JPH06506356A

JPH06506356A - 所望のタンパク質を高レベルに発現させる組換え宿主細胞の選別法

Info

Publication number: JPH06506356A
Application number: JP4508181A
Authority: JP
Inventors: コーエン，ジャスタス・ビー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: JP3438889B2; DE69231676D1; ES2153358T3; AU1580692A; ATE199023T1; DE69231676T2; AU660671B2; WO1992017566A2; EP0724639A1; CA2104598A1; DK0724639T3; WO1992017566A3; EP0724639B1; GR3035599T3; CA2104598C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】所望のタンパク質を高レベルに発現させる組換え宿主細胞の選別性発明の背景生きている宿主細胞にＤＮＡを機能的な形態で導入する方法の発見は多くの基本的な生物学的過程を理解するための手掛かりを提供すると共に、重要なタンパク質または他の分子を商業的に有用な量で生産することを可能にした。

そのような遺伝子移送法の一般的な成功にもかかわらず、所望のタンパク質をコ・−ド化する遺伝子が宿生細胞中に導入されてその中で発現する効率を制限し得る、いくつかの一般的な課題が存在する。１つの問題は遺伝子がいつ成功裏に受容細胞中に移送されたかを知ることである。第２の問題は、その遺伝子を含有する細胞と、移送操作には耐えたけれどもその遺伝子を含有していない細胞とを識別することである。第３の問題は、その遺伝子を含有し、その遺伝子によってコード化されているタンパク質を高レベルに発現させる細胞を同定し、単離することである。

一般に、真核細胞中に遺伝子を導入する既知の方法は非常に効率が悪いという傾向がある。ある与えられた培養中の細胞のうち、外部から加えられたＤＮＡを取り込み、それを発現させる細胞の比率はわずかに過ぎず、ＤＮＡを安定に保持する細胞の比率はさらに低い。

所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子を組み込んでいる細胞の同定は、多くの場合、一般に選択可能遺伝子と呼ばれるもう１つの遺伝子であって選択可能なタンパク質をコード化する遺伝子を同じ細胞中に導入することによって達成される。選択可能なタンパク質は選択した特定の培養条件下で宿主細胞の成長または生存にとって必要なタンパク質であり、例えば抗生物質や他の薬剤に対する耐性を付与する酵素あるいは宿主細胞の代謝的または異化的な欠損を補う酵素である。例えば、真核細胞と共に一般に使用される選択可能遺伝子にはアミノグリコンド・ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＩまたはｎｅｏ）、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈ　ｙ　ｇ）、ジヒドロフオレート・レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジン・キナーゼ（ｔｋ）が含まれる。

選択可能なタンパク質をコード化する第２の組み込まれた遺伝子の宿主細胞による発現に基づいである遺伝子を組み込んでいる宿主細胞を同定する方法は同時トランスフェクション（もしくは同時形質転換）と呼ばれている。この方法では所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子と選択可能遺伝子が同時に宿主細胞に導入される。生成物遺伝子と選択可能遺伝子は、宿主細胞中に導入される前に、単一のＤＮＡ分子上に存在してもよいし、別個のＤＮＡ分子上に存在してもよい。

ウィグラーら、Ｃｅ１ｌ　１６：７７７（１９８９）。次に、選択可能遺伝子がコード化する選択可能なタンパク質を合成する細胞のみが成長または生存できる条件下で培養を行うことによって、選択可能遺伝子を組み込んでそれを発現させている細胞を同定または単離する。典型的な場合、このようにして同定または単離された細胞の多（の中に生成物遺伝子が存在し、それが発現される。

真核宿主細胞中に導入された遺伝子の発現レベルは、遺伝子のコピー数、転写）効率、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のプロセシング、安定性および翻訳効率を含む複数の因子に依存する。したがって所望の遺伝子の高レベルな発現は典型的な場合、上記因子の１またはそれ以上の最適化を必要とするであろう。

例えば、高い転写レベルを与える「強力な」プロモーターまたはエンハンサーに遺伝子のコード領域を共有結合させることによってタンノくり質の生産レベルを増大させることができる。プロモーターとエンハンサーは転写に関与する宿主細胞中のタンパク質と特異的に相互作用するヌクレオチド配列である。フレイガ− 。

＋１ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ、　１８５＋５１２（１９９０）　：マニアテイスら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７（１９８７）。プ■ モーターは遺伝子のコード配列の上流に位胃するヌクレオチド配列であり、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写を容易にする。高レベル発現のための強力なプロモーターとして知られている真核プロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター、マウス・メタロチオネイン＝■プロモーター、ラウス肉腫ウィルス長末端反復およびヒト・サイトメガ口ウイルス（ＣＭＶ）主要即時初期プロモーターなどがある。

エンハンサ−は連結したプロモーターからの転写を刺激する。エンハンサーは実際にはプロモーターと物理的および機能的に重複し得るのであるが、プロモーターとは異なり、転写開始部位の下流やプロモーターからかなり離れた所に位置していても活性である。例えば、上に挙げた強力なプロモーターはすべて強力なエンハンサ−をも含有しティる。ベンディグ、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　７：９１（アカデミツク・プレス、　１９８ｇ）。

宿主細胞中の遺伝子のコピー数を増大させることによってタンノくり質の生産レベルを増大させることもできる。高い遺伝子コピー数を得るための一方法は、例えば同時トランスフェクション中に選択可能遺伝子に対して大モル過剰の生成物遺伝子を用いることによって、宿主細胞中に複数コピーの遺伝子を直接導入することである。カウフマン、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５＋５３７（１９９０）。しかし、この方法では生成物遺伝子を高いコピー数で含有する細胞の比率は同時トランスフェクションされた細胞の一部に過ぎず、そのような細胞を、より少ないコピー数の生成物遺伝子を含有する大部分の細胞と識別するための一般的に適用可能な便利な方法は存在しないので、所望の高コピー数トランスフエクタントを同定するためには面倒で時間のかかるスクリーニング法を必要とするのが通例である。

高い遺伝子コピー数を得るためのもう１つの方法には、宿主細胞中で自律的に複製することができるベクター中に遺伝子をクローニングすることが含まれる。

そのようなベクターの例には、エプスタイン−バー・ウィルスまたは牛ノくピローマウイルスから誘導される哺乳類発現ベクターおよび酵母２ミクロンプラスミドヘクターカ含マレル。ステイーヴンおよびヘンチェル、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２４８：１（１９８７）　；イエーツら、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１２（１９８５）　；ベッグス、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２：１７５（アカデミツク・プレス、　１９８１）。しかしそのようなベクターの制御されない複製は細胞の生存能と相いれないし、制御された複製はベクターのコピー数を制限するので、この方法の有用性には限界がある。さらに、自律的な複製は（おそらく転写のレベルで）遺伝子の発現を妨害することが示されている。

レブコウスキーら、　Ｎａｔｕｒｅ３１７：１６９（１９８５）。

高い遺伝子コピー数を得るためのさらにもう１つの方法には、宿主細胞中での遺伝子増幅が含まれる。真核細胞中で自然に起こる遺伝子の増幅の頻度は比較的低い。シムケ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：５９８９（１９８８）。

しかし宿主細胞を適当な選択圧にさらすことによりて、遺伝子の増幅を誘発するか、もしくは少なくとも選択することもできる。例えば多くの場合、生成物遺伝子を選択可能で増幅可能な標識遺伝子と共に宿主細胞に導入し、次いで、同時トランスフェクションされた細胞を徐々に濃度が増大する選択剤にさらすことによって、その標識遺伝子の増幅について選択することができる。典型的な場合、生成物遺伝子はそのような条件下で標識遺伝子と同時に増幅されるであろう。

この目的に最も広く使用されている選択可能で増幅可能な標識遺伝子はＤＨＦＲ遺伝子である。ＤＨＦＲ遺伝子に関連して用いられる選択剤はメトトレキセート（Ｍｔｘ）である。所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションし、Ｍｔｘを含有する培養培地中でその細胞を一次培養することによってトランスフエクタントを同定する。野生型ＤＨＦＲ遺伝子を使用する場合に好適な宿主細胞はＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系であり、この細胞系はウルラウブおよびチェイシン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７７：４２１６（１９８０）に記述されているように調製され、増殖される。次に、トランスフエクタント細胞を逐次的に増大する量のＭｔｘにさらす。これはＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーとそれに付随する生成物遺伝子の複数コピーの合成を導く。シムケ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、、　Ｃｈｅ＋＋、　２６３：５９８９（１９８ｇ）　；アクセルら、米国特許第４３９９２１６号：アクセルら、米国特許第４６３４６６５号。

