JPH0638765A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質をコ―ドするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ［構成］ 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿から直接
取得された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡから遺伝子工
学的に誘導して得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋
白質の構成ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、該Ｄ
ＮＡ断片を含む発現ベクター、該発現ベクターによって
形質転換された形質転換体、並びに該形質転換体を培養
して得られる発現ポリペプチド及びその製造方法に関す
る。 ［効果］ このＤＮＡを形質転換体中で発現させて得ら
れる遺伝子産物は、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原として非Ａ
非Ｂ肝炎患者の診断に高い判定確度で使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする新規なＤ
ＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む発現ベクター、該発現ベ
クターによって形質転換された形質転換体、並びに該形
質転換体を培養して得られる発現ポリペプチド及びその
製造方法に関する。

【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウイルス性の伝染性
肝炎と考えられており、慢性化しやすく、肝硬変、肝癌
へ移行する率が高いことから、社会的に問題となってい
る。しかしながら患者あるいは健康キャリアー体内での
ウイルス発現量が少ないこと、また感染性ウイルスが同
定されておらず、原因ウイルスが１種なのかあるいは２
種以上存在するのかも分かっていないことなどからその
確定診断は、非常に困難である。現在まで非Ａ非Ｂ型肝
炎の診断は、臨床的には、血清中のアラニンアミノトラ
ンスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼのレベルの上昇を確認し、その上でＡ型肝炎、Ｂ型
肝炎およびＤ型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既知
のウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ等による肝炎か否かの診断
を行い、これらの疾病に該当しない場合に非Ａ非Ｂ型肝
炎と診断する、いわゆる除外診断によって行われてい
た。しかし、非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床像は他のウイルス性
肝炎のものと似通っており、上記のような除外診断法で
は、他のウイルス性の肝炎との鑑別診断は難しい。ま
た、ＡＬＴ値に異常のみられない健康キャリアーを同定
するのはさらに困難である。このため、健康キャリアー
からの輸血による感染を防止することは困難で、輸血後
肝炎の90％以上をこの肝炎が占めており、患者数は年間
100万人にのぼるといわれている。かかる状況を改善す
るため、多くの研究者が非Ａ非Ｂ型肝炎の診断用材料の
開発を行ってきたが、信頼性が低いものが多かった。こ
れらの診断用材料で最も信頼性の高いものは、カイロン
社のM.Houghtonら（特表平2-500880号公報）によって開
発されたものだと考えられている。カイロン社では、患
者血漿をチンパンジーに接種して非Ａ非Ｂ型肝炎を起こ
させ、その中で高い感染価の血漿を有する個体から血漿
を分離し、これよりＲＮＡを回収して蛋白質発現ベクタ
ーであるλｇｔ11を用いて患者血清でスクリーニングし
ている。カイロン社では得られた遺伝子を用いさらに遺
伝子のクローニングを行い、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ
＝カイロン社命名）のほぼ全遺伝子をクローニングし、
一部遺伝子を発現して得られた抗原蛋白質を用いて診断
用のキット化を行っている。その後、日本でもイムノス
クリーニングにより、非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子
が分離されてきている。ところが、槙らの特許（特願平
2-180889号）によると、分離された遺伝子は、カイロン
社の分離したＨＣＶに核酸、アミノ酸レベルでの相同性
の高いＨＣＶ・グループＩと、ホモロジーが低く、ＨＣ
Ｖ・グループＩとは異なるウイルスと考えてよい程度の
ホモロジーしか示さないグループIIに分類できることが
示された。またこのグループＩとグループIIの遺伝子の
発現産物を用いたＥＬＩＳＡの系で、グループＩに感染
している患者とグループIIに感染している患者を分類で
きることも示されている。

【発明が解決しようとする課題】カイロン社により非Ａ
非Ｂ型肝炎の原因ウイルスの１つと考えられるＨＣＶが
発見され、除外診断法に代わる診断が可能となった。し
かしながら、この診断材料を使用した患者血清スクリー
ニング結果は決して満足できるものではなく、カイロン
社のキットは特に日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とで
は50〜70％程度の反応しか示さない。即ち、臨床的には
非Ａ非Ｂ型肝炎と診断されている患者血清、あるいは遺
伝子増幅（ＰＣＲ）によってＨＣＶの遺伝子の存在が確
認されている患者血清と反応しない例が認められる。こ
の原因としては、１つには、カイロン社の分離したウイ
ルス遺伝子がＨＣＶのグループＩに属するウイルス遺伝
子であるため、その発現産物も、グループＩ特異的であ
ると考えられる。そのため、グループIIのウイルスに感
染している患者血清は、カイロン社のキットでは、検出
できない可能性が考えられる。またグループＩ、グルー
プII以外にその中間に位置するようなウイルスやそのど
ちらにも属さない例えばグループIII に相当するような
ウイスルあるいは、全くＨＣＶに相同性のないウイルス
の存在する可能性も否定できない。これらの課題を解決
するためには、グループIIに感染している日本人患者血
漿からグループII特異的なウイルス遺伝子を得る必要が
ある。さらにＨＣＶグループＩあるいはグループIIに対
して相同性の低いウイルスを得るためにはより多くの日
本人患者から、日本人由来の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺
伝子を多数得て、可能な限り多くの患者血清と反応する
抗原を得る必要がある。本発明は上記課題を解決するた
めの、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペ
プチドをコードする新規なＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を
含む発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体、並びに該形質転換体を培養して得られ
る発現ポリペプチド及びその製造方法を提供することを
目的としている。

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる目
的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶ・グルー
プIIのみに感染している日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血
漿から非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスと考えられる病因
ウイルス遺伝子を精製・単離し、さらにその遺伝子を用
いて複数の日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿からウイル
ス遺伝子を得、該遺伝子から誘導されたＤＮＡを含む発
現ベクターを構築し、および該発現ベクターにより形質
転換された形質転換体を得ることによって、本発明を完
成するに至った。本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿か
ら直接取得された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡから遺
伝子工学的に誘導して得られた、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする塩基配列
を含むＤＮＡ断片を提供する。このＤＮＡ断片の調製に
