JPH0716094A - Ｒｎａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法 - Google Patents
Ｒｎａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびＲ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライ
マーとをハイブリダイズさせ、ヘリカーゼ様活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼを用い、ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ第１プライマーからの伸長反応を
行い、剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、特定核
酸配列からＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をも
つ第１プライマーと該第１プライマーからの伸長物で形
成されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
１本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。得られたＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌ
レオチドを用いて特定核酸配列の増幅を行う。 【効果】 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をも
つ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程で、加熱処理
（95℃で５分間処理後、冷却）を行わない。また伝達Ｒ
ＮＡからの遺伝子増幅が可能となる。
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライ
マーとをハイブリダイズさせ、ヘリカーゼ様活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼを用い、ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ第１プライマーからの伸長反応を
行い、剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、特定核
酸配列からＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をも
つ第１プライマーと該第１プライマーからの伸長物で形
成されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
１本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。得られたＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌ
レオチドを用いて特定核酸配列の増幅を行う。 【効果】 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をも
つ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程で、加熱処理
（95℃で５分間処理後、冷却）を行わない。また伝達Ｒ
ＮＡからの遺伝子増幅が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドの製造
法に関し、また該ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する特定核酸
配列の増幅法に関する。
ロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドの製造
法に関し、また該ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する特定核酸
配列の増幅法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハイブリダイゼーションによる核酸の検
出は、遺伝病、癌、感染症などの診断における有効な手
段として汎用されるようになってきた。しかしながら、
特定核酸配列が非常に僅少な場合には、感度上の問題等
によりその検出が困難である。そのため、特定核酸配列
の増幅法の開発が試みられてきた。その最初の試みとし
て、目的とする核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅さ
せる方法（特開昭61-274697号公報、以下PCR 法と略
す）が開発された。しかしながら、PCR 法は、その原理
上、特殊な温度制御装置を必要とし、増幅効率も２倍づ
つしか増幅できないという欠点を有している。またＤＮ
Ａリガーゼを用いる増幅法（WO89/12696、特開平2-2934
号公報など、以下LCR 法と略す）も考案されたがPCR 法
と同様、特殊な温度制御装置と必要とする。
出は、遺伝病、癌、感染症などの診断における有効な手
段として汎用されるようになってきた。しかしながら、
特定核酸配列が非常に僅少な場合には、感度上の問題等
によりその検出が困難である。そのため、特定核酸配列
の増幅法の開発が試みられてきた。その最初の試みとし
て、目的とする核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅さ
せる方法（特開昭61-274697号公報、以下PCR 法と略
す）が開発された。しかしながら、PCR 法は、その原理
上、特殊な温度制御装置を必要とし、増幅効率も２倍づ
つしか増幅できないという欠点を有している。またＤＮ
Ａリガーゼを用いる増幅法（WO89/12696、特開平2-2934
号公報など、以下LCR 法と略す）も考案されたがPCR 法
と同様、特殊な温度制御装置と必要とする。
【０００３】そこで、特殊な温度制御装置を必要とせ
ず、効率よく遺伝子を増幅する方法が必要とされ、ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いた遺伝子増幅方法（特開平2-5864
号公報、特開平4-501057号公報など、以下NASBA法と略
す）が開発された。NASBA法は、転写開始配列を有する
プライマーと特定核酸配列をアニールさせ、ＤＮＡポリ
メラーゼで伸長反応後、熱をかけてＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを
得る。その後、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
（転写開始配列）の性質を利用し、一定温度で遺伝子増
幅反応を行うものである。また、NASBA法はメッセンジ
ャーＲＮＡからの遺伝子増幅が可能である。この方法
は、転写開始配列を有するプライマーを特定伝達ＲＮＡ
に結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）で相補的ＤＮＡを合成後、リボヌクレアーゼ(RNase
H)処理で伝達ＲＮＡを分解し、ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得
る。その後、転写開始配列の性質を利用し一定温度で遺
伝子増幅反応を行うものである。
ず、効率よく遺伝子を増幅する方法が必要とされ、ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いた遺伝子増幅方法（特開平2-5864
号公報、特開平4-501057号公報など、以下NASBA法と略
す）が開発された。NASBA法は、転写開始配列を有する
プライマーと特定核酸配列をアニールさせ、ＤＮＡポリ
メラーゼで伸長反応後、熱をかけてＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを
得る。その後、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
（転写開始配列）の性質を利用し、一定温度で遺伝子増
幅反応を行うものである。また、NASBA法はメッセンジ
ャーＲＮＡからの遺伝子増幅が可能である。この方法
は、転写開始配列を有するプライマーを特定伝達ＲＮＡ
に結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）で相補的ＤＮＡを合成後、リボヌクレアーゼ(RNase
H)処理で伝達ＲＮＡを分解し、ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得
る。その後、転写開始配列の性質を利用し一定温度で遺
伝子増幅反応を行うものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、PCR法
は特殊な温度制御装置と高価な耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを必要とし、増幅効率も２倍づつしか増幅できないと
いう欠点を有している。この欠点を解決すべくNASBA法
が開発された。しかしながら、このNASBA法も反応の中
間工程であるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において、加
熱処理（95℃で5分間処理後、冷却）を行わざるを得ず
操作が煩雑となる。また、NASBA法は伝達ＲＮＡからの
