JPH05184399A

JPH05184399A - ジアルジン遺伝子含有ジアルジアの検出方法

Info

Publication number: JPH05184399A
Application number: JP4147203A
Authority: JP
Inventors: Ronald M Atlas; エム．アトラスロナルド; Asim K Bej; ケー．ベイアシム; Meena H Mahbubani; エイチ．マーブバニミーナ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-06-06
Filing date: 1992-06-08
Publication date: 1993-07-27
Also published as: EP0517154A1; AU1804792A; CA2070333A1

Abstract

(57)【要約】【目的】水およびその他のサンプル中の微生物、特に
ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）の種を検出する改良され
た方法を提供する。【構成】この方法は、ジアルジンをコードする遺伝子
のサブ配列に特異な核酸プローブおよびプライマーによ
るものである。本発明はまた、サブ配列が属にわたって
保存されているジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）のヒト病
原体形態に特異的であるサンプル中のサブ配列を増幅し
かつ検出するプライマーおよびプローブも包含する。加
えて、本発明は、生存および死亡水媒体微生物、例えば
ジアルジアシストを熱−誘導されたｍＲＮＡの存在また
は不存在に基づいて識別する有効な手段を包含する。最
後に、本発明は、上記の態様を実施するためのキットを
包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の開示】本発明は、水またはその他のサンプル中
のジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）の種を検出する方法並
びにサンプル中のジアルジンのサブ配列を増幅しそして
検出するためのプライマーおよびプローブに関し、上記
サブ配列は上記属にわたって保存されているか、あるい
はジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）のヒト病原体形態に特
異的である。加えて本発明は、水媒体微生物、例えばジ
アルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）シストの生存微生物と死亡
微生物とを識別する有効な手段及び上記の観点を実施す
るためのキットを包含する。

【０００２】本発明は、ジアルジンをコードする遺伝子
のコピーを有するジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属の種
の検出法において、（ａ）核酸プローブをジアルジンを
コードする遺伝子の相補性部分にハイブリダイズせし
め；そして（ｂ）ジアルジンをコードする遺伝子への該
プローブのハイブリダイゼーションを検出することを含
んでからなる方法を包含する。段階（ａ）の前にジアル
ジン遺伝子のサブ配列を増幅する段階を更に含んでなる
上記方法がより好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応法は上
記物質を増幅する好ましい手段である。上記プローブ
は、ジアルジンをコードする保存領域または超可変性領
域に結合することが意図される。本明細書において、ジ
アルジンをコードする特異的サブ配列に結合するプロー
ブが開示される。

【０００３】また、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）の種
からの核酸サブ配列の増幅のためのヌクレオチドポリメ
ラーゼを包含する増幅法の使用も開示される。増幅プラ
イマーが結合する特異的サブ配列および特異的プライマ
ーも開示されている。プライマーが結合する結合領域
は、ジアルジンをコードする遺伝子の標的サブ配列を挟
む。

【０００４】上記方法に加えて、上記に定義された方法
に使用するための核酸プローブおよびプライマーも開示
される。ジアルジンをコードする遺伝子の核酸サブ配列
に実質的に結合する核酸プローブを含むジアルジア（Ｇ
ｉａｒｄｉａ）の種に特異な核酸の検出用キットも開示
される。より詳しくは、上記キットは、本明細書で記載
されるプライマーおよびプローブを含んでなる。

【０００５】本発明は更に、生存微生物を含有する疑い
のあるサンプル中の死亡微生物から生存微生物を識別す
る方法を開示する。上記方法は、（ａ）上記サンプル
を、別の方法では転写されないタンパク質をコードする
遺伝子の転写を誘導するのに充分な熱で処理し；（ｂ）
シストを溶解してｍＲＮＡを放出し；（ｃ）ｍＲＮＡを
ｃＤＮＡに逆転写し；（ｄ）熱誘導された遺伝子をコー
ドするｍＲＮＡの標的サブ配列を増幅し；そして（ｅ）
増幅された標的サブ配列を検出することを含んでなる。

