JPH05176770A - 遺伝子発現プロモーター - Google Patents
遺伝子発現プロモーターInfo
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- JPH05176770A JPH05176770A JP3167340A JP16734091A JPH05176770A JP H05176770 A JPH05176770 A JP H05176770A JP 3167340 A JP3167340 A JP 3167340A JP 16734091 A JP16734091 A JP 16734091A JP H05176770 A JPH05176770 A JP H05176770A
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- Japan
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- gene
- lymphocytes
- promoter
- cells
- gene expression
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 小川型コレラ菌リポ多糖に対する単クローン
抗体を産生するハイブリドーマからＤＮＡを抽出し、制
限酵素で消化断片化した後、ＤＮＡ断片を分離する。免
疫グロブリン重鎖可変領域ＤＮＡ断片（ＶＨ構造遺伝
子）の上流に位置するＤＮＡ領域から当該プロモーター
塩基配列が分離される。 【効果】 当該プロモーター塩基配列を用いて培養細胞
を発現させることにより、クローン化した遺伝子あるい
は構造を改変した遺伝子を用いた生理活性物質の生産に
広く利用することができる。
抗体を産生するハイブリドーマからＤＮＡを抽出し、制
限酵素で消化断片化した後、ＤＮＡ断片を分離する。免
疫グロブリン重鎖可変領域ＤＮＡ断片（ＶＨ構造遺伝
子）の上流に位置するＤＮＡ領域から当該プロモーター
塩基配列が分離される。 【効果】 当該プロモーター塩基配列を用いて培養細胞
を発現させることにより、クローン化した遺伝子あるい
は構造を改変した遺伝子を用いた生理活性物質の生産に
広く利用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な遺伝子発現プロ
モーターの構造および当該プロモーターを用いた培養細
胞の遺伝子発現方法に関するものであり、クローン化し
た遺伝子あるいは構造を改変した遺伝子を用いた生理活
性物質の生産に広く利用することができる。
モーターの構造および当該プロモーターを用いた培養細
胞の遺伝子発現方法に関するものであり、クローン化し
た遺伝子あるいは構造を改変した遺伝子を用いた生理活
性物質の生産に広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子操作技術の進歩により、真核細胞
の遺伝子を大腸菌などの原核細胞中で発現させ、その遺
伝子産物を生産させることが行なわれている（Setlow,
j. k.et al. ed. Genetic Engineering: Principle a
nd Methods, vol. 7, PlenumPublish Corporation, 1
985）。微生物を用いた動物細胞遺伝子産物の生産は単
一のペプチド鎖からなる比較的単純な蛋白質の生産には
有効であるので今後もいくつかの生理活性物質の生産に
利用されていくものと思われるが、糖蛋白質をはじめと
する複合蛋白質の生産に用いることはかなりの困難を伴
う。高等動物で生理活性を示す物質の多くは糖蛋白質で
あり、その糖鎖は比活性および安定性、あるいは特異性
の付与に関係している（小野寺一清、細胞培養技術、杉
野幸夫編、講談社、ｐ５１、１９８５）。活性蛋白質の
生合成過程で起こる修飾は、高等動物と下等微生物では
大きく異なつている。従つて、高等動物細胞中で目的生
理活性物質を産生せしめることの方が望ましい。ウイル
スやクローン化遺伝子のプロモーターを用いて培養動物
細胞中で遺伝子発現を行ない、遺伝子産物を得る事は技
術的には確立しつつある。しかし、発現量は十分ではな
い。
の遺伝子を大腸菌などの原核細胞中で発現させ、その遺
伝子産物を生産させることが行なわれている（Setlow,
j. k.et al. ed. Genetic Engineering: Principle a
nd Methods, vol. 7, PlenumPublish Corporation, 1
985）。微生物を用いた動物細胞遺伝子産物の生産は単
一のペプチド鎖からなる比較的単純な蛋白質の生産には
有効であるので今後もいくつかの生理活性物質の生産に
利用されていくものと思われるが、糖蛋白質をはじめと
