい。標
的核酸配列（Ｄ）をプライマーとして利用する場合、環
状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）は、標的核酸配列（Ｄ）と
相補的なアニール部分が、長さ、６〜１００ヌクレオチ
ド、好ましくは１０〜４０ヌクレオチドのものが使用さ
れる。また大きさは一般的に５０〜１００００ヌクレオ
チド、好ましくは１００〜５０００ヌクレオチドであれ
ばよい。
【０００７】本発明で用いる環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）と少なくとも部分的に相補的な配列を有するプラ
イマー（Ｂ）は、少なくともその一部の配列が環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的であれば、長さ、構造等
に制限されない。人工的に合成された核酸であっても、
天然に由来する核酸であってもよい。環状一本鎖ヌクレ
オチド（Ａ）との相補的な部分は、６〜１００ヌクレオ
チド、好ましくは１０〜４０ヌクレオチドの長さのもの
が用いられる。
（Ａ）と少なくとも部分的に相補的な配列を有するプラ
イマー（Ｂ）は、少なくともその一部の配列が環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的であれば、長さ、構造等
に制限されない。人工的に合成された核酸であっても、
天然に由来する核酸であってもよい。環状一本鎖ヌクレ
オチド（Ａ）との相補的な部分は、６〜１００ヌクレオ
チド、好ましくは１０〜４０ヌクレオチドの長さのもの
が用いられる。
【０００８】本発明で使用される耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｃ）は、環状ＤＮＡを鋳型として比較的高温で作
用させた場合、合成を行ないながら鋳型を一周した後、
先に合成したＤＮＡを剥しながら合成し続ける活性を有
しているヘリカーゼ様活性を持つポリメラーゼであれば
特に制限されない。例えばＴｔｈ（Thermus thermophil
us）ＤＮＡポリメラーゼ（Eur.J.Biochem.,149,41,(198
5)) 、Ｔａｑ（Thermus aquaticus ）ＤＮＡポリメラー
ゼ(J.Bacteriol.,127,1550,(1976))、Ｖｅｎｔ（Thermo
coccus litoralis）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（Baci
llus stearothermophilus ）ＤＮＡポリメラーゼなどが
使用できる。また耐熱性でなくともφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼなどのヘリカーゼ様活
性を有する酵素であれば、本発明に使用可能である。反
応の温度は、使用する酵素に応じて設定されるが一般的
には４０℃〜９０℃、好ましくは、６０℃〜８０℃で行
われる。
ーゼ（Ｃ）は、環状ＤＮＡを鋳型として比較的高温で作
用させた場合、合成を行ないながら鋳型を一周した後、
先に合成したＤＮＡを剥しながら合成し続ける活性を有
しているヘリカーゼ様活性を持つポリメラーゼであれば
特に制限されない。例えばＴｔｈ（Thermus thermophil
us）ＤＮＡポリメラーゼ（Eur.J.Biochem.,149,41,(198
5)) 、Ｔａｑ（Thermus aquaticus ）ＤＮＡポリメラー
ゼ(J.Bacteriol.,127,1550,(1976))、Ｖｅｎｔ（Thermo
coccus litoralis）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（Baci
llus stearothermophilus ）ＤＮＡポリメラーゼなどが
使用できる。また耐熱性でなくともφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼなどのヘリカーゼ様活
性を有する酵素であれば、本発明に使用可能である。反
応の温度は、使用する酵素に応じて設定されるが一般的
には４０℃〜９０℃、好ましくは、６０℃〜８０℃で行
われる。
【０００９】本発明で使用する標的核酸配列（Ｄ）は断
片化して、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）のプライマーとし
て機能できれば、長さ、構造等に特に制限されない。環
状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列の内部また
は端部に制限酵素による切断部位を有していることが望
ましい。
片化して、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）のプライマーとし
て機能できれば、長さ、構造等に特に制限されない。環
状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配列の内部また
は端部に制限酵素による切断部位を有していることが望
ましい。
【００１０】本発明の核酸増幅法は、環状一本鎖ヌクレ
オチド（Ａ）、該環状一本鎖ヌクレオチドと少なくとも
部分的に相補的な配列を有するプライマー（Ｂ）および
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、下記の操作
（ａ）〜（ｄ）を行なう。 操作（ａ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と上記プラ
イマー（Ｂ）をアニールさせる。 操作（ｂ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ａ）でアニールしたプライマー（Ｂ）を伸長させ、核
酸配列を増幅させる。 操作（ｃ）：増幅された核酸配列を断片化する。 操作（ｄ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ａ）〜（ｃ）を少なく
とも１回繰り返す。
オチド（Ａ）、該環状一本鎖ヌクレオチドと少なくとも
部分的に相補的な配列を有するプライマー（Ｂ）および
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、下記の操作
（ａ）〜（ｄ）を行なう。 操作（ａ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と上記プラ
イマー（Ｂ）をアニールさせる。 操作（ｂ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ａ）でアニールしたプライマー（Ｂ）を伸長させ、核
酸配列を増幅させる。 操作（ｃ）：増幅された核酸配列を断片化する。 操作（ｄ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ａ）〜（ｃ）を少なく