【０００６】より詳しくは、上記遺伝子は、ヒートショ
ック遺伝子およびジアルジンからなる群から選ばれる。
例えば、生存微生物は、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）
の種に由来するシストであってもよく、そしてこの方法
は、更に（ａ）上記シストをジアルジンをコードする遺
伝子の転写を誘導するのに充分な熱で処理し；（ｂ）シ
ストを溶解してｍＲＮＡを放出し；（ｃ）ｍＲＮＡをｃ
ＲＮＡに逆転写し；（ｄ）ジアルジン遺伝子をコードす
るｍＤＮＡの標的サブ配列を増幅し；そして（ｅ）増幅
された標的サブ配列を検出することを含んでなる。増幅
は、本明細書に記載された増幅プライマーを用いて行う
のが好ましい。

【０００７】キットに加えて、ジアルジア（Ｇｉａｒｄ
ｉａ）の種に対する上記の標的サブ配列を増幅するのに
必要な増幅試薬を含有する増幅管が本明細書に開示され
る。「増幅反応混合物」とは、標的核酸を増幅するのに
使用される種々の試薬を含んでなる水溶液を言う。これ
には、酵素、水性緩衝液、塩類、標的核酸およびヌクレ
オシド三燐酸塩が包含される。状況に応じて、上記混合
物は、完全または不完全増幅反応混合物のいずれかであ
ることができる。

【０００８】「増幅反応系」とは、核酸の標的配列のコ
ピーを増加する生体外手段を言う。この様な方法とし
て、限定されるものではないがポリメラーゼ連鎖反応増
幅〔ＰＣＲ〕、ＤＮＡリガーゼ、ＱＢＲＮＡレプリカ
ーゼおよびＲＮＡ転写に基づく増幅系が挙げられる。こ
れらは、多数の増幅試薬を包含し、そして以下に詳述さ
れる。「増幅反応管」とは、増幅試薬を保持するのに好
適な容器を言う。一般に、この様な管は、使用される増
幅系を阻害または妨害しないような内部成分から構成さ
れる。上記系は繰り返しの加熱および冷却の熱サイクル
を必要とするが、上記管は、サイクルプロセスに耐える
ことができなければならず、そして代表的にはサーモサ
ーキュラーのウェルに適合する。

【０００９】「増幅試薬」とは、種々の緩衝液、酵素、
プライマー、ヌクレオシドトリホスフェート（従来のお
よび従来でないものの両方）および選択された増幅法を
行うのに使用されるプローブを包含する。「増幅」と
は、代表的には標的核酸の「指数的」増加を言うが、本
明細書においては核酸の選択標的配列の数の直線的およ
び指数的増加の両方を記載する。「実質的に結合する」
とは、オリゴヌクレオチド間の相補的ハイブリダイゼー
ションを言い、ＰＣＲポリメラーゼの所望のプライミン
グを達成するためにハイブレリダイゼーションの厳密性
を減少することによって取り込まれ得る少数のミスマッ
チを包含する。

【００１０】「保存された領域」とは、同一属の全てで
はないにせよほとんどの種のゲノム中に存在するゲノム
のサブ配列を言う。「ハイブリダイズ」とは、相補性塩
基対を介する２つの一重鎖の結合を言う。「超可変性領
域」とは、１つの属の１または非常に少数の種（すなわ
ち、種の３０％未満）のゲノムに存在するゲノムのサブ
配列を言う。

【００１１】「内部陽性対照（ＩＰＣ）オリゴヌクレオ
チド配列」とは、標的核酸を増幅するのに使用されるの
と同一のプライマー対で増幅する組換体または合成オリ
ゴヌクレオチドを言う。ＩＰＣオリゴヌクレオチド配列
を使用して、試験されるサンプルが標的核酸を有してい
ない場合に増幅法が機能したことを検出使用者に保証す
る。これらのオリゴヌクレオチドは、一端または両端に
おいて、増幅法に使用される増幅プライマーの結合部位
に相補性の配列と接する。