する複合蛋白質の生産に用いることはかなりの困難を伴
う。高等動物で生理活性を示す物質の多くは糖蛋白質で
あり、その糖鎖は比活性および安定性、あるいは特異性
の付与に関係している（小野寺一清、細胞培養技術、杉
野幸夫編、講談社、ｐ５１、１９８５）。活性蛋白質の
生合成過程で起こる修飾は、高等動物と下等微生物では
大きく異なつている。従つて、高等動物細胞中で目的生
理活性物質を産生せしめることの方が望ましい。ウイル
スやクローン化遺伝子のプロモーターを用いて培養動物
細胞中で遺伝子発現を行ない、遺伝子産物を得る事は技
術的には確立しつつある。しかし、発現量は十分ではな
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来法の生
産性の悪い欠点を改善するため、縣濁状態での高密度培
養が容易なＢリンパ球あるいはＢリンパ球系ガン細胞を
遺伝子導入の宿主として用い、生産性の向上を図ること
を目的とするものである。また、Ｂリンパ球で大量に生
産される免疫グロブリン遺伝子プロモーターを遺伝子発
現に利用することにより、効率のよいかつ工業化可能な
方法で、天然の生理活性物質と同一のものを生産せしめ
ることを目的とするものである。
産性の悪い欠点を改善するため、縣濁状態での高密度培
養が容易なＢリンパ球あるいはＢリンパ球系ガン細胞を
遺伝子導入の宿主として用い、生産性の向上を図ること
を目的とするものである。また、Ｂリンパ球で大量に生
産される免疫グロブリン遺伝子プロモーターを遺伝子発
現に利用することにより、効率のよいかつ工業化可能な
方法で、天然の生理活性物質と同一のものを生産せしめ
ることを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明の構成は、以下の１〜３の技術的手段か
ら成つている。
るための本発明の構成は、以下の１〜３の技術的手段か
ら成つている。
【０００５】１．デオキシリボ核酸塩基配列
【化２】ＡＡＣＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＣＣ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴ
ＴＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＡＴ
ＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧ
ＧＡＴＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧ
ＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＧＡＣＴ
ＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＣＴＧＡ
ＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡ
ＧＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＡＴＧＴＡ
ＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴ
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ＴＴＧＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣ
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ＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧ
Ｇ
【０００６】２．前記１記載の塩基配列あるいはその部
分配列を任意のベクターに連結し、遺伝子導入に使用す
ることを特徴とする培養細胞の遺伝子発現方法。
分配列を任意のベクターに連結し、遺伝子導入に使用す
ることを特徴とする培養細胞の遺伝子発現方法。
【０００７】３．培養細胞がＢリンパ球あるいはガン化
Ｂリンパ球であることを特徴とする前記２記載の培養細
胞の遺伝子発現方法。 発明者は自然界に存在する病原菌のうち、コレラ菌のリ
ポ多糖が動物体内に侵入した際に多量かつ均一な抗体が
産生されることを発見した。この抗体蛋白質の重鎖遺伝
子を単離し、構造を解明した。この遺伝子の発現調節領
域の構造であるプロモーターは、Ｂリンパ球で下流の構
造遺伝子を多量に発現するのに好都合なものであつた。
本発明はこの二つの知見に基ずいている。このデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列と抗体遺伝子μ鎖構造遺伝
子の上流に存在するエンハンサー配列を横ならびに連結
