JPH051777B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は環状アデノシン−3′，5′−モノリン酸
ホスホジエステラーゼ阻害活性を有する新規生理
活性物質TPI及びその製造法に関する。 〔従来の技術〕 環状アデノシン−3′，5′−モノリン酸（以下ｃ
−AMPと略称する）は、生体内のセカンドメツ
センジヤーとして、さらに細胞膜機能、細胞や増
殖や分化に関与しているといわれている。このｃ
−AMPを分解して5′−アデノシンモノリン酸
（以下5′−AMPと略称する）にする酵素が環状ア
デノシン−3′，5′−モノリン酸ホスホジエステラ
ーゼ（以下PDEと略称する）であり、これを阻
害する物質は生体内のｃ−AMPレベルを上昇さ
せることから、種々の生理的効果、例えば気管支
拡張作用、強心作用、平滑筋弛緩作用、ホルモン
分泌促進作用等をもたらすことが知られている。 従来、微生物が生産するPDE阻害剤としては、
PDE−、PDE−〔アグリカルチユアル・バ
イオロジカル・ケミストリー（Agr.Biol.
Chem.），42(7)，1331〜1336，1978〕、テルフエロ
ール（Terferol）〔ザ・ジヤーナル・オブ・アン
チバイオテイクス（The Joumal of
Antibiotics）、37(1)，６〜９，1984〕、CC−1065
〔同上、33(8)，902〜903，1980〕、レチクロール
（Reticulol）〔同上、28(7)，558〜560，1975〕等
が知られているが、これらはいずれも放線菌が産
生するものである。また細菌が産生するものとし
ては、APD−、APD−、APD−〔同上、
36，194〜196，1983〕が知られている。さらに、
化学的合成品でPDEを阻害するものとしては、
テオフイリン、パパベリン、ニカルジピン等が知
られており、これらは気管支拡張剤、血管拡張剤
等の医薬として用いられている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記の如く微生物の産生する生理活性物質を探
索することは医療上有用であり、特にPDEを阻
害する物質の探索はその広範な薬理作用から医療
上ならびにｃ−AMP等の研究上極めて有用であ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは新規な生理活性物質を得べく自然
界から多くの微生物を分離し、その生産物の生物
学的性質を調べていたところ、土壌より新たに分
離したノドウリスポリウム（Nodulisporium）属
に属する微生物中にPDEの活性を強力に阻害す
る物質が生産されることを見出した。そして該培
養物から、このPDE阻害物質を採取し、その理
化学的性質を調べた結果、後述の構造式を有する
４種の新規物質であることを確認し、その各々を
TPI−１、TPI−２、TPI−３、TPI−４と命名
した。 さらに、本発明者らは、上記TPI−１、TPI−
２、TPI−３またはTPI−４にグリコシド結合加
水分解酵素を作用させてグリコシド結合を分解す
ることにより後述の構造式を有するグリコシド結
合脱離物質が得られることを知り、この物質を
TPI−５と命名した。 本明細書ではTPI−１、TPI−２、TPI−３、
TPI−４およびTPI−５をTPIと総称する。 すなわち、本発明は、式 （式中、Ｒはβ−Ｄ−グルコピラノシル、β−
Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル基または水素原子を示
す）で表わされる新規生理活性物質TPIまたはそ
の塩およびその製造法を提供するものである。 式（）において、Ｒがβ−Ｄ−グルコピラノ
シル基である物質がTPI−１であり、Ｒがβ−Ｄ
−ガラクトピラノシル基である物質がTPI−２で
あり、Ｒが6′−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル基である物質がTPI−３であり、Ｒが
6′−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
基である物質がTPI−４であり、Ｒが水素原子で
ある物質がTPI−５である。 本発明者らによつて分離された式 （式中、R′はβ−Ｄ−グルコピラノシル、β
−Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−
β−Ｄ−グルコピラノシルまたは6′−Ｏ−アセチ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を示す）で表
わされる生理活性物質TPI（）を生産する菌株
M5220株は次の菌学的性質を有する。 (1) 形態的特徴 M5220株はツアペツク寒天培地、麦芽汁寒天培
地、バレイシヨ・ブトウ糖寒天培地上で培養し、
観察した所見は次の通りである。 栄養菌糸は単生ないし菌糸束（Synnemata）
を形成し、黄褐色で幅2.5〜3.0μmに伸張し、その
壁は滑面である。分生子柄は大きさ50〜130×2.5
〜3.0μmで無色〜淡黄色であり、分岐をなし、隔
壁を有し、その壁は滑面である。分生子形成細胞
は分生子柄の先端に単生または２〜３輪生し、大
きさ６〜20×2.0〜2.5μmで無色〜淡黄色である。
分生子形成様式はシンポジユロスポラ型
（Sympodulosporae）である。形成した分生子は
無色、楕円形で基部はやや細くなつており、大き
さ3.0〜5.0×2.0〜2.8μmで、１細胞で壁は滑面で
ある。 (2) 各培地における生育状態 各種培地上で、26℃、10日間培養し、観察した
所見は次の通りである。なお、色の表示はエイ．
コーネラツプ アンド ジエ．エツチ．ワンシヤ
ー、メターン ハンドブツク オブ カラー第３
版、イエール メターン、ロンドン〔A.