【００１２】内部標的配列は、増幅プライマーの結合部
位に隣接して天然に見出されない外来配列である。従っ
て、内部対照配列は、もしかかるターゲットが存在した
なら増幅反応が標的核酸を増幅したであろうことを確立
するための増幅プライマーのための鋳型としての役割を
果たす。ＩＰＣオリゴヌクレオチド配列は、一重または
二重鎖ヌクレオチドとして供給され得る。一重鎖の場
合、当業者は、非直線的増加を促進するために、ＩＰＣ
の５’末端が他方のプライマーの対との塩基の同一性を
持たなければならないということを認識するであろう。

【００１３】「ジアルジア（ＧＧｉａｒｄｉａ）の種」
は、ヘキサミチデー（Ｈｅｘａｍｉｔｉｄａｅ）科の一
員である。原核生物の分類学が静的なものではなく、か
つ付加的な種が命名されてもよく、またはこれらの種が
いつの日か別の科または属に取り込まれ得ることを認識
すべきである。「核酸」とは、一重鎖または二重鎖形態
のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポ
リマーのいずれかであり、そして他に制限されない限り
天然由来ヌクレオチドと同様に機能することができる天
然ヌクレオチドの類縁体を包含することができる。

【００１４】「ヌクレオチドポリメラーゼ」とは、ヌク
レオチドトリホスフェート先駆体からのＤＮＡまたはＲ
ＮＡの合成を触媒することができる酵素を言う。本発明
の増幅反応において、上記ポリメラーゼは、鋳型依存性
であり、そして典型的には生成されるポリマーの３’末
端から延長される。上記ポリメラーゼが米国特許第４，
８８９，８１９号明細書に記載の通りに熱安定性である
ことが最も好ましい。

【００１５】「プライマー」または「核酸ポリメラーゼ
プライマー」とは、核酸鎖に相補性のプライマー延長生
成物の合成が開始される条件下に、すなわち好適な緩衝
液中の４種類の異なるヌクレオチドトリホスフェートお
よび１種類の重合用の試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラ
ーゼまたはリバーストランスクリプターゼ）の存在下に
且つ好適な温度でＤＮＡ合成の開始の点として作用する
ことができる天然または合成のオリゴヌクレオチドを言
う。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで
あることが好ましく、そして増幅の最大効率のために一
重鎖であるが、二重鎖でもよい。

【００１６】二重鎖の場合、プライマーは、延長生成物
を製造するのに使用する前にその鎖を分離するために先
ず処理される。プライマーの正確な長さは多くの因子に
依存するが、典型的には１５ないし２５ヌクレオチドの
範囲である。短いプライマー分子は、一般に言って鋳型
との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために
比較的に低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の
正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリッ
ド形成するのに十分に相補性でなければならない。プラ
イマーに取り込むことができる非相補性配列の例は、制
限酵素認識部位をコードする配列である（米国特許第
４，８００，１５９号を参照のこと）。

【００１７】プライマーは、所望により分光学的、光化
学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検
出可能な標識を導入することによって標識することがで
きる。例えば、有効な標識として、³²Ｐ、蛍光染料、電
子密度試薬、酵素、ビオチン、またはそれに対して抗血
清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンま
たはタンパク質が挙げられる。また、標識を使用してプ
ライマーまたは増幅されたＤＮＡを固体支持体に固定す
るのを促進することもできる。

【００１８】「プローブ」とは、相補性塩基対を通じて
標的核酸のサブ配列に結合するオリゴヌクレオチドを言
う。このプローブは、放射線同位体で直接標識するかあ
るいはストレプタビジン複合体を後で結合し得るビオチ
ンで標識するのが好ましい。プローブの存在または不存
在について検出することによって標的の存在または不存
在を検出することができる。

【００１９】核酸プローブについて「組換体」とは、そ
の生来のゲノムの一部分としてプローブ配列を天然に含
有する細胞から単離されたプローブと天然に関連する生
来の蛋白質又は核酸を含まないオリゴヌクレオチドを言
う。組換体プローブとして、増幅手段、例えばＰＣＲ、
および微生物を組換体プローブで形質転換する遺伝子ク
ローニング法により作成されたものが挙げられる。「サ
ブ配列」とは、核酸の比較的に長い配列の一部を構成す
る核酸の配列を言う。