あたっての重要な特徴は、ＥＬＩＳＡ法及びＰＣＲ法を
用いてグループIIのみに感染している慢性期の日本人非
Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿を出発材料として用いた点
が挙げられる。本発明者らは、この血漿プールから直接
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイスルＲＮＡを含む全ＲＮＡを取り出
し、ランダムプライマー法によりｃＤＮＡを合成した。
このｃＤＮＡをλファージに入れｃＤＮＡライブラリー
を作製した。さらにこのｃＤＮＡライブラリーをグルー
プIIのみに感染している非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を用い
てイムノスクリーニングし、グループIIに特異的なＤＮ
Ａ断片を得た。この得られたＤＮＡ断片をプローブとし
て用い、複数の慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿より得ら
れたｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリーニングし、相同性の異なる日本人
非Ａ非Ｂ型肝炎患者に特異的なｃＤＮＡを単離した。こ
のように、グループIIに感染している非Ａ非Ｂ型肝炎患
者血漿からグループII特異的な非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
ＲＮＡを単離する手法を採用したこと、及びさらに得ら
れたＤＮＡ断片を用い、多数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿
からスクリーニングを行ったことは、いくつかのグルー
プがあり且つ変異しやすいと考えられている非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス関連の患者の診断および該肝炎ウイルスを
有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスキャリアーの輸血用血液
の検出確度を上げるうえで非常に有効な抗原を提供する
ものである。以下に本発明のｃＤＮＡライブラリーの調
製方法、ＤＮＡ断片の単離、配列の決定、ポリペプチド
の発現、精製単離、及び酵素抗体法の詳細な説明を行
う。先ず、グループIIにのみ感染している非Ａ非Ｂ型肝
炎患者の新鮮血漿から細胞破砕物を分離し、その遠心上
清を更に遠心によりペレット化する。このペレットから
セシウムトリフルオロアセテートを用いる平衡密度勾配
遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離し、フェノー
ル／クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い全ＲＮＡ
を精製する。得られたＲＮＡ画分から、GublerとHoffma
n の方法により、ランダムプライマーを用いｃＤＮＡを
合成する。これをＤＮＡメチラーゼ（例えば、EcoRI メ
チラーゼ）で処理してメチル化した後に、ＤＮＡリンカ
ー（例えば、EcoRI リンカー）又はＤＮＡアダプター
（例えばEcoRI アダプター）を連結し、このものをλフ
ァージ（例えば、λｇｔ10，λｇｔ11）等のクローニン
グベクターにクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを
構築した。これをｃＤＮＡライブラリーＡとする。また
同様の方法で、複数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿か
らもｃＤＮＡライブラリーを構築した。これをｃＤＮＡ
ライブラリーＢとする。次に、λファージｃＤＮＡライ
ブラリーＡを大腸菌に感染させ、例えば寒天プレート上
で培養してプラークを形成させる。プラークをニトロセ
ルロースフイルターに移し取り、グループIIにのみ感染
している非Ａ非Ｂ型肝炎血清を用いるイムノスクリーニ
ングにより陽性クローンを検出する。このスクリーニン
グにより１個のクローンＣ11−Ｃ21が得られた。スクリ
ーニングの効率化を計るため、及びびより多くの人から
非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルス遺伝子を得るため、得ら
れた陽性クローンをプラスミド等のクローニングベクタ
ーにクローニングし、フラグメントを切り出し、ランダ
ムプライマー法により³²Ｐで標識し、ＤＮＡプローブを
作製し、該プローブを用いるハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリーニングし、ｃＤＮＡライブラリー
Ｂから陽性プラークを検出する。このようにして得られ
たクローンを用いさらにスクリーニングを行った。この
一連のスクリーニングによりさらに、４種のクローンが
得られた。本発明者らはこれらのクローンをＣ10−Ｅ1
2，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24，Ｃ10−Ｅ15と命名した。
これらの合計５つのクローン、即ちＣ11−Ｃ21，Ｃ10−
Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及びＣ10−Ｅ15はいずれ
も大腸菌ＪＭ109 株に移入され、形質転換株と成して夫
々微工研菌寄第 11892号，同第 11894号，同第 11895
号，同第 11896号及び同第 11897号として平成２年12月
11日付けで寄託されている。得られた５クローンのλフ
ァージＤＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを取得し、これ
を適切な制限酵素（例えば、EcoRI, BamHI）で切断し、
各ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した
後、ｐＵＣ119 あるいはＭ13ファージに組み込み、Sang
erらのジデオキシ鎖終止法［Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 5463(1977)］を用いて各ｃＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。このようにして決定された上記クローン
Ｃ11−Ｃ12，Ｃ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及び
Ｃ10−Ｅ15の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を夫々配列番号１，２，３，４及び５に示した。こ
れらは夫々369 BP，932 BP，559 BP，276 BP及び742 BP
から成る核酸配列を有するＤＮＡ断片である。従って、
本発明の実施態様により、本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス構造蛋白質を構成するポリペプチドが配列番号
１，２，３，４又は５によって示される読み取り枠に従
ってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部で表わさ
れることを特徴とする、該ポリペプチドをコードする塩
基配列を含むＤＮＡ断片を提供する。もちろん、これら
の塩基配列において、各アミノ酸に対応する他のコドン
から成る他のいかなる塩基配列も本発明に包含される。
５クローンは全て連続的なオープンリーディングフレー
ム（読み取り枠）が開き、終止コドンはもっていなかっ
た。ＨＣＶはゲノムＲＮＡの解析により日本脳炎ウイル
スなどのフラビウルスと類似したウイルスであることが
知られており（蛋白質・核酸・酵素35(12)，2117-2127
(1990))、この公知のフラビウイスルの遺伝子及びポリ
ペプチドに対する相同性に基づいて、本発明ＤＮＡ断片
がＨＣＶ構造蛋白質をコードしているものと認められ
た。特に、クローンＣ11−Ｃ12はＨＣＶのcoreをコード
する遺伝子であり、またクローンＣ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ
13，Ｃ10−Ｅ24及びＣ10−Ｅ15はいずれもＨＣＶのcore
の後半からenv 又はenv から下流の領域をコードする遺
伝子であると認められる。Ｃ11−Ｃ21クローンに関する
配列番号１によって示される核酸配列369 BPとオープン
リーディングフレームに沿って翻訳したアミノ酸配列12
3 アミノ酸をHoughtonら［特表平2-11089 号公報］の報
告したＨＣＶとオーバーラップした部分の相同性を比較
すると核酸レベルで81.8％、アミノ酸レベルで87％の相
同性を示した。また岡本ら（Japan J.Exp.Med.,60,3,p.