Kornerup and J.H.Wanscher、Methuen
handbook of colour、3rded.、Eyre Methuen、
London（1978）〕に従つた。 ツアペツク寒天培地 生育は遅く26℃10日間で直径11〜13mm。菌業は
平坦でビロード状〜やや綿毛状。色は暗緑色
（dark green 30F6）。周辺部は平滑。浸出液およ
び拡散性色素は出さない。裏面は暗緑色（dark
green 27F5）。 麦芽汁寒天培地 生育は遅く26℃10日間で直径15〜17mm。菌業は
厚く盛り上がりやや綿毛状。色は暗緑色（dark
green 27F3）。周辺部は平滑。浸出液および拡散
性色素は出さない。裏面は暗緑色（dark green
27F3）。 バレイシヨブドウ糖寒天培地 生育は遅く26℃10日間で直径15〜16mm。菌業は
厚く盛り上がりやや綿毛状。 色は暗緑色（dark green 27F3）。周辺部は平
滑。浸出液および拡散性色素は出さない。裏面は
暗緑色（dark green 27F3）。 (3) 生理的性質 生育PH範囲：１〜9.5 最適生育PH：３〜７ 生育温度範囲：13〜40℃ 最適生育温度：25〜30℃ 以上の菌学的性質、特に有性生殖をせず分生子
を形成し、菌糸は隔壁をもつことから、本菌株は
不完全菌に属する。また本菌株は、分生子形成様
式がシンポジユロスポラ型であり、分生子柄がよ
く分岐し、分生子形成細胞はしばしば輪生する等
の特色からノドウリスポリウム属に属する菌株で
ある。 よつて、本菌株を公知のものと区別するため、
ノドウリスポリウム エスピー．M5220
（Nodulisporium sp.M5220）と命名し、工業技
術院微生物工業研究所に受託番号微工研菌寄第
8133号（FERMP−8133）として寄託した。 本発明の生理活性物質TPI（）は、例えばノ
ドウリスポリウム属に属する生理活性物質TPI
（）生産菌を培養し、その培養物中から生理活
性物質TPI（）を採取することにより製造され
る。 本発明で使用される生理活性物質TPI（）生
産菌としては、前述のノドウリスポリウム エス
ピー．M5220があげられるが、自然変異株、人工
変異株も含め、ノドウリスポリウム属に属し生理
活性物質TPI（）を生産する能力を有する菌株
は全て本発明に使用することができる。 本発明方法において、培養はカビの培養に一般
に用いられている条件によつて行うことができ
る。 培地としては、微生物が同化し得る炭素源、消
化し得る窒素源、さらには必要に応じ無機塩、ビ
タミン類などを含有させた栄養培地が使用され
る。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
マルトース、シユクロース、ラクトース、ガラク
トース、デキストリン、澱粉、グリセリン、ソル
ビトール等の糖類及び大豆油等の植物性油脂類等
が単独または組合せて用いられる。窒素源として
はペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿
実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、
カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、
硝酸塩類等が単独または組合せて用いられる。そ
の他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、鉄塩、
マンガン塩等の無機塩類やビタミンＢ類、パント
テン酸カルシウム等のビタミン類等が適宜添加さ
れる。 培養にあたつては、上記栄養源を含有すれば培
地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を
用い、振盪培養又は通気攪拌培養を行うのが好ま
しい。培地のPHは３〜７、培養温度は25〜30℃が
好ましい。培養時間は液体培養の場合、通常２〜
10日であるが、培養物中の生理活性物質TPI（）
の蓄積量は約５日で最大に達するので、この時点
で培養を終了するのが好ましい。これらの培地組
成、培地の液性、培養温度、培養時間等の培養条
件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じ
て好ましい結果が得られるように適宜調節、選択
されることは言うまでもない。液体培養において
発砲があるときは、シリコン油、植物油、界面活
性剤などの消泡剤が適宜使用される。 このようにして得られた生理活性物質TPI（）
は主として培養液中に存在するので、培養物を
過補助剤、例えばセライト、パーライト、ハイ
フロースーパーセル等を加えて過するか、また
は遠心分離して培養液と菌体とに分離し、その
培養液から生理活性物質TPI（）を採取する
のが有利である。 培養液から生理活性物質TPI（）を分離、
精製するためには、液を非親水性有機溶媒、例
えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノールなどで
抽出し、その抽出液を濃縮することにより粗成物
として生理活性物質TPI（）が得られる。更に
精製するには、シリカゲル、活性アルミナ、活性
炭、非イオン性吸着樹脂等による吸着クロマトグ
ラフイー、アルキル基結合シリカゲルによる逆相
分配クロマトグラフイー、ゲル過担体によるゲ
ル過等、通常の有機物質を分離、精製する手段
を適宜組合せて行なうことが好ましい。具体的に