【００２０】「標的領域」とは、分析すべき核酸のサブ
配列を言い、そして通常多形性のＤＮＡ配列を含有して
いる。本発明は、検出の標的としてジアルジンをコード
する遺伝子を使用するジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種
の検出の改良された手段を提供する。本発明の種々の態
様は、核酸プローブがジアルジン遺伝子の標的配列に結
合するハイブリダイゼーション検出および検出に先立つ
ジアルジン遺伝子の選択標的配列のＰＣＲ増幅を包含す
る。加えて、本明細書においてジアルジン遺伝子を熱誘
導してシスト中で転写することを開示する。この事実
は、サンプル中で生存シストと死亡シストとを識別する
のに有効に使用できる。

【００２１】ジアルジン遺伝子は、いくつかの保存領域
を有している。これらは、７８〜１９０ｂｐ、２６７〜
３８５ｂｐ、及び６３９〜８０９ｂｐの間にある。この
遺伝子はまた、超可変性領域を有する。これらは、４０
５〜６２２ｂｐの間に位置する。ジアルジン遺伝子は、
ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属の決定的な分類決定因
子である。この遺伝子の保有領域または超可変領域は、
核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出の標的として
使用できる。保存領域に実質的に結合するプローブは、
この遺伝子の全てのメンバーの検出を可能にするであろ
う。超可変性領域に実質的に結合するプローブは、属内
のサブグループのあるいは特定の種の検出を認可能にす
る。

【００２２】核酸ハイブリダイゼーション技術は周知で
ある。微生物を検出するための核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを利用する数多くの化学的キットが目下利用可能で
ある。この技術の良好なレビューは、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＡＰｒａ
ｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＨＡＭＥＳおよびＨ
ｉｇｇｉｎｓ編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，第１８〜３０頁
または米国特許第４，８８６，７４１号明細書、第４〜
７欄に見出すことができる。この技術の常套の見地か
ら、この技術の概論を提供する試みをここでは行わな
い。

【００２３】検出に先立ってジアルジン遺伝子の選択サ
ブ配列を増幅することが有用である。数多くの核酸増幅
系が有効である。増幅系は周知であり、そしてＢｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：第２９０〜２９３頁、１９
９０年に論評されている。かかる系は、ＰＣＲ、リガー
ゼ増幅およびＱβ複製系を包含する。ジアルジア（Ｇｉ
ａｒｄｉａ）種の検出は、これらの種からの核酸を増幅
するのにＰＣＲを利用する。本明細書に記載されるよう
なジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）の検出は、多段階を必
要とする。

【００２４】これらの段階には、残存する微生物を検出
に好適な範囲にまで単離および／または濃縮するサンプ
リング法、細胞を溶解して核酸を放出する方法、標的核
酸配列を増幅するための好適な方法および増幅された配
列を検出する手段が含まれる。この方法の一般的な記載
は、Ａｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄＢｅｊ，Ａ．
Ｋ．，ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｌＰａ
ｔｈｏｇｅｎｓｉｎＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＷ
ａｔｅｒＳａｍｐｌｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＣＲ
ａｎｆＧｅｎｅＰｒｏｂｅｓｉｎＰＣＲＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第３９９〜４０６頁、Ｉｎｎｉｓ等
編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９
０年に見出される。

【００２５】標的核酸サブ配列を効率的に増幅するため
に、ＰＣＲは、ポリメラーゼ延長を開始するための増幅
プライマーを必要とする。プライマーの選択は、本発明
の重要な態様である。プライマーは、先ず保存領域また
は超可変性領域のフランキング領域に結合する能力に関
して選択される。プライマーは更に、低い二次構造およ
び比較的等しい熱融点に関して選択される。