遺伝子増幅が可能であり、ＲＮＡリボヌクレアーゼの使
用により煩雑な加熱処理を省略できるが、伝達ＲＮＡか
らの増幅法にのみ適用し、ＤＮＡからの増幅には適さな
い。
は特殊な温度制御装置と高価な耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを必要とし、増幅効率も２倍づつしか増幅できないと
いう欠点を有している。この欠点を解決すべくNASBA法
が開発された。しかしながら、このNASBA法も反応の中
間工程であるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において、加
熱処理（95℃で5分間処理後、冷却）を行わざるを得ず
操作が煩雑となる。また、NASBA法は伝達ＲＮＡからの
遺伝子増幅が可能であり、ＲＮＡリボヌクレアーゼの使
用により煩雑な加熱処理を省略できるが、伝達ＲＮＡか
らの増幅法にのみ適用し、ＤＮＡからの増幅には適さな
い。
【０００５】本発明の目的は、上記のような従来からの
問題点を解決するものであり、その目的とするところ
は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本
鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において煩雑な加熱処
理を必要としない簡便な製造法を提供することにある。
問題点を解決するものであり、その目的とするところ
は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本
鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において煩雑な加熱処
理を必要としない簡便な製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究をすすめた結果、本発明に到達
した。すなわち本発明は次の工程を含むことを特徴とす
るＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖
オリゴヌクレオチドを製造する方法である。 （ａ）特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマー
をハイブリダイズさせる。（ここで剥離用プライマーお
よびＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１
プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、
その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補
的配列がＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
第１プライマーの特定核酸配列の相補的配列の３’側に
存在する。） （ｂ）次いでヘリカーゼ様活性を有するＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ第１プライマーからの伸長反応を行う。 （ｃ）さらに剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、
特定核酸配列からＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ第１プライマーと該第１プライマーからの伸長
物で形成されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。
題を解決すべく鋭意研究をすすめた結果、本発明に到達
した。すなわち本発明は次の工程を含むことを特徴とす
るＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖
オリゴヌクレオチドを製造する方法である。 （ａ）特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマー
をハイブリダイズさせる。（ここで剥離用プライマーお
よびＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１
プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、
その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補
的配列がＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
第１プライマーの特定核酸配列の相補的配列の３’側に
存在する。） （ｂ）次いでヘリカーゼ様活性を有するＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ第１プライマーからの伸長反応を行う。 （ｃ）さらに剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、
特定核酸配列からＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ第１プライマーと該第１プライマーからの伸長
物で形成されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。
【０００７】本発明では工程（ｂ）および工程（ｃ）が
同時に行われることが好ましい。また本発明のＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌク
レオチドを製造する方法では、工程（ｃ）において形成
されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１
本鎖オリゴヌクレオチドと特定核酸配列との二重鎖領域
が、ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼの作用
により、剥離用プライマーからの伸長反応にともない巻
戻され、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
１本鎖オリゴヌクレオチドが特定核酸配列から分離され
ることが好ましい。
同時に行われることが好ましい。また本発明のＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌク
レオチドを製造する方法では、工程（ｃ）において形成
されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１
本鎖オリゴヌクレオチドと特定核酸配列との二重鎖領域
が、ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼの作用
により、剥離用プライマーからの伸長反応にともない巻
戻され、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
１本鎖オリゴヌクレオチドが特定核酸配列から分離され
ることが好ましい。
【０００８】また本発明は次の工程を含むことを特徴と
するＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本
鎖オリゴヌクレオチドを用いた特定核酸配列の増幅法で
ある。 （Ａ）上記工程（ａ）〜工程（ｃ）を経て得られたＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴ
ヌクレオチドに第２プライマーをハイブリダイズさせ
る。 （Ｂ）次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行
い、二重鎖ＤＮＡを合成した後、 （Ｃ）二重鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを反応させて
一重鎖ＲＮＡを複数合成する。 （Ｄ）一重鎖ＲＮＡを鋳型として、第２プライマーをハ
イブリダイズさせる。 （Ｅ）次いでＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成させる。 （Ｆ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解
し、一本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｇ）得られた一本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ第１プライマーをハイブリダイズ
させ、伸長反応を行い、二重鎖ＤＮＡを合成する。 （Ｈ）さらに工程（Ｃ）から（Ｇ）を繰り返して特定核
酸配列を増幅する。
するＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本
鎖オリゴヌクレオチドを用いた特定核酸配列の増幅法で
ある。 （Ａ）上記工程（ａ）〜工程（ｃ）を経て得られたＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴ
ヌクレオチドに第２プライマーをハイブリダイズさせ
る。 （Ｂ）次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行
い、二重鎖ＤＮＡを合成した後、 （Ｃ）二重鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを反応させて
一重鎖ＲＮＡを複数合成する。 （Ｄ）一重鎖ＲＮＡを鋳型として、第２プライマーをハ
