JPH051777B2

JPH051777B2 -

Info

Publication number: JPH051777B2
Application number: JP7019886A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Yaginuma; Masashi Kurita; Masaki Takada; Kenji Kinoshita
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1986-03-28
Publication date: 1993-01-11
Also published as: JPS62215551A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は環状アデノシン−3′，5′−モノリン酸
ホスホジエステラーゼ阻害活性を有する新規生理
活性物質TPI及びその製造法に関する。〔従来の技術〕環状アデノシン−3′，5′−モノリン酸（以下ｃ
−AMPと略称する）は、生体内のセカンドメツ
センジヤーとして、さらに細胞膜機能、細胞や増
殖や分化に関与しているといわれている。このｃ
−AMPを分解して5′−アデノシンモノリン酸
（以下5′−AMPと略称する）にする酵素が環状ア
デノシン−3′，5′−モノリン酸ホスホジエステラ
ーゼ（以下PDEと略称する）であり、これを阻
害する物質は生体内のｃ−AMPレベルを上昇さ
せることから、種々の生理的効果、例えば気管支
拡張作用、強心作用、平滑筋弛緩作用、ホルモン
分泌促進作用等をもたらすことが知られている。従来、微生物が生産するPDE阻害剤としては、
PDE−、PDE−〔アグリカルチユアル・バ
イオロジカル・ケミストリー（Agr.Biol.
Chem.），42(7)，1331〜1336，1978〕、テルフエロ
ール（Terferol）〔ザ・ジヤーナル・オブ・アン
チバイオテイクス（The Joumal of
Antibiotics）、37(1)，６〜９，1984〕、CC−1065
〔同上、33(8)，902〜903，1980〕、レチクロール
（Reticulol）〔同上、28(7)，558〜560，1975〕等
が知られているが、これらはいずれも放線菌が産
生するものである。また細菌が産生するものとし
ては、APD−、APD−、APD−〔同上、
36，194〜196，1983〕が知られている。さらに、
化学的合成品でPDEを阻害するものとしては、
テオフイリン、パパベリン、ニカルジピン等が知
られており、これらは気管支拡張剤、血管拡張剤
等の医薬として用いられている。〔発明が解決しようとする問題点〕上記の如く微生物の産生する生理活性物質を探
索することは医療上有用であり、特にPDEを阻
害する物質の探索はその広範な薬理作用から医療
上ならびにｃ−AMP等の研究上極めて有用であ
る。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは新規な生理活性物質を得べく自然
界から多くの微生物を分離し、その生産物の生物
学的性質を調べていたところ、土壌より新たに分
離したノドウリスポリウム（Nodulisporium）属
に属する微生物中にPDEの活性を強力に阻害す
る物質が生産されることを見出した。そして該培
養物から、このPDE阻害物質を採取し、その理
化学的性質を調べた結果、後述の構造式を有する
４種の新規物質であることを確認し、その各々を
TPI−１、TPI−２、TPI−３、TPI−４と命名
した。さらに、本発明者らは、上記TPI−１、TPI−
２、TPI−３またはTPI−４にグリコシド結合加
水分解酵素を作用させてグリコシド結合を分解す
ることにより後述の構造式を有するグリコシド結
合脱離物質が得られることを知り、この物質を
TPI−５と命名した。本明細書ではTPI−１、TPI−２、TPI−３、
TPI−４およびTPI−５をTPIと総称する。すなわち、本発明は、式（式中、Ｒはβ−Ｄ−グルコピラノシル、β−
Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル基または水素原子を示
す）で表わされる新規生理活性物質TPIまたはそ
の塩およびその製造法を提供するものである。式（）において、Ｒがβ−Ｄ−グルコピラノ
シル基である物質がTPI−１であり、Ｒがβ−Ｄ
−ガラクトピラノシル基である物質がTPI−２で
あり、Ｒが6′−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル基である物質がTPI−３であり、Ｒが
6′−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
基である物質がTPI−４であり、Ｒが水素原子で
ある物質がTPI−５である。本発明者らによつて分離された式（式中、R′はβ−Ｄ−グルコピラノシル、β
−Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−
β−Ｄ−グルコピラノシルまたは6′−Ｏ−アセチ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を示す）で表
わされる生理活性物質TPI（）を生産する菌株
M5220株は次の菌学的性質を有する。 (1) 形態的特徴 M5220株はツアペツク寒天培地、麦芽汁寒天培
地、バレイシヨ・ブトウ糖寒天培地上で培養し、
観察した所見は次の通りである。栄養菌糸は単生ないし菌糸束（Synnemata）
を形成し、黄褐色で幅2.5〜3.0μmに伸張し、その
壁は滑面である。分生子柄は大きさ50〜130×2.5
〜3.0μmで無色〜淡黄色であり、分岐をなし、隔
壁を有し、その壁は滑面である。分生子形成細胞
は分生子柄の先端に単生または２〜３輪生し、大
きさ６〜20×2.0〜2.5μmで無色〜淡黄色である。
分生子形成様式はシンポジユロスポラ型
（Sympodulosporae）である。形成した分生子は
無色、楕円形で基部はやや細くなつており、大き
さ3.0〜5.0×2.0〜2.8μmで、１細胞で壁は滑面で
ある。 (2) 各培地における生育状態各種培地上で、26℃、10日間培養し、観察した
所見は次の通りである。なお、色の表示はエイ．
コーネラツプアンドジエ．エツチ．ワンシヤ
ー、メターンハンドブツクオブカラー第３
版、イエールメターン、ロンドン〔A.
Kornerup and J.H.Wanscher、Methuen
handbook of colour、3rded.、Eyre Methuen、
London（1978）〕に従つた。ツアペツク寒天培地生育は遅く26℃10日間で直径11〜13mm。菌業は
平坦でビロード状〜やや綿毛状。色は暗緑色
（dark green 30F6）。周辺部は平滑。浸出液およ
び拡散性色素は出さない。裏面は暗緑色（dark
green 27F5）。麦芽汁寒天培地生育は遅く26℃10日間で直径15〜17mm。菌業は
厚く盛り上がりやや綿毛状。色は暗緑色（dark
green 27F3）。周辺部は平滑。浸出液および拡散
性色素は出さない。裏面は暗緑色（dark green
27F3）。バレイシヨブドウ糖寒天培地生育は遅く26℃10日間で直径15〜16mm。菌業は
厚く盛り上がりやや綿毛状。色は暗緑色（dark green 27F3）。周辺部は平
滑。浸出液および拡散性色素は出さない。裏面は
暗緑色（dark green 27F3）。 (3) 生理的性質生育PH範囲：１〜9.5 最適生育PH：３〜７生育温度範囲：13〜40℃ 最適生育温度：25〜30℃ 以上の菌学的性質、特に有性生殖をせず分生子
を形成し、菌糸は隔壁をもつことから、本菌株は
不完全菌に属する。また本菌株は、分生子形成様
式がシンポジユロスポラ型であり、分生子柄がよ
く分岐し、分生子形成細胞はしばしば輪生する等
の特色からノドウリスポリウム属に属する菌株で
ある。よつて、本菌株を公知のものと区別するため、
ノドウリスポリウムエスピー．M5220
（Nodulisporium sp.M5220）と命名し、工業技
術院微生物工業研究所に受託番号微工研菌寄第
8133号（FERMP−8133）として寄託した。本発明の生理活性物質TPI（）は、例えばノ
ドウリスポリウム属に属する生理活性物質TPI
（）生産菌を培養し、その培養物中から生理活
性物質TPI（）を採取することにより製造され
る。本発明で使用される生理活性物質TPI（）生
産菌としては、前述のノドウリスポリウムエス
ピー．M5220があげられるが、自然変異株、人工
変異株も含め、ノドウリスポリウム属に属し生理
活性物質TPI（）を生産する能力を有する菌株
は全て本発明に使用することができる。本発明方法において、培養はカビの培養に一般
に用いられている条件によつて行うことができ
る。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、消
化し得る窒素源、さらには必要に応じ無機塩、ビ
タミン類などを含有させた栄養培地が使用され
る。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
マルトース、シユクロース、ラクトース、ガラク
トース、デキストリン、澱粉、グリセリン、ソル
ビトール等の糖類及び大豆油等の植物性油脂類等
が単独または組合せて用いられる。窒素源として
はペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿
実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、
カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、
硝酸塩類等が単独または組合せて用いられる。そ
の他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、鉄塩、
マンガン塩等の無機塩類やビタミンＢ類、パント
テン酸カルシウム等のビタミン類等が適宜添加さ
れる。培養にあたつては、上記栄養源を含有すれば培
地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を
用い、振盪培養又は通気攪拌培養を行うのが好ま
しい。培地のPHは３〜７、培養温度は25〜30℃が
好ましい。培養時間は液体培養の場合、通常２〜
10日であるが、培養物中の生理活性物質TPI（）
の蓄積量は約５日で最大に達するので、この時点
で培養を終了するのが好ましい。これらの培地組
成、培地の液性、培養温度、培養時間等の培養条
件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じ
て好ましい結果が得られるように適宜調節、選択
されることは言うまでもない。液体培養において
発砲があるときは、シリコン油、植物油、界面活
性剤などの消泡剤が適宜使用される。このようにして得られた生理活性物質TPI（）
は主として培養液中に存在するので、培養物を
過補助剤、例えばセライト、パーライト、ハイ
フロースーパーセル等を加えて過するか、また
は遠心分離して培養液と菌体とに分離し、その
培養液から生理活性物質TPI（）を採取する
のが有利である。培養液から生理活性物質TPI（）を分離、
精製するためには、液を非親水性有機溶媒、例
えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノールなどで
抽出し、その抽出液を濃縮することにより粗成物
として生理活性物質TPI（）が得られる。更に
精製するには、シリカゲル、活性アルミナ、活性
炭、非イオン性吸着樹脂等による吸着クロマトグ
ラフイー、アルキル基結合シリカゲルによる逆相