ＤＨＦＲＨＦ法を他の細胞型に拡張するために、メトトレキセートに対する感受性が減少しているタンパク質をコード化する突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を、正常な数の内因性野生型ＤＨＦＲ遺伝子を含有している宿主細胞と組み合わせて使用することができる。シモンセンおよびレビンソン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０：２４９５（１９８３）。別法として、生成物遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子およびｎｅｏ’遺伝子などの優性選択可能遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションすることができる。

キムおよびウォルド、Ｃｅ１ｌ　４２：１２９（１９８５）。ネオマイシン（または関連する薬剤Ｇ４１８）を含有する培養培地中で細胞を一次培養することによってトランスフェクタントを同定し、次いで、そのようにして同定されたトランスフェクタントを逐次的に増大する量のＭｔｘにさらすことによって、ＤＨＦＲ遺伝子と生成物遺伝子の増幅について選択する。

この議論から理解されるであろうように、高レベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞の選択は一般に多段階工程である。第１段階では、生成物遺伝子と選択遺伝子を組み込んでいる一次トランスフヱクタントを選択する。以降の段階では、この−次トランスフエクタントを選択可能遺伝子の高レベル発現に関するさらなる選択に付し、次いで生成物遺伝子の高レベル発現に関する無作為スクリーニングに付す。高レベルの所望のタンパク質を発現させている細胞を同定するためには、典型的には多数のトランスフエクタントをスクリーニングする必要がある。トランスフェクタントの大部分は最大レベルより少ない所望のタンパク質を生産する。

このような組換え宿主細胞を一段階で直接的に選択するいくつかの方法が記述されている。例えばある方法では、生成物遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションし、高濃度のＭｔｘを含有する培地中で直接培養することによって高レベルのＤＨＦＲを発現させる細胞を選択する。この方法で選択された細胞の多（は同時トランスフェクションされた生成物遺伝子をも高レベルで発現させる。ページおよびシンデンハム、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：６４（１９９１）。もう１つの方法には、転写される領域の５゛末端に生成物遺伝子を含有し、３゛末端に選択可能遺伝子を含有するポリシストロン性ｍＲＮＡ発現ベクターの使用が含まれる。ポリシストロン性ｍＲＮＡの３°末端にある選択可能遺伝子の翻訳は充分でないので、このようなベクターは所望の遺伝子の優先的翻訳を示し、選択を生き残るために高レベルのポリシストロン性ｍＲＮＡを必要とする。カウフマン」ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ、　、　１８５：４８７（１９９０）　：カウフマン、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５　：５３７（１X９０）　：カウフマンら、ＥＭＢＯＪ、　６：１８７（１９８７）。したがって、特定の選択可能遺伝子と組み合わせて使用するのに適した選択剤を含有する培地中で一次トランスフェクタントを培養することにより、所望のタンパク質生成物を高レベルで発現させる細胞を一段階で得ることができる。

残念ながら、これらの既知の一段階選択法はそれらの有用性を制限するいくつかの欠点を持っている。高レベルの選択剤を含有する培地中で直接培養することによって得られる高発現細胞は乏しい成長性と安定性を有することがあり、それゆえに長期間の生産工程に対するそれらの有用性には制限がある。ページおよびシンプル７　：／、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：６４（１９９１）。Ｍｔｘに対する高レベルの耐性に関する一段階選択は、増幅された遺伝子を含有する細胞ではなくて、むしろ変化したＭｔｘ−耐性ＤＨＦＲ酵素を伴う細胞か、あるいは変化したＭｔｘ輸送特性を有する細胞を生産することがある。ハーバ−ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５６：９５０１（１９８１）：アサラフおよびシムケ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４ニア１５４（１９８７）。ポリシストロン性ベクターの場合には、３′選択可能遺伝子の発現について選択した時に、５゛生成物遺伝子の欠失または再配置に関する強い選択が起こる。５゛生成物遺伝子中にそのような突然変異を有するベクターを保持する細胞はその集団中で他の細胞とよりも早く成長し、それゆえに高レベルの所望のタンパク質を実際に発現させる細胞の選択を妨害する傾向がある。カウフマン、　Ｉｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　１８５：５３７（１９９０）。

したがって、組換え宿主細胞における所望のタンパク質生成物の高レベル発現を獲得する方法であって、高濃度のＭｔｘや他の選択剤に細胞をさらす必要のない方法、あるいは自律的に複製するベクターまたはポリシストロン性ｍＲＮＡ発現ベクターの使用を必要としない方法を提供することが本発明の１つの目的である。高レベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を選択する方法であつて、迅速かつ便利に実施することができ、多数の細胞をスクリーニングする必要がない方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。高レベルの所望のタンパク質生成物を発現させる組換え宿主細胞の新しい一段階選択法を提供することが本発明のもう１つの目的である。

したがって本発明は、高レベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞の選択法であって、数多くの様々な真核宿主細胞にとって有用であり、現行の細胞選択技術に固有の問題を回避する改善された方法を提供する。

発明の要約本発明は、高レベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を選択するための改善された方法に関する。本発明の方法では、出発選択可能遺伝子の転写される領域中に、対応するｍＲＮＡ前駆体から低い効率でそのイントロンが正しくスプライスされるような長さのイントロンを挿入することによって、該出発選択可能遺伝子を修飾する。その結果として、イントロンで修飾された遺伝子から生産される選択可能なタンパク質の量は出発選択可能遺伝子から生産されるものの１よりかなり少なくなる。

次いで宿主細胞をイントロンで修飾した選択可能遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子で同時トランスフェクションする。このような同時トランスフェクションの後では、得られたトランスフェクシントのほとんどが、トランスフェクタントにおいてイントロンで修飾された選択可能遺伝子から生産される比較的低いレベルの選択可能タンパク質の結果として、選択可能タンパク質の特徴である選択可能な表現型を示し得ないということが観測される。しかし驚くべきことに、それらのトランスフェクタントの一部は選択可能な表現型を示し、それらのトランスフェクタントの中では、大部分が生成物遺伝子によってコード化される所望のタンパク質を高レベルに発現させることが認められる。

図面の簡単な説明図４は、Ｒａ５２．２細胞を実施例２に記述するように同時トランスフェクションした後に得られたハイグロマイシン耐性（ｈｙｇつ、ネオマイシン耐性（ｎｅ。

つおよびハイグロマイノン／ネオマイシン耐性（ｈｙｇ’／ｎｅｏ’）細胞のコロニー数を示す。それぞれの異なるネオマイシン耐性遺伝子内に存在する合成イントロンの長さを示す。ネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクターの構築については実施例１に記述する。

図２は、様々な薬物耐性細胞培養によって生産されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のレベルを示す。Ｒａ５２．２細胞を実施例２に記述するようにベクターで同時トランスフェクションした。薬物耐性細胞培養から得られる培地中のｈＧＨのレベル（ｐ　ｇ／細胞）をＥＬＩ　ＳＡ放射線免疫検定法によって決定した。

図３は、実施例２に記述の如く、ｐＲＫ−ｈｙｇ、ｐＲ８Ｖ−ｂＧＨおよびｐＮｅｏｌ、Ｇ−７１もしくはｐＮｅｏｌ、Ｇ△ＳでトランスフェクションしたＲａ５２．２細胞の培養から得られた個々の細胞クローンに誹って生産されるｈＧＨのレベルを示す。

発明の詳細な説明一般に本発明の方法には、所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子とイントロンを含有する選択可能遺伝子で真核宿主細胞を同時トランスフェクションすることが含まれ、該イントロンは、その宿主細胞中で該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを、イントロンを含まない選択可能遺伝子と比較して減少させる。

イントロンは非コードヌクレオチド配列であり、多くの真核遺伝子内に正常に存在し、総合的にスプライシングと呼ばわる多段階の過程で、新たに転写されたｍＲＮＡ前駆体から除去される。

単一の作用機序が、哺乳類、植物および酵母細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの原因であると考えられている。一般にスプライシングの過程は、イントロンの５°末端と３°末端が正しく切断され、得られたｍＲＮＡの末端が正確に連結されて１、タンパク質合成にとって適切な読み枠を有する成熟したｍＲＮＡが生産されることを必要とする。