イブリダイズさせる。 （Ｅ）次いでＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成させる。 （Ｆ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解
し、一本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｇ）得られた一本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ第１プライマーをハイブリダイズ
させ、伸長反応を行い、二重鎖ＤＮＡを合成する。 （Ｈ）さらに工程（Ｃ）から（Ｇ）を繰り返して特定核
酸配列を増幅する。
【０００９】以下に本発明に使用される用語を説明す
る。「伸長反応」とは核酸配列に十分に相補的な配列を
もつプライマーを核酸配列にハイブリダイズした後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼとデオキシアデノシン5'−三リン酸
（dATP）、デオキシシチジン5'−三リン酸（dCTP）、デ
オキシグアノシン5'−三リン酸（dGTP）、及びデオキシ
チミジン5'−三リン酸（dTTP）の存在下、プライマーに
デオキシヌクレオチドを共有結合し、核酸配列に相補的
なＤＮＡ配列を順次合成する反応である。「剥離用プラ
イマー」とはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドを特定核酸配列から分離
させるためのプライマーである。剥離用プライマーから
の伸長反応に伴い、伸長反応方向の上流に存在するＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴ
ヌクレオチドがヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により特定核酸配列から分離される。
る。「伸長反応」とは核酸配列に十分に相補的な配列を
もつプライマーを核酸配列にハイブリダイズした後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼとデオキシアデノシン5'−三リン酸
（dATP）、デオキシシチジン5'−三リン酸（dCTP）、デ
オキシグアノシン5'−三リン酸（dGTP）、及びデオキシ
チミジン5'−三リン酸（dTTP）の存在下、プライマーに
デオキシヌクレオチドを共有結合し、核酸配列に相補的
なＤＮＡ配列を順次合成する反応である。「剥離用プラ
イマー」とはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドを特定核酸配列から分離
させるためのプライマーである。剥離用プライマーから
の伸長反応に伴い、伸長反応方向の上流に存在するＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴ
ヌクレオチドがヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により特定核酸配列から分離される。
【００１０】「ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列」とはＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合する配列で
ある。ＲＮＡポリメラーゼはこのプロモーター配列に特
異的に結合し、該プロモーター配列よりも下流のＤＮＡ
配列と相同なＲＮＡを合成する。「ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列をもつ第１プライマー」とは５’末
端にＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモーター配列
を有し、３’末端側に特定核酸配列に相補的な核酸配列
を有するプライマーである。「ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチド」とは
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プラ
イマーとＤＮＡポリメラーゼによる該第１プライマーか
らの伸長物の結合物である。
列」とはＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合する配列で
ある。ＲＮＡポリメラーゼはこのプロモーター配列に特
異的に結合し、該プロモーター配列よりも下流のＤＮＡ
配列と相同なＲＮＡを合成する。「ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列をもつ第１プライマー」とは５’末
端にＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモーター配列
を有し、３’末端側に特定核酸配列に相補的な核酸配列
を有するプライマーである。「ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチド」とは
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プラ
イマーとＤＮＡポリメラーゼによる該第１プライマーか
らの伸長物の結合物である。
【００１１】「ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラ
ーゼ」とはプライマーからの伸長反応を行いＤＮＡを合
成しつつ、伸長方向に存在する二本鎖ＤＮＡ部位を巻き
戻して一本鎖ＤＮＡに変換するポリメラーゼのことであ
る。例えば、PHI29ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラ
グメント（Klenow fragment）、Ｍ２ＤＮＡポリメラー
ゼなどがヘリカーゼ様活性を有しており、本発明に使用
可能である。また耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔ
ｈ（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ
ｑ（Thermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎ
ｔ（Thermococcuslitoralis）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ
ｓｔ（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラ
ーゼなどもヘリカーゼ様活性を有しており本発明に使用
できる。
ーゼ」とはプライマーからの伸長反応を行いＤＮＡを合
成しつつ、伸長方向に存在する二本鎖ＤＮＡ部位を巻き
戻して一本鎖ＤＮＡに変換するポリメラーゼのことであ
る。例えば、PHI29ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラ
グメント（Klenow fragment）、Ｍ２ＤＮＡポリメラー
ゼなどがヘリカーゼ様活性を有しており、本発明に使用
可能である。また耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔ
ｈ（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ
ｑ（Thermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎ
ｔ（Thermococcuslitoralis）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ
ｓｔ（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラ
ーゼなどもヘリカーゼ様活性を有しており本発明に使用
できる。
【００１２】本発明に使用する特定核酸配列は一重鎖Ｄ
ＮＡであっても二重鎖ＤＮＡであってもよい。それらが
人為的に作成されたものであっても、天然に存在するも
のであっても支障はない。天然のＤＮＡを使用する場合
には常法に従い検体から抽出後、本発明に利用できる。
検体の具体的な調製法としては、例えば腸炎ビブリオの
菌株をブレインハートインフュージョン培地に接種し
て、一晩培養する。成育したコロニーをエッペンドルフ
チューブにかきとり、希釈用緩衝液に懸濁し、さらにこ
こへ、プロテイナーゼ、溶菌液を加えて撹拌し、約60℃
で30分間インキュベートし、次いで得られた溶解液を、
フェノール、クロロホルムなどで抽出後、エタノール沈
澱して核酸を得る。
ＮＡであっても二重鎖ＤＮＡであってもよい。それらが
人為的に作成されたものであっても、天然に存在するも
のであっても支障はない。天然のＤＮＡを使用する場合
には常法に従い検体から抽出後、本発明に利用できる。
検体の具体的な調製法としては、例えば腸炎ビブリオの
菌株をブレインハートインフュージョン培地に接種し
て、一晩培養する。成育したコロニーをエッペンドルフ
チューブにかきとり、希釈用緩衝液に懸濁し、さらにこ
こへ、プロテイナーゼ、溶菌液を加えて撹拌し、約60℃
で30分間インキュベートし、次いで得られた溶解液を、
フェノール、クロロホルムなどで抽出後、エタノール沈
澱して核酸を得る。
【００１３】本発明においてＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を持つ第１プライマーのプロモーター配列
は、T3ＲＮＡポリメラーゼ、T7ＲＮＡポリメラーゼ、SP