した発現増強配列を作製した。この構造を核外遺伝子と
して挙動する牛乳頭腫ウイルスを骨格とするベクターに
さらに連結導入し、酵素活性を指標に定量することが可
能なベータガラクトシダーゼを発現の試験遺伝子とし
て、発現量を試験した。その結果、この発現増強構造
は、Ｂリンパ球で下流に存在する構造遺伝子を強く発現
維持することが判明した。この発現増強構造をリンホカ
インの一つであるインターロイキン２遺伝子に連結し
て、発現せしめることができた。
Ｂリンパ球であることを特徴とする前記２記載の培養細
胞の遺伝子発現方法。 発明者は自然界に存在する病原菌のうち、コレラ菌のリ
ポ多糖が動物体内に侵入した際に多量かつ均一な抗体が
産生されることを発見した。この抗体蛋白質の重鎖遺伝
子を単離し、構造を解明した。この遺伝子の発現調節領
域の構造であるプロモーターは、Ｂリンパ球で下流の構
造遺伝子を多量に発現するのに好都合なものであつた。
本発明はこの二つの知見に基ずいている。このデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列と抗体遺伝子μ鎖構造遺伝
子の上流に存在するエンハンサー配列を横ならびに連結
した発現増強配列を作製した。この構造を核外遺伝子と
して挙動する牛乳頭腫ウイルスを骨格とするベクターに
さらに連結導入し、酵素活性を指標に定量することが可
能なベータガラクトシダーゼを発現の試験遺伝子とし
て、発現量を試験した。その結果、この発現増強構造
は、Ｂリンパ球で下流に存在する構造遺伝子を強く発現
維持することが判明した。この発現増強構造をリンホカ
インの一つであるインターロイキン２遺伝子に連結し
て、発現せしめることができた。
【０００８】この発明の発現調節領域の構造であるプロ
モーターは、データベース検索の結果、他の抗体蛋白質
の重鎖遺伝子プロモーターと構造類似性を有するもの
の、本発明に於てのみ利用された、過去に報告の無い唯
一のものであつた。また、本発明のＢリンパ球は、生体
から採取した正常細胞でも、ガン化したＢリンパ球でも
よく、特にガン化したＢリンパ球は無血清培養も容易で
当該プロモーターを用いた生理活性物質生産に適してい
る。当該プロモーターの下流に賦し、発現せしめる遺伝
子は、遺伝子産物に細胞毒性が無いかぎり、その種類を
問わない。
モーターは、データベース検索の結果、他の抗体蛋白質
の重鎖遺伝子プロモーターと構造類似性を有するもの
の、本発明に於てのみ利用された、過去に報告の無い唯
一のものであつた。また、本発明のＢリンパ球は、生体
から採取した正常細胞でも、ガン化したＢリンパ球でも
よく、特にガン化したＢリンパ球は無血清培養も容易で
当該プロモーターを用いた生理活性物質生産に適してい
る。当該プロモーターの下流に賦し、発現せしめる遺伝
子は、遺伝子産物に細胞毒性が無いかぎり、その種類を
問わない。
【０００９】
【発明の効果】本発明により、懸濁状態でかつ無血清培
養の可能なＢリンパ球腫瘍で高等動物生理活性物質を生
産することができる。
養の可能なＢリンパ球腫瘍で高等動物生理活性物質を生
産することができる。
【００１０】
【実施例】次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説
明する。 実施例１．当該プロモーターを含む遺伝子領域の単離と
構造解析。 小川型コレラ菌リポ多糖にたいする単クローン抗体を産
生するハイブリドーマ４種からＤＮＡを抽出し、制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化断片化したのち、免疫グロブリンＪ
Ｈ遺伝子断片をプローブとしてサザン法（Southern, E.
M., Detectionof specific sequences among DNA
fragments separated by gelelectrophoresis, J.
Mol. Biol.,98, 503-517,1975 ）により遺伝子の再構成
パターンを解析すると、９．２キロ塩基対のサイズを示
す再構成遺伝子が検出される。このサイズＤＮＡ断片を
精製し、ラムダフアージsharon４Ａにクローン化した。
明する。 実施例１．当該プロモーターを含む遺伝子領域の単離と
構造解析。 小川型コレラ菌リポ多糖にたいする単クローン抗体を産
生するハイブリドーマ４種からＤＮＡを抽出し、制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化断片化したのち、免疫グロブリンＪ
Ｈ遺伝子断片をプローブとしてサザン法（Southern, E.
M., Detectionof specific sequences among DNA
fragments separated by gelelectrophoresis, J.