イントロンの切断が起こる位置をスプライス部位と呼ぶ。多数の異なる遺伝子中のスプライス部位を取り巻（ヌクレオチド配列を比較することによって、イントロンの各末端のスプライス部位に関する共通配列を定義することが可能になっている。この共通配列は、スプライス部位に対するそれぞれの位置に認められる最も一般的なヌクレオチドを特定するものである。例えば高等真核生物のｍＲＮＡでは、５゛スプライス位が共通配列ＡＧ　：ＧｔＪＡＡＧＵ（ここにコロン記号は切断と連結の部位を表す）内に現れ、３゛スプライス位が共通配列（Ｕ／Ｃ）、ＮＣＡＧ　：Ｇ内に現れる。酵母のｍＲＮＡでは、５′スプライス部位が共通配列：Ｇ　Ｕ　Ａ　Ｌｉ　Ｇ　Ｕによって限定されており、３°スプライス部位が共通配列（Ｃ／１Ｊ）ＡＧ：によって限定されている。オーンマおよびゴトー、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１９５＋２４７（１９８７）、バンエッｔ□ ら、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｂｅｗ＋、　５５：１１１９（＋９８６）　：　’７ウント、　Ｎｕｃ、Ａｅｉｄｓ@Ｒａｓ、　１０：４５９（１９８２）。

様々な天然に存在する突然変異遺伝子および合成的に構築した突然変異遺伝子の分析によって、５°および３゛スプライス位の共通配列内の多くの位置におけるヌクレオチド変化が、成熟し、たｒｎＲＮＡの合成を減少または停止させるという効果を持っていることが示されている。シャープ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５ニア６６（１９８７）　；バジェッ］・ら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５５：１１１９（１９８６）　ニゲリーン、　Ａｒ１ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、@２０：６７１（１９８６）ａスプライス部位を含むＲＮＡの二次構造がスプライシングの効率に影響を与え得ることも突然変異の研究によって明らかにされている。ゾルニック、Ｃｅ１ｌ　４３：６６７（１９８５）　；　：７ナルスカら、Ｃｅ１ｌ：２６５（１９８５）、。

、イントロンの長さもスプライシングの効率に影響を与え得る。ウサギベーターグロビン遺伝子の大きなイントロン内で異なるサイズの欠失突然変異を作成することによって、ライ−リンガらは正しいスプライシングに必要な最小のイントロンの長さが約６９ヌクレオチド（ｎｔｓ）であることを決定した。Ｃｅ１ｌ　３７：９１５（１９８４）。アデノウィルスＥＩＡ領域のイントロンに関する同様の研究は、約７８ｎｔｓのイントロン内が正しいスプライシングの発生を可能にするが、その効率が減少することを明らかにしている。イントロンの長さを９１ｎｔｓまで増大させると正常なスプライシング効率が回復したが、イントロンを６３ｎｔｓまで欠失させると正しいスプライシングが停止した。ウルフエンダールら、　Ｎｕｃ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：６２９９（１９８５）。

本発明はその態様の１つとして、高１ノベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もしくは単離する方法であって、次の段階からなる方法を提供する：（１）真核宿主細胞を、（ａ）天然に存在する選択可能遺伝子中には存在しないイントロンを含有するように修飾された選択可能遺伝子であって、該イントロンが該宿主細胞によってスプライシングされて選択可能タンパク質をコード化するメツセンジャーＲＮＡを与えることができ、該選択可能遺伝子中の該インＦ・ロンの存在が宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質の１ノベルを減少させる、選択可能遺伝子、および、（ｂ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、で同時トランスフェクションし、（２）得られたトランスフェクタントを、該選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養する。

本発明はもう１つの態様として、高レベルの所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もＩバは単離する方法であって、次の段階からなる方法を提供する。

（１）真核宿主細胞を、（ａ）第１の選択可能遺伝子、（ｂ）第２の選択可能遺伝子であって、天然に存在する選択可能遺伝子中には存在しないイントロンを含有するように修飾されており、そのイントロンは該宿主細胞中でスプライシングされて選択可能タンパク質をコード化するメツセンジャーＲＮＡを与える能力を有し、該選択可能遺伝子中の該イントロンの存在がその宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減少させる、選択可能遺伝子、および、（Ｃ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、で同時トランスフェクションし、（２）得られたトランスフェクタントを、第１の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養し、（３）段階（２）の選択を生き残りたトランスフェクシントを、第２の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養する。

本明細書で用いる用語「選択可能遺伝子」とは、選択した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長または生存にとって必要なタンパク質をコード化するＤＮＡを意味する。したがって選択可能遺伝子で形質転換された宿生細胞はある種の細胞培養条件下で成長または生存することができ、一方、トランスフェクションされなかった宿主細胞は成長または生存することができない。典型的な場合、選択可能遺伝子は薬物に対する耐性を付与するが、もしくは宿主細胞における代謝的または異化的欠損を補償するであろう。例えば一般に使用される選択遺伝子には、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＩまたはｎｅｏ）、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、ンヒドロフォレート・レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジン・キナーゼ（ｔｋ）の遺伝子が含まれる。

本明細書で使用する用語「選択可能タンパク質」とは、選択可能遺伝子によってコード化されているタンパク質を意味する。用語「選択可能な表現型」とは、選択可能遺伝子または選択可能タンパク質によって宿主細胞に付与される表現型を意味する。用語「選択剤」とは、特定の選択可能標識が欠損している宿主細胞の成長または生存を妨害する物質を意味する。例えば選択可能遺伝子がアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼをコード化している場合、好適な選択剤にはネオマイシンおよびＧ４１８が含まれる。選択可能遺伝子がハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコード化している場合、好適な選択剤はハイグロマイシンである。

本明細書で使用する用語「生成物遺伝子」とは、所望のタンパク質生成物をコード化するＤＮＡを意味する。本発明の方法は選択可能遺伝子ではない生成物遺伝子の高レベルな発現を得るのに特に適しているのであるが、宿主細胞中で発現することができる生成物遺伝子であればいずれも使用することができる。したがって生成物遺伝子によってコード化されるタンパク質は典型的には、選択した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長または生存に必要ではないタンパク質であろう。例えば生成物遺伝子は、抗体、ウィルス抗原、インターフェロンあるいは成長ホルモンをコード化してもよい。

選択可能遺伝子と生成物遺伝子はゲノムＤＮＡや、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡから得ることができ、またインビトロ合成によって得ることもできる。

例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからのそのような遺伝子の単離は、検出可能な部分（放射性同位体など）で標識されたＤＮＡハイブリッド形成プローブであって、相補的な塩基対形成によって所望の選択遺伝子または生成物遺伝子に優先的にハイブリッド形成することができるＤＮＡハイブリッド形成プローブを使用することによって都合よく達成される。ケラ−およびマナク、　ｒＤＮＡ　ＰｒｏｂｅＪの１４９〜２１３頁（１９８９）。別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて適当なウィルス供給源、細胞供給源または組織供給源の核酸内に存在するそのような遺伝子を増幅することによって、所望の選択可能遺伝子または生成物遺伝子を得ることもできる。同時トランスフェクシヨンの際にイントロンで修飾された選択可能遺伝子に対して大モル過剰の生成物遺伝子を使用することができるように、本発明の方法で使用する生成物遺伝子と、イントロンで修飾された選択可能遺伝子は、別個のＤＮＡ分子であることが好ましい。

本明細書で使用する用語「イントロン」とは、ある遺伝子の転写される領域内もしくはメツセンジャーＲＮＡ前駆体内に存在する核酸配列であって、翻訳に先立って宿主細胞によってそのメツセンジャーＲＮＡ前駆体から摘出または「スプライシング」され得るヌクレオチド配列をいう。本発明での使用に適したイントロンは、天然に存在する核酸からの精製や新規（デノボ）合成などの当該技術分野でよく知られている数種類の方法のいずれかによって調製することができる。天然に存在する数多くの真核遺伝子中に存在するイントロンが同定され、特徴づけられている。マウントＮｕｃ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１０：４５９（１９８２）。機能的なスプライス部位を含む人工的なイントロンも記述されている。ライニーら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９：３２９（１９８９）　ニガターマンら、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ、　９：１５２６（１９８９）。

例えば適当な制限エンドヌクレアーゼによる天然に存在する核酸の消化や、イントロンの５′末端および３゜末端にある配列に相補的なプライマーを用いるＰＣＲクローニングによって、天然に存在する核酸からイントロンを得ることができる。別法として、限定された配列と長さのイントロンを有機化学の様々な方法を用いて合成的に調製することもできる。ナラングら、　１ｉｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８：９０（１９７９）　：カルサースら、　１ｌｅｔｈ、　ＥｎｚｙｍｏｌB １５４：（１９８５）　：フレーターら、　Ｎｕｃ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：５３９９（１９８６）。