167-177,1990）の発表した日本人より得られたＨＣＶク
ローンＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４との比較でも核酸レ
ベルで82.1％および82.7％、アミノ酸レベルで87.8％お
よび89.4％の相同性を示した。HoughtonらのＨＣＶおよ
びＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４の３つのクローン間での同じ
領域での相同性は、核酸レベルで92.1％〜97.6％、アミ
ノ酸レベルで95.5％〜96.7％とよく保存されており、我
々の得たクローンＣ11−Ｃ21は、これら３つのクローン
とは、相同性において一定の距離があり、グループの異
なるウイルスの遺伝子だと考えられる。残りの４つのク
ローンのうち３クローン、Ｃ10−Ｅ12、Ｃ10−Ｅ13、Ｃ
10−Ｅ15は、ＨＣＶ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４と核酸レ
ベルで83〜93％、アミノ酸レベルで82〜95％の相同性を
示している。またＣ10−Ｅ24は核酸レベルで63％前後、
アミノ酸レベルで60％前後の相同性を示した。このよう
に本発明ＤＮＡ断片は、従来公知のＤＮＡ断片とは異な
るもので新規のＤＮＡである。ＨＣＶは、グループＩお
よびグループIIの２つのグループに分けられるが、宿主
内で変異を受けやすいウイルスである可能性が高く、グ
ループＩ、グループIIの中間のタイプのものや、他のグ
ループに分けられるウイルスが存在する可能性もある。
そのため、一種のＤＮＡ断片からつくられる抗原蛋白だ
けでは、すべての非Ａ非Ｂ型肝炎患者を診断することは
困難である。この問題を解決するためには、ＤＮＡ等の
調製方法を設定し、より多くのクローンを得ることが重
要である。この得られたクローンをいくつか組み合わせ
て診断に用いることにより、診断の効率を高めることが
可能である。本発明はまた、上述のようにして得られた
ＤＮＡ断片を、プロモーターの下流に存在するベクター
内のクローニング部位に、導入して得られる発現を提供
する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ等の慣
用のベクターが用いられる。発現ベクターは、当該技術
分野で公知の技術を用いて構築される。図１は発現プラ
スミドの構築例を示すものであるが、以下にその構築方
法を説明する。先ず、前記Ｃ11−Ｃ21クローンをｐＵＣ
119 に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ11−Ｃ
21DNA から２つのプライマー（５′−TTACGAATTCATGGGC
ACGAATCCT −３′、５′−TTAATCGATGACCTTACCCACATTGC
G −３′）を用いた遺伝子増幅法（ＰＣＲ）により３′
末端にストップコドンの入ったＤＮＡ断片を得る。この
ＤＮＡ断片をＳｍａＩで消化したｐＵＣ118 に連結し、
プラスミドｐＵＣ118 ・Ｃ11−Ｃ21・Ｓｍａを得る。こ
のプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、グ
ラスパウダー法により精製する。一方、発現ベクターで
あるＴｒｐ・ＴｒｐＥ ＤＮＡ（特願平2-180889号）を
ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ消化およびバクテリアアルカリ
性ホスファターゼ（ＢＡＰ）処理した後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行い処理ベクターＤＮＡを得る。
このベクターＤＮＡと前述のＣ11−Ｃ21 ＤＮＡ断片と
をライゲーション緩衝液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼによ
り連結することによって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造
蛋白質の構成ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写制
御できる位置にプロモーターをもつ発現プラスミドＴｒ
ｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21を得た。他のクローンについ
ても適当な制限酵素を用いて処理し、発現ベクターに組
込むことにより、対応する発現プラスミドを得ることが
できる。プロモーターとしては、大腸菌、ファージ等由
来のものが挙げられる。例えば、トリプトファン合成酵
素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａ
ｃ）、ラムダファージＰ_L ，Ｐ_R などがある。また、転
写終結因子は必ずしも必要ないが、発現ベクター内に存
在させるのが好ましい。本発明は更に、宿主を、本発明
発現ベクターで形質転換して得られる形質転換体を提供
する。宿主としては、大腸菌，枯草菌，酵母などのこの
分野で慣用される微生物が用いられる。形質転換は発現
ベクターを宿主細胞に移入するための慣用的方法によっ
て実施される。宿主として細菌（例えば大腸菌）を用い
る場合には、塩化カルシウムを用いる直接取込み法［Ma
ndel,M. とHiga,A.,J.Mol.Bio.53,159-162(1970)］が使
用できる。さらに、発現ベクターを含む大腸菌等の宿主
を例えばアンピシリン含有２ＹＴ培地に接種し、培養
し、更にアンピシリン含有リン酸培地中で継代培養する
ことによって発現菌体を増殖し、目的ポリペプチドを産
生させることができる。宿主からの目的物の精製方法と
しては、宿主細胞を例えば超音波破砕した後に遠心分離
を行って非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされ
るポリペプチド又は該ポリペプチドを含む融合ポリペプ
チドを含有する不溶性画分を得、このポリペプチドを尿
素含有バッファで可溶化抽出し、イオン交換カラムクロ
マトグラフィー（例えば、S-Sepharose)に掛けて精製す
ることができる。従って、本発明はまた、配列番号１，
２，３，４又は５のＤＮＡ断片を構成する塩基配列によ
ってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部を含む組
換ポリペプチドの製造方法を提供する。即ち、本発明方
法は、該ＤＮＡ断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る
