JPH0516838B2 - - Google Patents
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Description
［発明の背景］
本発明はDNA及びRNAのような核酸を固体支
持体上に固定化する方法に関する。固定化された
核酸は相補性の一重鎖ポリヌクレオチドとのハイ
ブリツド形成により、特定のポリヌクレオチド配
列の存在を測定するためのプローブ（probe）と
して特に使用される。核酸のハイブリツド形成
は、中でも人間及び動物薬、農業及び食品科学の
分野における分析方法として有用である。特に、
該方法はバクテリア及びウイルスのような病原因
子の検知及び同定を行い、抗生物質耐性について
微生物を選別（スクリーニング）し、また悪性細
胞を検出するのに用いられる。 ハイブリツド形成試験では、通常、試料中に存
在する核酸又はプローブ核酸のどちらか一方を固
定化する。かかる固相技術においては、最終的に
は、固定相上に形成された、プローブと相補性の
試料ポリヌクレオチド間のハイブリツドの検出が
行なわれる。これらの方法において、核酸の固定
化のために従来最も一般的に用いられてきたマト
リツクスは微細孔性のニトロセルロース膜であ
る。より近年になつて、微細孔性ナイロン膜は、
ニトロセルロースよりも良好な機械的強度を有す
るため、普及するようになつた。第４級アンモニ
ウムイオンのような陽イオン性基をナイロン膜に
導入してその湿潤性の改良を行つた製造業者もい
る。核酸の固定化に用いられる全ての公知のニト
ロセルロース膜及びナイロン膜は、それらの表面
上にポリヌクレオチドを吸着せしめるために高濃
度の塩（high salt）を必要とし、また吸着した
DNA又はRNAを永久的に固定するために約80℃
のベーキングを必要とする。 固体マトリツクス上に形成された固定化ハリブ
リツドの検出は、通常、該ハイブリツドと特異的
に結合する検知可能な蛋白質試薬を加えることに
より行われる。通常、かかる蛋白質試薬は、プロ
ーブ核酸上のリガンド部分又はハイブリツド自体
の独特な構造と結合するという点で特異的な抗体
又は他の結合性蛋白質から成る。前者の例として
は、ビオチン基又はハプテン基を有するプローブ
核酸のアビジン又は抗ハプテン抗体との結合によ
る検出がある。後者の例としてはDNA・RNA若
しくはRNA・RNA二重鎖体（duplexes）又は挿
入若しくは抗原的に変性された二重鎖体に対して
選択性を有する抗体の使用がある。特異的結合蛋
白質試薬は検知可能な成分、通常は酵素で標識化
される。 酵素標識された又は検知可能な蛋白質試薬を用
いて、従来公知の固体マトリツクス上のハイブリ
ツド形成を測定する際の問題はかかる試薬の非特
異的吸着である。この非特異的結合により、全試
験操作の感度が制限される。したがつて、効果的
かつ安定な固定化を得るために高濃度の塩やベー
キングを必要としないより良好な、核酸を固定化
するための固体マトリツクスが必要とされてい
る。さらに、かかる新規なマトリツクスは、特に
ハイブリツド形成試験において、また特に得られ
たハイブリツドを標識蛋白質試薬を用いて検出す
る場合に必要とされる。また、ハイブリツド形成
操作には、通常、数段階のインキユベーシヨン及
び洗浄工程が要求されるため、公知の微細孔性膜
は、脆弱で取扱いが困難であるために迅速処理に
は向かない。固体状のより剛性の支持体材料によ
つてこれらの問題が解決される。 ［発明の概要］ 核酸が、アミジン残基に変換（誘導）されたア
ミド基を有するナイロンから成る固体支持体又は
マトリツクス上に効果的かつ安定に固定化され得
ることが今や見出された。かかる変換反応は、通
常、ナイロンのアミド基を、トリアルキルオキソ
ニウム塩のようなアルキル化剤を用いて処理する
ことにより無水条件下で活性化し、次いでアルキ
ル化アミド基を適切なアミンと無水条件下で反応
せしめることによつて達成される。核酸とアミジ
ン変換ナイロン支持体との間の相互作用の性質は
正確には良く知られていないが、静電気力及び恐
らくは他の非共有的結合力が主に係るものと考え
られる。 本発明の核酸固定化方法は幾つかの利点によつ
て特徴づけられる。核酸の、変性されたナイロン
表面への吸着を達成するために高濃度の塩を存在
せしめる必要がない。さらに、吸着された核酸の
ベーキングを行つて固体支持体に安定に固定化せ
しめる必要もない。酵素標識複合体
（conjugates）のような蛋白質系試薬を用いて支
持体上に形成されたハイブリツドの検出を行う際
の特別な利点は、この変性ナイロン表面がかかる
試薬に対して極めて低い非特異的結合性を示すこ
とによつてより高感度の検出限界が達成されるこ
とである。 ［好ましい実施態様の説明］ 特定の核酸のハイブリツド形成に必要である
か、又は好ましいナイロン支持体中のアミド基の
変換の程度は、通常、日常的な試験によつて測定
される。したがつて、反応条件は、固定化される
核酸にとつての特定の必要性によつて広範に変化
させてもよい。例えば、ナイロン支持体をビーズ
の形で用いた場合、通常は、直径4.8mmのビーズ
表面上に露出される、利用可能なアミド基の100
〜400ナノモルが変換されることが予測される。
表面が平滑であると仮定すると、これにより一平
方cm当り140〜560ナノモルのアミジン基が得られ
る。かかる直径が4.8mmのビーズ上に露出された
アミド基の約200〜250ナノモルの変性が、核酸を
固定化するのに特に有用でなることが判明してい
る。 誘導反応の第一段階には、無水条件下におけ
る、適切なアルキル化剤によるアミド基の活性化
が含まれる。活性化剤はアミドを０−アルキル化
してイミデートを形成する働きをする。次の、ア
ミンとの反応によりアミジン残基が形成される。
有用なアルキル化剤には硫酸ジアルキル、アルキ
ルトリフレート、アルキルジフエニルスルホニウ
ム塩、過塩素酸アルギル及び特に、低級アルキル
塩のようなトリアルキルオキソニウム塩、好まし
くはトリメチルオキソニウム塩及びトリエチルオ
キソニウム塩が挙げられる。塩の対アニオンは、
通常、ヘキサクロロアンチモン酸塩、ヘキサフル
オロリ酸塩及びテトラフルオロ硼酸塩から選ばれ
るが、最後に挙げたテトラフルオロ硼酸塩が好ま
しい。 使用するアミンは第１及び第２脂肪族アミン並
びに第１及び第２芳香族アミンから選ばれる。ア
ミンは１又は複数の第１及び／又は第２アミノ基
を有することができる。例えば、ジアミノエタ
ン、ジアミノヘキサン、スペルミジン、スペルミ
ン及びポリエチレンイミンが有用である。アミン
は、活性化アミドと反応する第１又は第２アミノ
基を必ず少くとも１個有していなければならず、
更に、第３及び第４アミン類及びグアニド残基の
ようなカチオン性基又はカチオンとなり得る基を
含んでいてもよい。特に有用なアミンはジアミン
類及びポリアミン類である。ジアミン類を使用す
れば良好な結果が得られ、ナイロン支持体上にア
ミノアミジン基が形成される。かかるジアミン類
としてはアルカンジアミン類、特に炭素原子数２
〜12のα，ω−アルカンジアミン類、例えば１，
６−ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、プト
レツシン及びカダベリン（cadoverine）が挙げ
られる。得られたアミジン残基は次式： （式中、Ｑはアルキル化ナイロンとの反応に用い
たアミンの残基を表わし；Ｘは、対アニオンを表
わす）を有する。ジアミンを用いた場合には、上
記式中のＱは−Ｒ−NH2基（式中、Ｒは好まし
くはアルキレン基、フエニレン基、アルキフエニ
レン基又はフエナルキレン基を表わす）を表わ
す。 本発明によるナイロン支持体を変性するための
特に有用な一般的方法は、まず、支持体をトリア
ルキルオキソニウム塩、例えばテトラフルオロ硼
酸トリメチルオキソニウムの非水溶媒、例えば塩
化メチレン、四塩化炭素又はジエチルエーテル溶
液で処理する。インキユベーシヨンを、好ましく
は撹拌しながら約１1/2〜約５時間行うが、約３
時間位が最適である。反応温度は広範に変化させ
ることができ、主に任意に決定される。室温にお
ける処理が通常用いられる。活性化せしめた支持
体を非水溶液から除去し、次いで場合により一連
の非水溶媒による洗浄を行う。次に、活性化ナイ
ロンを選ばれたアミン、例えば１，３−ヘキサン
ジアミンのようなアルカンジアミンと上記のよう
な非水溶媒溶液中で反応させる。この反応は周囲
条件下にて約１〜約５時間行うが、反応時間は少
くとも約３時間位が好適である。次いで、好まし
くは、変性された支持体を、まず、非水溶媒を用
いて、そして最後に水又は緩衝液を用いて一晩又
は所望によりそれ以上の、長時間にわたつて洗浄
する。最終生成物は水若しくは緩衝液の存在下に
又は乾燥状態で保存することができる。 ナイロン支持体は、通常、α，ω−アミノカル
ボン酸モノマーから成るものばかりでなく、ジア
ミンとジカルボン酸モノマーとの縮合物をはじめ
とするポリアミドから成るものとする。活性化操
作は、モノマー単位の長さにかかわらず、どのよ
うなポリアミドにも適用することができる。芳香
族、アルキル又はアルケニル骨格はすべてアミノ
カルボアルコキシ（aminocarbalkoxy）−置換ナ
イロンを与える。同様に、骨格及びアミド基は広
範に置換され得るが、もしある種の官能基、例え
ばカルボキシル基、ヒドロキシル基、フエノール
基及びアミンが存在する場合には、これらはアル
キル化反応中に修飾される。これは、最終的に変
性されたナイロンが、実質的に核酸を吸着する働
きをする限り許容される。 支持体の配座及び一般的組成は、その表面上に
変換されて及び核酸と相互作用する、露出された
ナイロンアミド基を有する限り、核酸の固定化へ
の適用に際しては所望により変化させることがで
きる。支持体はビーズ、細片、マイクロタイター
ウエル（microtier wells）、試験管、微細孔性膜
等の形態であつてよい。ビーズは、その操作性の
良さ及び高い表面積率から特に有利であることが
判明している。直径1μM〜約１cmの範囲のナイ