本明細書で使用する用語ｒＰＣＲＪおよび「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、米国特許第４６８３１９５号（１９８７年７月２８日発効）に記述されているインビトロ増幅法を意味する。一般的にＰＣＲ法には、増幅すべき核酸配列を含む鋳型核酸に優先的にハイブリッド形成することができる２つのＤＮＡプライマーを用いるプライマー伸長合成のサイクルの繰り返しが含まれる。全ゲノムＤＮＡ、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、ウィルスまたはプラスミドＤＮＡから特定のＤＮＡ配列をクローン化するためにＰＣＲ法を使用することができる。ワンプおよびマーク、　ｒＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＪの７０〜７５頁（アカデミツク・プレス、１９９０）、シャルフ、　ｒＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＪの８４〜９８頁；カワサキおよびワンプ、　ｒＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪの８９〜９７頁（ストックトン・プレス、１９８９）。

核酸をインビトロで修飾するための様々な既知の方法のいずれかを用いて、正常時にはその選択可能遺伝子内に存在しないイントロンを含有するように選択可能遺伝子を修飾することができる。典型的な場合、まず正常時にＲＮＡに転写される選択可能遺伝子の領域内で、制限エンドヌクレアーゼを用いて選択可能遺伝子を切断し、次いで得られた制限断片を、例えばＤＮＡリガーゼ酵素を用いる連結（ライゲーション）によって、宿主細胞発現にとって正しい向きでイントロンに共有結合させる。

本発明において有用であるためには、選択可能遺伝子中に導入されるイントロンが、イントロンで修飾された選択可能遺伝子の宿主細胞内における発現レベルを、修飾されていない選択可能遺伝子と比較してかなり減少させるような長さでなければならない。好ましくは、イントロンが、そのイントロンのスプライシングを停止させることなく、選択可能タンパク質をコード化する成熟したｍＲＮＡの合成が可能であるような最小限の長さを有するであろう。多少の増減は考え得るものの、典型的な場合には、選択可能遺伝子中に導入されるイントロンは５０ないし８０ｎｔｓの長さを有するであろう。

生成物遺伝子の高レベルな発現を得るために、特定の宿主細胞中の特定の選択可能遺伝子内でどの大きさのイントロンが最適であるかを予め正確に予測することは困難であるので、異なる大きさのイントロンの何らかのスクリーニングが必要になることは理解されるであろう。しかし一旦適切な大きさのイントロンを決定すれば、本発明の方法でそれを通例の如（使用することにより、いかなる所望のタンパク質の高レベル発現をも得ることができる。イントロンの長さは、そのイントロンの長さを１または数（好ましくは１０未満）ヌクレオチド長だけ増大させた時に得られる一次トランスフエクタントの数と比較して、そのイントロンで修飾された選択可能遺伝子によってコード化される選択可能タンパク質の選択可能な表現型特性を示す一次トランスフェクタントが相対的に少ない数で得られるような長さであるべきである。

異なる長さのイントロンを調製することは簡単な問題であり、それらには新規（デノボ）合成や現存のイントロンのインビトロ欠失突然変異導入などの当該技術分野でよく知られている方法が含まれる。同様に、異なる長さのイントロンによって修飾された選択可能遺伝子を含有する様々な宿主細胞における生成物遺伝子の発現レベルを決定することも簡単な問題であり、それらには分析的ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ検定法または放射線免疫検定法などの当該技術分野でよく知られている分析法が含まれる。

本明細書で使用する用語「発現」とは、宿主細胞内で起こる転写または翻訳を意味する。宿主細胞内での生成物遺伝子の発現レベルは、その細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量か、もしくは生成物遺伝子によってコード化され、その細胞によって生産されるタンパク質の量に基づいて決定することができる。例えば生成物遺伝子から転写されたｍＲＮＡをノーザンハイブリッド形成によって定量することができる。サムプルツクら、　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＩＪ、７．３〜７．５７頁（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、１９８９）。生成物遺伝子によってコード化されるタンパク質は、そのタンパク質の生物学的活性を検定するか、もしくはそのような活性とは無関係な検定法（そのタンパク質と反応することができる抗体を用いるウェスタンブロッティングや放射線免疫検定法など）によって定量することができる。サムプルツクら、「蓋ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ　、　１８．１〜１８．８８頁（コールド−スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、１９８９）。

遺伝子の転写には、それが選択可能遺伝子であるか、イントロンで修飾された選択可能遺伝子であるか、あるいは所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子であるかにかかわりなく、発現のために使用する特定の宿主細胞中で機能的なプロモーターにその遺伝子が機能可能に連結している必要がある。遺伝子は、それがあるプロモーターの制御下でＲＮＡに転写され得る場合に、そのプロモーターに機能可能に連結しているという。

哺乳類宿主細胞中での使用に適したプロモーターにはＳＶ４０初期プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター、マウス・メタロチオネイン−■プロモーター、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウィルス主要即時初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウィルスＬＴＲプロモーターおよび単純庖疹ウィルス・チミジンキナーゼプロモーターが含まれる。サムプルツクら。

ｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ　、　１６．５〜１６．２６頁（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、１９８９）；ベンディグ、　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　７・９１（アカデミツク・プレス、１９８８）。植物宿主細胞での使用に適したプロモーターには、オクトピン・シンターゼ（ＯＣＳ）およびツバリン・シンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子並びに３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターが含まれる。リヒテンシュタインおよびフラー、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：１０４（アカデミツク・プレス、１９８７）。酵母宿主細胞での使用に適したプロモーターはホスホグリセレート・キナーゼ（ｐｇｋ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、アルコール・デヒドロゲナーゼ（ａ　ｄ　ｈ）および他の解糖系遺伝子のプロモーターが含まれる。キンスマンおよびキンゲスマン、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　７６−８３頁（ブラックウェル・サイエンティフィク・パブリケーションズ、１９８８）。

本明細書で使用する用語「トランスフェクション」および「同時トランスフェクション」とは、一般に核酸を宿主細胞中に導入する過程をいう。真核宿主細胞中に遺伝子を導入するために様々な方法が知られている。これらの方法のうちで最も一般的使用される方法には細胞中へのＤＮＡの直接的な移送が含まれる。例えばリン酸カルシウム沈殿物またはＤＥＡＥデキストランの存在下で細胞をＤＮＡにさらすことによって哺乳類細胞中にＤＮＡを導入することができる。ケオウンら、　１ｌｅｔｈ、　ＥｎｚｙＩＩｏｌ、　１８５　：５２７（１９９０）。哺乳類細胞とは対照的に、酵母と植物細胞は激しい化学的処理や物理的処理に対して比較的耐性な厚い壁によって取り囲まれており、これが多くの小分子の取り込みを阻害する。したがってそのような細胞中にＤＮＡを導入する方法は、典型的にはその第１段階として、その細胞壁のいくらかを除去することによる、酵母または植物細胞の、それぞれスフェロプラストまたはプロトプラストへの変換を伴う。次に、そのスフェロプラストまたはプロトプラストをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でＤＮＡにさらすことによって、その細胞中にＤＮＡを導入する。ヒンネンら、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

７５：１９２９（１９７８）。ピールボルテら、　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　５：２３５（１９８４）　；ポトリカスら。

１１ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９９　：　１６９（１９８５）。別法として、酢酸リチウムで処理しておいた無傷の酵母細胞中にＤＮＡを導入することもできる。ステアルンスら、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ。

１、　ｔ８５：２８０（１９９０）。

真核細胞中に遺伝子を導入する他の方法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または組換えウィルスによる感染を伴う方法など、当該技術分野でよく知られている。カウフマン、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５：４８７（１９９０）　；ケオウンら、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５：５２７（１９９０）　；リヒテンシュタインら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：１０４（アカデミツク・プレス、１９８７）。

上述の如（イントロンを含有するように修飾された選択可能遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子による同時トランスフェクションの後、特定の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で宿主細胞を培養する。

好適な栄養培地と細胞培養法は当該技術分野でよく知られている。シェルマン、Ｍｅｔｈ、　ＥｎｚｙＩＩｏｌ、　１９４＋３（１９９１）　；　７ザー、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５：５６７（１９９０）　FべＩレリンおよびボーデ、　ｒＢａｓｉｃ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ中の１３３〜１７７頁（ＶＣＨパブリッシャーズ、１９８７）。イントロンの大きさが適切に選択されたとすれば、そのような一段階選択の結果として数個の一次トランスフェクタントが得られ、それらの−次トランスフエクタントは生成物遺伝子の高レベル発現に関して都合よく検定される。