は、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤を充填した
カラムに粗成物を吸着させた後、クロロホルム−
イソプロパノール−酢酸、酢酸エチル−イソプロ
パノール−酢酸、酢酸エチル−メタノール酢酸等
の混合溶媒を用いて溶出することにより行なわれ
る。目的物の溶出のチエツクはシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイー又はウシ心臓由来のPDEを用
いた阻害活性測定等により行なうことができる。 これらのカラムクロマトグラフイーによりTPI
−１、TPI−２、TPI−３およびTPI−４を分離
し、各々単離することができる。式（）におけ
るＲが水素原子であるTPI−５、即ち式 （式中、R″は水素原子を示す）で表わされる
生理活性物質TPIは、式（）で表わされる生理
活性物質TPIまたはその塩に水性媒体中グリコシ
ド結合加水分解酵素またはその処理物を作用させ
てグリコシド結合を酵素的に分解することにより
得られる。 グリコシド結合加水分解酵素としては、TPI
（）がTPI−１またはTPI−３物質である場合
はβ−グリコシダーゼを用いればよく、TPI（）
がTPI−２またはTPI−４物質である場合はβ−
ガラクトシダーゼを用いればよい。 上記の酵素は動物、植物、微生物のいずれの由
来のグリコシド結合加水分解酵素でもよく、通常
は市販されているβ−グルコシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼが用いられる。 前記酵素が微生物由来である場合には、その酵
素生産菌により菌体外酵素または菌体内酵素とし
て存在する。菌体外酵素である場合は、本酵素生
産菌の培養物から除菌した培養液から公知の酵
素分離精製手段により種々の段階に精製された酵
素剤が用いられる。菌体内酵素である場合は、本
酵素生産菌の培養物から得た生菌体の形態で使用
し得る。さらにまた物理的あるいは化学的方法に
よる菌体処理物、例えばアセトン、メタノール、
エタノールなどの親水性有機溶媒による乾燥菌体
磨砕、超音波などの処理による菌体破壊物、セチ
ルピルジウムクロライド、界面活性剤などの処理
による菌体溶解物あるいはこれらから公知の酵素
分離精製手段により分離した酵素剤も本発明にお
いて使用し得る。 前記酵素の処理物とは、上述した如く、本酵素
活性を有し、種々の形態で存在するものを意味す
るが、これに限らず、適当な担体に固定化された
固定化酵素あるいは固定化酵素生産菌体を意味す
る。 上記の固定化酵素あるいは固定化菌体は、公知
の固定化酵素および固定化菌体を製造する方法に
より調製することができる。例えば酵素を共有結
合法、イオン結合法、物理的吸着法などの担体結
合法により固定化する方法、酵素または菌体を架
橋法により固定化する方法、酵素または菌体を半
透膜性のポリマーの皮膜によつてマイクロカプセ
ル状、中空系状、膜状などに被覆した包括法ある
いは格子型包括法により固定化する方法により行
うことができる。上記の如く、本酵素またはその
生産菌体を固定化することにより連続的に使用で
きる。 上記の酵素反応は、該酵素の至適PHの範囲で行
うのが好ましい。反応温度は該酵素の至適温度の
範囲で行うのが好ましいが、通常は25〜37℃程度
で行われる。反応時間は、生成されるTPI−５を
薄層クロマトグラフイー（TLC）、高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）などにより追跡できる
ので、TPI−５が最大に蓄積されるのを待つて適
宜反応を終了すればよい。上記酵素を固定化酵素
あるいは固定化菌体の形態で使用する場合には、
連続的に酵素反応を行わせることができる。 このようにして得られた酵素反応液からTPI−
５を採取するには、反応液のPHを酸性にし、酢酸
エチル、酢酸ブチル、ブタノールなどの非親水性
有機溶媒で抽出し、その抽出液を濃縮することに
より粗成物として得られる。更に精製するには、
生理活性物質TPI（）の分離精製方法と同様に
クロマトグラフイー、ゲル過などにより精製す
ることができる。 生理活性物質TPIを塩とするには、粗成物の段
階で常法により塩とすることもできるが、単離後
に塩に変換するのが好ましい。好ましい塩として
は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土
類金属塩、アルミニウム塩、その他の金属塩、ア
ンモニウム塩、公知の塩基性アミノ酸との塩、公
知の有機アミンとの塩などが挙げられる。 以上の如くして得られた生理活性物質TPIの
各々の理化学的性質について以下の通り示す。 〈生理活性物質TPI−１〉 物質の色及び性状 白色粉末 中性、酸性、塩基性の区別 酸性 元素分析（C₃₄H₄₈O₁₂・３／2H₂Ｏとして） Ｃ Ｈ 実測値 60.43％ 7.48％ 理論値 60.44％ 7.56％ 分子式 C₃₄H₄₈O₁₂ 分子量（FABマススペクトルによる） 648 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−20.6°（Ｃ＝1.0、MeOH） 紫外部吸収スペクトル MeOH又は酸性MeOH中 λ max（nm）：253（Ｅ１％ １cm250） 311肩 アルカリ性MeOH中 λ max（nm）：240肩 300（Ｅ１％ １cm350） （第１図） 赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2930、2850、1720、1590、1470、1430、