Mol. Biol.,98, 503-517,1975 ）により遺伝子の再構成
パターンを解析すると、９．２キロ塩基対のサイズを示
す再構成遺伝子が検出される。このサイズＤＮＡ断片を
精製し、ラムダフアージsharon４Ａにクローン化した。
【００１１】約２０万のフアージクローンをスクリーニ
ングし、２個の遺伝子断片を単離した。この断片には、
Ｊ５５８フアミリーと称されるグループに属する免疫グ
ロブリン重鎖可変領域遺伝子断片（ＶＨ）が含まれてお
り、このＶＨは他の小川型コレラ菌リポ多糖に対する抗
体でも同一のものが発現に使われていることが判明し
た。その遺伝子地図を図１に示した。ＶＨ構造遺伝子の
上流にはＣＡＴＣＴ，ＣＴＣＡＴＧ，ＡＴＧＣＡＡＡ
Ｔ，ＴＡＡＡＴＡＴＡ，ＴＡＴＡなどの、プロモーター
領域によく見つかる構造やＢリンパ球に於ける組織特異
的発現に関わる配列が見つかつた。
ングし、２個の遺伝子断片を単離した。この断片には、
Ｊ５５８フアミリーと称されるグループに属する免疫グ
ロブリン重鎖可変領域遺伝子断片（ＶＨ）が含まれてお
り、このＶＨは他の小川型コレラ菌リポ多糖に対する抗
体でも同一のものが発現に使われていることが判明し
た。その遺伝子地図を図１に示した。ＶＨ構造遺伝子の
上流にはＣＡＴＣＴ，ＣＴＣＡＴＧ，ＡＴＧＣＡＡＡ
Ｔ，ＴＡＡＡＴＡＴＡ，ＴＡＴＡなどの、プロモーター
領域によく見つかる構造やＢリンパ球に於ける組織特異
的発現に関わる配列が見つかつた。
【００１２】実施例２．当該プロモーターとエンハンサ
ーの連結 小川型コレラ菌リポ多糖にたいする単クローン抗体を産
生するハイブリドーマ４種からＤＮＡを抽出し、制限酵
素BamHI で部分消化したＤＮＡ断片のゲノム遺伝子ライ
ブラリーをsharon２８フアージを用いて作製し、免疫グ
ロブリン重鎖ＪＨ遺伝子断片をプローブとして約２０万
個をスクリーニングした結果、図２に示す遺伝子クロー
ンを単離した。このうち、制限酵素XbaIで消化される
１．１キロ塩基対のＤＮＡ断片（エンハンサーを含むこ
とが公知）をXbaIリンカーを結合した当該プロモーター
HindIII-NcoI断片と連結した。その後、当該プロモータ
ー５’末端を介してそでに報告されている牛乳頭腫ウイ
ルスを骨格とするベクターBMGneo（Karasuyama, H. and
Melchers, F. Eur.J. Immunol., 18, 97-104, 1988
）のメタロチオニンプロモーターを除外したXbaI部位
に連結した後、平滑末端化した３’部位にSalIリンカー
を連結した。
ーの連結 小川型コレラ菌リポ多糖にたいする単クローン抗体を産
生するハイブリドーマ４種からＤＮＡを抽出し、制限酵
素BamHI で部分消化したＤＮＡ断片のゲノム遺伝子ライ
ブラリーをsharon２８フアージを用いて作製し、免疫グ
ロブリン重鎖ＪＨ遺伝子断片をプローブとして約２０万
個をスクリーニングした結果、図２に示す遺伝子クロー
ンを単離した。このうち、制限酵素XbaIで消化される
１．１キロ塩基対のＤＮＡ断片（エンハンサーを含むこ
とが公知）をXbaIリンカーを結合した当該プロモーター
HindIII-NcoI断片と連結した。その後、当該プロモータ
ー５’末端を介してそでに報告されている牛乳頭腫ウイ
ルスを骨格とするベクターBMGneo（Karasuyama, H. and
Melchers, F. Eur.J. Immunol., 18, 97-104, 1988
）のメタロチオニンプロモーターを除外したXbaI部位
に連結した後、平滑末端化した３’部位にSalIリンカー
を連結した。
【００１３】実施例３．当該プロモーターを用いた異種
遺伝子の発現 実施例２で作製した当該プロモーターとエンハンサー下
流に大腸菌ベータガラクトシダーゼ遺伝子（HaeII-HaeI
I 断片）を定法に従い連結挿入し、２ｍＭリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．２）に浮遊した細胞にエレクトロポ
レーシヨン法（４ｋＶ／ｃｍ、細胞密度１０7 個／ｍ
ｌ、３パルス、パルス幅：２０マイクロ秒、エレクトロ
ポレーター：ＢＴＸ社、アメリカ合衆国）で導入し、２
日間、薬剤Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）でＲＰＭＩ１