別法として、異なる選択可能遺伝子をコード化する２つの選択遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクション後、第１の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で細胞を培養し、個々の一次トランスフエクタントを選択する。次いで、これらの−次トランスフェクタントを第２の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で培養する。ここに第２の選択可能遺伝子は上述のごとくイントロンによって修飾されている。図２に示すように、この二段階選択法によれば、上述の一段階選択法の場合に可能であったレベルよりかなり高い生成物遺伝子の発現レベルを得ることが可能であり得る。

したがって本発明の教示によれば、１）宿主細胞中でその選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質の量を減少させるイントロンによって修飾された選択可能遺伝子で同時トランスフェクションされた宿主細胞であって、２）その後に選択可能遺伝子を欠（宿生細胞の成長または生存を許さない選択条件下で成長または生存することができる宿主細胞、を発現のために使用することにより、所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子の高レベルな発現が得られる。

したがって本発明の方法は、工業、農業および医薬分野における多くの異なるタンパク質の生産に有用であり、天然の供給源からは制限された量しか入手することができないタンパク’ｊｉｔ（例えば成長ホルモン、インターフェロン、神経栄養性因子、ＤＮａｓ　ｅ、エリスロボエチン、インヒビン、インスリン、リラクシンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質を含む）の生産にとりわけ有用である。本発明の組換え宿主細胞中で生産される所望のタンパク質は宿主細胞溶解液から回収することもできるが、好ましくは分泌されたタンパク質として細胞培養培地から回収されるであろう。いずれの場合にも、当該技術分野でよく知られている方法によって所望のタンパク質を他の宿主細胞タンパク質から精製して、実質上均一な所望のタンパク質の調製物を得ることができる。

以下の実施例は単に例示を目的とするものであって、本発明の限定を意図するものではない。

実施例１トランスフェクション用のベクターの構築１、ｐＳＶＥ、ｈｙｇＢ元々はプラスミドｐＬＧ９０（グリッツおよびディピース、Ｇｅｎｅ　２５：１７９（１９８３））中に得られた遺伝子であって、クレンら、Ｇｅｎｅ　５７：２１（１９８７）が記述しているように開始コドンの直前の配列に関して修飾が加えられている細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｒｈｙｇＢ」）を、２つの制限エンドヌクレアーゼ断片として単離した：該遺伝子の５゛部分を含有するＣＩａｌ−Ｐｓｔｌ断片および３°部分を含有するＰｓｔｌ−ＢａｍＨＩ断片。これらの断片を、プラスミドｐＭＬ−１（ラスキーおよびボッチャン、　Ｎａｔｕｒｅ　２８３＋７９（１９８１））中のＳＶ４０初期エンハンサ−／プロモーターおよびヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）ポリアデニル化（ポリ（Ａ））領域を含有する大きいＣ１ａｌ−ＢａｍＨＩ断片に同時に連結した。得られたベクターは、先行するＳＶ４０初期エンハンサ−／プロモーターと後続のＨＢＶ−ポリ（Ａ）領域を伴うｈｙｇＢ遺伝子を含有している。

２、ｐＲＫ、ｂｙｇｈＶｇＦ３ｒ−ド配列を含有すｐＳＶＥ、ｈｙｇＢのＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ−Ｂ　ａｍＨＩ断片に対して、ベクターｐＲＫ７（ＰＣＴ公開番号Ｗ０９０１０２７９８（１９９０年３月２２日公開））の大きいＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ−Ｂ　ａｍＨＩ断片を連結することによってベクターｐＲＫ、ｈｙｇを構築した。したがってｐＲＫ、ｂｙｇ中のｈｙｇＢ遺伝子の前方にはｐＲＫ７のエンハンサ−／プロモーターおよびイントロン領域が存在し、ｈｙｇＢ遺伝子の後方にはｐＲＫ７のＳＶ４０後期ポ１バＡ）領域が存在する。

３、ｐＲ８Ｖ−ｈＧＨこのベクターはラウス肉腫ウィルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来する転写調節配列の制御下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の完全なコード配列を含有する。

ｒ　ａ　ｓ　Ｐ、　ｈＧＨ（：＋−１ンおよびレビンソン、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：１１９（１９８ｇ））のｒａｓプロモーターをＲ３Ｖプロモーターで置換することによって、これを構築した。

４・旦￥１ニｐＭλリプラスミドｐＭＴ−ＵＭ２０はプラスミドｐＭＬ−１のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位の間にポリリンカー領域を含有する。プラスミドｐＵｃ１８（ノランダーら、Ｇｅｎｅ　２６：１０１（１０１（１９のポリリンカー領域を含有する中間体プラスミドｐＵＭ２０の小さいＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片にｐＭＬ−１の大きいＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を連結することによって、これを構築した。ｐＭＬ−ＵＭ２０中のポリリンカー領域の配列はそのＥｃｏＲＩ部位およびＨｉ　ｎ　ｄＩ／ＩＩ部位を含めて下記の通りである・５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴ−３’　［配列番号１コこの配列は制限エンドヌクレアーゼＳｍａ　Ｉ（ＣＣＣ／ＧＧＧ）、ＢａｍＨＩ（Ｇ／ＧＡＴＣＣ）、Ｓａ　Ｉ　Ｉ（Ｇ／ＴＣＧＡＣ）およびＸｈｏ　Ｉ（Ｃ／ＴＣＧＡＧ）にとっての認識部位を含有しており、これらを下記の構築で使用する（切断部位を「／」で示す）。

（以下余白）５、ｐｓＶ１６Ｂ、ｎｅ。

コノベクターは、先行するベクターｐｓＶ１６Ｂ５（１９９１年６月１３日ｉ：公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９１１０８２９１）のエンハンサ−／プロモーターおよびイントロン領域と、後続するＨＢＶポリ（Ａ）シグナルを伴う、修飾された細菌性ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｎ　ｅ　ｏ）遺伝子を含有する。これを下記の数段階で構築した。

ａ、中間体プラスミドｐＵＣ，ｎｅｏ３′の構築５ｐｈＩおよびＰｓｔｌ制限エンドヌクレアーゼでの消化によってプラスミドｐＵｃ１１９を直線化した後、これを、（ｉ）ｎｅｏコード領域の３′部分を含有するベクターｐＳＶＥ、ＮｅｏＢａ　１６（シーバーブら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア１（１９８４））のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＳｍａＩ断片と、（ｉｉ）ＨＢＶポリ（Ａ）領域を含有するベクターｐ３１１Ｅ（リウら）のＢａｍＨＩ−３ｐｈｌ断片に同時に連結させた。連結に先立って、ｐ３１１Ｅ由来の断片のＢａｍＨＩ付着末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて４種類すべてのデオキシリポヌクレオチドの存在下で補填することによって、ｐｓＶＥ、Ｎｅｏ１３ａ１６由来の断片のＳｍａＩによって生成した平滑末端に結合できるようにした。したがって、得られたｐＵＣ，ｎｅｏ３゜プラスミドは、ＰＵＣ１１９のポリリンカー内に挿入されたＨＢＶポリ（Ａ）領域とｎｅｏ遺伝子の３°末端から構成される。

ｂ、ｐｓＶｌ、６Ｂ、ｈｙｇの構築（ｉ）ベクターｐｓＶ１６Ｂ、ｔＰＡのエンハンサ−／プロモーターとイントロン領域を含有する該ベクターの５Ｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片と（ｕ）ｈｙｇＢコード配列を含有するｐｓＶ１６Ｂ、ｔＰＡのＨｉｎｄＩＩＩ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片を、（ｔｔｉ）Ｓ　ｓ　ｔ■と５ａｌＩでの消化によって直線化したｐｕｃ１１９に連結するという三部分連結によってこのベクターを構築した。Ｐｓｔｌ切断によって生じた５Ｖ１６Ｂ。

ｔＰＡ断片の３′突出末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて削除し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生じた５ｖ１６Ｂ、ｔｐＡの５°突出末端を補填することにより、これら２つの末端の平滑末端連結ができるようにした。このベクターは、ｐＵＣ１１９のポリリンカー領域内に挿入された５Ｖ１６Ｂエンハンサ−／プロモーターおよびイントロン領域とそれに続＜ｈｙｇＢコード配列およびそれに続＜ＨＢ■ポリ（Ａ）領域を含有する。

ｃ、５Ｖ１６Ｂ、ｎｅｏの構築（ｉ）ｐＵＣ，ｎｅｏ３’の大きいＳｓ　ｔ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片、（ｉｔ）ＳＶ１６Ｂｘンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域を含有するｐｓＶ１６Ｂ、ｈｙｇの５ｓｔｌ−Ｃ１ａｌ断片、および（ｆｆｌ）ｎｅｏ＝＋−ド配列の５′部分を含有するｐＳＶＥ、ＮｅｏＢａ１６のＣ１ａｌ−ＰｓｔＩ断片を連結することによって、このベクターを構築した。