6 ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列などを用い
ればよい。該第１プライマーと特定核酸配列とのアニー
ル部位の配列長に特に制限はなく、好ましくは10〜100b
p 、特に好ましくは10〜50bp、更に好ましくは15〜30bp
がよいが、これに限定されるものではない。プライマー
の調製法は従来公知の方法に従う。具体的な手法として
は、例えばＡＢＩ社マニュアルに従ってホスホアミダイ
ド法により製造する。各種オリゴヌクレオチドの脱保護
はアンモニア水で実施する。精製はＦＰＬＣで逆相カラ
ムにて実施してもよい。
モーター配列を持つ第１プライマーのプロモーター配列
は、T3ＲＮＡポリメラーゼ、T7ＲＮＡポリメラーゼ、SP
6 ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列などを用い
ればよい。該第１プライマーと特定核酸配列とのアニー
ル部位の配列長に特に制限はなく、好ましくは10〜100b
p 、特に好ましくは10〜50bp、更に好ましくは15〜30bp
がよいが、これに限定されるものではない。プライマー
の調製法は従来公知の方法に従う。具体的な手法として
は、例えばＡＢＩ社マニュアルに従ってホスホアミダイ
ド法により製造する。各種オリゴヌクレオチドの脱保護
はアンモニア水で実施する。精製はＦＰＬＣで逆相カラ
ムにて実施してもよい。
【００１４】本発明では、剥離用プライマーおよびＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマ
ーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、その位置
関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補的配列が
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プラ
イマーの特定核酸配列の相補的配列の３’側に存在す
る。剥離用プライマーを設計する場合、剥離用プライマ
ーと特定核酸配列とのアニール部位の配列長に特に制限
はなく、好ましくは10〜100bp 、特に好ましくは10〜50
bp、更に好ましくは15〜30bpがよいが、これに限定され
るものではない。
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマ
ーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、その位置
関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補的配列が
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プラ
イマーの特定核酸配列の相補的配列の３’側に存在す
る。剥離用プライマーを設計する場合、剥離用プライマ
ーと特定核酸配列とのアニール部位の配列長に特に制限
はなく、好ましくは10〜100bp 、特に好ましくは10〜50
bp、更に好ましくは15〜30bpがよいが、これに限定され
るものではない。
【００１５】以下に本発明を図面（図１および図２）を
用いて説明する。剥離用プライマーａとＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマーｂは特定
核酸配列の相補的結合配列に結合でき、その位置関係は
該剥離用プライマーａの特定核酸配列の相補的結合配列
ａ’が該第１プライマーｂの特定核酸配列の相補的結合
配列ｂ’の３’側に存在しなければならない。該第１プ
ライマーｂと剥離用プライマーａの特定核酸配列の相補
的結合配列間の距離（ｂ’とａ’間の距離）に特に制限
はなく、ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼに
より該剥離用プライマーａからの伸長反応にともない、
該第１プライマーｂと該第１プライマーｂからの伸長物
ｃが特定核酸配列から分離する距離に設定すればよい。
好ましくは０〜2000bp、特に好ましくは20〜1000bpがよ
いが、これに限定されるものではない。
用いて説明する。剥離用プライマーａとＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマーｂは特定
核酸配列の相補的結合配列に結合でき、その位置関係は
該剥離用プライマーａの特定核酸配列の相補的結合配列
ａ’が該第１プライマーｂの特定核酸配列の相補的結合
配列ｂ’の３’側に存在しなければならない。該第１プ
ライマーｂと剥離用プライマーａの特定核酸配列の相補
的結合配列間の距離（ｂ’とａ’間の距離）に特に制限
はなく、ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼに
より該剥離用プライマーａからの伸長反応にともない、
該第１プライマーｂと該第１プライマーｂからの伸長物
ｃが特定核酸配列から分離する距離に設定すればよい。
好ましくは０〜2000bp、特に好ましくは20〜1000bpがよ
いが、これに限定されるものではない。
【００１６】剥離用プライマーａとＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を持つ第１プライマーｂは以下の方
法に基づき特定核酸配列とアニールさせる（工程ａ）。
特定核酸配列が二本鎖ＤＮＡの場合には、該特定核酸配
列と該第１プライマーｂと剥離用プライマーａを混合
し、80〜105 ℃で２〜５分間加熱後、室温になるまで放
置する。特定核酸配列が一本鎖ＤＮＡの場合には、該特
定核酸配列と該第１プライマーｂと剥離用プライマーａ
を混合し、しばらく放置してもよいし、50〜105 ℃で２
〜５分間加熱後、室温になるまで放置してもよい。アニ
ール反応終了後、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTPの４種
のデオキシリボヌクレオチド）存在下、ヘリカーゼ様活
性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いて、剥離用プライマ
ーａとＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第
１プライマーｂからの伸長反応を生じせしめる（工程
ｂ）。該第１プライマーｂと第１プライマーｂからの伸
長物ｃは、剥離用プライマーａからの伸長反応に従っ
て、特定核酸配列と形成される二重鎖領域が、ヘリカー
ゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼの作用により巻戻さ
れ、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本
鎖オリゴヌクレオチドｄが特定核酸配列から分離される
（工程ｃ）。剥離用プライマーａからの伸長反応とＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を持つ第１プライマ
ーｂからの伸長反応（工程ｂ）と、ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドｄ
が特定核酸配列から分離される反応（工程ｃ）を同時に
生じせしめても何等問題はない。
のプロモーター配列を持つ第１プライマーｂは以下の方
法に基づき特定核酸配列とアニールさせる（工程ａ）。
特定核酸配列が二本鎖ＤＮＡの場合には、該特定核酸配
列と該第１プライマーｂと剥離用プライマーａを混合
し、80〜105 ℃で２〜５分間加熱後、室温になるまで放
置する。特定核酸配列が一本鎖ＤＮＡの場合には、該特
定核酸配列と該第１プライマーｂと剥離用プライマーａ
を混合し、しばらく放置してもよいし、50〜105 ℃で２
〜５分間加熱後、室温になるまで放置してもよい。アニ
ール反応終了後、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTPの４種
のデオキシリボヌクレオチド）存在下、ヘリカーゼ様活
性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いて、剥離用プライマ
ーａとＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第
１プライマーｂからの伸長反応を生じせしめる（工程
ｂ）。該第１プライマーｂと第１プライマーｂからの伸
長物ｃは、剥離用プライマーａからの伸長反応に従っ
て、特定核酸配列と形成される二重鎖領域が、ヘリカー
ゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼの作用により巻戻さ
れ、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本
鎖オリゴヌクレオチドｄが特定核酸配列から分離される
（工程ｃ）。剥離用プライマーａからの伸長反応とＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を持つ第１プライマ
ーｂからの伸長反応（工程ｂ）と、ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドｄ
が特定核酸配列から分離される反応（工程ｃ）を同時に
生じせしめても何等問題はない。
【００１７】ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドの具体的な製法の一例と
しては、腸炎ビブリオのゲノムを緩衝液に懸濁し、デオ
キシリボヌクレオチドおよびT7転写開始配列と耐熱性溶