ロンビーズが特に用いられる。均質又は不均質な
ナイロンで形成された支持体を用いることがで
き、また非ナイロ芯又は基材上にナイロンを被覆
して用いてもよい。 本発明の変性されたナイロン支持体は、一般
に、所望の数の塩基を含むDNA、RNA及びそれ
らの誘導体又は変性体をはじめとする核酸の固定
化に用いることができる。ゲノム及びプラスミド
核酸並びにそれらの制限フラグメント及び合成オ
リゴヌクレオチドは本発明により固定化すること
ができる。 通常、所望の核酸又は核酸の母集団は、支持体
を該核酸の緩衝液又は分散液中でインキユベート
することにより変性ナイロン支持体上に固定化さ
れる。緩衝液はイオン強度が低く、通常、塩濃度
約0.5M以下及びPH約４〜約10、好ましくは約７
を有するものが好ましい。有用な緩衝液は、リン
酸塩、炭酸塩、トリス等を含み、ヌクレアーゼ阻
害剤、例えばエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）、ドデシル硫酸ナトリウム又はアウリ
ントリカルボン酸（aurin tricaiboxyhi acid）
を含有する。インキユベーシヨンを約１〜４時間
行つて結合部位を飽和せしめる。より短いインキ
ユベーシヨン時間を用いて飽和状態に満たない量
の核酸を吸着せしめてもよい。インキユベーシヨ
ン温度は、好ましくは、20〜60℃であるが、例え
ば50℃といつたやゝ高温を用いるのが好ましい。
固定化が完了したら、次に支持体をこの目的のた
め周知のサケ精子DNAのような非特異的な核酸
溶液中でインキユベートして、満たされていない
核酸結合部位を飽和せしめるのが好ましい。 固定化核酸は、アフイニテイーリガンドとして
一重鎖又は二重鎖核酸を用いたアフイニテイーク
ロマトグラフイー及び精製方法において使用する
ことができ、特に、生体液のような試料中の特定
のポリヌクレオチド配列を検知するハイブリツド
形成試験に適用される。一般に、本発明の核酸固
定化手段は、固相ポリヌクレオチドの使用又は形
成を伴ういかなるハイブリツド形成方法において
も用いることができる。 通常のハイブリツド形成試験においては、試料
の核酸又はプローブとしての核酸のどちらかが、
相補性を測定する目的で他の一方と接触せしめら
れる場合に固定化される。プローブは、対象とさ
れる配列に対して実質的に相補性の少くとも１の
一重鎖の塩基配列を有する。本発明の固定化方法
は、通常、より長いインキユベーシヨン時間を用
いてこの素子を製造又は調製するこができ、しか
も、実際の試験に必要な時間が増えることがない
ので、該試験を行うための固定化プローブを提供
するのにより有用である。 試料中の対象となる配列の存在を示す、ハイブ
リツドの形成は種々の方法で検知される。当業界
公知のように試料の核酸及び固定化されていない
プローブのうちの一方を放射性同位元素、蛍光
体、化学発光体、酸素又は特異的に結合可能なり
ガンドのような検知可能なマーカーで標識するこ
とができる。したがつて、ナイロン支持体と結び
付くようになる。かかる標識の量はハイブリツド
形成の程度と直接関係する。また、対象とされる
配列の第１の部分が、固定化された第１のプロー
ブとハリブリツドを形成し、対象とされる配列
の、相互に排他的な第２の部分と標識化された又
は他の方法により検知可能な第２のプローブとの
ハイブリツド形成により検知が行なわれる２重ハ
イブリツド形成方法も公知である。 プローブを標識化する特に際立つた方法は、特
定のヌクレオチド配列を選ぶか又はプローブの化
学的変性により、プローブの分子中に、特定の結
合性物質のための結合部位を包含せしめることで
ある。ヌクレオチド配列中に存在する結合部位の
例は、プローブがプロモーター蛋白質（例えばバ
クテリオフアージプロモーター及びRNAポリメ
ラーゼ）と結合可能なプロモーター配列［例えば
ラクトースプロモーター及びトリプトフアンプロ
モーター（trp−promoter）］から成るか、又は
リプレツサー蛋白質（例えばラクトースリプレツ
サー）と結合可能なオペレーター配列（例えばラ
クトースオペレーター）から成るか、あるいはま
た特定の抗体と結合可能な抗原性ヌクレオチド若
しくは配列（例えば５−ブロモ若しくは５−ヨー
ドデオキシウリジン及びＺ−DNA）から成るよ
うな部位である（英国特許明細書第2125964号参
照）。プローブの化学的変性により導入された結
合部位は特に有用であり、通常、特定の結合対の
片方をプローブ核酸と結合せしめることが伴う。
結合対は、ビオチン／アビジン、ハプテン及び抗
原／抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤等
の有用な結合対から選ばれる。結合対が蛋白質性
要素と非蛋白質性要素とから成る場合、蛋白質性
要素はプローブのハイブリツド形成の変性条件下
では不安定になるため、非蛋白質性要素をプロー
ブと結合せしめるのが好ましい。好ましいシステ
ムにはプローブと、ビオチン又はハプテンのよう
なリガンドとを結合させ、これらに対してそれぞ
れ標識アビジン又は抗ハプテン抗体を用いること
が含まれる。有用なリガンド標識プローブの製造
は公知である（例えば欧州特許公告公報第63879
号及び第97373号；PCT公報第83−002286号参
照。 本発明に特に有用なハイブリツド形成の形式
は、固定化ポリヌクレオチドプローブの使用及び
得られたハイブリツドを標識化された若しくはそ
の他の方々によつて検知可能なハイブリツド結合
性試薬、通常は該ハイブリツドに対する選択性を
有する抗体のような特異的結合性蛋白質との結合
によつて測定することが伴うものである。一重鎖
核酸類及び他の種類の二重鎖体と比較して特定の
二重鎖体に対して選択性を有する抗体には、
DNA・RNA、RNA・RNAに対する抗体及び限
られた範囲内のDNA・DNAに対する抗体並びに
挿入二重鎖体（intercalated duplexes）に対す
る抗体がある。 DNA・RNAハイブリツドに対して特異性を有
する抗体は、単独重合体又はヘテロ重合体ポリヌ
クレオチド二重鎖体から成る免疫原（抗原）によ
つて刺激される。有用な単独重合体二重鎖体のう
ち、特に好ましいものはポリ（rA）・ポリ（dT）
である［キタガワ（Kitagawa）及びストーラー
（Stoller）、Mol、Immunol、19、413（1982）］。
しかしながら、通常、ヘテロ重合体二重鎖体が好
んで用いられφ×174ビリオン（virion）DNAの
RNAポリメラーゼによる転写をはじめとする
種々の方々によつて製造される［ナカザト
（Nakazato）、Biochem、19、2835（1981）］。選
ばれたDNA・RNA二重鎖体はメチル蛋白質によ
つて吸着されるか又は他の方法により通常の抗原
性担体材料、例えば牛血清アルブミンと結合せし
めて所望の宿主である動物に注射する［ストーラ
ー（Stoller）、Meth.Enzymol.、70、70（1980）
参照］。 RNA・RNA二重鎖体に対する抗体は中でもレ
オウイルス又は砂糖きびが感染するフイージー病
ウイルスのようなウイルス類からの二重鎖RNA
に対して惹起される。またホモポリマーの二重鎖
体、例えば、中でもポリ（rI）・ポリ（rC）又は
ポリ（rA）・ポリ（rU）が上記のような免疫感
作に用いられる。 DNA・DNA二重鎖体に対して選択性を有する
モノクローナル抗体が欧州特許公開第135139号に
報告されている。 挿入二重鎖体に体する抗体は、通常、カチオン
性蛋白質又は蛋白質誘導体（例えばメチル化牛血
清アルブミン）とアニオン性の挿入核酸複合体と
のイオン複合体から成る免疫原に対して惹起され
る。あるいは、挿入複合体は担体プロテインと共
有結合せしめてもよい。 上記の抗ハイブリツド抗体は、通常、上記のよ
うな検知可能な基で標識され、本発明の支持体上
に形成されたハイブリツドを容易に測定すること
が可能となる。また、抗体試薬は、それ自体の抗
原性のような本来の性質に基いて検出される。標
識化抗（抗体試薬）又は蛋白質Ａは、一次抗体試
薬と結合してその検知が可能となる。 本発明を下記の実施例により説明するが、これ
によつて本発明は、何ら制限されるものではな
い。 実施例 １ 大腸菌（E.coli）23sリボーソームRNAに対し
て相補性の配列を有する一重鎖DNAプローブを
アミノアミジン変性ナイロンビーズ上に吸着せし
めた。該プローブと大腸菌23sRNAとのハイブリ
ツドを形成し、このハイブリツドを、DNA・
RNAハイブリツドに対する抗体を用いて検出し
た。 アミノアミジンナイロンビーズの製造 直径4.8mmの磨き仕上されたナイロンビーズ
［米国、イリノイ州、シカゴのプレシジヨン・プ
ラスチツク・ボール・カンパニー（Precision
Plastic Ball Co.）社から入手可能］を、ビーズ
100個につき約20mlの割合の塩化メチレン中に入
れた。ビーズ100個につき0.3ｇのテトラフルオロ
硼酸トリメチルオキソニウムを加え、この溶液を
30分間激しく撹拌した。ビーズを取り出し、塩化
メチレンで速やかに洗浄し、新たに調製した１，
６−ヘキサンジアミンの塩化メチレン18mg／ml溶
液、ビーズ100個につき20ml中で４時間振とうし
た。ビーズを塩化メチレン、次いで十分量の脱イ
オン水で一晩洗浄した。これを減圧下、40〜50℃
にて乾燥した。 TNBS試験によりこのビーズのアミノ基を調
べた。ビーズ１個を、その表面上のアミンと反応
してビーズを黄橙色に着色するスルホン酸トリニ
トロベンゼン（TNBS）1.17ミリモルを含むPH
9.3の0.1M Na2B4O7緩衝液0.85mlと共に室温にて
３時間振とうした。次に30ｍＭグリシン150μ
を加えて過剰のTNBSと30分間反応させた。反
応混合物のアリコート40μを亜硫酸ナトリウム
1.5ｍＭを含むPH7.0の0.1M硫酸ナトリウム緩衝液
0.96ml中に加えて希釈すると、414nｍにおける吸
収が記録された。この反応に用いた全TNBSを、
ビーズを用いない以外は上記のように製造した対