とも１回繰り返す。
【００１１】また本発明の核酸増幅法は、試料中の標的
核酸配列（Ｄ）、該標的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部
分的に相補的な配列を有する環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行なう。 操作（ａ）：標的核酸配列（Ｄ）を断片化する。 操作（ｂ）：断片化した標的核酸配列（Ｄ）と上記環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）をアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）でアニールした標的核酸配列
（Ｄ）をプライマーとし、環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）を鋳型として、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）
を用いて反応させ、核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：生成した核酸配列を断片化する。 操作（ｅ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ｂ）〜（ｄ）を少なく
とも１回繰り返す。
核酸配列（Ｄ）、該標的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部
分的に相補的な配列を有する環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行なう。 操作（ａ）：標的核酸配列（Ｄ）を断片化する。 操作（ｂ）：断片化した標的核酸配列（Ｄ）と上記環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）をアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）でアニールした標的核酸配列
（Ｄ）をプライマーとし、環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）を鋳型として、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）
を用いて反応させ、核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：生成した核酸配列を断片化する。 操作（ｅ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ｂ）〜（ｄ）を少なく
とも１回繰り返す。
【００１２】本発明を図１に基づいて説明する。尚、図
中Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを示す。操作（ａ）： 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）にプライマ
ー（Ｂ）をアニールさせる。アニールは最大の選択性を
もたらすように、選択された温度において行われる。一
般的には環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）とプライマー
（Ｂ）が特異的に結合し、かつミスマッチによる非特異
的結合が最小となるように昇温させて行う。操作（ｂ）： 操作（ａ）でアニールしたプライマー
（Ｂ）を、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて伸長さ
せ、核酸配列を増幅させる。当該操作は、例えばｄＮＴ
Ｐ（dATP, dCTP, dGTP, dTTPの４種のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（例えばThermus thermophilus DNAポリメラーゼ、Ther
mus aquaticus DNA ポリメラーゼ等）を用いて、該環状
ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることによ
って行われる。これらの酵素は、高温で反応させること
によりＤＮＡの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸
長物の合成を進めていくことができる。操作（ｃ）： 増幅された核酸配列を断片化する。操作（ｄ）： 必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ａ）〜（ｃ）を少なく
とも１回繰り返す。
中Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを示す。操作（ａ）： 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）にプライマ
ー（Ｂ）をアニールさせる。アニールは最大の選択性を
もたらすように、選択された温度において行われる。一
般的には環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）とプライマー
（Ｂ）が特異的に結合し、かつミスマッチによる非特異
的結合が最小となるように昇温させて行う。操作（ｂ）： 操作（ａ）でアニールしたプライマー
（Ｂ）を、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて伸長さ
せ、核酸配列を増幅させる。当該操作は、例えばｄＮＴ
Ｐ（dATP, dCTP, dGTP, dTTPの４種のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（例えばThermus thermophilus DNAポリメラーゼ、Ther
mus aquaticus DNA ポリメラーゼ等）を用いて、該環状
ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることによ
って行われる。これらの酵素は、高温で反応させること
によりＤＮＡの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸
長物の合成を進めていくことができる。操作（ｃ）： 増幅された核酸配列を断片化する。操作（ｄ）： 必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ａ）〜（ｃ）を少なく
とも１回繰り返す。
【００１３】本発明を図２を用いて説明する。尚、図中
Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｄは標的核酸配列、Ｃは