５、ｐＮｅｏｌ、ＧベクターｐＮｅｏ１．Ｇは、ｎｅｏコード配列内にイントロンが存在するという点でｐｓＶ１６Ｂ、ｎｅｏと異なる。ｎｅｏ遺伝子の内部の短いＢａ１ｌ−Ｐｓｔｌ断片を例外としてｐｓＶ１５Ｂ、ｎｅｏのすべてを含有するｐｓＶ１６Ｂ、ｎｅｏの大きいＢａ　Ｉ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片を、下記のＰＣＲ法によって作成したイントロン含有ｎｅｏ断片に連結した。

ａ）ｎｅｏコード領域内の唯一のＰｓｔ１部位を取り巻く配列（転写されないＮａｔｕｒｅ　３３４：１１９（１９８８））中に認められるように、択一的なＨ −ｒＢＳＬり’／　ンＩ　ＤＸ（コーエンら、Ｃｅ１１５８：４６１（１９８９））に続くイントロンの５°末端配列からなる第１のブライ７−ｎｅｏ１３−５２９Ｇを調製した。ｎｅｏ１３−５２９Ｇプライマーの完全なヌクレオチド配列は、５−ＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴｇｔ　ａｇｇｔｃ　ｔ　ｃ　ｃ　ｃ　ｇ−３′　［配列番号２］である。ｎｅｏ配列を大文字で示し、Ｈ−ｒａｓ配列を小文字で示す。Ｐｓｔｌ認識配列に下線を付す。ｎｅｏ配列の最後の３ヌクレオチドが択一的なＨ−ｒａＳエクソンＩＤＸの最後の３ヌクレオチドに同一であることに注意すること。コーエンら、Ｃｅ１１５８：４６１（１９８９）。

ｂ）ＢａｌＩ切断部位とブライ７−ｎｅｏ！３−５２９Ｇ中のｎｅｏ配列の最後のヌクレオチドの間のｎｅｏ遺伝子の転写される鎖の配列と、それに続＜Ｈ−ｒａｓイントロンＤの３′末端の転写される鎖の配列からなる第２のプライマーｎｅｏ＋３−５６７を調製した。コーエンら、Ｃｅ１１．５８：４６１（１９８９）。ｎｅｏ１３−５６７プライマーの完全なヌクレオチド配列は、５’−ＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴｃｔｇｇｇａａａｇｇａｇｇｇａ　ｔｇｇｇａｔｃ−３′「配列番号３」である。ｎｅｏ配列を大文字で示し、Ｈ−ｒ　ａ　ｓ配列を小文字で示す。

Ｃ）ブライ７−ｎｅｏ１３−５２９０とｎｅｏ１３−５６７をｐｃＢ法で使用することにより、プラスミドｉ　Ｉ　ｅ　１２Ｎ（ＧＸココ−ンおよびレビンソン、　Ｎａｔｕｒｅ３３４：１１９（１９８８））（−７−エンら、Ｃｅ１１５８：４６１（１９８９）ではＩＩｅ１２（Ｇ）とも呼ばれている）のエクソン４（コーエンら、Ｃｅ１ｌ　５８：４６１（１９８９））とＩＤＸの間に位置するイントロンを増幅した。得られた増幅産物をＰｓｔｌによる部分的消化に付し、ｎｅｏコード配列内のＰｓｔｌ認識部位での切断によって生成した断片を電気泳動的な分画の後に、ポリアクリルアミドゲルから単離した。したがって、単離されたこの断片は、ｎｅｏ遺伝子のＰｓ　ｔ　■−Ｂａ　］　Ｉ断片内に挿入されたプラスミドｉ　Ｉ　ｅ　１２Ｎ（Ｇ）のＨ−ｒａｓ遺伝子中のＩＤＸに続（全イントロンＤ配列を含有する。

７、ｐＮｅｏ１３Ｇ△ＳこのベクターはｐＮｅｏｌｓＧのイントロン内部のＳｍａ　Ｉ断片（約３００ｎｔＳ）を欠（。ｐＮｅｏｌｘＧをＳｍａ　Ｉで消化した後、大きい方のＳｍａ　Ｉ断片を自己連結させることによって、これを構築した。

８、ｐＮｅｏｌｓＧ−６５このベクターはベクターｐＮｅｏ１３Ｇ中に存在するＨ−ｒａｓイントロンの中央部分を欠くが、該イントロンの５゛末端の１ｉｎｔｓと３′末端の５４ｎｔｓを保持している。（ｉ）ベクターｐＮｅｏｌｓＧの大きいＳｍａ　ｌ−３ｓ　ｔＩＩ断片を、（ｉｔ）Ｈ−ｒ　ａ　ｓイントロンの３′部分とそれに続（ｎｅｏおよびＨＢＶ配列を含有するベクターｐＮｅｏ１．Ａ（このベクターはイントロンのヌクレチド位置４におけるＧからＡへの置換を除いてｐＮｅｏｌｓＧと同一である）のＥｃｏＮＩ−８ｓｔＩＩ断片に連結して、イントロンの３−近位ＥｃｏＮ１部位と５゛−近位Ｓｍａ　１部位の間の配列を除去することによって、これを構築した。ＥｃｏＮＩ消化によって生成した５′突出末端を補填して、Ｓｍａ　Ｉ切断によって生成する平滑末端に連結できるようにした。

９、ｐＮｅｏｌｓＧ−１０１プラスミドｐＭＬ−ＵＭ２０のポリリンカー領域の部分をベクターｐＮｅｏ１３Ｇ−６５の６５ｎ　を長イントロンに加えて１０１ｎｔ長のイントロンを作成することにより、このベクターを構築した。ベクターｐＮｅｏｌｓＧの大きいＳｍａｌ−８ｓｔＩＩ断片を、ｐＭＬ−ＵＭ２０の消化によって生成した３６ｎｔ長のＳｍａｌ−Ｘｈｏｌ断片と、上述のｐＮｅｏｌ、Ａ由来のＥｃｏＮＩ−ＳｓｔＩＩ断片とに、同時に連結した。ＸｈｏＩ消化によって生成した５°突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。得られたプラスミドの１つｐＮｅｏ　１３Ｇ−１０１は、ｐＮｅｏｌｓＧ断片のＳｍａＴ部位に融合したポリリンカー領域の補填Ｘｈｏ１部位（これはＸｈｏ１部位を再生させた）と、ｐＮｅｏＩｓＡ断片の補填ＥｃｏＮＩ末端に融合したポリリンカー領域のＳｍａ　Ｔ生成末端とを有する。

１０、ｐＮｅｏ　１ｓＧ−７６ベクターｐＮｅｏ　！　、Ｇ−７６は７６ｎ　を長のイントロンを含有し、これはｐＮｅｏｌｓＧ−１０１内のｐＭＬ−０Ｍ２０由来のボ’Ｊ’）　ンカー領域ＣＩ）一部を削除することによってｐＮｅｏｌｓＧ−１０１から誘導された。ｐＮｅｏｌｓＧ−１０１の大きいＸｈｏ　ｌ−８ｓ　ｔＩＩ断片を、ｎｅｏ遺伝子とイントロンの３°部分を含有するｐＮｅｏｌ、Ｇ−１０１のＢａｍＨＩ−８ｓｔＩＩ断片に連結することによって、これを構築した。ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩによって生成した５゛突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。

１１、　ｐＮｅ　ｏ　Ｉ　３Ｇ−７２ｊベクターｐＮｅｏ１３Ｇ−７２＊は７２ｎ　を長のイントロンを含有し、これはｐＮｅｏｌｓＧ−１０１内のｐＭＬ−０Ｍ２０由来のポリリンカー領域の一部を欠失させることによって、ｐＮｅｏｌｓＧ−１０１から誘導された。ｐＮｅｏｌ、Ｇ−７２＊中に残存しているポリリンカーの部分は５’−ＧＡＴＣＣＣＣ−３’という配列を有する。ｐＮｅｏｌｘＧの大きいＳｍａ　ｌ−８ｓ　ｔＩＩ断片を、ｎｅｏ遺伝子とイントロンの３°部分を含有するｐＮｅｏｌｓＡ−１０１（このベクターはイントロンのヌクレオチド位置４におけるＧからＡへの置換を除いてｐＮｅｏｌｓＧ−１０１と同一である）のＢａｍＨｌ−８ｓｔｌＩ断片に連結することによって、このベクターを構築した。ＢａｍＨＩ切断によって生成した５°突出末端を補填することによって、Ｓｍａ　Ｉによって生成した平滑末端への連結を可能にした。