1370、1340、1250、1170、1140、1060cm^-1に特
徴的な吸収帯を有する。 （第６図） プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.88（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.68（ｔ，2H）、2.94（ｔ，2H） 3.40〜4.00（5H）、4.89（ｄ，1H） 6.42（ｄ，1H）、6.61（ｄ，ｄ，2H） 6.71（ｄ，1H） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.1(s)、168.2(s)、164.2(s)、161.8(s)、
158.4(s)、156.0(s)、149.1(s)、145.2(s)、
116.5(d)、116.1(s)、113.5(s)、112.1(d)、
109.3(d)、103.4(d)、102.7(d)、78.6(d)、78.4
(d)、75.3(d)、71.6(d)、63.0(t)、37.2(t)、35.2
(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0(t)、31.1
(t)、30.9(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0(t)、24.0
(t)、14.8(q)、14.8(q)、 溶解性 メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。 呈色反応 過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。 薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用） 展開溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.25 （10：４：0.1） 酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.36 （10：４：0.1） 酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.17 （６：６：0.1） クロロホルム：メタノール：酢酸 0.38 （10：２：0.1） 〈生理活性物質TPI−２〉 物質の色及び性状 白色粉末 中性、酸性、塩基性の区別 酸性 元素分析（C₃₄H₄₈O₁₂・H₂Ｏとして） Ｃ Ｈ 実測値 61.79％ 7.56％ 理論値 61.26％ 7.51％ 分子式 C₃₄H₄₈O₁₂ 分子量（FABマススペクトルによる） 648 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−12.6°（Ｃ＝0.9、MeOH） 紫外部吸収スペクトル MeOH又は酸性MeOH中 λ max（nm）：253（Ｅ１％ １cm230） 311肩 アルカリ性MeOH中 λ max（nm）：240肩 300（Ｅ１％ １cm325） （第２図） 赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2930、2850、1720、1600、1470、1410、
1320、1240、1170、1140、1050cm^-1に特徴的な
吸収帯を有する。 （第７図） プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.87（ｔ，3H）、0.89（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.60（ｍ，4H） 2.68（ｔ，2H）、2.94（ｔ，2H） 3.50〜4.00（5H）、4.88（ｄ，1H） 6.42（ｄ，1H）、6.64（ｄ，ｄ，2H） 6.74（ｄ，1H） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.1(s)、168.2(s)、164.2(s)、161.8(s)、
158.6(s)、156.0(s)、149.1(s)、145.2(s)、
116.6(d)、116.1(s)、113.4(s)、112.1(d)、
109.4(d)、104.1(d)、102.8(d)、77.4(d)、75.3
(d)、72.7(d)、70.5(d)、62.7(t)、37.2(t)、35.2
(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0(t)、31.1
(t)、31.0(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0(t)、24.0