分配クロマトグラフイー、ゲル過担体によるゲ
ル過等、通常の有機物質を分離、精製する手段
を適宜組合せて行なうことが好ましい。具体的に
は、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤を充填した
カラムに粗成物を吸着させた後、クロロホルム−
イソプロパノール−酢酸、酢酸エチル−イソプロ
パノール−酢酸、酢酸エチル−メタノール酢酸等
の混合溶媒を用いて溶出することにより行なわれ
る。目的物の溶出のチエツクはシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイー又はウシ心臓由来のPDEを用
いた阻害活性測定等により行なうことができる。これらのカラムクロマトグラフイーによりTPI
−１、TPI−２、TPI−３およびTPI−４を分離
し、各々単離することができる。式（）におけ
るＲが水素原子であるTPI−５、即ち式（式中、R″は水素原子を示す）で表わされる
生理活性物質TPIは、式（）で表わされる生理
活性物質TPIまたはその塩に水性媒体中グリコシ
ド結合加水分解酵素またはその処理物を作用させ
てグリコシド結合を酵素的に分解することにより
得られる。グリコシド結合加水分解酵素としては、TPI
（）がTPI−１またはTPI−３物質である場合
はβ−グリコシダーゼを用いればよく、TPI（）
がTPI−２またはTPI−４物質である場合はβ−
ガラクトシダーゼを用いればよい。上記の酵素は動物、植物、微生物のいずれの由
来のグリコシド結合加水分解酵素でもよく、通常
は市販されているβ−グルコシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼが用いられる。前記酵素が微生物由来である場合には、その酵
素生産菌により菌体外酵素または菌体内酵素とし
て存在する。菌体外酵素である場合は、本酵素生
産菌の培養物から除菌した培養液から公知の酵
素分離精製手段により種々の段階に精製された酵
素剤が用いられる。菌体内酵素である場合は、本
酵素生産菌の培養物から得た生菌体の形態で使用
し得る。さらにまた物理的あるいは化学的方法に
よる菌体処理物、例えばアセトン、メタノール、
エタノールなどの親水性有機溶媒による乾燥菌体
磨砕、超音波などの処理による菌体破壊物、セチ
ルピルジウムクロライド、界面活性剤などの処理
による菌体溶解物あるいはこれらから公知の酵素
分離精製手段により分離した酵素剤も本発明にお
いて使用し得る。前記酵素の処理物とは、上述した如く、本酵素
活性を有し、種々の形態で存在するものを意味す
るが、これに限らず、適当な担体に固定化された
固定化酵素あるいは固定化酵素生産菌体を意味す
る。上記の固定化酵素あるいは固定化菌体は、公知
の固定化酵素および固定化菌体を製造する方法に
より調製することができる。例えば酵素を共有結
合法、イオン結合法、物理的吸着法などの担体結
合法により固定化する方法、酵素または菌体を架
橋法により固定化する方法、酵素または菌体を半
透膜性のポリマーの皮膜によつてマイクロカプセ
ル状、中空系状、膜状などに被覆した包括法ある
いは格子型包括法により固定化する方法により行
うことができる。上記の如く、本酵素またはその
生産菌体を固定化することにより連続的に使用で
きる。上記の酵素反応は、該酵素の至適PHの範囲で行
うのが好ましい。反応温度は該酵素の至適温度の
範囲で行うのが好ましいが、通常は25〜37℃程度
で行われる。反応時間は、生成されるTPI−５を
薄層クロマトグラフイー（TLC）、高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）などにより追跡できる
ので、TPI−５が最大に蓄積されるのを待つて適
宜反応を終了すればよい。上記酵素を固定化酵素
あるいは固定化菌体の形態で使用する場合には、
連続的に酵素反応を行わせることができる。このようにして得られた酵素反応液からTPI−
５を採取するには、反応液のPHを酸性にし、酢酸
エチル、酢酸ブチル、ブタノールなどの非親水性
有機溶媒で抽出し、その抽出液を濃縮することに
より粗成物として得られる。更に精製するには、
生理活性物質TPI（）の分離精製方法と同様に
クロマトグラフイー、ゲル過などにより精製す
ることができる。生理活性物質TPIを塩とするには、粗成物の段
階で常法により塩とすることもできるが、単離後
に塩に変換するのが好ましい。好ましい塩として
は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土
類金属塩、アルミニウム塩、その他の金属塩、ア
ンモニウム塩、公知の塩基性アミノ酸との塩、公
知の有機アミンとの塩などが挙げられる。以上の如くして得られた生理活性物質TPIの
各々の理化学的性質について以下の通り示す。〈生理活性物質TPI−１〉物質の色及び性状白色粉末中性、酸性、塩基性の区別酸性元素分析（C₃₄H₄₈O₁₂・３／2H₂Ｏとして）ＣＨ実測値 60.43％ 7.48％理論値 60.44％ 7.56％分子式 C₃₄H₄₈O₁₂ 分子量（FABマススペクトルによる） 648 比旋光度〔α〕²⁵ _D−20.6°（Ｃ＝1.0、MeOH）紫外部吸収スペクトル MeOH又は酸性MeOH中 λ max（nm）：253（Ｅ１％１cm250） 311肩アルカリ性MeOH中 λ max（nm）：240肩 300（Ｅ１％１cm350）（第１図）赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2930、2850、1720、1590、1470、1430、
1370、1340、1250、1170、1140、1060cm^-1に特
徴的な吸収帯を有する。（第６図）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.88（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.68（ｔ，2H）、2.94（ｔ，2H） 3.40〜4.00（5H）、4.89（ｄ，1H） 6.42（ｄ，1H）、6.61（ｄ，ｄ，2H） 6.71（ｄ，1H）Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.1(s)、168.2(s)、164.2(s)、161.8(s)、
158.4(s)、156.0(s)、149.1(s)、145.2(s)、
116.5(d)、116.1(s)、113.5(s)、112.1(d)、
109.3(d)、103.4(d)、102.7(d)、78.6(d)、78.4
(d)、75.3(d)、71.6(d)、63.0(t)、37.2(t)、35.2
(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0(t)、31.1
(t)、30.9(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0(t)、24.0
(t)、14.8(q)、14.8(q)、溶解性メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。呈色反応過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用）展開溶媒 Rf値クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.25 （10：４：0.1）酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.36 （10：４：0.1）酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.17 （６：６：0.1）クロロホルム：メタノール：酢酸 0.38 （10：２：0.1）〈生理活性物質TPI−２〉物質の色及び性状白色粉末中性、酸性、塩基性の区別酸性元素分析（C₃₄H₄₈O₁₂・H₂Ｏとして）ＣＨ実測値 61.79％ 7.56％理論値 61.26％ 7.51％分子式 C₃₄H₄₈O₁₂ 分子量（FABマススペクトルによる） 648 比旋光度〔α〕²⁵ _D−12.6°（Ｃ＝0.9、MeOH）紫外部吸収スペクトル MeOH又は酸性MeOH中 λ max（nm）：253（Ｅ１％１cm230） 311肩アルカリ性MeOH中 λ max（nm）：240肩 300（Ｅ１％１cm325）（第２図）赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2930、2850、1720、1600、1470、1410、
1320、1240、1170、1140、1050cm^-1に特徴的な
吸収帯を有する。（第７図）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.87（ｔ，3H）、0.89（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.60（ｍ，4H） 2.68（ｔ，2H）、2.94（ｔ，2H） 3.50〜4.00（5H）、4.88（ｄ，1H） 6.42（ｄ，1H）、6.64（ｄ，ｄ，2H） 6.74（ｄ，1H）Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.1(s)、168.2(s)、164.2(s)、161.8(s)、
158.6(s)、156.0(s)、149.1(s)、145.2(s)、
116.6(d)、116.1(s)、113.4(s)、112.1(d)、
109.4(d)、104.1(d)、102.8(d)、77.4(d)、75.3
(d)、72.7(d)、70.5(d)、62.7(t)、37.2(t)、35.2
(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0(t)、31.1
(t)、31.0(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0(t)、24.0
(t)、14.8(q)、14.8(q)、溶解性メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。呈色反応過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用）展開溶媒 Rf値クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.19 （10：４：0.1）酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.21 （10：４：0.1）酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.14 （６：６：0.1）クロロホルム：メタノール：酢酸 0.22 （10：２：0.1）〈生理活性物質TPI−３〉物質の色及び性状白色粉末中性、酸性、塩基性の区別酸性元素分析ＣＨ実測値 61.93％ 7.36％理論値 62.59％ 7.30％分子式 C₃₆H₅₀O₁₃ 分子量（FABマススペクトルによる） 690 比旋光度〔α〕²⁵ _D−19.6°（Ｃ＝0.6、MeOH）紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax(on)：252（Ｅ１％１cm184） 310肩（第３図）赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2925、2850、1720、1650、1600、1460、
1240、1130、1040cm^-1に特徴的な吸収帯を有す