１２゜ｐＮｅ　ｏ　Ｉ　ａＧ−７２ベクターｐＮｅｏ１．Ｇ−７２も７２ｎ　を長のイントロンを含有するが、ｐＮｅｏｌ、Ｇ−７２＊のポリリンカー由来の配列が５°−ＴＣＧＡＧＴＣ−３’という配列で置換されている点でｐＮｅｏ　Ｉ、Ｇ−７２＊と異なる。このベクターを下記の通りに構築した。

ａ）画部分連結によって中間体ベクター１０．２８．９を作成した。その４断片は次の通りである。

ｉ、ＨＢＶポリ（Ａ）領域とｐｔＪｃ１１９配列を含有するｐＮｅｏｌｓＡ−１０１の大きいＥｃｏＲＩ−８ｓｔＩＩ断片。

ｆｆ、５Ｖ１６Ｂ由来のエンハンサ−／プロモーター、ｎｅｏ遺伝子の５°部分および１０１ｎｔ長のイントロンの５゛末端分を含有するｐＮｅｏｌ、Ａ−１０１のＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片。

ｆｆｉ、ｎｅｏ遺伝子とイントロンの３°部分を含有するｐＮｅｏ１３ＡのＥｃ。

Ｎ１−８ＳｔＩＩ断片。

汁０次の配列を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって得た合成りＮＡ断片：Ａ鎖：　５−ＴＣＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣ−３°　［配列番号４］Ｂ鎖：　５”−ＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣ［配列番号５］これらのオリゴヌクレオチドはアニーリングさせた時に、一端に５°−ＴＣＧＡという配列の５°突出部を残し、他端に１つのＧヌクレオチドという５°突出部を残すように設計された。これらの突出部はそれぞれＸｈｏｌ切断およびＥｃｏＮＩ切断によって生成する５゛突出末端に相補的である。

上記４断片の連結によって、８５ｎｔイントロンとイントロンの位置４におけるＧからＡへの置換を有するベクター１０．２８．９が生成した。このベクターは近接する２つのＸｈｏ１部位をイントロン内に含有している。１つはＸｈｏｌで生成した断片２の末端の、合成断片の５’ＴＣＧＡ突出部への連結によって再形成され、他方は合成断片内に含有される（下線部）。

ｂ）ｐＮｅｏｌｓＧ−１０１の大きいＸｈｏＩ−８ｓｔｌＩ断片を、ｎｅｏ遺伝子とイントロンの３°部分を含有する１０．２８．９のＸｈｏＩ−８ｓ　ｔＩＩ断片に連結することによってｐＮｅｏｌｓＧ−７２を構築した。この構築によりイントロンから内部Ｘｈｏｌ断片が除去されて、７２ｎｔ長のイントロンと、そのイントロンのヌクレオチド位置４におけるＡからＧへの置換とが生成する。

１３、ｐＮｅｏｌｓＧ−７１およびｐＮｅｏｌｓＧ−７０ｐＮｅｏ１．Ｇ−７２について上に概略を記したものと同じ手法によって、これらのベクターを構築した。しかし、それぞれの場合について、合成オリゴヌクレオチド配列がｐＮｅｏｌｓＧ−７２を構築するために使用したものとはわずかに異なった。中間体ベクター１０．２８．５を作成するためには、Ａ鎮が上記の配列の最後のヌクレオチドを欠き、Ｂ鎖が上記のＢ鎖配列の最初のヌクレオチドを欠いた。これは、この中間体ベクター１０．２８．５内の８４ｎｔ長のイントロンと、最終的なｐＮｅｏｌｓＧ−７１ベクター中の７１ｎｔイントロンをもたらした。同様に、上記Ａ鎖配列の最後の２ヌクレオチドを欠＜ＡＭオリゴヌクレオチドと、上記Ｂ鎖配列の第１と第３のヌクレオチドを欠くＢ鎖オリゴヌクレオチドを用いて、中間体ベクター１０．２８．１を作成した。これは、この中間体ベクター１０゜２８．１中の８３ｎ　を長のイントロンと、最終的なベクターｐＮｅｏＩｓＧ４０中の７０ｎｔ長のイントロンとをもたらした。

１４、ｐＮｅｏｌｓＧ−６９ベクターｐＮｅｏｌｓＧ−６９は６９ｎｔ長のイントロンを含有し、これはｐＮｅｏｌｓｃ；−１０１内のｐＭＬ−０Ｍ２０由来のポリリンカー領域の一部を削除することによッテ、ｐＮｅｏＩｓＧ−１０１から誘導された。ｐＮｅｏｌｘＧ −１０１の大きいＸｈｏＩ−８ｓｔＩＩ断片を、ｎｅｏ遺伝子とイントロンの３ °部分を含有するｐＮｅｏＩｓＡのＥ　ｃ　ｏＮ　Ｉ−８ｓ　ｔＩＩ断片に連結することによって、これを構築した。

リン酸カルシウム法（グラハムおよびファン・デル・ニブ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６（１９７３））によって、ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の形質転換Ｔ２４／ＥＪアレルを含有するプラスミドｐＴ２４−１０（ケイポンら、Ｎａｔｕｒｅ　３０２：３３（１９８３））でＲａ　ｔ−１細胞（シーバーブら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２ニア１（１９８４））を安定にトランスフェクションした。非選択培地中で２週間培養した後、接触阻害された細胞のバックグラウンドに対して現れる形質転換された細胞の中心を同定し、さらに増殖させ、低密度で軟寒天中に接種し、そこから、形質転換された細胞の個々のコロニーを単離した。比較的高い形質転換度を示した１つのコロニーをＲａ５２．２と命名した。

２、トランスフェクシヨンリン酸カルシウム法によって、１．４Ｘ１０’細胞あたりに表示した量の下記ＤＮＡを用いてＲａ５２．２細胞を正副１対でトランスフェクションした。

１、　０．５μｇのｐ　ＲＫ−ｈ　Ｙ　ｇ、および、２．１０．０μｇ（ＤｐＲ３Ｖ−ｈＧＨ−および、３、　２．０μｇの下記ＤＮＡのうちの１つ（イントロンで修飾されたネオマイシン耐性遺伝子を含有するネオマイシン耐性ベクター）：ａ）ｐＮｅｏｌ、Ｇ−７１ｂ）ｐＮｅｏＩｓＧ−７２ｃ）ｐＮｅｏ　ｌ５Ｇ−７２＊ｄ）ｐＮｅｏ　ｌ５Ｇ−７６ｅ）ｐＮｅｏ　１ｓＧ−１０１ｆ）ｐＮｅｏｌｓＧ−△Ｓ。

３、選択同時トランスフェクションした細胞を２日後に４００μｇ／ｍｌのネオマイシン類縁体Ｇ４１８か、もしくは２００μｇ／ｍ＋のハイグロマイシンを含有する培地（等体積のＤＭＥＭとＦ１２培地、５％牛脂児血清、２ｍＭグルタミン）に移し７、その後、２日毎に供給した。薬物にさらした２０日後に６４１８耐性コロニー（Ｇ４１８’）を計数し、さらなる培養のために貯蔵した。選択剤にさらした１０日後にハイグロマイシン耐性コロニー（ｈ　ｙ　ｇ　’）を計数し、さらなる培養のために貯蔵した。ｈ３’ｇ’貯蔵物中の細胞を１回継代し、３５０μ ｇ／ｍ１（ｐＮｅｏ１３Ｇ−７１またはｐＮｃｏ１３Ｇ−７２でトランスフェクションしたｈｙｇ’貯蔵物）もしくは４００μｇ／ｍ１（ｐＮｅｏ　１．Ｇ−７２＊、ｐＮｅｏＬｓＧ−７６、ｐＮｅｏ１３Ｇ４０１またはｐＮｅｏ１３Ｇ−△ Ｓでトランスフェクションした細胞のｈｙｇ’貯蔵物）の濃度の６４１８を含有する培地中に様々な密度で接種し、その後２ないし４日毎に供給した。Ｇ４１８にさらした２ないし４週間後に、得られたハイグロマイシン／Ｇ４１８耐性コロニー（ｈｙｇ’／Ｇ４１８）を計数し、さらなる培養のために貯蔵した。