(t)、14.8(q)、14.8(q)、 溶解性 メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。 呈色反応 過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。 薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用） 展開溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.19 （10：４：0.1） 酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.21 （10：４：0.1） 酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.14 （６：６：0.1） クロロホルム：メタノール：酢酸 0.22 （10：２：0.1） 〈生理活性物質TPI−３〉 物質の色及び性状 白色粉末 中性、酸性、塩基性の区別 酸性 元素分析 Ｃ Ｈ 実測値 61.93％ 7.36％ 理論値 62.59％ 7.30％ 分子式 C₃₆H₅₀O₁₃ 分子量（FABマススペクトルによる） 690 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−19.6°（Ｃ＝0.6、MeOH） 紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax(on)：252（Ｅ１％ １cm184） 310肩 （第３図） 赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3400、2925、2850、1720、1650、1600、1460、
1240、1130、1040cm^-1に特徴的な吸収帯を有す
る。 （第８図） プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.88（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.08（ｓ，3H）、2.68（ｔ，2H） 2.94（ｔ，2H）、3.20〜4.00（ｍ，3H）、4.00
〜4.60（ｍ，2H） 4.35（ｄ，1H）、6.44（ｄ，1H） 6.59（ｄ，ｄ，2H）6.73（ｄ，1H） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.2(s)、173.1(s)、167.9(s)、164.4(s)、
161.7(s)、158.3(s)、156.0(s)、149.2(s)、
145.2(s)、116.5(d)、116.3(s)、113.3(s)、
112.1(d)、109.4(d)、103.3(d)、103.0(d)、78.3
(d)、75.8(d)、75.2(d)、71.8(d)、65.0(t)、37.2
(t)、35.2(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、32.9
(t)、31.1(t)、30.9(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0
(t)、24.0(t)、21.0(q)、14.8(q)、14.8(q) 溶解性 メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。 呈色反応 過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。 薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用） 展開溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.54 （10：４：0.1） 酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.51 （10：４：0.1） 酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.35 （６：６：0.1） クロロホルム：メタノール：酢酸 0.52 （10：２：0.1） 〈生理活性物質TPI−４〉 物質の色及び性状 白色粉末 中性、酸性、塩基性の区別 酸性 元素分析 Ｃ Ｈ 実測値 62.35％ 7.57％ 理論値 62.59％ 7.30％ 分子式 C₃₆H₅₀O₁₃ 分子量（FABマススペクトルによる） 690 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−13.3（Ｃ＝0.4、MeOH） 紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax（nm）：252（Ｅ１％ １cm172） 310肩 （第４図） 赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3420、2930、2860、1730、1660、1610、1470、
1240、1140、1040cm^-1に特徴的な吸収帯を有す
る。 （第９図） プロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノー
ル中、100MHz） δ（ppm）：0.87（ｔ，3H）、0.90（ｔ，3H） 1.31（ｍ，20H）、1.61（ｍ，4H） 2.73（ｓ，3H）、2.68（ｔ，2H） 2.95（ｔ，2H）、3.20〜4.00（ｍ，2H）、4.00
〜4.60（ｍ，2H） 4.87（ｄ，1H）、6.43（ｄ，1H） 6.60（ｄ，ｄ，2H）6.73（ｄ，1H） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重メタノール