る。（第８図）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.88（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.08（ｓ，3H）、2.68（ｔ，2H） 2.94（ｔ，2H）、3.20〜4.00（ｍ，3H）、4.00
〜4.60（ｍ，2H） 4.35（ｄ，1H）、6.44（ｄ，1H） 6.59（ｄ，ｄ，2H）6.73（ｄ，1H）Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.2(s)、173.1(s)、167.9(s)、164.4(s)、
161.7(s)、158.3(s)、156.0(s)、149.2(s)、
145.2(s)、116.5(d)、116.3(s)、113.3(s)、
112.1(d)、109.4(d)、103.3(d)、103.0(d)、78.3
(d)、75.8(d)、75.2(d)、71.8(d)、65.0(t)、37.2
(t)、35.2(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、32.9
(t)、31.1(t)、30.9(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0
(t)、24.0(t)、21.0(q)、14.8(q)、14.8(q) 溶解性メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。呈色反応過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用）展開溶媒 Rf値クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.54 （10：４：0.1）酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.51 （10：４：0.1）酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.35 （６：６：0.1）クロロホルム：メタノール：酢酸 0.52 （10：２：0.1）〈生理活性物質TPI−４〉物質の色及び性状白色粉末中性、酸性、塩基性の区別酸性元素分析ＣＨ実測値 62.35％ 7.57％理論値 62.59％ 7.30％分子式 C₃₆H₅₀O₁₃ 分子量（FABマススペクトルによる） 690 比旋光度〔α〕²⁵ _D−13.3（Ｃ＝0.4、MeOH）紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax（nm）：252（Ｅ１％１cm172） 310肩（第４図）赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3420、2930、2860、1730、1660、1610、1470、
1240、1140、1040cm^-1に特徴的な吸収帯を有す
る。（第９図）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.87（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.73（ｓ，3H）、2.68（ｔ，2H） 2.95（ｔ，2H）、3.20〜4.00（ｍ，2H）、4.00
〜4.60（ｍ，2H） 4.87（ｄ，1H）、6.43（ｄ，1H） 6.60（ｄ，ｄ，2H）6.73（ｄ，1H）Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.2(s)、173.0(s)、168.0(s)、164.2(s)、
161.8(s)、158.4(s)、156.0(s)、149.1(s)、
145.2(s)、116.5(d)、116.1(s)、113.5(s)、
111.9(d)、109.4(d)、103.7(d)、102.9(d)、75.2
(d)、74.7(d)、72.5(d)、70.4(d)、64.9(t)、37.2
(t)、35.2(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0
(t)、31.1(t)、31.0(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0
(t)、24.0(t)、21.0(q)、14.8(q)、14.8(q) 溶解性メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。呈色反応過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用）展開溶媒 Rf値クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.46 （10：４：0.1）酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.43 （10：４：0.1）酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.29 （６：６：0.1）クロロホルム：メタノール：酢酸 0.48 （10：２：0.1）〈生理活性物質TPI−５〉物質の色及び性状白色粉末中性、酸性、塩基性の区別酸性元素分析ＣＨ実測値 69.30％ 7.72％理論値 69.11％ 7.87％分子式 C₂₈H₃₈O₇ 分子量） 486 紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax（nm）：271（Ｅ１％１cm389） 305肩（Ｅ１％１cm243）（第５図）赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3320、2920、2850、1650、1600、1580、1450、
1300、1240、1200、1140、1060cm^-1に特徴的な
吸収帯を有する。（第１０図）プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホ
ルム中、100MHz） δ（ppm）：0.85（ｔ，3H）、0.88（ｔ，3H） 1.27（ｍ，20H）、1.60（ｍ，4H） 3.02（ｔ，ｔ，4H）、6.32（ｓ，2H） 6.62（ｄ，1H）、6.74（ｄ，1H） 11.27（ｓ，1H）Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重クロロホル
ム中、25MHz） 174.7(s)、169.3(s)、166.3(s)、165.3(s)、
161.4(s)、155.0(s)、150.0(s)、149.5(s)、
116.2(d)、111.5(d)、109.0(d)、108.7(s)、
104.2(s)、101.8(d)、37.3(t)、36.7(t)、32.3
(t)、31.9(t)、31.9(t)、31.9(t)29.9(t)、29.9
(t)、29.3(t)、29.2(t)、22.8(t)、22.8(t)、14.2
(q)、14.2(q) 溶解性メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、石油エーテ
ルに不溶。呈色反応過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応陽性。ニンヒドリン反応、ヨードホルム
反応、モーリツシユ反応陰性。薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用）展開溶媒 Rf値クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.87 （10：４：0.1）酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.68 （10：４：0.1）酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.78 （６：６：0.1）クロロホルム：メタノール：酢酸 0.77 （10：２：0.1）上記理化学的性質から、本発明の生理活性物質
TPI−３、TPI−４およびTPI−５は前述の式
（）で表わされる構造を有するものと推定され
る。本発明の生理活性物質TPIは、従来の微生物が
生産するPDE阻害物質とは全く異なる新規物質
である。すなわち、前述のPDE−、PDE−、
CC−1065、APD−、APD−およびAPD−
は何れも含窒素化合物であり、レクチクロー
ル、テルフエロールはそれぞれC₁₁H₁₀O₅、C₁₉
H₁₆O₃の分子式を有する化合物であり、本発明の
物質とは明瞭に異なる。〔作用〕本発明の生理活性物質TPIは強力なPDE阻害活
性を有する。以下にウシ心臓由来のPDE
（EC3.1.4.17）活性に対する作用を示す。方法酵素反応液1.0mlに40mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.5）2mM塩化マグネシウム、0.4mMc−
AMP、PDE（30μｇ蛋白量、ベーリンガーマンハ
イム社製）と被験物質を添加し、30℃で30分間反
応させ、次いで55％トリクロル酢酸0.1mlを加え
て反応を停止後、生成する5′−AMP量を高速液
体クロマトグラフイー（日立、655システム）を
用い測定した。高速液体クロマトの測定条件は、
カラム：日立＃3056 ４×150mm、移動層10mM
KH₂PO₄（PH2.0）：MeOH（10：１）、流速1.5ml／
min、検出262mμ。阻害率は次の式により算出し
た。阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×100（％）Ａ：被験物質を含まない場合の5′−AMP量Ｂ：被験物質添加の場合の5′−AMP量阻害
率50％の時の被験物質濃度IC₅₀を求めた結果を以
下に示す。結果被験物質 IC₅₀濃度（μｇ／ml） TPI−１ 2.8 TPI−２ 5.4 TPI−３ 2.8 TPI−４ 3.5 TPI−５ 2.3 パパベリン 25 ニカルジピン 6.0 テオフイリン 470 さらに、TPI−１をマウスに100mg／Kg腹腔内
投与しても死亡例はなかつた。〔発明の効果〕叙上の如く、本発明の生理活性物質TPIはPDE
活性を強力に阻害するだけでなく、安全性も高い
ことから、気管支拡張剤、強心剤、平滑筋弛緩
剤、ホルモン分泌促進剤等の医薬あるいは研究用
試薬として有用である。〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例１ノドウリスポリウム・エスピーM5220株（微工
研菌寄第8133号）の斜面培地から一白金耳を、グ
ルコース２％、ペプトン１％、CSL1％、リン酸
第一カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1％、セ
ライト１％を含む培地（PH6.5）100mlを500ml容
三角フラスコに分注し、120℃、20分間オートク
レイブ減菌したものに接種し、26℃、４日間振盪
培養し、これを種母とした。この種母をグルコー
ス５％、フアーマメデイア２％、CSL0.5％、リ
ン酸第二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.1
％、炭酸カルシウム0.5％、硫酸第一鉄0.0005％、
硫酸亜鉛0.0002％、塩化コバルト0.00013％。硫
酸マンガン0.0003％、硫酸銅0.0002％（PH7.0）の
組成からなる減菌培地100mlを入れた500ml三角フ
ラスコに３％接種し26℃、５日間振盪培養を行つ
た。この様にして得た培養液10を遠心により菌