複製可能な発現ベクターを構築する工程、該発現ベクタ
ーを宿主細胞内に移入して形質転換体を得る工程、該Ｄ
ＮＡ断片を発現させ得る条件下で該形質転換体を培養し
て該組換えポリペプチドを産生する工程、該組換えポリ
ペプチドを回収する工程を含む。本発明はまた、このよ
うにして得られる、配列番号１，２，３，４又は５によ
って示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成
ポリペプチドを含む組換えポリペプチドも提供する。本
明細書中、「組換えポリペプチド」とは、ベクター内の
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質を構成するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを発現させて得られるポリペプ
チド自体又は該ポリペプチドとｔｒｐＥなどの他のペプ
チドとの融合ポリペプチドを意味する。本発明の発現ポ
リペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に掛けた後、ウェスタンブロット法により正常人血清又
は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清各２検体と抗原抗体反応させ
た結果、図３に示すように患者血清とのみ強く反応する
ことから、この発現ポリペプチドは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス特異抗原として作用することが確認された。また酵
素抗体法により、本発明の発現ポリペプチドＴｒｐＥ・
Ｃ11−Ｃ21、槙らの特許［特願平2-180889号］で得られ
たグループＩの遺伝子より発現させたポリペプチドＴｒ
ｐＥ・Ｃ11−７、およびカイロン社のキット（オーソＨ
ＣＶ Ａｂ ＥＬＩＳＡキット）を用いて、臨床的に非
Ａ非Ｂ型肝炎と判断された患者の血清と反応させ陽性率
を検討した。カイロン社キットは33例中、23例が陽性で
69.7％、グループＩであるＴｒｐＥ・Ｃ11−７は26例が
陽性で、78.8％の陽性率を示した。一方、本発明の発現
ポリペプチドＴｒｐＥ・Ｃ11−Ｃ21の場合28例が陽性で
84.8％の陽性率を示し、カイロン社のキットより高い陽
性率を得た。さらに、グループＩの発現ポリペプチドで
あるＴｒｐＥ・Ｃ11−７と、グループIIであると考えら
れるＴｒｐＥ・Ｃ11−Ｃ21とを組み合わせることにより
31例中、30例が陽性となり、陽性率は93.9％と上昇す
る。（表１、図２参照） 以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明は本発明の要旨を変えない限りこれらの実施例に
限定されるものではない。

【実施例】

実施例１非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿からのｃＤＭＡライブラリーの
調製 慢性期にある日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿を、
槙らがクローニングした、グループＩのｃＤＮＡクロー
ンＣ11-7の発現産物及びグループIIのｃＤＮＡクローン
Ｃ10-14 の発現産物を用いたＥＬＩＳＡの系でスクリー
ニングし、Ｃ10-14 のみに反応してくる患者血漿を得
た。この患者血漿をさらに、グループＩでよく保存され
ている領域のプライマー（５′−ＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴ
ＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３′，５′−ＣＴＧＧＧＡＧＡ
ＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧ−３′）及びグループIIでよ
く保存されている領域のプライマー（５′−ＧＡＴＧＣ
ＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３′，５′−ＧＴＣ
ＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ−３′）を用いた
遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を行なった。ＰＣＲ法はGene
Amp^TM（DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elme
r Cetus)を用い、ＤＮＡ変性95℃、 1.5分、アニーリン
グ55℃、２分、ＤＮＡ合成70℃、３分の条件で行った。
この条件でグループIIのプライマーでのみ、遺伝子が増
幅してくる患者血漿をプールして用いた。この患者の新
鮮血漿から以下に述べる手順でＲＮＡ画分を調製後、λ
ｇｔ10、λｇｔ11ファージを用いてｃＤＮＡライブリラ
ーを作製した。まず、血漿１ｌを等量の50m Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH8.0)、１m Ｍ ＥＤＴＡで希釈後、細胞
破砕物等を3500ｇで20分間遠心することにより除去す
る。この上清をさらに4500rpm （約100000ｇ）、４℃で
４時間遠心することによりペレットを得た。このペレッ
トを常法に従い蛋白変性剤である６Ｍグアニジウムチオ
シアネートを用いて溶解後、セシウムトリフルオロアセ
テート液の上に重層し、ベックマンＳＷ50ローターで33
000rpm、20℃で18時間遠心してペレットを得た。このペ
レットを10m Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)、１m Ｍ
ＥＤＴＡ溶液に溶かし、フェノール：クロロホルム
（１：１）混合液で２回の抽出操作の後、上清をとり５
Ｍ ＮａＣｌを10分の１量およびエタノールを 2.5倍量
加えて−20℃に２時間放置した。２時間放置後 15000ｇ
で20分間遠心し得られたペレットをジエチルピロカーボ
ネート処理水に溶解しＲＮＡ試料とした。得られたＲＮ
Ａ試料を用いて、Gubler & Hoffmanの方法に従い、市販
キット（Amersham社あるいは BRL社）を用いランダムプ
ライマー法によりｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼで処理した後にＥｃｏＲＩ
リンカーあるいはＥｃｏＲＩアダプターを連結し、λｇ
ｔ11ファージのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。作