照を用いて測定した。 種々の量のグリシン（０〜0.8ミリモル）を上
記Na2B4O7緩衝液中でTNBS1.6ミリモルと30分
間反応させて検量線を作成した。ビーズを用いず
に測定した全TNBSとビーズと反応後の過剰の
TNBSの量との差がビーズ上のアミノ基のモル
数である。通常、各々のビーズはアミノ基200〜
250ナノモルを含んでいた。 DNAのアミノアミジンビーズ上への吸着 ビーズ25個をエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）１ミリモルとプローブDNA50μｇを含
むPH7.4の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液3.0mlに
加えた。この混合物を50℃で8.5時間振とうし、
アルカリ処理を行つたサケ精子DNA（5.2mg／ml）
0.22mlを加え、更に４時間振とうを続けた。ビー
ズをハイブリツド形成反応溶液5.0ml中に移し、
これを55℃で11時間振とうした。ビーズを１×
SSPE（SDS1％）２〜３mlで２度すすいでハイブ
リツド形成反応に用いた（１×SSPEはNaCl0.18
モル、EDTA1ミリモルを含むPH7.7の10ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液である）。 対照ビーズを下記のようにして製造した。アミ
ノアミジンナイロンビーズ52個を、アルカリ処理
したサケ精子DNA（5.2mg／ml）0.5mlを含むPH7.4
のリン酸ナトリウム緩衝液6.0mlに加えた。混合
物を50℃で17時間振とうし、ビーズをハイブリツ
ド形成溶液６ml中に移してから55℃で６時間振と
うした。ビーズを１×SSPE（SDS1％）で２度す
すいだ。 DNA・RNAに対するモノクローナル抗体の製造 DNA.RNAハイブリツドの製造 このハイブリツドは、φ×174ビリオンDNAの
大腸菌からのDNA依存性RNAポリメラーゼによ
る転写によつて製造される。この操作法はナカザ
ト（Nakazato）によりBiochem、19、2835
（1980）に記載されている。 メチル化チログロブリンの製造 牛チログロブリン［米国、ミズリー州、セント
ルイスのシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical
Co.）製］100mgを無水メタノール10ml及び2.5M
HClのメタノール溶液400μと合わせた。混合物
をロータリーミキサーで室温にて５日間反応させ
た。沈澱物を遠心分離により採取してメタノール
で２度、更にエタノールで２度洗浄した。次いで
該沈澱物を減圧下で一晩乾燥した。 マウスの免疫感作 EDTA1ミリモルを含むPH7.4の20ｍＭトリスー
塩化水素緩衝液250μ中のDNA・RNAハイブリ
ツド150μｇをメチル化チログロブリン150μｇの
水250μ溶液と合わせた。沈澱物が形成され、
これにトリス緩衝液2.5mlを加えた。混合物全体
を等量のフロインドアジユバントで乳化した。
各々のBALB／ｃマウスに上記懸濁液0.5mlを免
疫注射した。３週間後及びそれ以後は１週間ごと
に追加免疫注射を行つた。第１回目の追加免疫注
射を行つてから１週間目から開始して以後２週間
ごとに血液を採取した。 血清中の抗体価を酵素標識免疫吸着試験法によ
つて測定した。イムロン（Immulon）［米国、
バージニア州、アレクサンドリアのダイナテツク
社（Dynateck）製］マイクロタイターウエルの
それぞれに5μｇ／ml溶液50μを入れることによ
りDNA・RNAを塗布した。このDNA・RNA
を、NaCl0.15モルを含むPH6.8の0.015Mクエン酸
ナトリウム緩衝液中に加えた。この溶液を室温で
２時間放置してから、ウエルを牛血清アルブミン
５mg／ml及びトウイーン（Tween）20洗浄剤0.5
％（ｖ／ｖ）を含むPH7.4の0.02Mリン酸ナトリ
ウ緩衝液で洗浄した。適当に希釈した抗血清をウ
エルに加えて固定化DNA・RNAと該抗体とを結
合せしめた。次に結合した抗体を周知の操作によ
り、酵素標識抗マウスIgGを用いて検出した。
DNA・RNAに対して高い血清力価を有するが、
一重鎖DNAに対しては低い力価を有するマウス
の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブ
リドーマを製造した［スチユアート（Stuart）等
のProc.Natl.Acad.Sci.USA、78、3751（1981）；
ガルフレ（Galfre）及びミルスタイン
（Milstein）のMeth.in Enzymol.、73、１
（1981）］。例えば、この細胞系は、米国、マリー
ランド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（American Type
Culture Collec−tion）にATCC HB8730として
寄託されている。 クローン化ハイブリドーマはマウスの腹腔内で
増殖せしめ更なる用途のための適当量の抗体が生
成される。抗体は、アニオン交換高速液体クロマ
トグラフイーにより腹水から単離した。 23sRNAのハイブリツド形成試験 各々のビーズを表示した量の23sRNAを含むハ
イブリツド形成反応溶液150μ中に入れた。こ
れらをこの溶液0.5ml中、55℃で30分間インキユ
ベートし、最後にもう一度すすぎを行つた。 ビーズ上に形成されたRNA・DNAハイブリツ
ドをイムノアツセイ法により測定した。各々のビ
ーズを、NaCl0.15モル、牛血清アルブミン0.5％
（ｗ／ｖ）、トウイーン200.5％（ｖ／ｖ）及び
EDTA1ミリモルを含むPH7.4の0.02Mリン酸ナト
リウム（PBS／BSA／トウイーン／EDTA）50μ
中、室温で30分間振とうし、次にRNA・DAN
に対する抗体0.1μｇを含むこの溶液100μを加え
た。振とうを30分間続行し、ビーズを、トウイー
ン0.5％（ｖ／ｖ）、BSA0.5％（ｗ／ｖ）及び
MgCl21.0ミリモルを含むPH7.4の50ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（リン酸塩／BSA／トウイー
ン／MgCl2）で２度（各0.5ml）すすいだ。β−
ガラクトシダーゼ抗マウスIgG［500倍希釈；米
国、イリノイ州、シカゴのアマーシヤム社
（Amersham）製］を含むリン酸塩／BSA／トウ
イーン／MgCl2150μを各ビーズに加えて１時間
振とうした。ビーズをリン酸塩／BSA／トウイ
ーン／MgCl20.5mlですすぎ更に５分ずつ２度振
とうしながら洗浄して更にもう一度すすぎを行つ
た。 各々のビーズを結合したβ−ガラクトシダーゼ
標識を、MgCl25ミリモル及び７−β−ガラクト
シル−３−［３−ジメチル−アミノプロピルカル
ボキシアミド］クマリン0.8ミリモルを含むPH7.4
の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液［ウオーラ
（Worah）等のClin.Chem.、27、673（1981）］0.45
mlを加え、この混合物を25℃で30分間インキユベ
ートして測定した。次にMgCl21ミリモルを含む
PH7.4の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液1.5mlを加
え、蛍光を記録した。 支持体と緩衝液のみを含む支持体対照を用いて
試験を行い結果の背景蛍光を修正した。また、
20000倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ複合体
20μの活性を測定して対照ビーズに対する非特
異的結合を計算した。 結果を下記に示す。
持体上に固定化する方法に関する。固定化された
核酸は相補性の一重鎖ポリヌクレオチドとのハイ
ブリツド形成により、特定のポリヌクレオチド配
列の存在を測定するためのプローブ（probe）と
して特に使用される。核酸のハイブリツド形成
は、中でも人間及び動物薬、農業及び食品科学の
分野における分析方法として有用である。特に、
該方法はバクテリア及びウイルスのような病原因
子の検知及び同定を行い、抗生物質耐性について
微生物を選別（スクリーニング）し、また悪性細
胞を検出するのに用いられる。 ハイブリツド形成試験では、通常、試料中に存
在する核酸又はプローブ核酸のどちらか一方を固
定化する。かかる固相技術においては、最終的に
は、固定相上に形成された、プローブと相補性の
試料ポリヌクレオチド間のハイブリツドの検出が
行なわれる。これらの方法において、核酸の固定
化のために従来最も一般的に用いられてきたマト
リツクスは微細孔性のニトロセルロース膜であ
る。より近年になつて、微細孔性ナイロン膜は、
ニトロセルロースよりも良好な機械的強度を有す
るため、普及するようになつた。第４級アンモニ
ウムイオンのような陽イオン性基をナイロン膜に
導入してその湿潤性の改良を行つた製造業者もい
る。核酸の固定化に用いられる全ての公知のニト
ロセルロース膜及びナイロン膜は、それらの表面
上にポリヌクレオチドを吸着せしめるために高濃
度の塩（high salt）を必要とし、また吸着した
DNA又はRNAを永久的に固定するために約80℃
のベーキングを必要とする。 固体マトリツクス上に形成された固定化ハリブ
リツドの検出は、通常、該ハイブリツドと特異的
に結合する検知可能な蛋白質試薬を加えることに
より行われる。通常、かかる蛋白質試薬は、プロ
ーブ核酸上のリガンド部分又はハイブリツド自体
の独特な構造と結合するという点で特異的な抗体
又は他の結合性蛋白質から成る。前者の例として
は、ビオチン基又はハプテン基を有するプローブ
核酸のアビジン又は抗ハプテン抗体との結合によ
る検出がある。後者の例としてはDNA・RNA若
しくはRNA・RNA二重鎖体（duplexes）又は挿
入若しくは抗原的に変性された二重鎖体に対して
選択性を有する抗体の使用がある。特異的結合蛋