図３は異なるネオマイシン耐性ベクターを用いて得られた薬物耐性コロニーの数を表（５，ている。このデータは最適な大きさのイントロ゛／が７１または７２ｎｔＳであることを示している。なぜならネオマイシン耐性遺伝子内にこれらの長さのイントロンを含有しているｐＮｅｏ１３Ｇ−７１、ｐＮｅｏ１３Ｇ−７２およびｐＮｅｏｌｓＧ−７２＊ベクターはＧ４１　ｓ’および１１）’ｇ’／Ｇ４１８’：＋ロ＝−を生じさせるが、ネオマイノン耐性遺伝子内に７６ｎｔ長のインｉ・ロンを含有するｐＮｅｏｌｓＧ−７６ベクターの場合と比較すると相対的にコロニーが少ないからである。

はぼ等しい細胞密度のＧ４１８、ｈｙｇ’およびｈｙｇ／Ｇ４１８耐性細胞を＄５８−メチオニンおよび５ｓＳ−システィンで代謝的に放射線標識し、その後、上清タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルで分析することによって、細胞培養上清中に存在するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ＞のレベルを決定した。

さらに、ポリクローナル抗ｈＧＨ抗体を用いるＥＬＩＳＡ放射線免疫検定法によって、細胞培養上清中のｈＧＨのレベルを決定した。薬物耐性細胞の貯蔵物を微量滴定培養プレートの各ウェルあたり１．５Ｘ１０’細胞の密度で接種し、密集成長させた。次に細胞を収集し、計数し、その細胞培養上清（調整培地）を検定した。図２は、同時トランスフェクションされた異なる細胞型のそれぞれについて、細胞培養上清中のｈＧＨの計算された量を細胞あたりに基づいて示すものであるられる細胞培養上清中の免疫反応性のｈＧＨの量（ＥＬＩＳＡによって決定したもの）を、そのウェルから回収された細胞の数で割ることによって得た。

最適な大きさのイントロンが７１または７２ｎｔｓであるという先の決定と合致して、図２のデータは最も高いレベルのｈ（、Ｉ（が、ｐＮｅｏｌｓＧ−７１、ｐＮｅｏｌｓＧ−７２またはｐＮｅｏ　１３Ｇ−７２＊ベクターで同時トランスフェクションされた細胞によって生産されることを示している。

ｐＮｅｏｌ　３Ｇ−７１もしくはｐＮｅｏ１３Ｇ−△ＳでトランスフェクションされたＧ４１８耐性細胞の貯蔵物を１０ｍｍ組織培養皿中に極めて低い密度で接種した。個々のコロニー（クローン）を単離し、１世代増殖させた後、各クロー〉・から細胞を収集し、５Ｑｍｍ組織培養皿あたり４Ｘ１０’細胞の密度で接種した。数時間後、３５５−メブーオニンと３５５−システィンで細胞を代謝的に放射線標識し、その後、上演タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）− ポリアクリルアミトゲルートで分析することにより、細胞培養上清中に存在するヒト成長ホルモン（ｌＩＧ　）ｉ　）の１ノベルを決定しまた。

さらに、個々のクローンによって生産されるｈＧＨのレベルを、ポリク［１）− →−ル抗ｉｉ　Ｇ　Ｈ抗体を用いるＥＬＩＳＡ放射線免疫検定法によ一ンて決定しゾこ。各クローンから得た細胞を微量滴定細胞培養ブ１．ノー１・の各ウェルあたり］、、５Ｘ１０’細胞の密度で接種し、密集成昇させｔ−１次に細胞を収集し、計数し、細胞上清（調整培地）を検定し７た３、図３は分析した異なるクローンのそれぞれにつＬＮて、細胞の数、細胞培養上清中のｈＧＨの量（ＥＬｉＳＡによって決定しプニもの）および細胞あたりの生産されたｈＧＨの訓算量（ｐ　ｇ／細胞）を表す。

（以下余白）配列表（１）一般的情報。

（ｉ）出願人７ジエネンテク、インコーホレイテッド（ｉｉ）発明の名称：所望のタンパク質を高！ノベルに発現させる組換え宿主細胞の選別法（ｉｉｉ）配列の数・５（ｉｖ）通信先：（Ａ）宛て名、ジエ不ンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）町名二ポイント・サン・ブルー八・ブールバード４６０＠（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国籍：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　９４０８０（Ｖ）コンビコーター読み取り形式：（Ａ）媒体の型：５．２５インチ、３６０　Ｋｂフロッピーディスク（Ｂ）コンピューター・　ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテイン（ｐａｔｉｎＸジエンネンテク）（ｖｉ）本出願データ：（Ａ）出願番号；（Ｂ）出願日：　１９９２年２月２０日（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）原出願データ：（＾）出願番号：　０７／６７７．０４５（Ｂ）出願日：　１９９１年３月２９日（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：ヘンスレイ、マックス・ディ（Ｂ）登録番号：　２７，０４３（Ｃ）参照／整理番号＝６９３（ｉｘ）通信情報：（＾）電話：　４１５／２６６−１９９４（Ｂ）ファクンミリ：　４１５／９５２−９８８１（Ｃ）テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ・７５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木端（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１゜ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧ　ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴ　ＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣ５０ＣＴＣＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＧＣＡＴＧＣ＾＾ＧＣＴＴ　７５（２）配列番号２に関する情報。

（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ、４０塩基（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー木端（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列の記載、配列番号２：＾ＴＧ＾＾ＣＴＧＣＡ　ＧＧＡＣＧＡＧＧＣＡ　ＧＣＧＣＧＧＣＴＧＴ　ＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧ　４０（２）配列番号３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ：３３塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木端（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：ＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡ　ＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧ　ＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧ　ＡＴＣ３３（２）配列番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木端（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列の記載：配列番号４：ＴＣＧＡＧＣＣＣＴＴ　ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣ２０（２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ＝１７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木端（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５：圓＾ＣＴＣＧＡＧ＾＾＾＾ＧＧＧＣ１７＋Ｕ国際調査報告　ＰＣＴ／ＵＳ　９２７０１３５８

Claims

【特許請求の範囲】１．（１）天然にはその選択可能遺伝子内に存在しないイントロンを含有する選択可能遺伝子で真核宿主細胞をトランスフェクションする段階であって、該イントロンが該宿主細胞中でスプライシングされて選択可能タンパク質をコード化するメッセンジャーＲＮＡを与えることができ、該選択可能遺伝子内の該イントロンの存在が該宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減少させることを特徴とする段階と、（２）該選択可能タンパク質によって付与される選択可能な表現型を有するトランスフェクタントを同定する段階、からなる方法。２．選択可能遺伝子が原核生物供給源から得られるものである請求項１の方法。３．所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子で該宿主細胞をトランスフェクションすることをさらに含む請求項１の方法。４．第２の選択可能遺伝子で該宿主細胞をトランスフェクションすることをさらに含む請求項１の方法。５．所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子と第２の選択可能遺伝子で該宿主細胞をトランスフェクションすることをさらに含む請求項１の方法。６．第２の選択可能遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子またはＤＨＦＲ遺伝子である請求項４または請求項５の方法。７．該イントロンの長さが５５ないし８５ヌクレオチドである請求項１の方法。８．該イントロンの長さが６５ないし７５ヌクレオチドである請求項１の方法。９．該選択可能遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子である請求項１の方法。１０．該イントロンが該選択可能遺伝子のコード領域内に存在する請求項１の方法。１１．該イントロンが該選択可能遺伝子の転写される非コード領域内に存在する請求項１の方法。１２．該真核細胞宿主が哺乳類細胞である請求項１の方法。１３．該哺乳類細胞がチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはシミアンＣＯＳ細胞またはヒト胚性腎臓２９３細胞である請求項１２の方法。１４．請求項１の方法に従って作成されるトランスフェクタント細胞。１５．選択可能遺伝子とその選択可能遺伝子の転写される領域内のイントロンからなる単離された核酸であって、該イントロンが該選択可能遺伝子内に天然には存在せず、該イントロンが宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減少させるに足る長さであることを特徴とする単離された核酸。１６．（１）真核宿主細胞を、（ａ）その選択可能遺伝子内に天然には存在しないイントロンを含有する選択可能遺伝子であって、該イントロンが該宿主細胞中でスプライシングされて選択可能タンパク質をコード化するメッセンジャーＲＮＡを与えることができ、該選択可能遺伝子中の該イントロンの存在が、該宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減少させる選択可能遺伝子、および、（ｂ）所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子、で同時トランスフェクションし、（２）該選択可能遺伝子によって付与される選択可能な表現型を有するトランスフェクタントを同定する、ことからなる方法。１７．同時トランスフェクションされた宿主細胞から該生成物遺伝子によってコード化されるポリペプチドを回収することをさらに含む請求項１６の方法。