体を除き、培養遠心上清液8.5を得た。この上
清液に酢酸エチル５を加え、攪拌しながら
2N・HCl水溶液を滴下してPH２に調整し、酢酸
エチル抽出を行ない酢酸エチル4.5を得た。
TPI物質の大部分は酢酸エチル層に移つた。この
酢酸エチルに水３を加え、攪拌しながら、濃ア
ンモニア水を添加しPH９にし、TPI物質の大部分
を水に転溶させた。得られた水層３に酢酸エチ
ル２を加え、攪拌しながら2N・HCl水溶液に
てPH２に調整し、酢酸エチル抽出を行ない、約２
の酢酸エチル層を得た。この酢酸エチル層を無
水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮すると
約６ｇの茶褐色粉末が得られた。実施例２実施例１で得られたTPI物質を含有する粗粉末
６ｇを30mlのメタノールに溶解し、シリカゲル粉
末４ｇを加え、良く攪拌後減圧濃縮、乾燥してメ
タノールを除去後、あらかじめ、クロロホルム：
イソプロパノール：酢酸（10：２：0.1）の混合
溶媒にて充填したシリカゲルカラム（400ml）上
にのせ、同混合溶媒にて展開した。20ｇづつ分画
し、各分画についてクロロホルム：イソプロパノ
ール：酢酸（10：４：0.1）を展開溶媒としたシ
リカゲル薄層クロマトグラフイー（TLC）を行
ない、マナスルランプを用いた紫外部吸収検出、
又は過マンガン酸カリウム脱色反応検出により
Rf＝0.54、Rf＝0.46、Rf＝0.25及びRf＝0.19成分
を含有する画分を分取した。分画No.13〜No.28には
Rf＝0.54を示すTPI−３物質およびRf＝0.46を示
すTPI−４物質との混合物が含まれており、分画
No.71〜No.122にはRf＝0.25を示すTPI−１物質が
含まれており、分画No.123〜No.187にはRf＝0.25を
示すTPI−１物質とRf＝0.19を示すTPI−２物質
との混合物が含まれていた。分画No.13〜No.28を集め、20mlまで減圧濃縮し、
残渣を予め酢酸エチル：アセトン：酢酸（10：
６：0.1）の混合溶媒にて充填したシリカゲルカ
ラム（200ml）上にチヤージし、同混合溶媒で溶
出展開を行つた。溶出液は20ｇづつ分画し、各分
画について酢酸エチル：アセトン：酢酸（６：
６：0.1）を展開溶媒としたシリカゲルTLCを行
ない、マナスルランプ照射による紫外部検出およ
び過マンガン酸カリウム脱色反応による検出によ
り、Rf＝0.35およびRf＝0.29成分を含有する画分
を分取した。Rf＝0.35のみを示す物質を含有する
分画No.35〜No.40を集め、約３mlまで減圧濃縮し
た。残渣にｎ−ヘキサンを加えTPI−３物質を沈
澱させた。この沈澱物をグラスフイルター上に集
め、ｎ−ヘキサンで洗浄後、減圧乾燥してTPI−
３物質20mgを得た。 Rf＝0.29のみ示す物質を含有する分画No.48〜No.
69を集め、約３mlまで減圧濃縮した。残渣にｎ−
ヘキサンを加えTPI−４物質を沈澱させた。この
沈澱物をグラスフイルター上に集めｎ−ヘキサン
で洗浄後、減圧乾燥してTPI−４物質15mgを得
た。実施例３実施例２で得たRf＝0.25を示すTPI−１物質を
含む分画No.71〜No.122を集め、20mlまで濃縮後、
酢酸エチルを加え200mlとし、更に水200mlを加
え、激しく攪拌後、酢酸エチル層を分取し、減圧
下濃縮し、約10mlとし、ｎ−ヘキサンを加え、
TPI−１物質を沈澱させた。この沈澱物をグラス
フイルター上に集め、ｎ−ヘキサンで洗浄後減圧
乾燥して純粋なTPI−１物質として1.8ｇ得た。実施例２で得たRf＝0.25を示すTPI−１物質と
Rf＝0.19を示すTPI−２物質の混合物を含む分画
No.123〜No.187を集め、減圧濃縮し、約20mlのメタ
ノールに溶解させ、シリカゲル粉末２ｇを加え、
良く混合し、減圧下でメタノールを除去後、あら
かじめクロロホルム：メタノール：酢酸（10：
２：0.1）の混合溶媒にて作成したシリカゲルカ
ラム（200ml）上にチヤージし、同混合溶媒で溶
出展開を行つた。溶出液は20ｇづつ分画した。各
分画についてクロロホルム：イソプロパノール：
酢酸（10：４：0.1）を展開溶媒としたシリカゲ
ルT.L.Cを行ないマナスルランプ照射による紫外
部検出及び過マンガン酸カリウム脱色反応による
検出により、Rf＝0.19のみを示す物質を含有する
分画No.54〜No.130を集め、約20mlまで減圧濃縮し、
酢酸エチル200ml、水200mlを加え、激しく攪拌
し、酢酸エチル抽出を行い酢酸エチル層を分取
し、減圧濃縮して約10mlとし、ｎ−ヘキサンを加
えTPI−２物質を沈澱させた。この沈澱物をグラ
スフイルター上に集め、ｎ−ヘキサンで洗浄後、
減圧乾燥してTPI−２物質600mgを得た。実施例４実施例３で得たTPI−１物質50mgを0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.5）４mlに溶し、これにβ−グル
コシダーゼ（シグマ社製、4.6U／mg）４mgを加
え、26℃で７日間酵素反応を行うとTPI−１物質
の約50％がTPI−５物質に変換した。この反応液
をPH３に調節し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エ
チル層を分取し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、
減圧濃縮した。残渣を予めクロロホルム：メタノ
ール：酢酸（20：１：0.1）で充填したシリカゲ
ルカラム（28ml）上にチヤージし、同混合溶媒で
溶出展開を行つた。溶出液は５ｇづつ分画し、分
画No.28〜No.31を集め、減圧濃縮した。残渣にｎ−
ヘキサンを加え、TPI−５物質を沈澱させた。こ
の沈澱物をガラスフイルター上に集め、ｎ−ヘキ
サンで洗浄後、減圧乾燥してTPI−５物質の白色
粉末15mgを得た。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of Industrial Application] The present invention relates to a novel physiologically active substance TPI having cyclic adenosine-3',5'-monophosphate phosphodiesterase inhibitory activity and a method for producing the same. [Prior art] Cyclic adenosine-3',5'-monophosphoric acid (hereinafter referred to as c
-AMP) is said to be involved in cell membrane function, cell growth, and differentiation as a second messenger in living organisms. This c
The enzyme that decomposes -AMP into 5'-adenosine monophosphate (hereinafter abbreviated as 5'-AMP) is cyclic adenosine-3',5'-monophosphate phosphodiesterase (hereinafter abbreviated as PDE). It is known that inhibiting substances increase the c-AMP level in the living body, resulting in various physiological effects, such as bronchodilatory effects, cardiotonic effects, smooth muscle relaxing effects, and hormone secretion promoting effects. Conventionally, PDE inhibitors produced by microorganisms include:
PDE-, PDE- [Agricultural Biological Chemistry (Agr.Biol.
Chem.), 42 (7), 1331-1336, 1978], Terferol [The Journal of Antibiotics]
Antibiotics), 37 (1), 6-9, 1984], CC-1065
[Ibid., 33 (8), 902-903, 1980], Reticulol [Ibid., 28 (7), 558-560, 1975], etc. are known, but these are all produced by actinomycetes. It is something. In addition, bacteria produce APD-, APD-, APD- [same as above,
36, 194-196, 1983] is known. moreover,
Chemically synthesized products that inhibit PDE include:
Theophylline, papaverine, nicardipine, etc. are known, and these are used as pharmaceuticals such as bronchodilators and vasodilators. [Problems to be solved by the invention] As mentioned above, the search for physiologically active substances produced by microorganisms is medically useful, and in particular the search for substances that inhibit PDE is useful for medical and clinical purposes due to its wide range of pharmacological effects. - Extremely useful for research on AMP, etc. [Means for Solving the Problems] The present inventors isolated many microorganisms from nature in order to obtain new physiologically active substances, and while investigating the biological properties of their products, discovered that new microorganisms from soil We found that isolated microorganisms belonging to the genus Nodulisporium produce a substance that strongly inhibits the activity of PDE. Then, as a result of collecting this PDE inhibitor from the culture and examining its physical and chemical properties, it was confirmed that there are four new substances with the structural formulas described below.