白質試薬は検知可能な成分、通常は酵素で標識化
される。 酵素標識された又は検知可能な蛋白質試薬を用
いて、従来公知の固体マトリツクス上のハイブリ
ツド形成を測定する際の問題はかかる試薬の非特
異的吸着である。この非特異的結合により、全試
験操作の感度が制限される。したがつて、効果的
かつ安定な固定化を得るために高濃度の塩やベー
キングを必要としないより良好な、核酸を固定化
するための固体マトリツクスが必要とされてい
る。さらに、かかる新規なマトリツクスは、特に
ハイブリツド形成試験において、また特に得られ
たハイブリツドを標識蛋白質試薬を用いて検出す
る場合に必要とされる。また、ハイブリツド形成
操作には、通常、数段階のインキユベーシヨン及
び洗浄工程が要求されるため、公知の微細孔性膜
は、脆弱で取扱いが困難であるために迅速処理に
は向かない。固体状のより剛性の支持体材料によ
つてこれらの問題が解決される。 ［発明の概要］ 核酸が、アミジン残基に変換（誘導）されたア
ミド基を有するナイロンから成る固体支持体又は
マトリツクス上に効果的かつ安定に固定化され得
ることが今や見出された。かかる変換反応は、通
常、ナイロンのアミド基を、トリアルキルオキソ
ニウム塩のようなアルキル化剤を用いて処理する
ことにより無水条件下で活性化し、次いでアルキ
ル化アミド基を適切なアミンと無水条件下で反応
せしめることによつて達成される。核酸とアミジ
ン変換ナイロン支持体との間の相互作用の性質は
正確には良く知られていないが、静電気力及び恐
らくは他の非共有的結合力が主に係るものと考え
られる。 本発明の核酸固定化方法は幾つかの利点によつ
て特徴づけられる。核酸の、変性されたナイロン
表面への吸着を達成するために高濃度の塩を存在
せしめる必要がない。さらに、吸着された核酸の
ベーキングを行つて固体支持体に安定に固定化せ
しめる必要もない。酵素標識複合体
（conjugates）のような蛋白質系試薬を用いて支
持体上に形成されたハイブリツドの検出を行う際
の特別な利点は、この変性ナイロン表面がかかる
試薬に対して極めて低い非特異的結合性を示すこ
とによつてより高感度の検出限界が達成されるこ
とである。 ［好ましい実施態様の説明］ 特定の核酸のハイブリツド形成に必要である
か、又は好ましいナイロン支持体中のアミド基の
変換の程度は、通常、日常的な試験によつて測定
される。したがつて、反応条件は、固定化される
核酸にとつての特定の必要性によつて広範に変化
させてもよい。例えば、ナイロン支持体をビーズ
の形で用いた場合、通常は、直径4.8mmのビーズ
表面上に露出される、利用可能なアミド基の100
〜400ナノモルが変換されることが予測される。
表面が平滑であると仮定すると、これにより一平
方cm当り140〜560ナノモルのアミジン基が得られ
る。かかる直径が4.8mmのビーズ上に露出された
アミド基の約200〜250ナノモルの変性が、核酸を
固定化するのに特に有用でなることが判明してい
る。 誘導反応の第一段階には、無水条件下におけ
る、適切なアルキル化剤によるアミド基の活性化
が含まれる。活性化剤はアミドを０−アルキル化
してイミデートを形成する働きをする。次の、ア
ミンとの反応によりアミジン残基が形成される。
有用なアルキル化剤には硫酸ジアルキル、アルキ
ルトリフレート、アルキルジフエニルスルホニウ
ム塩、過塩素酸アルギル及び特に、低級アルキル
塩のようなトリアルキルオキソニウム塩、好まし
くはトリメチルオキソニウム塩及びトリエチルオ
キソニウム塩が挙げられる。塩の対アニオンは、
通常、ヘキサクロロアンチモン酸塩、ヘキサフル
オロリ酸塩及びテトラフルオロ硼酸塩から選ばれ
るが、最後に挙げたテトラフルオロ硼酸塩が好ま
しい。 使用するアミンは第１及び第２脂肪族アミン並
びに第１及び第２芳香族アミンから選ばれる。ア
ミンは１又は複数の第１及び／又は第２アミノ基
を有することができる。例えば、ジアミノエタ
ン、ジアミノヘキサン、スペルミジン、スペルミ
ン及びポリエチレンイミンが有用である。アミン
は、活性化アミドと反応する第１又は第２アミノ
基を必ず少くとも１個有していなければならず、
更に、第３及び第４アミン類及びグアニド残基の
ようなカチオン性基又はカチオンとなり得る基を
含んでいてもよい。特に有用なアミンはジアミン
類及びポリアミン類である。ジアミン類を使用す
れば良好な結果が得られ、ナイロン支持体上にア
ミノアミジン基が形成される。かかるジアミン類
としてはアルカンジアミン類、特に炭素原子数２
〜12のα，ω−アルカンジアミン類、例えば１，
６−ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、プト
レツシン及びカダベリン（cadoverine）が挙げ
られる。得られたアミジン残基は次式： （式中、Ｑはアルキル化ナイロンとの反応に用い
たアミンの残基を表わし；Ｘは、対アニオンを表
わす）を有する。ジアミンを用いた場合には、上
記式中のＱは−Ｒ−NH2基（式中、Ｒは好まし
くはアルキレン基、フエニレン基、アルキフエニ
レン基又はフエナルキレン基を表わす）を表わ
す。 本発明によるナイロン支持体を変性するための
特に有用な一般的方法は、まず、支持体をトリア
ルキルオキソニウム塩、例えばテトラフルオロ硼
酸トリメチルオキソニウムの非水溶媒、例えば塩
化メチレン、四塩化炭素又はジエチルエーテル溶
液で処理する。インキユベーシヨンを、好ましく
は撹拌しながら約１1/2〜約５時間行うが、約３
時間位が最適である。反応温度は広範に変化させ
ることができ、主に任意に決定される。室温にお
ける処理が通常用いられる。活性化せしめた支持
体を非水溶液から除去し、次いで場合により一連
の非水溶媒による洗浄を行う。次に、活性化ナイ
ロンを選ばれたアミン、例えば１，３−ヘキサン
ジアミンのようなアルカンジアミンと上記のよう
な非水溶媒溶液中で反応させる。この反応は周囲
条件下にて約１〜約５時間行うが、反応時間は少
くとも約３時間位が好適である。次いで、好まし
くは、変性された支持体を、まず、非水溶媒を用
いて、そして最後に水又は緩衝液を用いて一晩又
は所望によりそれ以上の、長時間にわたつて洗浄
する。最終生成物は水若しくは緩衝液の存在下に
又は乾燥状態で保存することができる。 ナイロン支持体は、通常、α，ω−アミノカル
ボン酸モノマーから成るものばかりでなく、ジア
ミンとジカルボン酸モノマーとの縮合物をはじめ
とするポリアミドから成るものとする。活性化操
作は、モノマー単位の長さにかかわらず、どのよ
うなポリアミドにも適用することができる。芳香
族、アルキル又はアルケニル骨格はすべてアミノ
カルボアルコキシ（aminocarbalkoxy）−置換ナ
イロンを与える。同様に、骨格及びアミド基は広
範に置換され得るが、もしある種の官能基、例え
ばカルボキシル基、ヒドロキシル基、フエノール
基及びアミンが存在する場合には、これらはアル
キル化反応中に修飾される。これは、最終的に変
性されたナイロンが、実質的に核酸を吸着する働
きをする限り許容される。 支持体の配座及び一般的組成は、その表面上に
変換されて及び核酸と相互作用する、露出された
ナイロンアミド基を有する限り、核酸の固定化へ
の適用に際しては所望により変化させることがで
きる。支持体はビーズ、細片、マイクロタイター
ウエル（microtier wells）、試験管、微細孔性膜
等の形態であつてよい。ビーズは、その操作性の
良さ及び高い表面積率から特に有利であることが
判明している。直径1μM〜約１cmの範囲のナイ
ロンビーズが特に用いられる。均質又は不均質な
ナイロンで形成された支持体を用いることがで
き、また非ナイロ芯又は基材上にナイロンを被覆
して用いてもよい。 本発明の変性されたナイロン支持体は、一般
に、所望の数の塩基を含むDNA、RNA及びそれ
らの誘導体又は変性体をはじめとする核酸の固定
化に用いることができる。ゲノム及びプラスミド
核酸並びにそれらの制限フラグメント及び合成オ
リゴヌクレオチドは本発明により固定化すること
ができる。 通常、所望の核酸又は核酸の母集団は、支持体
を該核酸の緩衝液又は分散液中でインキユベート
することにより変性ナイロン支持体上に固定化さ
れる。緩衝液はイオン強度が低く、通常、塩濃度
約0.5M以下及びPH約４〜約10、好ましくは約７
を有するものが好ましい。有用な緩衝液は、リン
酸塩、炭酸塩、トリス等を含み、ヌクレアーゼ阻
害剤、例えばエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）、ドデシル硫酸ナトリウム又はアウリ
ントリカルボン酸（aurin tricaiboxyhi acid）
を含有する。インキユベーシヨンを約１〜４時間
行つて結合部位を飽和せしめる。より短いインキ
ユベーシヨン時間を用いて飽和状態に満たない量
の核酸を吸着せしめてもよい。インキユベーシヨ
ン温度は、好ましくは、20〜60℃であるが、例え
ば50℃といつたやゝ高温を用いるのが好ましい。
固定化が完了したら、次に支持体をこの目的のた
め周知のサケ精子DNAのような非特異的な核酸
溶液中でインキユベートして、満たされていない
核酸結合部位を飽和せしめるのが好ましい。 固定化核酸は、アフイニテイーリガンドとして
一重鎖又は二重鎖核酸を用いたアフイニテイーク
ロマトグラフイー及び精製方法において使用する
ことができ、特に、生体液のような試料中の特定
のポリヌクレオチド配列を検知するハイブリツド
形成試験に適用される。一般に、本発明の核酸固
定化手段は、固相ポリヌクレオチドの使用又は形
成を伴ういかなるハイブリツド形成方法において
も用いることができる。 通常のハイブリツド形成試験においては、試料
の核酸又はプローブとしての核酸のどちらかが、
相補性を測定する目的で他の一方と接触せしめら
れる場合に固定化される。プローブは、対象とさ
れる配列に対して実質的に相補性の少くとも１の
一重鎖の塩基配列を有する。本発明の固定化方法
は、通常、より長いインキユベーシヨン時間を用
いてこの素子を製造又は調製するこができ、しか