血毒遺伝子に相同な配列を有するプライマー１および耐
熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を有する剥離プラ
イマー２を混合し、約95℃に加熱後、室温になるまで放
置する。ＤＮＡポリメラーゼを添加し、約30℃で保温し
反応を行う。
もつ一本鎖オリゴヌクレオチドの具体的な製法の一例と
しては、腸炎ビブリオのゲノムを緩衝液に懸濁し、デオ
キシリボヌクレオチドおよびT7転写開始配列と耐熱性溶
血毒遺伝子に相同な配列を有するプライマー１および耐
熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を有する剥離プラ
イマー２を混合し、約95℃に加熱後、室温になるまで放
置する。ＤＮＡポリメラーゼを添加し、約30℃で保温し
反応を行う。
【００１８】本発明の製造法により製造されたＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌレ
オチドｄを使用して核酸の増幅を行うには、まず該一本
鎖ヌクレオチドｄに相補的な第２プライマーｅをアニー
ルさせ（図２、工程Ａ）、ＤＮＡポリメラーゼ反応によ
り二重鎖ＤＮＡを形成させる（工程Ｂ）。該二本鎖ＤＮ
ＡにＲＮＡポリメラーゼを反応させ、一重鎖ＲＮＡｆを
合成させる（工程Ｃ）。該一重鎖ＲＮＡには上記一本鎖
ヌクレオチドに相補的な第２プライマーｅがアニール可
能であり（工程Ｄ）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
（逆転写酵素）により該一重鎖ＲＮＡｆに相補的なＤＮ
Ａ配列ｇを合成する（工程Ｅ）。一重鎖ＲＮＡに相補的
なＤＮＡ配列ｇと一重鎖ＲＮＡｆを例えばリボヌクレア
ーゼを用いて分離し（工程Ｆ）、該一重鎖ＲＮＡに相補
的なＤＮＡ配列ｇとＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列をもつ第一プライマーｂをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼにより二重鎖にする（工程Ｇ）。以上の反応
を少なくとも１回繰り返し、増幅反応を行う。
リメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌレ
オチドｄを使用して核酸の増幅を行うには、まず該一本
鎖ヌクレオチドｄに相補的な第２プライマーｅをアニー
ルさせ（図２、工程Ａ）、ＤＮＡポリメラーゼ反応によ
り二重鎖ＤＮＡを形成させる（工程Ｂ）。該二本鎖ＤＮ
ＡにＲＮＡポリメラーゼを反応させ、一重鎖ＲＮＡｆを
合成させる（工程Ｃ）。該一重鎖ＲＮＡには上記一本鎖
ヌクレオチドに相補的な第２プライマーｅがアニール可
能であり（工程Ｄ）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
（逆転写酵素）により該一重鎖ＲＮＡｆに相補的なＤＮ
Ａ配列ｇを合成する（工程Ｅ）。一重鎖ＲＮＡに相補的
なＤＮＡ配列ｇと一重鎖ＲＮＡｆを例えばリボヌクレア
ーゼを用いて分離し（工程Ｆ）、該一重鎖ＲＮＡに相補
的なＤＮＡ配列ｇとＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列をもつ第一プライマーｂをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼにより二重鎖にする（工程Ｇ）。以上の反応
を少なくとも１回繰り返し、増幅反応を行う。
【００１９】本発明に使用する第２プライマーとはＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖ヌクレ
オチドに相補的なプライマーをいう。
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖ヌクレ
オチドに相補的なプライマーをいう。
【００２０】本発明において特定核酸配列の検出を行う
には、上記増幅法により増幅した試料を電気泳動、サザ
ンブロット、ドットブロットなどを行う必要があり、具
体的な検出法の一例としては、上記工程ａから工程ｃに
より得られた反応液にＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー配列をもつ一本鎖ヌクレオチドに相補的な第２プライ
マー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）、ＲＮＡポリメラーゼおよび必要によりリボヌクレ
アーゼを添加して約42℃で反応させ、反応液を例えばナ
イロン膜に数μｌ滴下後、放射線標識プローブまたは酵
素標識プローブをハイブリダイズさせて検出できる。ま
た別な検出例としては、上記第２プライマー、ＤＴＴ、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例、AMV逆転写酵
素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例、T7ＲＮＡポリメラー
ゼ）および必要によりリボヌクレアーゼ（例、RNaseH)
を添加して約42℃で反応させ、反応液をアガロースゲル
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線
での蛍光を検出する。反応液の他に分子量マーカーも同
時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたヌク
レオチド断片の長さを算出することができる。
には、上記増幅法により増幅した試料を電気泳動、サザ
ンブロット、ドットブロットなどを行う必要があり、具
体的な検出法の一例としては、上記工程ａから工程ｃに
より得られた反応液にＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー配列をもつ一本鎖ヌクレオチドに相補的な第２プライ
マー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）、ＲＮＡポリメラーゼおよび必要によりリボヌクレ
アーゼを添加して約42℃で反応させ、反応液を例えばナ
イロン膜に数μｌ滴下後、放射線標識プローブまたは酵
素標識プローブをハイブリダイズさせて検出できる。ま
た別な検出例としては、上記第２プライマー、ＤＴＴ、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例、AMV逆転写酵
素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例、T7ＲＮＡポリメラー
ゼ）および必要によりリボヌクレアーゼ（例、RNaseH)
を添加して約42℃で反応させ、反応液をアガロースゲル
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線
での蛍光を検出する。反応液の他に分子量マーカーも同
時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたヌク
レオチド断片の長さを算出することができる。
【００２１】
【発明の効果】従来方法では、ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌレオチドを得るた
めに加熱処理（95℃で5分間処理後、冷却）を必要と
し、この加熱操作は反応を自動化する際の障壁となり、
装置自体に加熱装置を設けなければならない。ところ
が、本発明ではヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラ
ーゼを使用して、その操作を簡便化できることにより、
このような煩雑な操作および装置を必要とせずに、ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴ
ヌレオチドを得ることができる。本発明の１本鎖オリゴ
ヌレオチドの製造法は、塩基配列が既知の核酸をその初
期に存在する量に比較してより大量に生成させる増幅方
法に適用できる。また特定核酸配列の検出法にも適用で
きる。
ロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌレオチドを得るた
めに加熱処理（95℃で5分間処理後、冷却）を必要と
し、この加熱操作は反応を自動化する際の障壁となり、
装置自体に加熱装置を設けなければならない。ところ
が、本発明ではヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラ
ーゼを使用して、その操作を簡便化できることにより、
このような煩雑な操作および装置を必要とせずに、ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴ
ヌレオチドを得ることができる。本発明の１本鎖オリゴ
ヌレオチドの製造法は、塩基配列が既知の核酸をその初
期に存在する量に比較してより大量に生成させる増幅方
法に適用できる。また特定核酸配列の検出法にも適用で
きる。
【００２２】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ （各種オリゴヌクレオチドの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシン
セサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて
配列表に示される配列、すなわち、T7ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列（T7転写開始配列）および耐熱性