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを示す。操作（ａ）： 標的核酸配列（Ｄ）を断片化する。操作（ｂ）： 断片化した標的核酸配列（Ｄ）と上記環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）をアニールさせる。操作（ｃ）： 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ｂ）でアニールした断片化した標的核酸配列（Ｄ）を
プライマーとして伸長させ、核酸配列を増幅させる。操作（ｄ）： 生成した核酸配列を断片化する。操作（ｅ）： 必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ｂ）〜（ｄ）を少なく
とも１回繰り返す。
Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｄは標的核酸配列、Ｃは
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを示す。操作（ａ）： 標的核酸配列（Ｄ）を断片化する。操作（ｂ）： 断片化した標的核酸配列（Ｄ）と上記環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）をアニールさせる。操作（ｃ）： 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ｂ）でアニールした断片化した標的核酸配列（Ｄ）を
プライマーとして伸長させ、核酸配列を増幅させる。操作（ｄ）： 生成した核酸配列を断片化する。操作（ｅ）： 必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ｂ）〜（ｄ）を少なく
とも１回繰り返す。
【００１４】
【発明の効果】本発明の増幅法によれば、ヘリカーゼ様
活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることに
より、環状一本鎖ヌクレオチド１分子から複数の核酸配
列が生成されるので効率よく増幅することが可能であ
る。また、本発明の増幅法は複雑な温度の調節や、専用
の機器を必要としない。さらに、本発明の増幅法は、プ
ローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非特
異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブの
増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Signal/Noise) 比を増加させるこ
とができる。
活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることに
より、環状一本鎖ヌクレオチド１分子から複数の核酸配
列が生成されるので効率よく増幅することが可能であ
る。また、本発明の増幅法は複雑な温度の調節や、専用
の機器を必要としない。さらに、本発明の増幅法は、プ
ローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非特
異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブの
増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Signal/Noise) 比を増加させるこ
とができる。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示す
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、これら実施例によって本発明の範囲は限定され
ない。 （実施例１）常法により精製した一本鎖ブルースクリプ
ト KS+ＤＮＡを環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）として、
Ｍ１３primerＰ１（東洋紡製）をプライマー（Ｂ）とし
て、以下の操作を行った。 操作（ａ） 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）1 pmolに、プライマー
（Ｂ）10pmolを反応液20μl に加えた。94℃に２分間保
った後、50℃に５分間保温し、アニールさせた。 反応液 10 mM Tris-HCl (pH 8.9) 1.5 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% Triton X-100 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP 操作（ｂ） 上記反応液に、Tth ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）４
単位を加え、75℃で60分間保温し、プライマーを伸長さ
せた。 操作（ｃ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡを確認した。結果
は反応開始後、０分（レーン２）では、鋳型の環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）しか存在しないが、３０分（レー
ン３）、６０分（レーン４）保温した後では、鋳型より
高分子側にスメア状にＤＮＡが合成されていた。このこ
とはプライマー（Ｂ）が環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）
を鋳型として伸長され、核酸配列が増幅されたことを示
している。
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、これら実施例によって本発明の範囲は限定され
ない。 （実施例１）常法により精製した一本鎖ブルースクリプ
ト KS+ＤＮＡを環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）として、
Ｍ１３primerＰ１（東洋紡製）をプライマー（Ｂ）とし
て、以下の操作を行った。 操作（ａ） 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）1 pmolに、プライマー
（Ｂ）10pmolを反応液20μl に加えた。94℃に２分間保
った後、50℃に５分間保温し、アニールさせた。 反応液 10 mM Tris-HCl (pH 8.9) 1.5 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% Triton X-100 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP 操作（ｂ） 上記反応液に、Tth ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）４