６４０／１０％牛胎児血清培養液で培養した後、細胞を
回収し、１０6 個／ｍｌの細胞密度で２ｍＭリン酸緩衝
生理食塩水（ｐＨ７．２）に再浮遊した後、終濃度１０
μＭのフルオレツセン-di-ベーターガラクトピラノシド
で1 分間染色した。
遺伝子の発現 実施例２で作製した当該プロモーターとエンハンサー下
流に大腸菌ベータガラクトシダーゼ遺伝子（HaeII-HaeI
I 断片）を定法に従い連結挿入し、２ｍＭリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．２）に浮遊した細胞にエレクトロポ
レーシヨン法（４ｋＶ／ｃｍ、細胞密度１０7 個／ｍ
ｌ、３パルス、パルス幅：２０マイクロ秒、エレクトロ
ポレーター：ＢＴＸ社、アメリカ合衆国）で導入し、２
日間、薬剤Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）でＲＰＭＩ１
６４０／１０％牛胎児血清培養液で培養した後、細胞を
回収し、１０6 個／ｍｌの細胞密度で２ｍＭリン酸緩衝
生理食塩水（ｐＨ７．２）に再浮遊した後、終濃度１０
μＭのフルオレツセン-di-ベーターガラクトピラノシド
で1 分間染色した。
【００１４】この細胞液に１０μｇ／ｍｌの終濃度でプ
ロピジウムアイオダイドを加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベク
トンデイツキンソン社）で死細胞を除外した条件下で蛍
光測定した。また、マウス正常リンパ球については、細
胞表面マーカーと光散乱特性を指標にＦＡＣＳｔａｒ
（ベクトンデイツキンソン社）を用いて分別し、遺伝子
導入細胞として用いた。導入遺伝子の細胞あたりの数は
遺伝子増幅法（Erlich,H. A., PCR Technology, Stockt
on Press, 1989）によつた。大腸菌ベータガラクトシ
ダーゼ遺伝子センス５’およびアンチセンス３’末端２
０マーを合成し、プライマーとして用いた。
ロピジウムアイオダイドを加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベク
トンデイツキンソン社）で死細胞を除外した条件下で蛍
光測定した。また、マウス正常リンパ球については、細
胞表面マーカーと光散乱特性を指標にＦＡＣＳｔａｒ
（ベクトンデイツキンソン社）を用いて分別し、遺伝子
導入細胞として用いた。導入遺伝子の細胞あたりの数は
遺伝子増幅法（Erlich,H. A., PCR Technology, Stockt
on Press, 1989）によつた。大腸菌ベータガラクトシ
ダーゼ遺伝子センス５’およびアンチセンス３’末端２
０マーを合成し、プライマーとして用いた。
【００１５】その結果、マウス正常リンパ球のうち細胞
表面免疫グロブリン陽性のＢリンパ球で８から１１蛍光
ユニツト／コピー、非Ｂリンパ球細胞では、２ユニツト
／コピー以下であつた。例外として、骨髄顆粒球細胞で
５ユニツト／コピーの活性が確認された。この結果によ
り、当該プロモーターを用いた異種遺伝子の発現にＢリ
ンパ球が適していることが判明した。Ｂリンパ球腫瘍を
用いて同様の試験を行なうと、Ｓｐ２／０細胞２３ユニ
ツト／コピー、ＮＳ−１細胞で１７ユニツト／コピー、
Ｐ３ＵＩ細胞で１１ユニツト／コピー，Ｘ６３Ａｇ８−
６５３細胞で４ユニツト／コピーの値を示し、細胞株の
種類により、発現量が異なることが判明した。このこと
は、異種遺伝子の発現量の高い細胞株を効率のよい生産
の目的で選択することができることを意味している。
表面免疫グロブリン陽性のＢリンパ球で８から１１蛍光
ユニツト／コピー、非Ｂリンパ球細胞では、２ユニツト
／コピー以下であつた。例外として、骨髄顆粒球細胞で
５ユニツト／コピーの活性が確認された。この結果によ
り、当該プロモーターを用いた異種遺伝子の発現にＢリ
ンパ球が適していることが判明した。Ｂリンパ球腫瘍を
用いて同様の試験を行なうと、Ｓｐ２／０細胞２３ユニ
ツト／コピー、ＮＳ−１細胞で１７ユニツト／コピー、
Ｐ３ＵＩ細胞で１１ユニツト／コピー，Ｘ６３Ａｇ８−
６５３細胞で４ユニツト／コピーの値を示し、細胞株の
種類により、発現量が異なることが判明した。このこと
は、異種遺伝子の発現量の高い細胞株を効率のよい生産
の目的で選択することができることを意味している。
【００１６】実施例４．当該プロモーターを用いたイン