中、25MHz） 174.2(s)、173.0(s)、168.0(s)、164.2(s)、
161.8(s)、158.4(s)、156.0(s)、149.1(s)、
145.2(s)、116.5(d)、116.1(s)、113.5(s)、
111.9(d)、109.4(d)、103.7(d)、102.9(d)、75.2
(d)、74.7(d)、72.5(d)、70.4(d)、64.9(t)、37.2
(t)、35.2(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.3(t)、33.0
(t)、31.1(t)、31.0(t)、30.6(t)、30.6(t)、24.0
(t)、24.0(t)、21.0(q)、14.8(q)、14.8(q) 溶解性 メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、ベンゼン、
石油エーテルに不溶。 呈色反応 過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応、モーリツシユ反応陽性。ニンヒドリン
反応、ヨードホルム反応陰性。 薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用） 展開溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.46 （10：４：0.1） 酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.43 （10：４：0.1） 酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.29 （６：６：0.1） クロロホルム：メタノール：酢酸 0.48 （10：２：0.1） 〈生理活性物質TPI−５〉 物質の色及び性状 白色粉末 中性、酸性、塩基性の区別 酸性 元素分析 Ｃ Ｈ 実測値 69.30％ 7.72％ 理論値 69.11％ 7.87％ 分子式 C₂₈H₃₈O₇ 分子量） 486 紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax（nm）：271（Ｅ１％ １cm389） 305肩（Ｅ１％ １cm243） （第５図） 赤外部吸収スペクトル（KBr法） 3320、2920、2850、1650、1600、1580、1450、
1300、1240、1200、1140、1060cm^-1に特徴的な
吸収帯を有する。 （第１０図） プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホ
ルム中、100MHz） δ（ppm）：0.85（ｔ，3H）、0.88（ｔ，3H） 1.27（ｍ，20H）、1.60（ｍ，4H） 3.02（ｔ，ｔ，4H）、6.32（ｓ，2H） 6.62（ｄ，1H）、6.74（ｄ，1H） 11.27（ｓ，1H） Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（重クロロホル
ム中、25MHz） 174.7(s)、169.3(s)、166.3(s)、165.3(s)、
161.4(s)、155.0(s)、150.0(s)、149.5(s)、
116.2(d)、111.5(d)、109.0(d)、108.7(s)、
104.2(s)、101.8(d)、37.3(t)、36.7(t)、32.3
(t)、31.9(t)、31.9(t)、31.9(t)29.9(t)、29.9
(t)、29.3(t)、29.2(t)、22.8(t)、22.8(t)、14.2
(q)、14.2(q) 溶解性 メタノール、エタノール、ブタノール等の低級
アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイ
ド、アルカリ性水に可溶。ヘキサン、石油エーテ
ルに不溶。 呈色反応 過マンガン酸カリウム反応、塩化第二鉄反応、
沃素反応陽性。ニンヒドリン反応、ヨードホルム
反応、モーリツシユ反応陰性。 薄層クロマトグラフイー（東京化成社製、シ
リカゲルｆ使用） 展開溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：酢酸 0.87 （10：４：0.1） 酢酸エチル：イソプロパノール：酢酸 0.68 （10：４：0.1） 酢酸エチル：アセトン：酢酸 0.78 （６：６：0.1） クロロホルム：メタノール：酢酸 0.77 （10：２：0.1） 上記理化学的性質から、本発明の生理活性物質
TPI−３、TPI−４およびTPI−５は前述の式
（）で表わされる構造を有するものと推定され
る。 本発明の生理活性物質TPIは、従来の微生物が
生産するPDE阻害物質とは全く異なる新規物質
である。すなわち、前述のPDE−、PDE−、
CC−1065、APD−、APD−およびAPD−
は何れも含窒素化合物であり、レクチクロー
ル、テルフエロールはそれぞれC₁₁H₁₀O₅、C₁₉
H₁₆O₃の分子式を有する化合物であり、本発明の
物質とは明瞭に異なる。 〔作用〕 本発明の生理活性物質TPIは強力なPDE阻害活
性を有する。以下にウシ心臓由来のPDE
（EC3.1.4.17）活性に対する作用を示す。 方 法 酵素反応液1.0mlに40mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.5）2mM塩化マグネシウム、0.4mMc−