単位を加え、75℃で60分間保温し、プライマーを伸長さ
せた。 操作（ｃ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡを確認した。結果
は反応開始後、０分（レーン２）では、鋳型の環状一本
鎖ヌクレオチド（Ａ）しか存在しないが、３０分（レー
ン３）、６０分（レーン４）保温した後では、鋳型より
高分子側にスメア状にＤＮＡが合成されていた。このこ
とはプライマー（Ｂ）が環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）
を鋳型として伸長され、核酸配列が増幅されたことを示
している。
図１は本発明の原理を模式的に示した図である。図中、
Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは核
酸ポリメラーゼを示す。図２は本発明の原理を模式的に
示した図である。図中、Ｄは標的核酸配列、Ａは環状一
本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは核酸ポリメラ
ーゼを示す。図３は実施例１において合成されたＤＮＡ
の電気泳動パターンを示す。レーン１はマーカーＤＮＡ
（λ-Hind III ）、２、３、４はそれぞれ７５℃で０
分、３０分、６０分保温した場合のパターンに対応して
いる。矢印は、鋳型として用いた環状一本鎖ヌクレオチ
ド（Ａ）の位置を示す。
Ａは環状一本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは核
酸ポリメラーゼを示す。図２は本発明の原理を模式的に
示した図である。図中、Ｄは標的核酸配列、Ａは環状一
本鎖ヌクレオチド、Ｂはプライマー、Ｃは核酸ポリメラ
ーゼを示す。図３は実施例１において合成されたＤＮＡ
の電気泳動パターンを示す。レーン１はマーカーＤＮＡ
（λ-Hind III ）、２、３、４はそれぞれ７５℃で０
分、３０分、６０分保温した場合のパターンに対応して
いる。矢印は、鋳型として用いた環状一本鎖ヌクレオチ
ド（Ａ）の位置を示す。
Claims (9)
- 【請求項１】 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）、該環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と少なくとも部分的に相補的
な配列を有するプライマー（Ｂ）および耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｃ）を用いて、該環状一本鎖ヌクレオチド
（Ａ）にアニールした該プライマー（Ｂ）を伸長させる
ことにより、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な
配列を繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成させる
ことにより核酸配列を増幅することを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 - 【請求項２】 検体試料中の標的核酸配列（Ｄ）、該標
的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部分的に相補的な配列を
有する環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、環状一本鎖ヌクレオチ
ド（Ａ）にアニールした標的核酸配列（Ｄ）をプライマ
ーとして、環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と相補的な配
列を繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成させるこ
とにより核酸配列を増幅することを特徴とする核酸配列
の増幅方法。 - 【請求項３】 環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）、該環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と少なくとも部分的に相補的
な配列を有するプライマー（Ｂ）および耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｄ）
を行なうことを特徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）と上記プラ
イマー（Ｂ）をアニールさせる。 操作（ｂ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ａ）でアニールしたプライマー（Ｂ）を伸長させ、核
酸配列を増幅させる。 操作（ｃ）：増幅された核酸配列を断片化する。 操作（ｄ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ａ）〜（ｃ）を少なく
とも１回繰り返す。 - 【請求項４】 検体試料中の標的核酸配列（Ｄ）、該標
的核酸配列（Ｄ）と少なくとも部分的に相補的な配列を
有する環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）および耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜
（ｅ）を行なうことを特徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：標的核酸配列（Ｄ）を断片化する。 操作（ｂ）：断片化した標的核酸配列（Ｄ）と上記環状
一本鎖ヌクレオチド（Ａ）をアニールさせる。 操作（ｃ）：環状一本鎖ヌクレオチド（Ａ）を鋳型とし
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）を用いて、操作
（ｂ）でアニールした断片化した標的核酸配列（Ｄ）を
プライマーとして伸長させ、核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：生成した核酸配列を断片化する。 操作（ｅ）：必要に応じて、断片化した核酸配列をプラ
イマーとして用いて、上記操作（ｂ）〜（ｄ）を少なく
とも１回繰り返す。 - 【請求項５】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがヘリカーゼ
様活性を持つポリメラーゼであることを特徴とする請求
項１〜４の核酸配列の増幅方法。 - 【請求項６】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが環状ＤＮＡ