They were named TPI-1, TPI-2, TPI-3, and TPI-4. Furthermore, the present inventors have discovered the above TPI-1, TPI-
2. We learned that a glycosidic bond-eliminating substance having the structural formula described below can be obtained by treating TPI-3 or TPI-4 with a glycosidic bond hydrolase to break down the glycosidic bond.
It was named TPI-5. In this specification, TPI-1, TPI-2, TPI-3,
TPI-4 and TPI-5 are collectively referred to as TPI. That is, the present invention provides the formula (wherein R is β-D-glucopyranosyl, β-
D-galactopyranosyl, 6'-O-acetyl-β
-D-glucopyranosyl, 6'-O-acetyl-β
The present invention provides a novel physiologically active substance TPI represented by -D-galactopyranosyl group or a hydrogen atom) or a salt thereof, and a method for producing the same. In formula (), a substance in which R is a β-D-glucopyranosyl group is TPI-1, and R is a β-D-glucopyranosyl group.
- The substance in which R is a 6′-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl group is TPI-2, and the substance in which R is a 6′-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl group, and R is TPI-2.
A substance in which R is a 6'-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl group is TPI-4, and a substance in which R is a hydrogen atom is TPI-5. The formula isolated by the inventors (In the formula, R' is β-D-glucopyranosyl, β
-D-galactopyranosyl, 6'-O-acetyl-
A strain that produces the physiologically active substance TPI (indicating β-D-glucopyranosyl or 6′-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl group)
Strain M5220 has the following mycological properties. (1) Morphological characteristics Strain M5220 was cultured on Czapetsk agar, wort agar, and potato-glucose agar.
The observed findings are as follows. Vegetative hyphae are solitary or hyphal bundles (Synnemata)
It is yellow-brown in color and elongated to a width of 2.5-3.0 μm, and its walls are smooth. Conidiophore size 50-130×2.5
It is ~3.0 μm, colorless to pale yellow, branched, and has septa, the walls of which are smooth. Conidiogenic cells grow singly or in whorls in 2-3 at the tip of the conidiophore, and are colorless to pale yellow in size, 6-20 x 2.0-2.5 μm.
The conidiation mode is Sympodulosporae. The conidia formed are colorless, oval, slightly tapered at the base, 3.0-5.0 x 2.0-2.8 μm in size, and have a single cell with a smooth wall. (2) Growth status on each medium The following findings were observed after culturing on various media at 26°C for 10 days. In addition, the color display is A.
Cornerup and Jie. Etsuchi. One Shear, Metan Handbook of Color No. 3
Edition, Yale Mettern, London [A.
Kornerup and J.H.Wanscher, Methuen
handbook of colour, 3rd., Eyre Methuen,
London (1978)]. Tuapetsk agar medium Growth is slow and grows to 11-13mm in diameter in 10 days at 26℃. The fungus is flat and velvety to slightly fluffy. The color is dark green (30F6). The periphery is smooth. Exudates and diffusible dyes are not released. The back side is dark green.
green 27F5). Wort agar medium Growth is slow and the diameter is 15-17mm in 10 days at 26℃. The fungi are thick and raised and slightly fluffy. The color is dark green
green 27F3). The periphery is smooth. Exudates and diffusible dyes are not released. The back side is dark green.
27F3). Potato Glucose Agar Medium Growth is slow and the diameter is 15-16 mm in 10 days at 26℃. The fungi are thick and raised and slightly fluffy. The color is dark green (dark green 27F3). The periphery is smooth. Exudates and diffusible dyes are not released. The back side is dark green (dark green 27F3). (3) Physiological properties Growth PH range: 1 to 9.5 Optimal growth PH: 3 to 7 Growth temperature range: 13 to 40°C Optimum growth temperature: 25 to 30°C Mycological properties, especially non-sexual reproduction Since it forms conidia and its hyphae have septa, this strain belongs to Deuteromycetes. In addition, this strain belongs to the genus Nodourisporium because of its conidial formation mode of the symposiulospora type, its conidiophores being well branched, and its conidial cells often forming whorls. Therefore, in order to distinguish this strain from known strains,
Nodourisporium sp. M5220
(Nodulisporium sp. M5220) and was given the accession number No.
Deposited as No. 8133 (FERMP-8133). The physiologically active substance TPI () of the present invention is, for example, a physiologically active substance TPI belonging to the genus Nodurisporium.
() It is produced by culturing the producing bacteria and collecting the physiologically active substance TPI () from the culture. The physiologically active substance TPI ()-producing bacteria used in the present invention include the aforementioned Nodourisporium sp. M5220 is mentioned, but all strains belonging to the genus Nodurisporium and having the ability to produce the physiologically active substance TPI () can be used in the present invention, including natural mutant strains and artificial mutant strains. In the method of the present invention, culturing can be carried out under conditions generally used for culturing molds. As the medium, a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, inorganic salts and vitamins, is used. Carbon sources include glucose, fructose,
Saccharides such as maltose, sucrose, lactose, galactose, dextrin, starch, glycerin, and sorbitol, vegetable oils and fats such as soybean oil, etc. are used alone or in combination. Nitrogen sources include peptone, yeast extract, meat extract, soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, malt extract,
casein, amino acids, urea, ammonium salts,
Nitrates and the like are used alone or in combination. Other phosphates, magnesium salts, calcium salts, sodium salts, potassium salts, iron salts,
Inorganic salts such as manganese salts, vitamin Bs, vitamins such as calcium pantothenate, etc. are added as appropriate. For culturing, the medium may be liquid or solid as long as it contains the above-mentioned nutrient source, but it is usually preferable to use a liquid medium and perform shaking culture or aerated agitation culture. The pH of the medium is preferably 3 to 7, and the culture temperature is preferably 25 to 30°C. In the case of liquid culture, the culture time is usually 2~
10 days, but the bioactive substance TPI () in the culture
Since the accumulated amount reaches its maximum in about 5 days, it is preferable to terminate the culture at this point. It goes without saying that culture conditions such as medium composition, medium liquid properties, culture temperature, culture time, etc. should be adjusted and selected as appropriate to obtain favorable results depending on the type of bacterial strain used and external conditions. . When foaming occurs in liquid culture, antifoaming agents such as silicone oil, vegetable oil, and surfactants are appropriately used. Physiologically active substance TPI () obtained in this way
is mainly present in the culture solution, so the culture is filtered by adding a super-adjuvant such as celite, perlite, high flow super cell, etc., or centrifuged to separate the culture solution and the bacterial cells. It is advantageous to collect the biologically active substance TPI () from the fluid. Separation of the physiologically active substance TPI () from the culture solution,
For purification, the liquid is extracted with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, butanol, etc., and the extract is concentrated to obtain the physiologically active substance TPI() as a crude product. For further purification, ordinary organic substances can be purified by adsorption chromatography using silica gel, activated alumina, activated carbon, nonionic adsorption resin, etc., reverse phase partition chromatography using alkyl group-bonded silica gel, gel filtration using a gel supercarrier, etc. It is preferable to use an appropriate combination of separation and purification means. Specifically, the crude product is adsorbed in a column filled with adsorbent such as silica gel or alumina, and then chloroform-
This is carried out by elution using a mixed solvent such as isopropanol-acetic acid, ethyl acetate-isopropanol-acetic acid, ethyl acetate-methanol acetic acid, or the like. Elution of the target product can be checked by silica gel thin layer chromatography or inhibitory activity measurement using PDE derived from bovine heart. TPI by these column chromatography
-1, TPI-2, TPI-3 and TPI-4 can be separated and each isolated. TPI-5 in which R in formula () is a hydrogen atom, that is, formula The physiologically active substance TPI represented by the formula (in which R'' represents a hydrogen atom) is obtained by treating the physiologically active substance TPI represented by the formula () or a salt thereof with a glycosidic bond hydrolase or a treated product thereof in an aqueous medium. It is obtained by enzymatically decomposing glycosidic bonds. Glycosidic bond hydrolases include TPI