も、実際の試験に必要な時間が増えることがない
ので、該試験を行うための固定化プローブを提供
するのにより有用である。 試料中の対象となる配列の存在を示す、ハイブ
リツドの形成は種々の方法で検知される。当業界
公知のように試料の核酸及び固定化されていない
プローブのうちの一方を放射性同位元素、蛍光
体、化学発光体、酸素又は特異的に結合可能なり
ガンドのような検知可能なマーカーで標識するこ
とができる。したがつて、ナイロン支持体と結び
付くようになる。かかる標識の量はハイブリツド
形成の程度と直接関係する。また、対象とされる
配列の第１の部分が、固定化された第１のプロー
ブとハリブリツドを形成し、対象とされる配列
の、相互に排他的な第２の部分と標識化された又
は他の方法により検知可能な第２のプローブとの
ハイブリツド形成により検知が行なわれる２重ハ
イブリツド形成方法も公知である。 プローブを標識化する特に際立つた方法は、特
定のヌクレオチド配列を選ぶか又はプローブの化
学的変性により、プローブの分子中に、特定の結
合性物質のための結合部位を包含せしめることで
ある。ヌクレオチド配列中に存在する結合部位の
例は、プローブがプロモーター蛋白質（例えばバ
クテリオフアージプロモーター及びRNAポリメ
ラーゼ）と結合可能なプロモーター配列［例えば
ラクトースプロモーター及びトリプトフアンプロ
モーター（trp−promoter）］から成るか、又は
リプレツサー蛋白質（例えばラクトースリプレツ
サー）と結合可能なオペレーター配列（例えばラ
クトースオペレーター）から成るか、あるいはま
た特定の抗体と結合可能な抗原性ヌクレオチド若
しくは配列（例えば５−ブロモ若しくは５−ヨー
ドデオキシウリジン及びＺ−DNA）から成るよ
うな部位である（英国特許明細書第2125964号参
照）。プローブの化学的変性により導入された結
合部位は特に有用であり、通常、特定の結合対の
片方をプローブ核酸と結合せしめることが伴う。
結合対は、ビオチン／アビジン、ハプテン及び抗
原／抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤等
の有用な結合対から選ばれる。結合対が蛋白質性
要素と非蛋白質性要素とから成る場合、蛋白質性
要素はプローブのハイブリツド形成の変性条件下
では不安定になるため、非蛋白質性要素をプロー
ブと結合せしめるのが好ましい。好ましいシステ
ムにはプローブと、ビオチン又はハプテンのよう
なリガンドとを結合させ、これらに対してそれぞ
れ標識アビジン又は抗ハプテン抗体を用いること
が含まれる。有用なリガンド標識プローブの製造
は公知である（例えば欧州特許公告公報第63879
号及び第97373号；PCT公報第83−002286号参
照。 本発明に特に有用なハイブリツド形成の形式
は、固定化ポリヌクレオチドプローブの使用及び
得られたハイブリツドを標識化された若しくはそ
の他の方々によつて検知可能なハイブリツド結合
性試薬、通常は該ハイブリツドに対する選択性を
有する抗体のような特異的結合性蛋白質との結合
によつて測定することが伴うものである。一重鎖
核酸類及び他の種類の二重鎖体と比較して特定の
二重鎖体に対して選択性を有する抗体には、
DNA・RNA、RNA・RNAに対する抗体及び限
られた範囲内のDNA・DNAに対する抗体並びに
挿入二重鎖体（intercalated duplexes）に対す
る抗体がある。 DNA・RNAハイブリツドに対して特異性を有
する抗体は、単独重合体又はヘテロ重合体ポリヌ
クレオチド二重鎖体から成る免疫原（抗原）によ
つて刺激される。有用な単独重合体二重鎖体のう
ち、特に好ましいものはポリ（rA）・ポリ（dT）
である［キタガワ（Kitagawa）及びストーラー
（Stoller）、Mol、Immunol、19、413（1982）］。
しかしながら、通常、ヘテロ重合体二重鎖体が好
んで用いられφ×174ビリオン（virion）DNAの
RNAポリメラーゼによる転写をはじめとする
種々の方々によつて製造される［ナカザト
（Nakazato）、Biochem、19、2835（1981）］。選
ばれたDNA・RNA二重鎖体はメチル蛋白質によ
つて吸着されるか又は他の方法により通常の抗原
性担体材料、例えば牛血清アルブミンと結合せし
めて所望の宿主である動物に注射する［ストーラ
ー（Stoller）、Meth.Enzymol.、70、70（1980）
参照］。 RNA・RNA二重鎖体に対する抗体は中でもレ
オウイルス又は砂糖きびが感染するフイージー病
ウイルスのようなウイルス類からの二重鎖RNA
に対して惹起される。またホモポリマーの二重鎖
体、例えば、中でもポリ（rI）・ポリ（rC）又は
ポリ（rA）・ポリ（rU）が上記のような免疫感
作に用いられる。 DNA・DNA二重鎖体に対して選択性を有する
モノクローナル抗体が欧州特許公開第135139号に
報告されている。 挿入二重鎖体に体する抗体は、通常、カチオン
性蛋白質又は蛋白質誘導体（例えばメチル化牛血
清アルブミン）とアニオン性の挿入核酸複合体と
のイオン複合体から成る免疫原に対して惹起され
る。あるいは、挿入複合体は担体プロテインと共
有結合せしめてもよい。 上記の抗ハイブリツド抗体は、通常、上記のよ
うな検知可能な基で標識され、本発明の支持体上
に形成されたハイブリツドを容易に測定すること
が可能となる。また、抗体試薬は、それ自体の抗
原性のような本来の性質に基いて検出される。標
識化抗（抗体試薬）又は蛋白質Ａは、一次抗体試
薬と結合してその検知が可能となる。 本発明を下記の実施例により説明するが、これ
によつて本発明は、何ら制限されるものではな
い。 実施例 １ 大腸菌（E.coli）23sリボーソームRNAに対し
て相補性の配列を有する一重鎖DNAプローブを
アミノアミジン変性ナイロンビーズ上に吸着せし
めた。該プローブと大腸菌23sRNAとのハイブリ
ツドを形成し、このハイブリツドを、DNA・
RNAハイブリツドに対する抗体を用いて検出し
た。 アミノアミジンナイロンビーズの製造 直径4.8mmの磨き仕上されたナイロンビーズ
［米国、イリノイ州、シカゴのプレシジヨン・プ
ラスチツク・ボール・カンパニー（Precision
Plastic Ball Co.）社から入手可能］を、ビーズ
100個につき約20mlの割合の塩化メチレン中に入
れた。ビーズ100個につき0.3ｇのテトラフルオロ
硼酸トリメチルオキソニウムを加え、この溶液を
30分間激しく撹拌した。ビーズを取り出し、塩化
メチレンで速やかに洗浄し、新たに調製した１，
６−ヘキサンジアミンの塩化メチレン18mg／ml溶
液、ビーズ100個につき20ml中で４時間振とうし
た。ビーズを塩化メチレン、次いで十分量の脱イ
オン水で一晩洗浄した。これを減圧下、40〜50℃
にて乾燥した。 TNBS試験によりこのビーズのアミノ基を調
べた。ビーズ１個を、その表面上のアミンと反応
してビーズを黄橙色に着色するスルホン酸トリニ
トロベンゼン（TNBS）1.17ミリモルを含むPH
9.3の0.1M Na2B4O7緩衝液0.85mlと共に室温にて
３時間振とうした。次に30ｍＭグリシン150μ
を加えて過剰のTNBSと30分間反応させた。反
応混合物のアリコート40μを亜硫酸ナトリウム
1.5ｍＭを含むPH7.0の0.1M硫酸ナトリウム緩衝液
0.96ml中に加えて希釈すると、414nｍにおける吸
収が記録された。この反応に用いた全TNBSを、
ビーズを用いない以外は上記のように製造した対
照を用いて測定した。 種々の量のグリシン（０〜0.8ミリモル）を上
記Na2B4O7緩衝液中でTNBS1.6ミリモルと30分
間反応させて検量線を作成した。ビーズを用いず
に測定した全TNBSとビーズと反応後の過剰の
TNBSの量との差がビーズ上のアミノ基のモル
数である。通常、各々のビーズはアミノ基200〜
250ナノモルを含んでいた。 DNAのアミノアミジンビーズ上への吸着 ビーズ25個をエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）１ミリモルとプローブDNA50μｇを含
むPH7.4の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液3.0mlに
加えた。この混合物を50℃で8.5時間振とうし、
アルカリ処理を行つたサケ精子DNA（5.2mg／ml）
0.22mlを加え、更に４時間振とうを続けた。ビー
ズをハイブリツド形成反応溶液5.0ml中に移し、
これを55℃で11時間振とうした。ビーズを１×
SSPE（SDS1％）２〜３mlで２度すすいでハイブ
リツド形成反応に用いた（１×SSPEはNaCl0.18
モル、EDTA1ミリモルを含むPH7.7の10ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液である）。 対照ビーズを下記のようにして製造した。アミ
ノアミジンナイロンビーズ52個を、アルカリ処理
したサケ精子DNA（5.2mg／ml）0.5mlを含むPH7.4
のリン酸ナトリウム緩衝液6.0mlに加えた。混合
物を50℃で17時間振とうし、ビーズをハイブリツ
ド形成溶液６ml中に移してから55℃で６時間振と
うした。ビーズを１×SSPE（SDS1％）で２度す
すいだ。 DNA・RNAに対するモノクローナル抗体の製造 DNA.RNAハイブリツドの製造 このハイブリツドは、φ×174ビリオンDNAの
大腸菌からのDNA依存性RNAポリメラーゼによ
る転写によつて製造される。この操作法はナカザ
ト（Nakazato）によりBiochem、19、2835
（1980）に記載されている。 メチル化チログロブリンの製造 牛チログロブリン［米国、ミズリー州、セント
ルイスのシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical
Co.）製］100mgを無水メタノール10ml及び2.5M
HClのメタノール溶液400μと合わせた。混合物