溶血毒遺伝子に相同な配列を有する第１プライマー（配
列番号１）、耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を
有する剥離用プライマー（配列番号２）、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオ
チドに相補的な第２プライマー（耐熱性溶血毒遺伝子の
配列に相補的な配列を有する）（配列番号３）を合成し
た。具体的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、0.2Mス
ケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で55℃一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
る。 実施例１ （各種オリゴヌクレオチドの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシン
セサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて
配列表に示される配列、すなわち、T7ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列（T7転写開始配列）および耐熱性
溶血毒遺伝子に相同な配列を有する第１プライマー（配
列番号１）、耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を
有する剥離用プライマー（配列番号２）、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオ
チドに相補的な第２プライマー（耐熱性溶血毒遺伝子の
配列に相補的な配列を有する）（配列番号３）を合成し
た。具体的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、0.2Mス
ケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で55℃一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００２３】（腸炎ビブリオからのゲノムの調製）腸炎
ビブリオの菌株を 3% NaClを含むブレインハートインフ
ュージョン培地（Brain Heart Infusion Agar)に接種し
て、37℃で一晩培養した。成育したコロニーをそれぞれ
1.5mlのエッペンドルフチューブにかきとり、希釈用緩
衝液（0.1MNaH2PO4, pH 7.0） 300μｌに懸濁した。さ
らにここへプロテイナーゼＫ（ナカライテスク社） 0.6
mg、溶菌液（8M尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、
0.25％ラウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA, pH
7.6) 600μｌを加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベ
ートした。得られた溶解液をフェノールで２回、クロロ
ホルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。
ビブリオの菌株を 3% NaClを含むブレインハートインフ
ュージョン培地（Brain Heart Infusion Agar)に接種し
て、37℃で一晩培養した。成育したコロニーをそれぞれ
1.5mlのエッペンドルフチューブにかきとり、希釈用緩
衝液（0.1MNaH2PO4, pH 7.0） 300μｌに懸濁した。さ
らにここへプロテイナーゼＫ（ナカライテスク社） 0.6
mg、溶菌液（8M尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、
0.25％ラウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA, pH
7.6) 600μｌを加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベ
ートした。得られた溶解液をフェノールで２回、クロロ
ホルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。
【００２４】（検出用プローブの調製） （１）リンカーアームを有する腸炎ビブリオ用オリゴヌ
クレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー392 型を用いて、ホスホ
アミダイド法にて、配列表に示される配列、すなわち検
出用プローブ（配列番号４）を合成した。この際、特表
昭60-500717 号公報に記載された合成法により、デオキ
シウリジンから化学合成した 5位にリンカーアームを有
するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。こ
のウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴと置換し
うるが、この実施例においては5'末端のＴを置換した。
合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水
で50℃、一夜脱保護処理した後、ファルマシア社製FPLC
で陰イオン交換カラムを用いて精製した。
クレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー392 型を用いて、ホスホ
アミダイド法にて、配列表に示される配列、すなわち検
出用プローブ（配列番号４）を合成した。この際、特表
昭60-500717 号公報に記載された合成法により、デオキ
シウリジンから化学合成した 5位にリンカーアームを有
するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。こ
のウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴと置換し
うるが、この実施例においては5'末端のＴを置換した。
合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水
で50℃、一夜脱保護処理した後、ファルマシア社製FPLC
で陰イオン交換カラムを用いて精製した。
【００２５】（２）リンカーオリゴヌクレオチドのアル
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドにそのリンカーアーム
を介して、アルカリホシファターゼを文献(Ncleic Acid
s Research, vol.14, p.6114, 1986) に従って結合し
た。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を0.2M NaHCO
3 12.5μl に溶解し、ここへ10mg/ml スベリン酸スクシ
ニミジル(DSS)25 μｌを加えて、室温で２分間反応させ
た。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0) で平衡化したSeph
adex G-25 カラム(1cmφ×30cm) でゲル濾過して過剰の
DSS を除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアル
カリホスファターゼ (100mM NaHCO3, 3M HClに溶解した
もの）と室温で16時間反応させることによりアルカリホ
スファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プロー
ブはファルマシア製FPLCで陰イオン交換カラムを用いて
精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコ
ン30K(アミコン社) を用いて限外濾過法により濃縮し
た。
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドにそのリンカーアーム
を介して、アルカリホシファターゼを文献(Ncleic Acid
s Research, vol.14, p.6114, 1986) に従って結合し
た。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を0.2M NaHCO
3 12.5μl に溶解し、ここへ10mg/ml スベリン酸スクシ
ニミジル(DSS)25 μｌを加えて、室温で２分間反応させ
た。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0) で平衡化したSeph
adex G-25 カラム(1cmφ×30cm) でゲル濾過して過剰の
DSS を除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアル
カリホスファターゼ (100mM NaHCO3, 3M HClに溶解した
もの）と室温で16時間反応させることによりアルカリホ
スファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プロー
ブはファルマシア製FPLCで陰イオン交換カラムを用いて
精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコ
ン30K(アミコン社) を用いて限外濾過法により濃縮し