If () is a TPI-1 or TPI-3 substance, β-glycosidase may be used;
is a TPI-2 or TPI-4 substance, β-
Galactosidase may be used. The above-mentioned enzyme may be a glycoside bond hydrolase derived from any animal, plant, or microorganism, and commercially available β-glucosidase and β-galactosidase are usually used. When the enzyme is derived from a microorganism, it exists as an extracellular enzyme or an intracellular enzyme depending on the enzyme-producing microorganism. In the case of an extracellular enzyme, an enzyme preparation is used that has been purified to various stages by known enzyme separation and purification means from a culture solution sterilized from a culture of the present enzyme-producing bacterium. When the enzyme is an intracellular enzyme, it can be used in the form of live cells obtained from a culture of the enzyme-producing microorganism. Furthermore, bacterial cells treated by physical or chemical methods, such as acetone, methanol,
Dry bacterial cell grinding with a hydrophilic organic solvent such as ethanol, bacterial cell disrupted material by treatment with ultrasound, etc., bacterial cell lysate by treatment with cetylpyridium chloride, surfactant, etc., or known enzyme separation and purification means from these. Enzyme agents separated by can also be used in the present invention. As mentioned above, the processed product of the enzyme means a product that has the present enzyme activity and exists in various forms, but is not limited to this, and is not limited to an immobilized enzyme immobilized on a suitable carrier or an immobilized product. It means an enzyme-producing bacterial cell. The above-mentioned immobilized enzyme or immobilized bacterial cells can be prepared by a known method for producing immobilized enzymes and immobilized bacterial cells. For example, methods in which enzymes are immobilized by carrier binding methods such as covalent bonding, ionic bonding, and physical adsorption; methods in which enzymes or bacterial cells are immobilized by crosslinking; and enzymes or bacterial cells are immobilized in semipermeable polymers. Immobilization can be carried out by an entrapping method in which a microcapsule-like, hollow-system-like, film-like, etc. film is coated with a film, or a lattice-type entrapping method. As mentioned above, by immobilizing the present enzyme or the microbial cells that produce it, it can be used continuously. The above enzymatic reaction is preferably carried out within the optimal pH range of the enzyme. The reaction temperature is preferably carried out within the optimum temperature range of the enzyme, but is usually carried out at about 25 to 37°C. The reaction time can be monitored by thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), etc. to track the TPI-5 produced, so wait for the maximum amount of TPI-5 to accumulate and proceed with the reaction as appropriate. Just finish it. When using the above enzymes in the form of immobilized enzymes or immobilized bacterial cells,
Enzyme reactions can be carried out continuously. From the enzyme reaction solution obtained in this way, TPI-
5 can be obtained as a crude product by making the pH of the reaction solution acidic, extracting with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, or butanol, and concentrating the extract. For further refinement,
It can be purified by chromatography, gel filtration, etc. in the same way as the separation and purification method of the physiologically active substance TPI (). To convert the physiologically active substance TPI into a salt, it can be converted into a salt in the crude product stage by a conventional method, but it is preferable to convert it into a salt after isolation. Preferred salts include alkali metal salts such as sodium and potassium, alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium, aluminum salts, other metal salts, ammonium salts, salts with known basic amino acids, and salts with known organic amines. Examples include salt. The physicochemical properties of each of the physiologically active substances TPI obtained as described above are shown below. <Physiologically active substance TPI-1> Color and properties of substance White powder Distinction between neutral, acidic, and basic Acidic Elemental analysis (as C ₃₄ H ₄₈ O ₁₂・3/2H ₂ O) C H Actual value 60.43% 7.48% Theoretical value 60.44% 7.56% Molecular formula C ₃₄ H ₄₈ O ₁₂ Molecular weight (according to FAB mass spectrum) 648 Specific rotation [α] ²⁵ _D −20.6° (C=1.0, MeOH) Ultraviolet absorption spectrum In MeOH or acidic MeOH λ max (nm): 253 (E1% 1cm250) 311 shoulder in alkaline MeOH λ max (nm): 240 shoulder 300 (E1% 1cm350) (Figure 1) Infrared absorption spectrum (KBr method) 3400, 2930, 2850, 1720, 1590, 1470, 1430,
It has characteristic absorption bands at 1370, 1340, 1250, 1170, 1140, and 1060 cm ^-1 . (Figure 6) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 100MHz) δ (ppm): 0.88 (t, 3H), 0.90 (t, 3H) 1.31 (m, 20H), 1.61 (m, 4H) 2.68 ( C-13 nuclear magnetism Resonance spectrum (in heavy methanol, 25MHz) 174.1(s), 168.2(s), 164.2(s), 161.8(s),
158.4(s), 156.0(s), 149.1(s), 145.2(s),
116.5(d), 116.1(s), 113.5(s), 112.1(d),
109.3(d), 103.4(d), 102.7(d), 78.6(d), 78.4
(d), 75.3(d), 71.6(d), 63.0(t), 37.2(t), 35.2
(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0(t), 31.1
(t), 30.9(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0
(t), 14.8(q), 14.8(q), Solubility Soluble in lower alcohols such as methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and alkaline water. hexane, benzene,
Insoluble in petroleum ether. Color reaction Potassium permanganate reaction, ferric chloride reaction,
Iodine reaction and Mauritsch reaction positive. Ninhydrin reaction and iodoform reaction were negative. Thin layer chromatography (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., using silica gel f) Developing solvent Rf value Chloroform: Isopropanol: Acetic acid 0.25 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Isopropanol: Acetic acid 0.36 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Acetone : Acetic acid 0.17 (6:6:0.1) Chloroform: Methanol: Acetic acid 0.38 (10:2:0.1) <Physiologically active substance TPI-2> Color and properties of substance White powder Distinction between neutral, acidic, and basic Acidic Elemental analysis (As C ₃₄ H ₄₈ O ₁₂・H ₂ O) C H Actual value 61.79% 7.56% Theoretical value 61.26% 7.51% Molecular formula C ₃₄ H ₄₈ O ₁₂ Molecular weight (according to FAB mass spectrum) 648 Specific optical rotation [α] ²⁵ _D -12.6° (C=0.9, MeOH) Ultraviolet absorption spectrum In MeOH or acidic MeOH λ max (nm): 253 (E1% 1 cm230) 311 shoulder In alkaline MeOH λ max (nm): 240 shoulder 300 (E1% 1 cm325) (Figure 2) Infrared absorption spectrum (KBr method) 3400, 2930, 2850, 1720, 1600, 1470, 1410,
It has characteristic absorption bands at 1320, 1240, 1170, 1140, and 1050 cm ^-1 . (Figure 7) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 100MHz) δ (ppm): 0.87 (t, 3H), 0.89 (t, 3H) 1.31 (m, 20H), 1.60 (m, 4H) 2.68 ( C-13 nuclear magnetism Resonance spectrum (in heavy methanol, 25MHz) 174.1(s), 168.2(s), 164.2(s), 161.8(s),
158.6(s), 156.0(s), 149.1(s), 145.2(s),
116.6(d), 116.1(s), 113.4(s), 112.1(d),
109.4(d), 104.1(d), 102.8(d), 77.4(d), 75.3
(d), 72.7(d), 70.5(d), 62.7(t), 37.2(t), 35.2
(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0(t), 31.1
(t), 31.0(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0(t), 24.0
(t), 14.8(q), 14.8(q), Solubility Soluble in lower alcohols such as methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and alkaline water. hexane, benzene,
Insoluble in petroleum ether. Color reaction Potassium permanganate reaction, ferric chloride reaction,
Iodine reaction and Mauritsch reaction positive. Ninhydrin reaction and iodoform reaction were negative. Thin layer chromatography (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., using silica gel f) Developing solvent Rf value Chloroform: Isopropanol: Acetic acid 0.19 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Isopropanol: Acetic acid 0.21 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Acetone : Acetic acid 0.14 (6:6:0.1) Chloroform: Methanol: Acetic acid 0.22 (10:2:0.1) <Physiologically active substance TPI-3> Color and properties of substance White powder Distinction between neutral, acidic, and basic Acidic Elemental analysis C H Actual value 61.93% 7.36% Theoretical value 62.59% 7.30% Molecular formula C ₃₆ H ₅₀ O ₁₃ Molecular weight (according to FAB mass spectrum) 690 Specific rotation [α] ²⁵ _D −19.6° (C=0.6, MeOH) Ultraviolet absorption Spectrum λ ^MeOH _nax(on) : 252 (E1% 1cm184) 310 shoulder (Figure 3) Infrared absorption spectrum (KBr method) 3400, 2925, 2850, 1720, 1650, 1600, 1460,