【００２６】比較的にきれいな水サンプルは、増幅に先
立って標的核酸の単離または精製をすることなしに直接
検出してもよい。多量の水を濾過して微生物集団を濃縮
してもよい。濾過法およびフィルターは、当業者に公知
である。例えば、ＳｔａｎｄａｒｄＭｅｔｈｏｄＦ
ｏｒＴｈｅＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎＯｆＷａｔ
ｅｒａｎｄＷａｓｔｅｗａｔｅｒ，第１７版、第９
〜１４、ｔｈｅＡｍｅｒ．Ｐｕｂｌ．Ｈｅａｌｔ
ｈＡｓｓｏｃ．出版、１０１５Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ
Ｓｔ．Ｎ．Ｗ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．２
０００５を参照のこと。好ましいフィルターは、ジアル
ジアシストを捕捉し且つ異質物質を通過させる多孔度を
有する。

【００２７】水サンプルからの標的とする水媒介病原体
の実質的に全ての細胞またはシストを約０．１ないし約
１．０ｍｌのオーダーで少量のテストサンプル容量の水
に濃縮するのが好ましい。ジアルジアシストに関して、
水サンプルからの実質的に全ての標的とするシストの回
収は、例えば場合により分散を促進するターゲット微生
物を物理的に捕獲または凝集する役割を果たす懸濁また
は分散された添加剤による濾過および遠心分離を含む数
種類の好適な方法のいずれかにより行うことができる。
本発明による好ましいシストの回収は、少ない容量のサ
ンプル、すなわち約１ｍｌ以下からの濃縮により、ある
いはより多い量から濃縮または部分的に精製しておいて
もよい１００ｍｌサンプルからの濾過により得られる。

【００２８】ジアルジアシストは、約０．５μｍ以下の
多孔度を有するフィルターにより捕捉することができ
る。物理的破片が引き続いての濾過または増幅法を妨害
する場合、予備濾過段階が有効であろう。予備フィルタ
ーは、本発明に臨界的特徴を有していない。かかるフィ
ルターは、ジアルジア細菌を自由に通過させる多孔度及
び組成を一般に有する。水回収の物理的手段は周知であ
り、そして滅菌ガラス壜、注射器集成体およびその他の
水の保存に好適な容器が挙げられる。

【００２９】テフロン膜、例えば０．２μＭまたは０．
５μＭ孔径のＦｌｕｏｒｏｐｏｒｅＦＧＬＰ００１３
（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，
ＭＤ）が本発明に有効である。テフロン膜は、ＰＣＲ増
幅反応を妨害せず、そして増幅反応混合物中に残るであ
ろう。ジアルジアシストは、本質的に全ての標的ＤＮＡ
またはＲＮＡを放出する方法で細胞溶解される。次い
で、標的核酸は、潜在的妨害物質、例えば酵素、低分子
量阻害剤または標的ＤＮＡ配列の酵素的増幅を妨害し得
るその他の成分を含有しないようにシストから回収され
る。

【００３０】機械的細胞溶解が有効である。機械的細胞
溶解は、超音波処理または多段階凍結／解凍サイクルに
よって達成することができる。凍結および解凍のサイク
ルがより好ましい。細胞溶解の化学的手段も可能であ
り、標準細胞溶解手段、例えばリソチーム、逆浸透衝
撃、プロテアーゼＫ処理および洗浄剤を包含する。ＰＣ
Ｒ法に対して有害な影響、すなわちＴａｑポリメラーゼ
の阻害の可能性があるので、化学的方法はそれほど好ま
しくない。

【００３１】サンプルを加熱して、ＰＣＲ反応混合物の
成分を妨害し得るプロテアーゼおよびヌクレアーゼを変
性させることも可能である。また、化学的ヌクレアーゼ
およびプロテーアーゼ阻害剤を加熱と組み合わせて使用
できる。細胞を溶解する好ましい手段は、シストを熱サ
イクラー中で水中の０．１％ジエチルピロカーボネート
５０μｌ中で５分間９０℃に加熱し、続いて氷中で急冷
するかまたは熱サイクラー中で２分間５℃に細胞を急冷
することによって行われる。代わりに、核酸を凍結−解
凍サイクルによりシストから放出してもよい。