た。
【００２６】（ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドの合成）腸炎ビブリオ
のゲノム1ngを緩衝液（50 mM Tris-HCl,pH8.3, 6mM MgC
l2, 40 mM KCl ）に懸濁し、１mMデオキシリボヌクレオ
チド(Pharmacia)およびプライマー１、２と混合し、3分
間95℃で加熱後、室温になるまで放置した。PHI91 ＲＮ
Ａポリメラーゼを４単位添加し、30℃で１時間保温し反
応を行った。
をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドの合成）腸炎ビブリオ
のゲノム1ngを緩衝液（50 mM Tris-HCl,pH8.3, 6mM MgC
l2, 40 mM KCl ）に懸濁し、１mMデオキシリボヌクレオ
チド(Pharmacia)およびプライマー１、２と混合し、3分
間95℃で加熱後、室温になるまで放置した。PHI91 ＲＮ
Ａポリメラーゼを４単位添加し、30℃で１時間保温し反
応を行った。
【００２７】（検出）上記反応液にプライマー３（配列
番号３）、10 mM DTT 、40ユニットのＲＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ (AMV 逆転写酵素)(東洋紡）0.4 ユニッ
トのリボヌクレアーゼ(RNaseH)(Pharmacia) 、20ユニッ
トのT7ＲＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を添加し42℃
で３時間反応させた。反応液１μｌをナイロン膜に滴下
後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。この膜を中和
後、ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカ
リフォスファターゼ標識核酸プローブ（配列番号４）を
含むハイブリダイゼーション・バッファー(5×SSC, 0.5
% ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニールピロリドン、
1%ドデシル硫酸ナトリウム) を加えて、50℃で15分間ハ
イブリダイゼーションを行った。ナイロン膜をポリバッ
クから取り出し、洗浄液１(1×SSC, 1% ドデシル硫酸ナ
トリウム) で50℃、10分間振盪洗浄した。さらに洗浄液
2 (1×SSC)で室温下10分間振盪洗浄した。膜を新しいハ
イブリダイゼーションバックに移し、基質液(0.1M Tris
-HCl, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3mg/ml ニトロブルー
テトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロフェリールホス
フェート pH7.5) を入れ、シール後、37℃で30分間イン
キュベートした。
番号３）、10 mM DTT 、40ユニットのＲＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ (AMV 逆転写酵素)(東洋紡）0.4 ユニッ
トのリボヌクレアーゼ(RNaseH)(Pharmacia) 、20ユニッ
トのT7ＲＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を添加し42℃
で３時間反応させた。反応液１μｌをナイロン膜に滴下
後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。この膜を中和
後、ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカ
リフォスファターゼ標識核酸プローブ（配列番号４）を
含むハイブリダイゼーション・バッファー(5×SSC, 0.5
% ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニールピロリドン、
1%ドデシル硫酸ナトリウム) を加えて、50℃で15分間ハ
イブリダイゼーションを行った。ナイロン膜をポリバッ
クから取り出し、洗浄液１(1×SSC, 1% ドデシル硫酸ナ
トリウム) で50℃、10分間振盪洗浄した。さらに洗浄液
2 (1×SSC)で室温下10分間振盪洗浄した。膜を新しいハ
イブリダイゼーションバックに移し、基質液(0.1M Tris
-HCl, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3mg/ml ニトロブルー
テトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロフェリールホス
フェート pH7.5) を入れ、シール後、37℃で30分間イン
キュベートした。
【００２８】（結果）生成物はプライマー１、２ (配列
番号 1、2)を同時に用いたときのアルカリホスファター
ゼにより生じる紫色色素のスポットが検出できた。
番号 1、2)を同時に用いたときのアルカリホスファター
ゼにより生じる紫色色素のスポットが検出できた。
【００２９】図１は本発明のＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列をもつ１本鎖ヌクレオチドを製造する全体
図を示す。図２は本発明により得られたＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖ヌクレオチドを使
用する特定核酸配列の増幅方法を示す。図３は実施例１
のハイブリダイゼーションの結果を示す。図中、スポッ
ト１〜４はプライマー（配列番号１，２）存在下および
非存在下における実施結果を示す。スポット５はプライ
マー（配列番号１、２）存在下で特定核酸配列非存在化
におけるコントロールを示す。
モーター配列をもつ１本鎖ヌクレオチドを製造する全体
図を示す。図２は本発明により得られたＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖ヌクレオチドを使
用する特定核酸配列の増幅方法を示す。図３は実施例１
のハイブリダイゼーションの結果を示す。図中、スポッ
ト１〜４はプライマー（配列番号１，２）存在下および
非存在下における実施結果を示す。スポット５はプライ
マー（配列番号１、２）存在下で特定核酸配列非存在化
におけるコントロールを示す。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：T7転写開始配列と、耐熱性溶血毒遺伝子に相
同的な配列を有する。 配列：AATACGACTC ACTATAGCCCC GGTTCTGATG AGATATTGTT 40
同的な配列を有する。 配列：AATACGACTC ACTATAGCCCC GGTTCTGATG AGATATTGTT 40
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同的な配列を
有する。 配列：GCTGCATTC AAAACATCTGC 20
有する。 配列：GCTGCATTC AAAACATCTGC 20
【００３２】配列番号：３ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相補的な配列を
有する。 配列：ATTTTACGAA CACAGCAGAA TGACCG 26
有する。 配列：ATTTTACGAA CACAGCAGAA TGACCG 26
【００３３】配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：耐熱性溶血毒遺伝子の配列を有する。 配列：TCAGGTACTA AATGGTTGAC ATCCT 25
【図１】本発明のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ１本鎖ヌクレオチドを製造する工程ａから工程
ｃを示す。
列をもつ１本鎖ヌクレオチドを製造する工程ａから工程
ｃを示す。
【図２】本発明のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ１本鎖ヌクレオチドを使用する特定核酸配列の
増幅法を示す。
列をもつ１本鎖ヌクレオチドを使用する特定核酸配列の
増幅法を示す。
【図３】実施例１のハイブリダイゼーションの結果を示
す。
す。
Claims (4)
- 【請求項１】 次の工程を含むことを特徴とするＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌ
クレオチドを製造する方法。 （ａ）特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１プライマー
をハイブリダイズさせる。（ここで剥離用プライマーお
よびＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第１
プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、
その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補
的配列がＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ
第１プライマーの特定核酸配列の相補的配列の３’側に