ターロイキン２の産生 実施例３と同様の方法で、大腸菌ベータガラクトシダー
ゼ遺伝子の替わりに、マウスインターロイキン２（ＩＬ
２）ｃＤＮＡ遺伝子（５６３塩基対のＰｓｔＩ−Ｓｓｐ
Ｉ断片）を連結し、ＳＰ２／０細胞を用いて発現させ
た。遺伝子導入後、４日目に培養上清中のＩＬ２量を測
定した。測定は、アマシヤム社のＩＬ２測定キツトを用
いた放射免疫法によつた。産生されたＩＬ２の量は遺伝
子導入細胞１０7 個あたり、２．７μｇであつた。当該
プロモーターとエンハンサーの替わりにメタロチオネン
プロモーターを用いた時の産生量を比較すると、ＣｄＣ
ｌ2 （５μＭ）誘導時で、０．５μｇ／１０7 細胞であ
つた。
ターロイキン２の産生 実施例３と同様の方法で、大腸菌ベータガラクトシダー
ゼ遺伝子の替わりに、マウスインターロイキン２（ＩＬ
２）ｃＤＮＡ遺伝子（５６３塩基対のＰｓｔＩ−Ｓｓｐ
Ｉ断片）を連結し、ＳＰ２／０細胞を用いて発現させ
た。遺伝子導入後、４日目に培養上清中のＩＬ２量を測
定した。測定は、アマシヤム社のＩＬ２測定キツトを用
いた放射免疫法によつた。産生されたＩＬ２の量は遺伝
子導入細胞１０7 個あたり、２．７μｇであつた。当該
プロモーターとエンハンサーの替わりにメタロチオネン
プロモーターを用いた時の産生量を比較すると、ＣｄＣ
ｌ2 （５μＭ）誘導時で、０．５μｇ／１０7 細胞であ
つた。
【００１７】
配列番号：１ 配列の長さ：３４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：１．．３４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００１８】
【化３】 AACTGTGTTA CAGTGGGGGC CACTGTCTCA AGGATGCAAA TCTTTTTAGT GCACAGGCTC 60 TAATGTTACA TCTATAGCCT CAACACAAAG TTCAGGGATG AGGTATGTAG GTATGAGGAT 120 GAATTTCCAC AGAGAAGATT AGGACTGGGG CTTCAGAATC CTGATTCCTG ACCCAGGTGT 180 CCCTTCTTCT CCAGCAGGAG TAGGTGTTCA TCTAATATGT ATCCTGCTCA TGAATATGCA 240 AATCCTCTGA ATCTACATGG TAAATATAGG TTTGTCTATA CCACAAACAG AAAAACATGA 300 GATCACAGTT CTCTCTACAG TACTGAGCAC ACAGGACCTC ACCATGG 347
【００１９】
【図１】小川型コレラ菌リポ多糖と反応する抗体重鎖可
変部遺伝子の構造。 白ヌキの長方形部分は、当該プロモーターの領域を示
す。黒くぬりつぶした長方形部分は、免疫グロブリン重
鎖可変領域の構造遺伝子を意味する。各アルフアベツト
は制限酵素の切断部位を意味する。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｈｃ：ＨｉｎｃＩＩ，Ｎ：Ｎｃｏ
Ｉ，Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｓｔ：ＳｓｔＩ，Ｃ：ＣｌａＩ，
Ｂ：ＢａｍＨＩ。
変部遺伝子の構造。 白ヌキの長方形部分は、当該プロモーターの領域を示
す。黒くぬりつぶした長方形部分は、免疫グロブリン重
鎖可変領域の構造遺伝子を意味する。各アルフアベツト
は制限酵素の切断部位を意味する。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｈｃ：ＨｉｎｃＩＩ，Ｎ：Ｎｃｏ
Ｉ，Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｓｔ：ＳｓｔＩ，Ｃ：ＣｌａＩ，
Ｂ：ＢａｍＨＩ。
【００２０】
【図２】小川型コレラ菌リポ多糖と反応する抗体重鎖遺
伝子の構造 白ヌキ、黒ぬりつぶしの長方形は、図１と同様であり、
アルフアベツトは、制限酵素切断部位を意味する。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂ：ＢａｍＨＩ，Ｘ：ＸｂａＩ，
Ｒ：ＥｃｏＲＩ，Ｘｈ：ＨｈｏＩ。
伝子の構造 白ヌキ、黒ぬりつぶしの長方形は、図１と同様であり、