製したｃＤＮＡライブラリーは、平均10⁶ −10⁷ ＰＦＵ
の組み換え体ファージを含んでいた。このｃＤＮＡライ
ブラリーをｃＤＮＡライブラリーＡとする。またＥＬＩ
ＳＡ ＰＣＲ法でのスクリーニングを行っていない複数
の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿５ｌを出発材料とし、
同様の方法でλｇｔ10ファージを用いたｃＤＮＡライブ
ラリーＢを構築した。ｃＤＮＡライブラリーＢも平均10
⁶ −10⁷ ＰＦＵの組み換え体ファージを含んでいた。 実施例２非Ａ非Ｂ型肝炎特異的ｃＤＮＡの単離 実施例１で作製したｃＤＮＡライブラリーＡから非Ａ非
Ｂ型肝炎に特異的なｃＤＮＡをイムノスクリーニングに
よりクローニングした。イムノスクリーニングに使用す
る血清は、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ法でグループIIのみ
に感染していることを確認した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清
でＨＢｃ抗体およびＨＢｓ抗体陰性のもの２サンプルを
プールして用いた。まず、大腸菌Ｙ1090株にλｇｔ11フ
ァージを37℃で15分間感染させ、これを適当な密度で寒
天プレートにまき、43℃、３時間インキュベートしプラ
ークを形成させる。このプレートの寒天上に、10m Ｍ
ＩＰＴＧを染み込ませたHybond-Nニトロセルロースフィ
ルターをのせ37℃で３時間培養し融合蛋白の発現を誘発
する。発現蛋白の吸着したニトロセルロースフィルター
を３％ゼラチン溶液でブロッキングした後、非Ａ非Ｂ型
肝炎（ＮＡＮＢＨと略称する）患者血清と４℃で一晩反
応させる。ＴＢＳＴ溶液で３回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）と室温で 1.5時間反応
させる。このフィルターを再びＴＢＳＴ溶液で３回洗浄
し、基質であるジアミノベンチジンとＨ₂ Ｏ₂ との混合
液と反応させ陽性プラークを得た。得られたクローンＣ
11−Ｃ21はＨＢｃ抗体、ＨＢｓ抗体とは陽性の反応は認
められなかった。次にスクリーニングの効率化をはかる
ため、及びグループII以外のウイルス遺伝子をスクリー
ニングするため得られたＣ11−Ｃ21クローンをｐＵＣ11
9 にリクローニングしたものを、制限酵素で消化し、ラ
ンダムプライマーラベリング法で³²Ｐ標識しプローブと
して用い、ハイブリダイゼーションアッセイによりｃＤ
ＮＡライブラリーＢのスクリーニングを行った。スクリ
ーニングは、Ｃ600 ｈｆｌ（−）大腸菌に、 5×10⁴ Ｐ
ＦＵの組み換え体ファージを37℃、15分間で感染させ、
150mm Ｌプレートにまく。37℃で一晩インキュベート
し、プラークが出現したら４℃に１時間放置する。この
プレートの寒天にHybond-Nフィルターをかぶせ30秒間放
置する。次に、変性溶液(0.5Ｍ ＮａＯＨ， 1.5Ｍ Ｎ
ａＣｌ）で湿らせた濾紙の上にこのフィルターをのせ、
２分間放置後、中和溶液(0.5Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH
7.0 ， 1.5Ｍ ＮａＣｌ）に５分間浸し、更に、 2×Ｓ
ＳＣ中で洗浄後、風乾させる。乾燥したフィルターは 3
04nmＵＶを２分間照射し、ＵＶ−クロスリンキングし
た。このフィルターをＮＡＮＢＨ患者血清とのイムノス
クリーニングにより得られたＣ11−Ｃ21クローンの³²Ｐ
標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、スクリーニ
ングした。ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバ
ッファーで希釈し、ハイブリダイゼーションバッファ中
で55℃、一晩インキュベートし反応させる。その後、バ
ックグラウンドをおとすため、１×ＳＳＣ55℃で10分間
ずつ、２回洗浄する。このフィルターを−70℃でオート
ラジオグラフィーを行い、陽性ブラークを検出する。フ
ィルムとＬ−プレートをあわせて、Ｌ−プレートから陽
性プラークをＳＭバッファにかきとる。このスクリーニ
ングにより得られたクローンをプローブとして用い、さ
らにｃＤＮＡライブラリーＢのスクリーニングを行っ
た。この一連のスクリーニングにより４クローンが得ら
れ、それぞれＣ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24，Ｃ
10−Ｅ15と命名した。 実施例３非Ａ非Ｂ型肝炎特異的ｃＤＮＡの配列決定 得られた５クローンのλｇｔ11あるいはλｇｔ10のファ
ージを大腸菌に感染させ、大量のファージを回収する。
このファージから、常法に従い、アルカリ法によりＤＮ
Ａを抽出する。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａ
ｍＨＩあるいはＫｐｎＩで消化しアガロースゲル電気泳
動により精製する。一方、シークエンス用ベクターであ
るＭ13ファージのｍｐ18およびｍｐ19(Messing, J., Me
thod inEnzymology, 101, 20-78) あるいはｐＵＣ118
およびｐＵＣ119 (Vieira, J. とMessing, J., Methods
in Enzymology, 153, 3-11)を制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩあるいはＫｐｎＩで消化し、線状化した。前記
のｃＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを緩衝液中でＴ４リガ
ーゼにより連結し、この反応物を用い、大腸菌ＪＭ109
株に形質導入あるいは形質転換した。これらの大腸菌を
培養し、アルカリ法によりＤＮＡを回収しSangerらのジ
デオキシ鎖終止法を用い塩基配列を決定した。クローン
Ｃ10−Ｃ21，Ｃ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及び
Ｃ10−Ｅ15の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列は、夫々配列番号１，２，３，４及び５に示される
とおりであった。 実施例４非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされるポリペ
ブチドの発現および精製 （ｉ） 発現プラスミドの構築 得られたクローンの１つであるＣ11−Ｃ21を大腸菌(E.