存在する。） （ｂ）次いでヘリカーゼ様活性を有するＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ第１プライマーからの伸長反応を行う。 （ｃ）さらに剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、
特定核酸配列からＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列をもつ第１プライマーと該第１プライマーからの伸長
物で形成されるＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。 - 【請求項２】 請求項１における工程（ｂ）および工程
（ｃ）が同時に行われることを特徴とするＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオ
チドを製造する方法。 - 【請求項３】 請求項１の工程（ｃ）において形成され
るＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖
オリゴヌクレオチドと特定核酸配列との二重鎖領域が、
ヘリカーゼ様活性をもつＤＮＡポリメラーゼの作用によ
り、剥離用プライマーからの伸長反応にともない巻戻さ
れ、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本
鎖オリゴヌクレオチドが特定核酸配列から分離されるこ
とを特徴とするＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法。 - 【請求項４】 次の工程を含むことを特徴とするＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌ
クレオチドを用いた特定核酸配列の増幅法。 （Ａ）請求項１において製造したＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドに第
２プライマーをハイブリダイズさせる。 （Ｂ）次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行
い、二重鎖ＤＮＡを合成した後、 （Ｃ）二重鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを反応させて
一重鎖ＲＮＡを複数合成する。 （Ｄ）一重鎖ＲＮＡを鋳型として、第２プライマーをハ
イブリダイズさせる。 （Ｅ）次いでＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成させる。 （Ｆ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解
し、一本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｇ）得られた一本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列をもつ第１プライマーをハイブリダイズ
させ、伸長反応を行い、二重鎖ＤＮＡを合成する。 （Ｈ）さらに工程（Ｃ）から（Ｇ）を繰り返して特定核
酸配列を増幅する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14360893A JPH0716094A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | Ｒｎａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14360893A JPH0716094A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | Ｒｎａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0716094A true JPH0716094A (ja) | 1995-01-20 |
Family
ID=15342692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14360893A Pending JPH0716094A (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | Ｒｎａポリメラーゼのプロモーター配列をもつ１本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0716094A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1539979A4 (en) * | 2002-09-20 | 2006-01-11 | New England Biolabs Inc | AMPLIFICATION DEPENDENT OF NUCLEIC ACID HELICASE |
| US7662594B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-02-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of RNA |
| US9416387B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-16 | Theranos, Inc. | Nucleic acid amplification |
| US9551027B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-01-24 | Theranos, Inc. | Nucleic acid amplification |
| US9916428B2 (en) | 2013-09-06 | 2018-03-13 | Theranos Ip Company, Llc | Systems and methods for detecting infectious diseases |
| US10450595B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-22 | Theranos Ip Company, Llc | Nucleic acid amplification |
| US11254960B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-02-22 | Labrador Diagnostics Llc | Nucleic acid amplification |
-
1993
- 1993-06-15 JP JP14360893A patent/JPH0716094A/ja active Pending
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1539979A4 (en) * | 2002-09-20 | 2006-01-11 | New England Biolabs Inc | AMPLIFICATION DEPENDENT OF NUCLEIC ACID HELICASE |
| US7282328B2 (en) | 2002-09-20 | 2007-10-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase dependent amplification of nucleic acids |
| US7662594B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-02-16 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of RNA |
| US7829284B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-11-09 | New England Biolabs, Inc. | Helicase-dependent amplification of nucleic acids |
| US10017809B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-10 | Theranos Ip Company, Llc | Nucleic acid amplification |
| US9551027B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-01-24 | Theranos, Inc. | Nucleic acid amplification |
| US9725760B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-08-08 | Theranos, Inc. | Nucleic acid amplification |
| US9416387B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-16 | Theranos, Inc. | Nucleic acid amplification |
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| US11603558B2 (en) | 2013-03-15 | 2023-03-14 | Labrador Diagnostics Llc | Nucleic acid amplification |
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