AMP、PDE（30μｇ蛋白量、ベーリンガーマンハ
イム社製）と被験物質を添加し、30℃で30分間反
応させ、次いで55％トリクロル酢酸0.1mlを加え
て反応を停止後、生成する5′−AMP量を高速液
体クロマトグラフイー（日立、655システム）を
用い測定した。高速液体クロマトの測定条件は、
カラム：日立＃3056 ４×150mm、移動層10mM
KH₂PO₄（PH2.0）：MeOH（10：１）、流速1.5ml／
min、検出262mμ。阻害率は次の式により算出し
た。 阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×100（％） Ａ：被験物質を含まない場合の5′−AMP量 Ｂ：被験物質添加の場合の5′−AMP量阻害
率50％の時の被験物質濃度IC₅₀を求めた結果を以
下に示す。 結 果 被験物質 IC₅₀濃度（μｇ／ml） TPI−１ 2.8 TPI−２ 5.4 TPI−３ 2.8 TPI−４ 3.5 TPI−５ 2.3 パパベリン 25 ニカルジピン 6.0 テオフイリン 470 さらに、TPI−１をマウスに100mg／Kg腹腔内
投与しても死亡例はなかつた。 〔発明の効果〕 叙上の如く、本発明の生理活性物質TPIはPDE
活性を強力に阻害するだけでなく、安全性も高い
ことから、気管支拡張剤、強心剤、平滑筋弛緩
剤、ホルモン分泌促進剤等の医薬あるいは研究用
試薬として有用である。 〔実施例〕 次に実施例を挙げて本発明を説明する。 実施例 １ ノドウリスポリウム・エスピーM5220株（微工
研菌寄第8133号）の斜面培地から一白金耳を、グ
ルコース２％、ペプトン１％、CSL1％、リン酸
第一カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1％、セ
ライト１％を含む培地（PH6.5）100mlを500ml容
三角フラスコに分注し、120℃、20分間オートク
レイブ減菌したものに接種し、26℃、４日間振盪
培養し、これを種母とした。この種母をグルコー
ス５％、フアーマメデイア２％、CSL0.5％、リ
ン酸第二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.1
％、炭酸カルシウム0.5％、硫酸第一鉄0.0005％、
硫酸亜鉛0.0002％、塩化コバルト0.00013％。硫
酸マンガン0.0003％、硫酸銅0.0002％（PH7.0）の
組成からなる減菌培地100mlを入れた500ml三角フ
ラスコに３％接種し26℃、５日間振盪培養を行つ
た。この様にして得た培養液10を遠心により菌
体を除き、培養遠心上清液8.5を得た。この上
清液に酢酸エチル５を加え、攪拌しながら
2N・HCl水溶液を滴下してPH２に調整し、酢酸
エチル抽出を行ない酢酸エチル4.5を得た。
TPI物質の大部分は酢酸エチル層に移つた。この
酢酸エチルに水３を加え、攪拌しながら、濃ア
ンモニア水を添加しPH９にし、TPI物質の大部分
を水に転溶させた。得られた水層３に酢酸エチ
ル２を加え、攪拌しながら2N・HCl水溶液に
てPH２に調整し、酢酸エチル抽出を行ない、約２
の酢酸エチル層を得た。この酢酸エチル層を無
水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮すると
約６ｇの茶褐色粉末が得られた。 実施例 ２ 実施例１で得られたTPI物質を含有する粗粉末
６ｇを30mlのメタノールに溶解し、シリカゲル粉
末４ｇを加え、良く攪拌後減圧濃縮、乾燥してメ
タノールを除去後、あらかじめ、クロロホルム：
イソプロパノール：酢酸（10：２：0.1）の混合
溶媒にて充填したシリカゲルカラム（400ml）上
にのせ、同混合溶媒にて展開した。20ｇづつ分画
し、各分画についてクロロホルム：イソプロパノ
ール：酢酸（10：４：0.1）を展開溶媒としたシ
リカゲル薄層クロマトグラフイー（TLC）を行
ない、マナスルランプを用いた紫外部吸収検出、
又は過マンガン酸カリウム脱色反応検出により
Rf＝0.54、Rf＝0.46、Rf＝0.25及びRf＝0.19成分
を含有する画分を分取した。分画No.13〜No.28には
Rf＝0.54を示すTPI−３物質およびRf＝0.46を示
すTPI−４物質との混合物が含まれており、分画
No.71〜No.122にはRf＝0.25を示すTPI−１物質が
含まれており、分画No.123〜No.187にはRf＝0.25を
示すTPI−１物質とRf＝0.19を示すTPI−２物質
との混合物が含まれていた。 分画No.13〜No.28を集め、20mlまで減圧濃縮し、
残渣を予め酢酸エチル：アセトン：酢酸（10：
６：0.1）の混合溶媒にて充填したシリカゲルカ
ラム（200ml）上にチヤージし、同混合溶媒で溶
出展開を行つた。溶出液は20ｇづつ分画し、各分
画について酢酸エチル：アセトン：酢酸（６：
６：0.1）を展開溶媒としたシリカゲルTLCを行
ない、マナスルランプ照射による紫外部検出およ
び過マンガン酸カリウム脱色反応による検出によ
り、Rf＝0.35およびRf＝0.29成分を含有する画分
を分取した。Rf＝0.35のみを示す物質を含有する
分画No.35〜No.40を集め、約３mlまで減圧濃縮し
た。残渣にｎ−ヘキサンを加えTPI−３物質を沈
澱させた。この沈澱物をグラスフイルター上に集
め、ｎ−ヘキサンで洗浄後、減圧乾燥してTPI−
３物質20mgを得た。 Rf＝0.29のみ示す物質を含有する分画No.48〜No.