【００３２】ＲＮＡ検出の場合、ＤＮＡをデオキシリボ
ヌクレアーゼにより破壊し、ｃＤＮＡを逆転写し、次い
で標的ＤＮＡをＰＣＲを使用して増幅する。標的とする
核酸配列のＰＣＲ増幅に続いて、増幅された標的とする
ＤＮＡを、十分な感度を有しかつ特異的である検出法に
より検出する。検出は、各標的遺伝子配列からの特異的
ＤＮＡ配列のプローブを利用する好適なハイブリダイゼ
ーションプローブの手段によるものである。また必要に
より、増幅された標的ＤＮＡ配列の定量を行うこともで
きる。

【００３３】サンプルが複雑な混合物、例えばジアルジ
ア（Ｇｉａｒｄｉａ）に感染された疑いのある患者から
の糞便サンプルである場合、核酸をその複合体混合物か
ら単離する必要があるであろう。生物学的サンプルから
核酸を抽出する種々の技術が当該技術分野に公知であ
る。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，“Ｓｉｍｐｌｅａｎｄ
ＲａｐｉｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＳａｍｐ
ｌｅｓｆｏｒＰＣＲ”ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，第４章、Ｅｒｌｉｃｈ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＯｒ
ｅｓｓ，１９８９年；ｍＡＮＩＡＴＩＳ等，１９８９
年，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２年；Ｈａｇｅｌｂｅｒｇおよび
Ｓｙｋｅｓ，１９８９年，Ｎａｔｕｒｅ３４２：４８
５；またはＡｅｅａｎｄ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓｉｎ
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｕｏ
ｎ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｈ
ａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編，ＩＲＬＰｒｅｓ
ｓ．，第１８〜３０頁，１９８５年を参照のこと。

【００３４】全核酸抽出法は、代表的に初期のフェノー
ル、フェノール／クロロホルムまたはグアニジニウム塩
との接触、引き続いてのアルコール沈降を包含する。ゲ
ノムＤＮＡは、更にアルコール沈降させる前にＲＮアー
ゼを使用することによって全ての核酸抽出物から得るこ
とができる。ＰＣＲ法は当該技術分野に周知である（米
国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６
８３，２０２号明細書）が、ＰＣＴ法に精通していない
ものに明確にかつ十分に本発明を理解させる目的でいく
つかの一般的なＰＣＲ情報を以下に記載する。

【００３５】ＰＣＲを始めるために、サンプル中の標的
核酸を変性する（サンプル核酸が二重鎖と仮定する）。
変性は、典型的にはサンプルを加熱することによって達
成される。これは、化学的変性がポリメラーゼ活性を阻
害し得るからである。一度鎖が分離されると、ＰＣＲに
おける次の段階は、分離された鎖を標的領域またはサブ
配列の側部に位置するプライマーとハイブリダイゼーシ
ョンする段階を包含する。次いで、プライマーを延長し
て標的鎖の相補性コピーを形成し、そして変性、ハイブ
リダイゼーションおよび延長のサイクルを所望の量の増
幅された核酸を得るのに必要なだけ何回も繰り返す。

【００３６】ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存延長
は、好適な塩類、金属カチオンおよびｐＨ緩衝系からな
る反応媒体中の好適な量の４種類のデオキシリボヌクレ
アーゼトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
ＰおよびｄＴＴＰ）の存在下での重合剤によって触媒さ
れる。好適な重合剤は、鋳型依存ＤＮＡ合成を触媒する
ことが知られている酵素である。例えば、鋳型がＲＮＡ
である場合、ＲＮＡを相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に
転化する好適な重合剤は、リバーストランスクリプター
ゼ（ＲＴ）、例えば鳥類骨髄芽球症ウイルスＲＴであ
る。

【００３７】一度増幅のための標的ＤＮＡであると、好
適なポリメラーゼとして例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩまたはそのクレノーフラグメント、Ｔ₄ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、およびテルムズアクアチクス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離された市販さ
れている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼが挙げられる。後者の酵素、すなわちＴ
ａｑポリメラーゼは、核酸の増幅および配列決定に広く
使用されている。ＤＮＡポリメラーゼを使用するための
反応条件は、当該技術分野に公知であり、そして例えば
ｔｈｅｔｒｅａｔｉｓｅＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙおよびＭａｎｉａｔｉｓ等，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，（上記）に記載されている。