をロータリーミキサーで室温にて５日間反応させ
た。沈澱物を遠心分離により採取してメタノール
で２度、更にエタノールで２度洗浄した。次いで
該沈澱物を減圧下で一晩乾燥した。 マウスの免疫感作 EDTA1ミリモルを含むPH7.4の20ｍＭトリスー
塩化水素緩衝液250μ中のDNA・RNAハイブリ
ツド150μｇをメチル化チログロブリン150μｇの
水250μ溶液と合わせた。沈澱物が形成され、
これにトリス緩衝液2.5mlを加えた。混合物全体
を等量のフロインドアジユバントで乳化した。
各々のBALB／ｃマウスに上記懸濁液0.5mlを免
疫注射した。３週間後及びそれ以後は１週間ごと
に追加免疫注射を行つた。第１回目の追加免疫注
射を行つてから１週間目から開始して以後２週間
ごとに血液を採取した。 血清中の抗体価を酵素標識免疫吸着試験法によ
つて測定した。イムロン（Immulon）［米国、
バージニア州、アレクサンドリアのダイナテツク
社（Dynateck）製］マイクロタイターウエルの
それぞれに5μｇ／ml溶液50μを入れることによ
りDNA・RNAを塗布した。このDNA・RNA
を、NaCl0.15モルを含むPH6.8の0.015Mクエン酸
ナトリウム緩衝液中に加えた。この溶液を室温で
２時間放置してから、ウエルを牛血清アルブミン
５mg／ml及びトウイーン（Tween）20洗浄剤0.5
％（ｖ／ｖ）を含むPH7.4の0.02Mリン酸ナトリ
ウ緩衝液で洗浄した。適当に希釈した抗血清をウ
エルに加えて固定化DNA・RNAと該抗体とを結
合せしめた。次に結合した抗体を周知の操作によ
り、酵素標識抗マウスIgGを用いて検出した。
DNA・RNAに対して高い血清力価を有するが、
一重鎖DNAに対しては低い力価を有するマウス
の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブ
リドーマを製造した［スチユアート（Stuart）等
のProc.Natl.Acad.Sci.USA、78、3751（1981）；
ガルフレ（Galfre）及びミルスタイン
（Milstein）のMeth.in Enzymol.、73、１
（1981）］。例えば、この細胞系は、米国、マリー
ランド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（American Type
Culture Collec−tion）にATCC HB8730として
寄託されている。 クローン化ハイブリドーマはマウスの腹腔内で
増殖せしめ更なる用途のための適当量の抗体が生
成される。抗体は、アニオン交換高速液体クロマ
トグラフイーにより腹水から単離した。 23sRNAのハイブリツド形成試験 各々のビーズを表示した量の23sRNAを含むハ
イブリツド形成反応溶液150μ中に入れた。こ
れらをこの溶液0.5ml中、55℃で30分間インキユ
ベートし、最後にもう一度すすぎを行つた。 ビーズ上に形成されたRNA・DNAハイブリツ
ドをイムノアツセイ法により測定した。各々のビ
ーズを、NaCl0.15モル、牛血清アルブミン0.5％
（ｗ／ｖ）、トウイーン200.5％（ｖ／ｖ）及び
EDTA1ミリモルを含むPH7.4の0.02Mリン酸ナト
リウム（PBS／BSA／トウイーン／EDTA）50μ
中、室温で30分間振とうし、次にRNA・DAN
に対する抗体0.1μｇを含むこの溶液100μを加え
た。振とうを30分間続行し、ビーズを、トウイー
ン0.5％（ｖ／ｖ）、BSA0.5％（ｗ／ｖ）及び
MgCl21.0ミリモルを含むPH7.4の50ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（リン酸塩／BSA／トウイー
ン／MgCl2）で２度（各0.5ml）すすいだ。β−
ガラクトシダーゼ抗マウスIgG［500倍希釈；米
国、イリノイ州、シカゴのアマーシヤム社
（Amersham）製］を含むリン酸塩／BSA／トウ
イーン／MgCl2150μを各ビーズに加えて１時間
振とうした。ビーズをリン酸塩／BSA／トウイ
ーン／MgCl20.5mlですすぎ更に５分ずつ２度振
とうしながら洗浄して更にもう一度すすぎを行つ
た。 各々のビーズを結合したβ−ガラクトシダーゼ
標識を、MgCl25ミリモル及び７−β−ガラクト
シル−３−［３−ジメチル−アミノプロピルカル
ボキシアミド］クマリン0.8ミリモルを含むPH7.4
の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液［ウオーラ
（Worah）等のClin.Chem.、27、673（1981）］0.45
mlを加え、この混合物を25℃で30分間インキユベ
ートして測定した。次にMgCl21ミリモルを含む
PH7.4の50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液1.5mlを加
え、蛍光を記録した。 支持体と緩衝液のみを含む支持体対照を用いて
試験を行い結果の背景蛍光を修正した。また、
20000倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ複合体
20μの活性を測定して対照ビーズに対する非特
異的結合を計算した。 結果を下記に示す。
【表】
検出されたRNA・DNAハイブリツトの量は、
ハイブリツド形成反応混合物中に加えた23sRNA
の量に比例して増加している。 対照ビーズに対するβ−ガラクトシダーゼ抗マ
ウスIgGの非特異的結合は、ビーズと接触した全
酵素複合体の0.035％であつた。 実施例 ２ DNAで被覆されたアミノアミジンビーズへの
β−ガラクトシダーゼーストレプトアビジンの非
特異的結合に関する研究を行つた。 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン複合
体の製造 β−ガラクトシダーゼ上のスルフヒドリル残基
をジチオトレイトールを用いた還元により露出せ
しめた。NaCl0.09モルを含むPH7.0の0.1MN−２
−ヒドロキシエチル−ピペラジン−N′−２−エ
タンスルホネート緩衝液（HEPES）２ml中のβ
−ガラクトシダーゼ（30000単位、等級、シグ
マ・ケミカル社製）をジチオトレイトール3.5μM
と合わせ、室温に４時間静置した。ジチオトレイ
トールを、上記緩衝液中のセフアロース
（Sepharose）C1−6B［米国、ニユージヤージー
州、ピスキヤタウエイのフアルマシア・フアイ
ン・ケミカルズ社（Pharmacia Fine
Chemicals）製］の2.5×80cmカラムを用いたク
ロマトグラフイーにより除去した。蛋白質を含む
画分を合わせてプールした。酸素１モルに対する
スルフヒドリル基のモル数をエルマン（Ellman）
の方法［Arch.Biochem.Biophys.、82、70の
（1959）］により測定した。 スクシイイミジル−４−（Ｎ−マレインイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（SMCC）［米国、イリノリ州、ロツクフオードの
ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical Co.）
製］5.3mgを無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
250μ中に溶解し、そのアリコート40μを、
NaCl0.15モルを含むPH7.0の0.1M HEPES緩衝液
３mlと合わせた。この水溶液のアリコート25μ
をHEPES／NaCl緩衝液825μ及び１ｍＭグル
タチオン（還元されたもの）100μに加えた。
この反応混合物を室温に15分間静置し、未反応の
グルタチオンをエルマン法により測定した。得ら
れた結果をSMCC濃度の計算に用いた。 ストレプトアビジン［米国、マリーランド州、
ガイサースバーグのベスセダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Bethseda Research Laboratories）
から入手］をバイオゲル（Biogel）Ｐ−6DG［米
国、カリフオルニア州、リツチモンドのバイオー
ラツド・ラボラトリーズ（Bio−Rad
Laboratories）製］中のゲル排除（gel
exclusion）クロマトグラフイーにより、
NaCl0.15モルを含むPH7.0の0.1M HEPES緩衝液
に交換した。次いで、3.7mg／mlストレプトアビ
ジン1.75mlを31mM SMCC17.6μと合わせ30℃
で１時間反応せしめた。反応混合物を、HEPES
緩衝液中のバイオゲルＰ−6DGの１×25cmカラ
ム上でクロマトグラフイーを行つた。280nｍに
おける吸収帯を有する最初の流出液のピークに対
応する画分をプールし、上記のようにガルタチオ
ンの逆滴定によりマレインイミド含有量を測定し
た。 マレインイミドが加水分解されので、速やかに
β−ガラクトシダーゼとの結合を開始した。
HEPES緩衝液3.3ml中の活性化ストレプトアビジ
ン3.9mgを還元されたβ−ガラクトシダーゼ32mg
に加えると反応混合物9.3mlが得られた。25℃に
て４時間反応を行つた後に1mMグルタチオン
800μを加えた反応をクエンチし、更に25℃で
30分間インキユベーシヨンを行つた。次に反応混
合物をバイオゲルＡ−1.5m（バイオーラツド・ラ
ボラトリーズ製）の1.5×110cmカラム上でクロマ
トグラフイーを行い、NaCl0.15モルを含むPH7.0
の0.1M HEPES緩衝液で展開せしめた。画分２
mmが採取され、280nｍにおける吸収が記録され
た。最初のピークは更なる研究のためにプールし
た。 非特異的結合の測定 上記実施例１の対照ビーズに関して記載した方
法に実質的に従つて製造したビーズをBSA 0.5
％、トウイーン20 0.5％及びMgCl2 １ミリモル
を含むPH8.0の0.1Mトリス塩化水素緩衝液μ中
で30分間振とうした。次いで100倍、500倍又は