coli) 内でプロモーターの下流にｔｒｐＥとの融合ポリ
ペプチドとして発現させた。まず、Ｃ11−Ｃ21クローン
をｐＵＣ119 に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・
Ｃ11−Ｃ21 ＤＮＡ１ngを、２つのプライマー（５′−
ＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴ
−３′，５′−ＴＴＡＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＣ
ＣＡＣＡＴＴＧＣＧ−３′）を用いＰＣＲ法を行う。Ｐ
ＣＲはGene Amp^TM(DNA Amplification Reagent Kit, Pe
rkin Elmer Cetus) のキットを用い、ＤＮＡ変性95℃、
1.5分、アニーリング50℃、２分、ＤＮＡ合成70℃３分
の条件で行い、得られたＤＮＡ断片を 0.8％アガロース
電気泳動により分解し、グラスパウダー法で精製した。
一方、ｐＵＣ118 を制限酵素ＳｍａＩで消化し、ＰＣＲ
法によって得られたＤＮＡ断片と緩衝液中でＴ４リガー
ゼにより連結し、プラスミドｐＵＣ118 ・Ｃ11−Ｃ21・
Ｓｍａを得た。このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素
反応液20μｌ［150mＭ ＮａＣｌ，6mＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH7.9)，6mＭ ＭｇＣｌ₂ 、15単位のＥｃｏＲＩ
酵素および15単位のＢａｍＨＩ酵素］中で37℃１時間消
化反応を行い、その後 0.8％アガロース電気泳動を行っ
て約 380bpのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離し、こ
れをグラスパウダー法（Gene Clean ^TM，Ｂｉｏ−101
社）により精製した。次に、発現ベクターであるＴｒｐ
・ＴｒｐＥのＤＮＡ１μｇを反応液20ml［150mＭ Ｎａ
Ｃｌ，6mＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)，6mＭ ＭｇＣ
ｌ₂ ，15単位のＥｃｏＲＩ酵素および15単位のＢａｍＨ
Ｉ酵素］中37℃で１時間消化し、その反応液に水39μｌ
を加え、70℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカ
リ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ(250単位／μｌ）
を加えて37℃で１時間保温した。この反応液にフェノー
ルを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタ
ノール沈澱し、沈澱物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ11−
Ｃ21ＤＮＡ断片を10×リガーゼ用バッファ［660mＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5) 66mＭ ＭｇＣｌ₂ ，100mＭジ
チオスレイトール，1mＭ ＡＴＰ］５μｌ，Ｔ４リガー
ゼ１μｌ(350単位／μｌ）に水を加えて50μｌとし、16
℃で一晩保温し、連結反応を行った。この反応液の10μ
ｌを用いて大腸菌ＨＢ101 株を形質転換した。形質転換
に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mande
l, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (197
0)］により作られる。形質転換大腸菌を25μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢ−プレート（１％トリプトン，
0.5％酵母エキス， 0.5％ＮａＣｌ， 1.5％寒天）上に
塗布し、37℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌の
コロニーを一白金耳取り、25μｇ／mlアンピシリンを含
むＬＢ培地に移し、一晩37℃で培養した。 1.5mlの菌培
養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパ
レーションをアルカリ法(Maniatis ら Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, 1982)により行った。得られ
たプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液20μｌ［150mＭ Ｎ
ａＣｌ，6mＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（pH7.5)，6mＭ Ｍｇ
Ｃｌ，15単位のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ酵素］中で
37℃、１時間消化し、アガロース電気泳動を行って、約
380ｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるＴｒｐ・
ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21発現プラスミドを選別した。この
プラスミドは大腸菌101株に移入され、形質転換体と成
して微工研菌寄第 11893号として平成２年12月11月付で
寄託されている。 （ii） クローンＣ11−Ｃ21でコードされるポリペプチ
ドの発現および精製 発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21をもつ大
腸菌ＨＢ101 株を50μｇ／mlのアンピシリンを含む３ml
の２ＹＴ培地(1.6％トリプトン，１％酵母エキス， 0.5
％ＮａＣｌ）に接種し、37℃で９時間培養する。この培
養液１mlを50μｇ／mlのアンピシリンを含む 100mlのＭ
９−ＣＡ培地(0.6％ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ，0.5％ ＫＨ₂
ＰＯ₄ ， 0.5％ ＮａＣｌ， 0.1％ ＮＨ₄ Ｃｌ，0.1m
Ｍ ＣａＣｌ₂ ，2mＭ ＭｇＳＯ₄ ， 0.5％ カザミノ
酸， 0.2％ グルコース）に植え継ぎ、37℃で21時間培
養した。更に、本培養液18mlを 1.2ｌのＭ９−ＣＡ培地
に植え継ぎ、37℃で培養した。ＯＤ₆₀₀ ＝ 0.3のときに
終濃度40mg／ｌになるようにインドールアクリル酸を加
え、さらに16時間培養した。この培養液を遠心分離して
菌体を集めた。菌体に20mlのバッファＡ(50mＡ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH8.0)，1mＭ ＥＤＴＡ， 30mＭ ＮａＣ
ｌ）を加えて懸濁し、再び遠心分離を行って発現菌体
2.6ｇを得た。得られた菌体をバッファＡ10ml中に懸濁
し、超音破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を
行い、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされる
ポリペプチドとｔｒｐＥの融合ポリペプチドを含む不溶
性画分を得た。その画分に10mlの６Ｍ尿素を含むバッフ
ァＡを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶
化した抽出物をS-Sepharose を用いたイオン交換カラム
クロマトグラフィーに掛けてＮａＣｌの０Ｍから 0.5Ｍ
までの濃度勾配により融合ポリペプチドの精製を行っ
た。 実施例５非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清中のＨＣＶ抗体の測定 （ｉ） ウェスタンブロット法による測定 実施例４により精製された発現産物をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動［Laemmli, Nature 277, 680
(1970)]を行った後、常法に従ってニトロセルロースフ
ィルター（Bio-rad,Trans-blot) にブロッティングを行
った。このフィルターを３％ゼラチン溶液でブロッキン
グ後、正常人血清および非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を４℃
で反応させる。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇ
Ｇ（ヤギ抗体）を反応させた。再びフィルターを洗浄
し、基質であるジアミノベンチジン溶液に浸し、発色を
確認した。図２に示したように正常人血清に対しては全
く反応していないが、患者血清に対しては強く反応し特
異的なバンドがみられた。 （ii） 酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ法）による測定 ウエスタンブロット法より大量の血清を診断する手段の
１つとしてＥＬＩＳＡ法が使用できる。方法は常法を用
いて行い、精製抗原をＰＢＳ（−）で５μｇ／mlの濃度
に希釈し、４℃あるいは室温でマイクロプレートに固定
する。洗浄液で数回洗浄後、希釈被検血清を加え、37℃
あるいは室温で１時間インキュベートする。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）を加え37
℃あるいは室温で反応させる。更に数回洗浄し、ジアミ
ノベンチジン溶液を50μｌ加え、37℃で発色させる。 2
Ｍ Ｈ₂ ＳＯ₄ で発色を停止させ、比色計で測定を行っ
た。表１に示したように、現在上市されているカイロン
社のキット（オーソＨＣＶＡｂ ＥＬＩＳＡテスト）と
陽性率を比較したところ、カイロン社のものは69.7％で
あるのに対し、本発明による発現抗原を用いたものは8
4.8％の陽性率であった（表１）。

【表１】

【発明の効果】本発明によって得られたｃＤＮＡ配列
は、非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的であり、これらの遺伝子を
微生物、例えば大腸菌等を利用した蛋白質発現系に組み
込むことによって産生されたポリペプチドは、多数の非
Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と反応するため、極めて感度の
よい且つ判定確度の高い診断キットを作製することがで
きる。また、これらを直接プローブとして用いたり、こ
れらの配列に基づいて特異性の高いプローブを合成した
りして、診断することも可能である。更に遺伝子増幅法
（ＰＣＲ）と組み合わせることによって診断や、非Ａ非
Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子を得ることもできる。また、
これらのポリペプチドは、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原
としての機能を有するため、ワクチンとしてこのポリペ
プチドを免疫することにより非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
感染を防御できることも期待できる。更にまた、これら
のポリリペプチドをウサギ等に免疫することにより、患
者体内のウイルス検出、分離に有用な抗体を得ることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21
の構築方法を示す。

【図２】発現産物と正常人血清または非Ａ非Ｂ型肝炎患
者血清との免疫反応性をウエスタンブロット法により調