69を集め、約３mlまで減圧濃縮した。残渣にｎ−
ヘキサンを加えTPI−４物質を沈澱させた。この
沈澱物をグラスフイルター上に集めｎ−ヘキサン
で洗浄後、減圧乾燥してTPI−４物質15mgを得
た。 実施例 ３ 実施例２で得たRf＝0.25を示すTPI−１物質を
含む分画No.71〜No.122を集め、20mlまで濃縮後、
酢酸エチルを加え200mlとし、更に水200mlを加
え、激しく攪拌後、酢酸エチル層を分取し、減圧
下濃縮し、約10mlとし、ｎ−ヘキサンを加え、
TPI−１物質を沈澱させた。この沈澱物をグラス
フイルター上に集め、ｎ−ヘキサンで洗浄後減圧
乾燥して純粋なTPI−１物質として1.8ｇ得た。 実施例２で得たRf＝0.25を示すTPI−１物質と
Rf＝0.19を示すTPI−２物質の混合物を含む分画
No.123〜No.187を集め、減圧濃縮し、約20mlのメタ
ノールに溶解させ、シリカゲル粉末２ｇを加え、
良く混合し、減圧下でメタノールを除去後、あら
かじめクロロホルム：メタノール：酢酸（10：
２：0.1）の混合溶媒にて作成したシリカゲルカ
ラム（200ml）上にチヤージし、同混合溶媒で溶
出展開を行つた。溶出液は20ｇづつ分画した。各
分画についてクロロホルム：イソプロパノール：
酢酸（10：４：0.1）を展開溶媒としたシリカゲ
ルT.L.Cを行ないマナスルランプ照射による紫外
部検出及び過マンガン酸カリウム脱色反応による
検出により、Rf＝0.19のみを示す物質を含有する
分画No.54〜No.130を集め、約20mlまで減圧濃縮し、
酢酸エチル200ml、水200mlを加え、激しく攪拌
し、酢酸エチル抽出を行い酢酸エチル層を分取
し、減圧濃縮して約10mlとし、ｎ−ヘキサンを加
えTPI−２物質を沈澱させた。この沈澱物をグラ
スフイルター上に集め、ｎ−ヘキサンで洗浄後、
減圧乾燥してTPI−２物質600mgを得た。 実施例 ４ 実施例３で得たTPI−１物質50mgを0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.5）４mlに溶し、これにβ−グル
コシダーゼ（シグマ社製、4.6U／mg）４mgを加
え、26℃で７日間酵素反応を行うとTPI−１物質
の約50％がTPI−５物質に変換した。この反応液
をPH３に調節し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エ
チル層を分取し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、
減圧濃縮した。残渣を予めクロロホルム：メタノ
ール：酢酸（20：１：0.1）で充填したシリカゲ
ルカラム（28ml）上にチヤージし、同混合溶媒で
溶出展開を行つた。溶出液は５ｇづつ分画し、分
画No.28〜No.31を集め、減圧濃縮した。残渣にｎ−
ヘキサンを加え、TPI−５物質を沈澱させた。こ
の沈澱物をガラスフイルター上に集め、ｎ−ヘキ
サンで洗浄後、減圧乾燥してTPI−５物質の白色
粉末15mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、TPI−１の紫外部吸収スペクトルを
示す図である。第２図は、TPI−２の紫外部吸収
スペクトルを示す図である。第３図は、TPI−３
の紫外部吸収スペクトルを示す図である。第４図
は、TPI−４の紫外部吸収スペクトルを示す図で
ある。第５図は、TPI−５の紫外部吸収スペクト
ルを示す図である。第６図は、TPI−１の赤外部
吸収スペクトルを示す図である。第７図は、TPI
−２の赤外部吸収スペクトルを示す図である。第
８図は、TPI−３の赤外部吸収スペクトルを示す
図である。第９図は、TPI−４の赤外部吸収スペ
クトルを示す図である。第１０図は、TPI−５の
赤外部吸収スペクトルを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、Ｒはβ−Ｄ−グルコピラノシル、β−
   Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
   −Ｄ−グルコピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−β
   −Ｄ−ガラクトピラノシル基または水素原子を示
   す）で表わされる生理活性物質TPIまたはその
   塩。 ２ ノドウリスポリウム属に属する式 （式中、R′はβ−Ｄ−グルコピラノシル、β
   −Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−
   β−Ｄ−グルコピラノシルまたは6′−Ｏ−アセチ
   ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を示す）で表
   わされる生理活性物質TPI生産菌を培養し、その
   培養物から該生理活性物質TPIを採取することを
   特徴とする生理活性物質TPIまたはその塩の製造
   法。 ３ 生理活性物質TPI生産菌がノドウリスポリウ
   ム・エスピーM5220（微工研菌寄第8133号）であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４ 式 （式中、R′はβ−Ｄ−グルコピラノシル、β
   −Ｄ−ガラクトピラノシル、6′−Ｏ−アセチル−
   β−Ｄ−グルコピラノシルまたは6′−Ｏ−アセチ
   ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を示す）で表
   わされる生理活性物質またはその塩に水性媒体中
   グリコシド結合加水分解酵素またはその処理物を
   作用させることを特徴とする式 （式中R″は水素原子を示す）で表わされる生
   理活性物質またはその塩の製造法。 ５ グリコシド結合加水分解酵素がβ−グルコシ
   ダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである特許請
   求の範囲第４項記載の製造法。