It has characteristic absorption bands at 1240, 1130, and 1040 cm ^-1 . (Figure 8) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 100MHz) δ (ppm): 0.88 (t, 3H), 0.90 (t, 3H) 1.31 (m, 20H), 1.61 (m, 4H) 2.08 ( s, 3H), 2.68 (t, 2H) 2.94 (t, 2H), 3.20~4.00 (m, 3H), 4.00
~4.60 (m, 2H) 4.35 (d, 1H), 6.44 (d, 1H) 6.59 (d, d, 2H) 6.73 (d, 1H) C-13 nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 25MHz) 174.2( s), 173.1(s), 167.9(s), 164.4(s),
161.7(s), 158.3(s), 156.0(s), 149.2(s),
145.2(s), 116.5(d), 116.3(s), 113.3(s),
112.1(d), 109.4(d), 103.3(d), 103.0(d), 78.3
(d), 75.8(d), 75.2(d), 71.8(d), 65.0(t), 37.2
(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 32.9
(t), 31.1(t), 30.9(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0
(t), 24.0(t), 21.0(q), 14.8(q), 14.8(q) Solubility Soluble in lower alcohols such as methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and alkaline water. hexane, benzene,
Insoluble in petroleum ether. Color reaction Potassium permanganate reaction, ferric chloride reaction,
Iodine reaction and Mauritsch reaction positive. Ninhydrin reaction and iodoform reaction were negative. Thin layer chromatography (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., using silica gel f) Developing solvent Rf value Chloroform: Isopropanol: Acetic acid 0.54 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Isopropanol: Acetic acid 0.51 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Acetone : Acetic acid 0.35 (6:6:0.1) Chloroform: Methanol: Acetic acid 0.52 (10:2:0.1) <Physiologically active substance TPI-4> Color and properties of substance White powder Distinction between neutral, acidic, and basic Acidic Elemental analysis C H Actual value 62.35% 7.57% Theoretical value 62.59% 7.30% Molecular formula C ₃₆ H ₅₀ O ₁₃ Molecular weight (according to FAB mass spectrum) 690 Specific optical rotation [α] ²⁵ _D −13.3 (C=0.4, MeOH) Ultraviolet absorption spectrum λ ^MeOH _nax (nm): 252 (E1% 1cm172) 310 shoulder (Figure 4) Infrared absorption spectrum (KBr method) 3420, 2930, 2860, 1730, 1660, 1610, 1470,
It has characteristic absorption bands at 1240, 1140, and 1040 cm ^-1 . (Figure 9) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 100MHz) δ (ppm): 0.87 (t, 3H), 0.90 (t, 3H) 1.31 (m, 20H), 1.61 (m, 4H) 2.73 ( s, 3H), 2.68 (t, 2H) 2.95 (t, 2H), 3.20~4.00 (m, 2H), 4.00
~4.60 (m, 2H) 4.87 (d, 1H), 6.43 (d, 1H) 6.60 (d, d, 2H) 6.73 (d, 1H) C-13 nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol, 25MHz) 174.2( s), 173.0(s), 168.0(s), 164.2(s),
161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.1(s),
145.2(s), 116.5(d), 116.1(s), 113.5(s),
111.9(d), 109.4(d), 103.7(d), 102.9(d), 75.2
(d), 74.7(d), 72.5(d), 70.4(d), 64.9(t), 37.2
(t), 35.2(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.3(t), 33.0
(t), 31.1(t), 31.0(t), 30.6(t), 30.6(t), 24.0
(t), 24.0(t), 21.0(q), 14.8(q), 14.8(q) Solubility Soluble in lower alcohols such as methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and alkaline water. hexane, benzene,
Insoluble in petroleum ether. Color reaction Potassium permanganate reaction, ferric chloride reaction,
Iodine reaction and Mauritsch reaction positive. Ninhydrin reaction and iodoform reaction were negative. Thin layer chromatography (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., using silica gel f) Developing solvent Rf value Chloroform: Isopropanol: Acetic acid 0.46 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Isopropanol: Acetic acid 0.43 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Acetone : Acetic acid 0.29 (6:6:0.1) Chloroform: Methanol: Acetic acid 0.48 (10:2:0.1) <Physiologically active substance TPI-5> Color and properties of substance White powder Distinction between neutral, acidic, and basic Acidic Elemental analysis C H Actual value 69.30% 7.72% Theoretical value 69.11% 7.87% Molecular formula C ₂₈ H ₃₈ O ₇ molecular weight) 486 Ultraviolet absorption spectrum λ ^MeOH _nax (nm): 271 (E1% 1cm389) 305 shoulder (E1% 1cm243) (No. Figure 5) Infrared absorption spectrum (KBr method) 3320, 2920, 2850, 1650, 1600, 1580, 1450,
It has characteristic absorption bands at 1300, 1240, 1200, 1140, and 1060 cm ^-1 . (Figure 10) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated chloroform, 100MHz) δ (ppm): 0.85 (t, 3H), 0.88 (t, 3H) 1.27 (m, 20H), 1.60 (m, 4H) 3.02 ( C-13 nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterium chloroform, 25MHz) 174.7(s) , 169.3(s), 166.3(s), 165.3(s),
161.4(s), 155.0(s), 150.0(s), 149.5(s),
116.2(d), 111.5(d), 109.0(d), 108.7(s),
104.2(s), 101.8(d), 37.3(t), 36.7(t), 32.3
(t), 31.9(t), 31.9(t), 31.9(t)29.9(t), 29.9
(t), 29.3(t), 29.2(t), 22.8(t), 22.8(t), 14.2
(q), 14.2(q) Solubility Soluble in lower alcohols such as methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and alkaline water. Insoluble in hexane, petroleum ether. Color reaction Potassium permanganate reaction, ferric chloride reaction,
Positive iodine reaction. Ninhydrin reaction, iodoform reaction, and Moritzsch reaction were negative. Thin layer chromatography (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., using silica gel f) Developing solvent Rf value Chloroform: Isopropanol: Acetic acid 0.87 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Isopropanol: Acetic acid 0.68 (10:4:0.1) Ethyl acetate: Acetone : Acetic acid 0.78 (6:6:0.1) Chloroform: Methanol: Acetic acid 0.77 (10:2:0.1) From the above physical and chemical properties, the physiologically active substance of the present invention
TPI-3, TPI-4 and TPI-5 are presumed to have the structure represented by the above formula (). The physiologically active substance TPI of the present invention is a new substance that is completely different from conventional PDE inhibitors produced by microorganisms. That is, the aforementioned PDE−, PDE−,
CC-1065, APD-, APD- and APD-
Both are nitrogen-containing compounds, and lecticlor and terferol have C ₁₁ H ₁₀ O ₅ and C _{19 ,} respectively.
It is a compound with a molecular formula of H ₁₆ O ₃ and is clearly different from the substance of the present invention. [Effect] The physiologically active substance TPI of the present invention has strong PDE inhibitory activity. Below are PDEs derived from bovine heart
(EC3.1.4.17) Indicates an effect on activity. Method Add 40mM Tris-HCl buffer (PH7.5), 2mM magnesium chloride, 0.4mMc- to 1.0ml of enzyme reaction solution.
Add AMP, PDE (30 μg protein amount, manufactured by Boehringer Mannheim) and the test substance, react at 30°C for 30 minutes, then add 0.1 ml of 55% trichloroacetic acid to stop the reaction, and measure the amount of 5'-AMP produced. was measured using high performance liquid chromatography (Hitachi, 655 system). The measurement conditions for high performance liquid chromatography are:
Column: Hitachi #3056 4 x 150mm, mobile phase 10mM
KH ₂ PO ₄ (PH2.0):MeOH (10:1), flow rate 1.5ml/
min, detection 262mμ. The inhibition rate was calculated using the following formula. Inhibition rate = (A-B)/A x 100 (%) A: 5'-AMP amount when the test substance is not included B: 5'-AMP amount when the test substance is added Test when inhibition rate is 50% The results of determining the substance concentration IC ₅₀ are shown below. Results Test substance IC ₅₀ concentration (μg/ml) TPI-1 2.8 TPI-2 5.4 TPI-3 2.8 TPI-4 3.5 TPI-5 2.3 Papaverine 25 Nicardipine 6.0 Theophylline 470 In addition, 100 mg/Kg of TPI-1 was administered intraperitoneally to mice. There were no deaths even after intravenous administration. [Effects of the invention] As mentioned above, the physiologically active substance TPI of the present invention is PDE.
Since it not only strongly inhibits the activity but also has high safety, it is useful as a bronchodilator, a cardiotonic agent, a smooth muscle relaxant, a hormone secretagogue, etc., or as a research reagent. [Example] Next, the present invention will be explained with reference to Examples. Example 1 One platinum loop was taken from a slant culture medium of Nodourisporium sp. M5220 strain (Feikoken Bacteria No. 8133) and mixed with 2% glucose, 1% peptone, 1% CSL, 0.2% potassium phosphate, and sulfuric acid. Dispense 100 ml of a medium (PH6.5) containing 0.1% magnesium and 1% Celite into a 500 ml Erlenmeyer flask, inoculate the flask after sterilizing it by autoclaving at 120°C for 20 minutes, and culture with shaking at 26°C for 4 days. This was used as the seed mother. This seed mother was mixed with 5% glucose, 2% Pharmamedia, 0.5% CSL, 0.1% potassium phosphate, and 0.1% magnesium sulfate.