5000倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−ストレ
プトアビジン複合体25μを適量のビーズに加
え、室温で１時間振とうした。NaCl0.5モルを含
むトリス緩衝液0.5mlを用いた５分間の振とうに
よるビーズの洗浄を２度行つた。 ビーズに非特異的に吸着された酸素を実施例１
に記載の蛍光試験により測定した。また、希釈さ
れたβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン
複合体の酸素活性を測定して、ビーズと接触した
全酸素に対する非特異的に結合した酸素を割合を
算出した。結果を下記に示す。 β−ガラクトシダーゼ −ストレプトアビジンの希釈率 非特異的結合率（％） １：100 0.0049 １：500 0.0039 １：5000 0.0062 非特異的結合は、ビーズと接触したβ−ガラク
トシダーゼ−ストレプトアビジンの量に実質的に
比例している。 実施例 ３ 比較を目的として、β−ガラクトシダーゼ複合
体の、従来技術による微細孔性ナイロン膜に対す
る非特異的結合について調べた。 膜の処理 ポール・バイオダイン（Poll Biodyne）Ａ［米
国、ニユーヨーク州、グレン・コーブのポール・
コーポレーシヨン（Poll Corporation）から入手
される］は孔径1.2μｍ及び付加された陽イオン基
及び陰イオン基を有するナイロン膜である。15cm2
の大きさの上記膜の小片を室温にて１時間、アル
カリ処理されたサケ精子DNA50μl／mlを含む14
×SSPE2mlと接触させた。次いてこの膜を風乾
し、減圧下80℃にて５時間ベークした。膜をハイ
ブリツト形成反応溶液３ml中55℃で17時間インキ
ユベートした。次にこれをSDS0.1％を含む１×
SSPE5ml中で30分間インキユベートした。 ニトラン（Nytran）［米国、ニユーハンプシヤ
ー州、キーンのシユレイチヤー・アンド・シユエ
ル社（Schleicher and Schuell）製］は、DNA
及び蛋白質の両者にとつてのトランスフアー媒体
として用いられる変性ナイロン−66製の膜であ
る。この膜は付加されたカチオン性基を有する。
蒸留水中で湿潤しせめ、次いで６×SSPE中に30
分間浸漬させることにより模擬（mock）ハイブ
リツト形成のための試料を作成した。この膜を減
圧下65℃にて２時間ベークし、ハイブリツト形成
反応溶液中に55℃にて17時間インキユベートし
た。 バイオダインＡ膜及びニトラン膜に対する酸素複
合体の非特異的結合の測定 上記膜を0.5cm角に切断し、それぞれをPBS／
BSA／トウイーン／EDTA150μlと共に室温にて
60分間振とうした。次いで、膜をリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl2で２度（各0.5ml）す
すんだ。これらを表示した希釈のβ−ガラクトシ
ダーゼ−抗マウスIgGまたはβ−ガラクトシダー
ゼ−ストレプトアビジン複合体を含むリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl2150μlと共に１時間振
とうした。膜を、HaCl0.5モルを含むリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl20.5mlで１度次いで５
分間づつ振とうしながら２度洗浄した。 膜と結合した酸素を、MgCl21ミリモル及び７
−β−ガラクトシル−３−［３−ジメチル−アミ
ノプロピルカルボキシアミド］クマリン0.8ミリ
モルを含むPH7.4の50mMリン酸ナトリウム250μl
中、25℃で30分間インキユーベートして測定し
た。インキユベーシヨンの最後にMgCl21ミリモ
ルを含むPH7.4の50mMリン酸ナトリウム緩衝液
1.5mlを加えて蛍光を記録した。また、希釈され
たβ−ガラクトシダーゼ複合体の酸素活性を測定
し、膜と接触した酸素の量に対する膜と非特異的
に結合した酸素の割合を算出した。結果を下記に
示す。
ハイブリツド形成反応混合物中に加えた23sRNA
の量に比例して増加している。 対照ビーズに対するβ−ガラクトシダーゼ抗マ
ウスIgGの非特異的結合は、ビーズと接触した全
酵素複合体の0.035％であつた。 実施例 ２ DNAで被覆されたアミノアミジンビーズへの
β−ガラクトシダーゼーストレプトアビジンの非
特異的結合に関する研究を行つた。 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン複合
体の製造 β−ガラクトシダーゼ上のスルフヒドリル残基
をジチオトレイトールを用いた還元により露出せ
しめた。NaCl0.09モルを含むPH7.0の0.1MN−２
−ヒドロキシエチル−ピペラジン−N′−２−エ
タンスルホネート緩衝液（HEPES）２ml中のβ
−ガラクトシダーゼ（30000単位、等級、シグ
マ・ケミカル社製）をジチオトレイトール3.5μM
と合わせ、室温に４時間静置した。ジチオトレイ
トールを、上記緩衝液中のセフアロース
（Sepharose）C1−6B［米国、ニユージヤージー
州、ピスキヤタウエイのフアルマシア・フアイ
ン・ケミカルズ社（Pharmacia Fine
Chemicals）製］の2.5×80cmカラムを用いたク
ロマトグラフイーにより除去した。蛋白質を含む
画分を合わせてプールした。酸素１モルに対する
スルフヒドリル基のモル数をエルマン（Ellman）
の方法［Arch.Biochem.Biophys.、82、70の
（1959）］により測定した。 スクシイイミジル−４−（Ｎ−マレインイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（SMCC）［米国、イリノリ州、ロツクフオードの
ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical Co.）
製］5.3mgを無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
250μ中に溶解し、そのアリコート40μを、
NaCl0.15モルを含むPH7.0の0.1M HEPES緩衝液
３mlと合わせた。この水溶液のアリコート25μ
をHEPES／NaCl緩衝液825μ及び１ｍＭグル
タチオン（還元されたもの）100μに加えた。
この反応混合物を室温に15分間静置し、未反応の
グルタチオンをエルマン法により測定した。得ら
れた結果をSMCC濃度の計算に用いた。 ストレプトアビジン［米国、マリーランド州、
ガイサースバーグのベスセダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Bethseda Research Laboratories）
から入手］をバイオゲル（Biogel）Ｐ−6DG［米
国、カリフオルニア州、リツチモンドのバイオー
ラツド・ラボラトリーズ（Bio−Rad
Laboratories）製］中のゲル排除（gel
exclusion）クロマトグラフイーにより、
NaCl0.15モルを含むPH7.0の0.1M HEPES緩衝液
に交換した。次いで、3.7mg／mlストレプトアビ
ジン1.75mlを31mM SMCC17.6μと合わせ30℃
で１時間反応せしめた。反応混合物を、HEPES
緩衝液中のバイオゲルＰ−6DGの１×25cmカラ
ム上でクロマトグラフイーを行つた。280nｍに
おける吸収帯を有する最初の流出液のピークに対
応する画分をプールし、上記のようにガルタチオ
ンの逆滴定によりマレインイミド含有量を測定し
た。 マレインイミドが加水分解されので、速やかに
β−ガラクトシダーゼとの結合を開始した。
HEPES緩衝液3.3ml中の活性化ストレプトアビジ
ン3.9mgを還元されたβ−ガラクトシダーゼ32mg
に加えると反応混合物9.3mlが得られた。25℃に
て４時間反応を行つた後に1mMグルタチオン
800μを加えた反応をクエンチし、更に25℃で
30分間インキユベーシヨンを行つた。次に反応混
合物をバイオゲルＡ−1.5m（バイオーラツド・ラ
ボラトリーズ製）の1.5×110cmカラム上でクロマ
トグラフイーを行い、NaCl0.15モルを含むPH7.0
の0.1M HEPES緩衝液で展開せしめた。画分２
mmが採取され、280nｍにおける吸収が記録され
た。最初のピークは更なる研究のためにプールし
た。 非特異的結合の測定 上記実施例１の対照ビーズに関して記載した方
法に実質的に従つて製造したビーズをBSA 0.5
％、トウイーン20 0.5％及びMgCl2 １ミリモル
を含むPH8.0の0.1Mトリス塩化水素緩衝液μ中
で30分間振とうした。次いで100倍、500倍又は
5000倍に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−ストレ
プトアビジン複合体25μを適量のビーズに加
え、室温で１時間振とうした。NaCl0.5モルを含
むトリス緩衝液0.5mlを用いた５分間の振とうに
よるビーズの洗浄を２度行つた。 ビーズに非特異的に吸着された酸素を実施例１
に記載の蛍光試験により測定した。また、希釈さ
れたβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン
複合体の酸素活性を測定して、ビーズと接触した
全酸素に対する非特異的に結合した酸素を割合を
算出した。結果を下記に示す。 β−ガラクトシダーゼ −ストレプトアビジンの希釈率 非特異的結合率（％） １：100 0.0049 １：500 0.0039 １：5000 0.0062 非特異的結合は、ビーズと接触したβ−ガラク
トシダーゼ−ストレプトアビジンの量に実質的に
比例している。 実施例 ３ 比較を目的として、β−ガラクトシダーゼ複合
体の、従来技術による微細孔性ナイロン膜に対す
る非特異的結合について調べた。 膜の処理 ポール・バイオダイン（Poll Biodyne）Ａ［米