を鋳型として高温で作用させた場合、ＤＮＡの合成を行
いながら鋳型を一周した後、先に合成したＤＮＡを剥が
しながら合成し続ける活性を有しているヘリカーゼ様活
性を持つポリメラーゼであることを特徴とする請求項１
〜５の核酸配列の増幅方法。 - 【請求項７】 検体試料中の標的核酸配列（Ｄ）と少な
くとも部分的に相補的な配列を有する環状一本鎖ヌクレ
オチド（Ａ）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ）および
デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む核酸配列増幅
用試薬キット。 - 【請求項８】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがヘリカーゼ
様活性を持つポリメラーゼであることを特徴とする請求
項７の核酸配列増幅用試薬キット。 - 【請求項９】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが環状ＤＮＡ
を鋳型として高温で作用させた場合、ＤＮＡの合成を行
いながら鋳型を一周した後、先に合成したＤＮＡを剥が
しながら合成し続ける活性を有しているヘリカーゼ様活
性を持つポリメラーゼであることを特徴とする請求項７
〜８の核酸配列増幅用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33987291A JPH05146299A (ja) | 1991-11-27 | 1991-11-27 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33987291A JPH05146299A (ja) | 1991-11-27 | 1991-11-27 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05146299A true JPH05146299A (ja) | 1993-06-15 |
Family
ID=18331621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33987291A Pending JPH05146299A (ja) | 1991-11-27 | 1991-11-27 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05146299A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714320A (en) * | 1993-04-15 | 1998-02-03 | University Of Rochester | Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides |
| US6077668A (en) * | 1993-04-15 | 2000-06-20 | University Of Rochester | Highly sensitive multimeric nucleic acid probes |
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| US6830884B1 (en) | 1998-12-15 | 2004-12-14 | Molecular Staging Inc. | Method of amplification |
| EP1539979A4 (en) * | 2002-09-20 | 2006-01-11 | New England Biolabs Inc | AMPLIFICATION DEPENDENT OF NUCLEIC ACID HELICASE |
| US6986985B1 (en) | 1994-01-13 | 2006-01-17 | Enzo Life Sciences, Inc. | Process for producing multiple nucleic acid copies in vivo using a protein-nucleic acid construct |
| US7135312B2 (en) | 1993-04-15 | 2006-11-14 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US7662594B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-02-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of RNA |
| WO2016152936A1 (ja) * | 2015-03-24 | 2016-09-29 | 国立大学法人 群馬大学 | Ｒｎａ配列の簡便検出法 |
| US9683255B2 (en) | 2005-09-09 | 2017-06-20 | Qiagen Gmbh | Method for activating a nucleic acid for a polymerase reaction |
-
1991
- 1991-11-27 JP JP33987291A patent/JPH05146299A/ja active Pending
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| US7829284B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-11-09 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of nucleic acids |
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| WO2016152936A1 (ja) * | 2015-03-24 | 2016-09-29 | 国立大学法人 群馬大学 | Ｒｎａ配列の簡便検出法 |
| JPWO2016152936A1 (ja) * | 2015-03-24 | 2018-01-18 | 国立大学法人群馬大学 | Ｒｎａ配列の簡便検出法 |
| US10597719B2 (en) | 2015-03-24 | 2020-03-24 | National University Corporation Gunma University | Detection kit and simple method for detecting target nucleic acids |
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