アルフアベツトは、制限酵素切断部位を意味する。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂ：ＢａｍＨＩ，Ｘ：ＸｂａＩ，
Ｒ：ＥｃｏＲＩ，Ｘｈ：ＨｈｏＩ。
【図３】本発明の遺伝子発現プロモーターの塩基配列。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年９月２８日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】削除
Claims (3)
- 【請求項１】 デオキシリボ核酸塩基配列 【化１】ＡＡＣＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＣＣ
ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴ
ＴＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＡＴ
ＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧ
ＧＡＴＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧ
ＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＧＡＣＴ
ＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＣＴＧＡ
ＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡ
ＧＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＡＴＧＴＡ
ＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴ
ＣＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＧＴ
ＴＴＧＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣ
ＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＧＴ
ＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧ
Ｇ であらわされる遺伝子発現プロモーターの構造。 - 【請求項２】 請求項１記載の塩基配列あるいはその部
分配列を任意のベクターに連結し、遺伝子導入に使用す
ることを特徴とする培養細胞での遺伝子発現方法。 - 【請求項３】 培養細胞がＢリンパ球あるいはガン化Ｂ
リンパ球であることを特徴とする請求項２記載の培養細
胞の遺伝子発現方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3167340A JPH05176770A (ja) | 1991-04-26 | 1991-04-26 | 遺伝子発現プロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3167340A JPH05176770A (ja) | 1991-04-26 | 1991-04-26 | 遺伝子発現プロモーター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176770A true JPH05176770A (ja) | 1993-07-20 |
Family
ID=15847920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3167340A Pending JPH05176770A (ja) | 1991-04-26 | 1991-04-26 | 遺伝子発現プロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05176770A (ja) |
-
1991
- 1991-04-26 JP JP3167340A patent/JPH05176770A/ja active Pending
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