【００３８】ＰＣＲ法の間、増幅反応混合物の温度は、
鎖分離およびプライマーアニーリングおよび延長が平衡
に生じるように非常に注意深く制御する。この反応混合
物は、（１）鎖脱離のための選択された標的配列へのア
ニーリングのための低温、一般には約３７℃ないし７０
℃、（２）プライマーのポリメラーゼ延長のための中間
温度、一般には約７０℃ないし８０℃および（３）鎖の
変性または分離のための高温、一般には約８０℃ないし
１００℃のサイクルを繰り返し行う。３つの温度範囲を
記載したが、増幅法を２つの温度範囲間で適当に行うこ
ともしばしば可能である。２つまたは３つの各熱サイク
ルは、増幅された標的ＤＮＡ配列の濃度を２倍に増加
し、よって全一連の１０回の増幅サイクルにより濃度を
１０２４倍に増加することができる。

【００３９】ＰＣＲ法の好ましい態様において、反応は
熱安定性ポリメラーゼ酵素によって触媒される。好まし
い熱安定性ポリメラーゼは、細菌テルムズアクアチク
ス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）から精製さ
れたＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。ＰＣＲ反応は
高温で行われる。好ましい温度は、酵素が熱安定性であ
りそして核酸が一重鎖および二重鎖の平衡状態であり、
よって十分なプライマーが鋳型鎖にアニーリングして合
理的な重合速度となるような温度である。鎖分離は、デ
ュープレックスの変性を引き起こすがポリメラーゼの不
可逆的変性を引き起こさないのに十分高い温度に十分な
時間反応系を加熱することによって達成される。Ｔａｑ
を使用する場合、ポリメラーゼ反応は、２種類または３
種類の温度の間の多くのサイクル、典型的には２０〜４
０回、初期に添加されたポリメラーゼ酵素を増加する必
要なしに行うことができる。

【００４０】ＰＣＲ法は、各段階後に新たな試薬を加え
る段階法でまたは全ての試薬を一定数の段階後に添加す
る方法で行うことができる。例えば、鎖分離が熱により
誘導されそしてポリメラーゼが熱感受性である場合、該
ポリメラーゼは、鎖分離の各ラウンド毎に添加しなけれ
ばならないであろう。しかしながら、ヘリカゼを変性に
使用する場合あるいは熱安定性ポリメラーゼを使用する
場合には、全ての試薬を最初に添加することができ、あ
るいはまた、試薬もモル比が反応に重要な場合、試薬が
合成反応により消費されるに従ってかかる試薬を定期的
に補充してもよい。

【００４１】当業者は、ＰＣＲ法が一般に熱安定性酵素
を用いて自動化された方法として行われるということを
知るであろう。この方法において、反応混合物は、変性
段階、プライマーアニーリング段階および延長段階を通
じてサイクルされる。熱安定性酵素を用いる用途に特に
適合する機械であるＤＮＡサーモサイクラーは、ヨーロ
ッパ特許第２３６，０６９号明細書および米国特許第
４，８８９，８１９号明細書により完全に開示されてい
る。

【００４２】ＰＣＲを行う好ましい態様は、多段階モー
ドである。多段階モードは、１組以上のＰＣＲプライマ
ー対を使用しての異なる標的領域の同時増幅である。多
段階法は、同様の熱融点を有するプライマー対を使用し
て実施されるのが好ましい。全ての対が互いに８℃以内
の熱融点を有しておりそして平均熱融点が４５℃ないし
７５℃であることが好ましく、平均熱融点が６０℃ない
し７０℃であることが好ましい。

【００４３】より詳しくは、少量の約５０μｌの水また
は水性緩衝液中の実質的に変性されていない標的ＤＮＡ
の回収後、および標的とするＤＮＡ配列に対して好適な
オリゴヌクレオチドプライマー対の選択の後、標的ＤＮ
Ａは、ｄＮＴＰ、Ｍｇ²⁺、ＤＮＡポリメラーゼおよびオ
リゴヌクレオチドプライマーとともにプライマーが分離
した（変性した) 標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズし且つ
ポリメラーゼがプライマーを延長して標的配列の十分な
二重鎖レプリカを作成する条件下にインキュベートされ
る。