%, calcium carbonate 0.5%, ferrous sulfate 0.0005%,
Zinc sulfate 0.0002%, cobalt chloride 0.00013%. A 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a sterile medium containing 0.0003% manganese sulfate and 0.0002% copper sulfate (PH 7.0) was inoculated with 3%, and cultured with shaking at 26° C. for 5 days. The culture fluid 10 thus obtained was centrifuged to remove the bacterial cells to obtain a culture centrifugation supernatant fluid 8.5. Add ethyl acetate 5 to this supernatant, and while stirring
A 2N HCl aqueous solution was added dropwise to adjust the pH to 2, and ethyl acetate extraction was performed to obtain 4.5% ethyl acetate.
Most of the TPI material was transferred to the ethyl acetate layer. Three portions of water were added to this ethyl acetate, and while stirring, concentrated aqueous ammonia was added to adjust the pH to 9, thereby dissolving most of the TPI substance into the water. Ethyl acetate 2 was added to the obtained aqueous layer 3, the pH was adjusted to 2 with 2N HCl aqueous solution while stirring, and ethyl acetate extraction was performed to obtain approximately 2
An ethyl acetate layer was obtained. This ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to obtain about 6 g of brown powder. Example 2 6 g of the crude powder containing the TPI substance obtained in Example 1 was dissolved in 30 ml of methanol, 4 g of silica gel powder was added, and after stirring well, the mixture was concentrated under reduced pressure and dried to remove methanol.
It was placed on a silica gel column (400 ml) packed with a mixed solvent of isopropanol:acetic acid (10:2:0.1) and developed with the same mixed solvent. Fractionate 20 g each, perform silica gel thin layer chromatography (TLC) on each fraction using chloroform: isopropanol: acetic acid (10:4:0.1) as a developing solvent, ultraviolet absorption detection using a Manaslu lamp,
Or by potassium permanganate decolorization reaction detection
Fractions containing Rf=0.54, Rf=0.46, Rf=0.25 and Rf=0.19 components were collected. Fractions No. 13 to No. 28 have
Contains a mixture of TPI-3 substance showing Rf=0.54 and TPI-4 substance showing Rf=0.46, and fractionated
No. 71 to No. 122 contain TPI-1 substance showing Rf = 0.25, and fractions No. 123 to No. 187 contain TPI-1 substance showing Rf = 0.25 and Rf = 0.19. It contained a mixture with TPI-2 substances. Fractions No. 13 to No. 28 were collected and concentrated under reduced pressure to 20 ml.
The residue was pre-mixed with ethyl acetate:acetone:acetic acid (10:
The column was charged onto a silica gel column (200 ml) packed with a mixed solvent of 6:0.1), and elution and development was performed with the same mixed solvent. The eluate was fractionated into 20 g portions, and each fraction was divided into ethyl acetate:acetone:acetic acid (6:
Silica gel TLC was performed using 6:0.1) as a developing solvent, and fractions containing Rf=0.35 and Rf=0.29 components were collected by ultraviolet detection using Manaslu lamp irradiation and detection using potassium permanganate decolorization reaction. Fractions No. 35 to No. 40 containing substances exhibiting only Rf=0.35 were collected and concentrated under reduced pressure to about 3 ml. N-hexane was added to the residue to precipitate TPI-3 substance. This precipitate was collected on a glass filter, washed with n-hexane, dried under reduced pressure, and TPI-
20 mg of 3 substances were obtained. Fractions No. 48 to No. containing substances showing only Rf=0.29.
69 was collected and concentrated under reduced pressure to approximately 3 ml. n- in the residue
Hexane was added to precipitate TPI-4 material. The precipitate was collected on a glass filter, washed with n-hexane, and dried under reduced pressure to obtain 15 mg of TPI-4 substance. Example 3 Fractions No. 71 to No. 122 containing the TPI-1 substance showing Rf = 0.25 obtained in Example 2 were collected, and after concentrating to 20 ml,
Add ethyl acetate to make 200 ml, then add 200 ml of water, stir vigorously, separate the ethyl acetate layer, concentrate under reduced pressure to make about 10 ml, add n-hexane,
TPI-1 material was precipitated. This precipitate was collected on a glass filter, washed with n-hexane, and dried under reduced pressure to obtain 1.8 g of pure TPI-1 substance. TPI-1 substance showing Rf=0.25 obtained in Example 2 and
Fraction containing a mixture of TPI-2 substances showing Rf=0.19
Collect No. 123 to No. 187, concentrate under reduced pressure, dissolve in about 20 ml of methanol, add 2 g of silica gel powder,
Mix well and remove methanol under reduced pressure, then add chloroform:methanol:acetic acid (10:
The column was charged onto a silica gel column (200 ml) prepared using a mixed solvent of 2:0.1), and elution and development were performed using the same mixed solvent. The eluate was fractionated into 20 g portions. For each fraction Chloroform: Isopropanol:
Silica gel TLC using acetic acid (10:4:0.1) as a developing solvent was performed, and ultraviolet detection by Manaslu lamp irradiation and detection by potassium permanganate decolorization reaction revealed that fraction No. 54 contained only a substance exhibiting Rf = 0.19. ~Collect No. 130 and concentrate under reduced pressure to approximately 20ml.
200 ml of ethyl acetate and 200 ml of water were added, stirred vigorously, extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was separated, concentrated under reduced pressure to about 10 ml, and n-hexane was added to precipitate the TPI-2 substance. This precipitate was collected on a glass filter, washed with n-hexane,
After drying under reduced pressure, 600 mg of TPI-2 substance was obtained. Example 4 50 mg of the TPI-1 substance obtained in Example 3 was dissolved in 4 ml of 0.1 M phosphate buffer (PH6.5), and 4 mg of β-glucosidase (manufactured by Sigma, 4.6 U/mg) was added thereto. When the enzymatic reaction was carried out at 26°C for 7 days, approximately 50% of the TPI-1 substance was converted to TPI-5 substance. This reaction solution was adjusted to pH 3 and extracted with ethyl acetate. After separating the ethyl acetate layer and dehydrating it with anhydrous sodium sulfate,
It was concentrated under reduced pressure. The residue was charged onto a silica gel column (28 ml) filled in advance with chloroform:methanol:acetic acid (20:1:0.1), and elution and development were performed with the same mixed solvent. The eluate was fractionated into 5 g portions, and fractions No. 28 to No. 31 were collected and concentrated under reduced pressure. n- in the residue
Hexane was added to precipitate the TPI-5 material. This precipitate was collected on a glass filter, washed with n-hexane, and dried under reduced pressure to obtain 15 mg of white powder of TPI-5 substance.

[Brief explanation of the drawing]

第１図は、TPI−１の紫外部吸収スペクトルを
示す図である。第２図は、TPI−２の紫外部吸収
スペクトルを示す図である。第３図は、TPI−３
の紫外部吸収スペクトルを示す図である。第４図
は、TPI−４の紫外部吸収スペクトルを示す図で
ある。第５図は、TPI−５の紫外部吸収スペクト
ルを示す図である。第６図は、TPI−１の赤外部
吸収スペクトルを示す図である。第７図は、TPI
−２の赤外部吸収スペクトルを示す図である。第
８図は、TPI−３の赤外部吸収スペクトルを示す
図である。第９図は、TPI−４の赤外部吸収スペ
クトルを示す図である。第１０図は、TPI−５の
赤外部吸収スペクトルを示す図である。 FIG. 1 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of TPI-1. FIG. 2 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of TPI-2. Figure 3 shows TPI-3
It is a figure showing the ultraviolet absorption spectrum of. FIG. 4 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of TPI-4. FIG. 5 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of TPI-5. FIG. 6 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of TPI-1. Figure 7 shows TPI
It is a figure showing the infrared absorption spectrum of -2. FIG. 8 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of TPI-3. FIG. 9 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of TPI-4. FIG. 10 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of TPI-5.

Claims

[Claims] 1 formula (wherein R is β-D-glucopyranosyl, β-
D-galactopyranosyl, 6'-O-acetyl-β
-D-glucopyranosyl, 6'-O-acetyl-β
-D-galactopyranosyl group or hydrogen atom) or a salt thereof. 2 Formulas belonging to the genus Nodurisporium (In the formula, R' is β-D-glucopyranosyl, β
-D-galactopyranosyl, 6'-O-acetyl-
b-D-glucopyranosyl or 6'-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl group) is cultured, and the physiologically active substance TPI is collected from the culture. A method for producing a physiologically active substance TPI or a salt thereof. 3. The production method according to claim 2, wherein the physiologically active substance TPI-producing bacterium is Nodurisporium sp. M5220 (Feikoken Bibori No. 8133). 4 formula (In the formula, R' is β-D-glucopyranosyl, β
-D-galactopyranosyl, 6'-O-acetyl-
β-D-glucopyranosyl or 6′-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl group) or its salt is treated with a glycoside bond hydrolase or its treated product in an aqueous medium. An expression characterized by (In the formula, R'' represents a hydrogen atom.) A method for producing a physiologically active substance or a salt thereof. 5. The production according to claim 4, wherein the glycoside bond hydrolase is β-glucosidase or β-galactosidase. Law.