国、ニユーヨーク州、グレン・コーブのポール・
コーポレーシヨン（Poll Corporation）から入手
される］は孔径1.2μｍ及び付加された陽イオン基
及び陰イオン基を有するナイロン膜である。15cm2
の大きさの上記膜の小片を室温にて１時間、アル
カリ処理されたサケ精子DNA50μl／mlを含む14
×SSPE2mlと接触させた。次いてこの膜を風乾
し、減圧下80℃にて５時間ベークした。膜をハイ
ブリツト形成反応溶液３ml中55℃で17時間インキ
ユベートした。次にこれをSDS0.1％を含む１×
SSPE5ml中で30分間インキユベートした。 ニトラン（Nytran）［米国、ニユーハンプシヤ
ー州、キーンのシユレイチヤー・アンド・シユエ
ル社（Schleicher and Schuell）製］は、DNA
及び蛋白質の両者にとつてのトランスフアー媒体
として用いられる変性ナイロン−66製の膜であ
る。この膜は付加されたカチオン性基を有する。
蒸留水中で湿潤しせめ、次いで６×SSPE中に30
分間浸漬させることにより模擬（mock）ハイブ
リツト形成のための試料を作成した。この膜を減
圧下65℃にて２時間ベークし、ハイブリツト形成
反応溶液中に55℃にて17時間インキユベートし
た。 バイオダインＡ膜及びニトラン膜に対する酸素複
合体の非特異的結合の測定 上記膜を0.5cm角に切断し、それぞれをPBS／
BSA／トウイーン／EDTA150μlと共に室温にて
60分間振とうした。次いで、膜をリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl2で２度（各0.5ml）す
すんだ。これらを表示した希釈のβ−ガラクトシ
ダーゼ−抗マウスIgGまたはβ−ガラクトシダー
ゼ−ストレプトアビジン複合体を含むリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl2150μlと共に１時間振
とうした。膜を、HaCl0.5モルを含むリン酸塩／
BSA／トウイーン／MgCl20.5mlで１度次いで５
分間づつ振とうしながら２度洗浄した。 膜と結合した酸素を、MgCl21ミリモル及び７
−β−ガラクトシル−３−［３−ジメチル−アミ
ノプロピルカルボキシアミド］クマリン0.8ミリ
モルを含むPH7.4の50mMリン酸ナトリウム250μl
中、25℃で30分間インキユーベートして測定し
た。インキユベーシヨンの最後にMgCl21ミリモ
ルを含むPH7.4の50mMリン酸ナトリウム緩衝液
1.5mlを加えて蛍光を記録した。また、希釈され
たβ−ガラクトシダーゼ複合体の酸素活性を測定
し、膜と接触した酸素の量に対する膜と非特異的
に結合した酸素の割合を算出した。結果を下記に
示す。
【表】
【表】
非特異的結合率は、β−ガラクトシダーゼ複合
体の濃度に殆んど比例して増加している。 以上が本発明の詳細な説明及び実施例である。
明らかに、本発明の精神及び範囲から逸脱しない
限り、多くのその他の変種及び変形を作成するこ
とが可能である。
体の濃度に殆んど比例して増加している。 以上が本発明の詳細な説明及び実施例である。
明らかに、本発明の精神及び範囲から逸脱しない
限り、多くのその他の変種及び変形を作成するこ
とが可能である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 核酸を、アミジン残基に誘導されたアミド基
を有するナイロンから成る固体支持体と接触させ
る工程を含むことを特徴とする核酸を固定化する
方法。 ２ ナイロンを、そのアミド基が活性化するよう
に処理し、かつアミンと反応させて該アミジン残
基を導入する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 活性化工程及びアミン反応工程を、無水条件
下で行う特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ アミンがジアミンであり、したがつてアミジ
ン残基がアミノ側鎖を有する特許請求の範囲第２
項記載の方法。 ５ ジアミンが炭素原子数２〜12のα，ω−アル
カンジアミンである特許請求の範囲第４項記載の
方法。 ６ 所定の塩基配列を有する固定化すべき核酸を
ナイロン支持体と結合させた後、該支持体に非特
異的核酸を接触させて、該支持体上の前記核酸と
の未結合部位を飽和させる特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ７ 固体支持体がビーズの形状である特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ８ 核酸がDNAである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ９ 核酸がRNAである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 １０ アミジン残基に誘導されたアミド基を有す
るナイロンから成る固体支持体と、これに結合し
た核酸から成ることを特徴とする固定化核酸。 １１ 核酸が、非共有結合により固体支持体と結
合した特許請求の範囲第１０項記載の固定化核
酸。 １２ ナイロン中の複数のアミド基が、次式： （式中、Ｒはアルキレン基、フエニレン基、アル
キルフエニレン基又はフエナルキレン基を表わ
し；Ｘは対イオンを表わす）で示されるアミノア
ミジン残基に誘導されている特許請求の範囲第１
０項記載の固定化核酸。 １３ Ｒが炭素原子数２〜12の線状アルキレン基
である特許請求の範囲第１２項記載の固定化核
酸。 １４ Ｒが線状ヘキシレン基である特許請求の範
囲第１２項記載の固定化核酸。 １５ 固体支持体がビーズの形状である特許請求
の範囲第１０項記載の固定化核酸。 １６ 核酸がDNAである特許請求の範囲第１０
項記載の固定化核酸。 １７ 核酸がRNAである特許請求の範囲第１０
項記載の固定化核酸。 １８ (a) 試料を、測定すべき配列に対して実質
的に相補性の、少なくとも１の一重鎖塩基配列
を有する固定化ポリヌクレオチドプロープと接
触させる工程；及び (b) 得られたハイブリツドを、ハイブリツドと結
合する標識化結合性試薬と接触させることによ
り測定する工程 から成り、前記固定化プローブは、アミジン残基
に誘導されたアミド基を有するナイロンから成る
固体支持体と結合していることを特徴とする、試
料中の特定のポリヌクレオチド配列を測定する方
法。 １９ プローブが、非共有結合により固体支持体
と結合している特許請求の範囲第１８項記載の方
法。 ２０ 固体支持体がビーズの形状である特許請求
の範囲第１８項記載の方法。 ２１ プローブがDNAから成る特許請求の範囲
第１８項記載の方法。 ２２ プローブがRNAから成る特許請求の範囲
第１８項記載の方法。 ２３ 得られたハイブリツドが、ポリヌクレオチ
ドプローブとは抗原的に異り、標識試薬が、一重
鎖核酸に対するよりもハイブツリド二重鎖体に対
して選択性を有する抗体試薬から成る特許請求の
範囲第１８項記載の方法。 ２４ 抗体試薬が、抗DNA・RNA性又は抗
RNA・RNA性である特許請求の範囲第１８項記
載の方法。 ２５ プローブが、標識化結合試薬と選択的に結
合している特定の結合性リガンドで標識されてい
る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２６ リガンドがビオチン又はハプテンであり、
結合試薬がそれぞれアビジン又は抗ハプテン抗体
である特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７ 結合試薬が酵素で標識されている特許請求
の範囲第１８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/781,332 US4806546A (en) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | Immobilization of nucleic acids on derivatized nylon supports |
| US781332 | 1985-09-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6281565A JPS6281565A (ja) | 1987-04-15 |
| JPH0516838B2 true JPH0516838B2 (ja) | 1993-03-05 |
Family
ID=25122380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61225059A Granted JPS6281565A (ja) | 1985-09-30 | 1986-09-25 | 核酸を変性ナイロン支持体に固定化する方法、これにより固定化された核酸及び試料中のポリヌクレオチド配列を測定する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4806546A (ja) |
| EP (1) | EP0221308B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6281565A (ja) |
| CA (1) | CA1288709C (ja) |
| DE (1) | DE3666707D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0281390B1 (en) * | 1987-03-02 | 1994-06-22 | Gen-Probe Incorporated | Polycationic supports for nucleic acid purification, separation and hybridization |
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