べた結果を示す写真である。

【図３】表１のＥＬＩＳＡの陽性数を図に書き換えたも
のである。

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA AGA AAC ACT AAC 48 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGT CGC CCA CAA GAC GTT AAG TTT CCG GGC GGC GGC CAG ATC GTT GGC 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTA TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGA TTG GGT GTG CGC GCG 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACA AGG AAG ACT TCG AAG CGG TCC CAG CCA CGT GGG GGG CGC CGG CCC 192 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 ATC CCT AAA GAT CGG CGC TCC ACT GGC AAG TCC TGG GGG AAA CCA GGA 240 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 TAC CCC TGG CCC CTA TAT GGG AAT GAG GGA CTC GGC TGG GCA GGG TGG 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTT CTG TCC CCC CGA GGT TCC CGT CCC TCT TGG GGC CCC ACT GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CAT AGG TCG CGC AAT GTG GGT AAG GTC ATC 369 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 115 120 配列番号：２ 配列の長さ：９３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CG CGC AAC TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC 47 Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 1 5 10 15 GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT 95 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 20 25 30 GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC 143 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 35 40 45 TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG 191 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 50 55 60 GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC 239 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 65 70 75 AAC GTA TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT 287 Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser 80 85 90 95 ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG 335 Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val 100 105 110 CCC TGC GTT CGG GAG AAC AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT 383 Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr 115 120 125 CCC ACG TTA GCG GCC AGG AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA 431 Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg 130 135 140 CGG CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG 479 Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met 145 150 155 TAC GTG GGG GAT CTC TGT GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC 527 Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe 160 165 170 175 ACT TTC TCA CCT CGT CGG CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA 575 Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser 180 185 190 ATC TAT CCC GGC CAC TTG ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG 623 Ile Tyr Pro Gly His Leu Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met 195 200 205 ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG 671 Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 ATC CCA CAA GCT GTC ATG GAC ATG GTG GCG GGG GCT CAC TGG GGA GTC 719 Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 225 230 235 CTA GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 767 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 240 245 250 255 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC ACC TAT GTG 815 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr Thr Tyr Val 260 265 270 ACA GGG GGG ACG ACA GGC CGC ACC ACC AGC TCG TTC GCA TCC CTC TTT 863 Thr Gly Gly Thr Thr Gly Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Phe 275 280 285 ACA CTT GGG TCG CAT CAG AAG GTC CAG CTT ATA AAT ACC AAT GGC AGC 911 Thr Leu Gly Ser His Gln Lys Val Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 290 295 300 TGG CAC ATC AAC AGG ACC GCC 932 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 305 310 配列番号：３ 配列の長さ：５５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CGC CGG TAT GAG ACG GCG CAA GAC TGC AAT TGC TCA CTC TAT CCC GGT 48 Arg Arg Tyr Glu Thr Ala Gln Asp Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly 1 5 10 15 CAC GTA TCT GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA 96 His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser 20 25 30 CCT ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC 144 Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala 35 40 45 GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT 192 Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Ile Ala Gly Leu 50 55 60 GCC TAC TAT TCC ATG GTG GCG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG 240 Ala Tyr Tyr Ser Met Val Ala Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met 65 70 75 80 CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GAC GGG AAG ACC ACC GTG ACG GGG GGG 288 Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Asp Gly Lys Thr Thr Val Thr Gly Gly 85 90 95 AGC GCA GCC TTC CAG TCC AGG AAG TTA GTG TCC TTC TTC TCA CCA GGG 336 Ser Ala Ala Phe Gln Ser Arg Lys Leu Val Ser Phe Phe Ser Pro Gly 100 105 110 CCG AAA CAA AAT ATC CAG CTT GAT AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC 384 Pro Lys Gln Asn Ile Gln Leu Asp Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile 115 120 125 AAC AGG ACT GCC CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC ATC 432 Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Ile 130 135 140 GCT GCG CTG TTC TAC GCG CAC AAG TTC AAT TCG TCC GGA TGC CTA GAG 480 Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Leu Glu 145 150 155 160 CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT GAC AAG TTC GCG CAG GGG TGG GGT 528 Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly 165 170 175 CCC ATC ACT CAC GAT ACG CCT AAG ATC CCG G 559 Pro Ile Thr His Asp Thr Pro Lys Ile Pro 180 185 配列番号：４ 配列の長さ：２７６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 GA CAC CGT ATG GCA TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC ACG GCT 47 His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 1 5 10 15 ACC ATG ATT CTG GCG TAT GTG ATG CGC ATC CCC GAG GTC GTC ATG GAC 95 Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Ile Pro Glu Val Val Met Asp 20 25 30 ATC ATT GGC GGG GCT CAC TGG GGC GTC ATG TTC GGC TTG GGC TAT TTT 143 Ile Ile Gly Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Gly Tyr Phe 35 40 45 TCT ATG CAG GGG GCT TGG GCA AAA GTC GTT GTC ATC CTT CTG CTG GCC 191 Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Val Val Ile Leu Leu Leu Ala 50 55 60 GCT GGG GTG GAT GCG ACT ACC CTC AGC GTT GGG GGC TCT GCC GCG CAC 239 Ala Gly Val Asp Ala Thr Thr Leu Ser Val Gly Gly Ser Ala Ala His 65 70 75 ACC ACC GGC GGC CTT GTC GGC TTG TTC AAG CCT GGC G 276 Thr Thr Gly Gly Leu Val Gly Leu Phe Lys Pro Gly 80 85 90 配列番号：５ 配列の長さ：７４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT GCC AGG GCC CTG GCA CAT 47 Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 1 5 10 15 GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG 95 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 20 25 30 CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 143 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 35 40 45 ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC AAC GTA TCC GGG ATA TAC 191 Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr 50 55 60 CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG 239 His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala 65 70 75 GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AAC 277 Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn 80 85 90 95 AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT CCC ACG TTA GCG GCC AGG 335 Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110 AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA CGG CAT GTC GAT TTG CTC 383 Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu 115 120 125 GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGT 431 Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys 130 135 140 GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGT CGG 479 Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg 145 150 155 CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC TTG 527 His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Leu 160 165 170 175 ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA 575 Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr 180 185 190 ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC ATG 623 Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met 195 200 205 GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC 671 Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr 210 215 220 TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTC 719 Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu 225 230 235 TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC AC 742 Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr 240 ２４５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 小原 道法 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡１−３−１ 東燃株式会社総合研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿から直接取得さ
   れた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡから遺伝子工学的に
   誘導して得られた、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質
   の構成ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
   断片。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、配列番号１によっ
   て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
   列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが、配列番号２によっ
   て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
   列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが、配列番号３によっ
   て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
   列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが、配列番号４によっ
   て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
   列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが、配列番号５によっ
   て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
   列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡ断片を、プロモーターの下流に存在するベクター内
   のクローニング部位に導入して得られる発現ベクター。
8. 【請求項８】 ベクターがプラスミドである請求項７記
   載の発現ベクター。
9. 【請求項９】 宿主を、請求項７又は８に記載の発現ベ
   クターで形質転換して得られる形質転換体。
10. 【請求項１０】 宿主が大腸菌である請求項９記載の形
    質転換体。
11. 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の
    ＤＮＡ断片を構成する塩基配列によってコードされるア
    ミノ酸配列の全部又は一部を含む組換えポリペプチドの
    製造方法であって、 前記ＤＮＡ断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る複製
    可能な発現ベクターを構築する工程、 前記発現ベクターを宿主細胞内に移入して形質転換体を
    得る工程、 前記ＤＮＡ断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体
    を培養して前記組換えポリペプチドを産生させる工程、 前記組換えポリペプチドを回収する工程、を含む方法。
12. 【請求項１２】 請求項11に記載の方法によって得られ
    る、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペプ
    チドを含む組換えポリペプチド。