【００４４】ＰＣＲ増幅条件、例えば温度、インキュベ
ーション時間、溶剤、酵素選択、試薬濃度、装置等を選
択して、標的ＤＮＡ配列の十分且つ特異的な増幅を与え
る。各プロセスおよびパラメーターに有効でかつ任意の
条件が、標的微生物、種々の種類のサンプル、標的ＤＮ
Ａ配列および選択されるプライマー対間で著しく異なる
ことが速やかに理解されよう。十分に良好に制御された
温度およびインキュベーション時間を用いて熱サイクル
を行うための溶剤の選択、酵素の選択および装置の選択
は、一般にＤＮＡのＰＣＲ増幅の分野の当業者に理解さ
れている。

【００４５】本発明の特異的標的配列のための至適温度
およびインキュベーション時間の選択は、常套の力価格
定、増幅されたＤＮＡの量および質の追跡、例えばＤＮ
Ａの蛍光染料、例えばエチジウムブロマイドによる染色
後のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって測定される。選択されたプライマーにより定義
されることが期待されるサイズを有する標的ＤＮＡの電
気泳動バンドの収量を最大化し、そしてその他のＤＮＡ
の増幅を極少化、好ましくは防止する反応条件を選択す
る。

【００４６】本発明のＰＣＲＤＮＡ増幅を行うための
特に好ましい条件の例として、９４℃で３分間の初期変
性；５０℃で１分間の再アニーリングおよび延長温度；
９４℃で１分間の変性温度およびＧＧＬ７８〜９７およ
びＧＧＲ１７１〜１９０についてのマグネシウム濃度
１．５ｍＭ；およびＧＧＬ２６７〜２８６およびＧＧＲ
３６６〜３８５およびＧＧＬ４０５−４３３およびＧＧ
Ｒ５９６〜６２２；９４℃で３分間の初期変性、６０℃
で６０秒間の再アニーリング温度；９４℃で６０秒間の
変性温度；およびＧＧＬ６３９〜６５８およびＧＧＲ７
９８−８０９について１．５ｍＭのマグネシウム濃度を
挙げることができる。プライマーに関する塩基配列を以
下の表２に記載する。

【００４７】ＲＮＡを用いて出発するＰＣＲ増幅につい
て、未変性標的ＲＮＡは、９０℃に５分間加熱し、引き
続いて５℃に２分間冷却することによって５０μｌ
０．１％ＤＥＰＣ含有水中でシストから回収される。
ｃＤＮＡは、ネズミ・モロネイ白血病ウイルス（ＭＭＬ
Ｃ）リバーストランスクリプターゼおよびプライマーＧ
ＧＲ７８９〜８０９を使用して標的ｍＲＮＡから単離さ
れる。

【００４８】ジアルジンをコードする遺伝子は、ジアル
ジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属の間で十分に保存されて検出
測定における標的として使用可能となる。ジアルジン遺
伝子は増幅なしで標的配列としての役割を果たすが、標
的領域に関する選択核酸サブ配列の増幅は、検出測定の
感度を著しく増加する。遺伝子内のサブ配列は、多形性
で広く異なる。すなわち、環境ジアルジア（Ｇｉａｒｄ
ｉａ）追跡に有利に使用することができるという事実で
ある。本発明の著しい発見のうちの一つは、検出をヒト
病原性ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）と無害の種とを分
別させるジアルジン遺伝子の超可変性領域の同定であ
る。

【００４９】ジアルジン遺伝子のヌクレオチド配列は既
知ではあるが、直接またはＰＣＲ増幅の後のいずれかに
ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）を検出するための標的と
してこの遺伝子を使用する可能性は、本発明に先立って
認識されておらずまたそうすることの原理も明らかにさ
れていなった。

【００５０】本発明は、以下の新規の発見を包含する。
すなわち、（１）ジアルジン遺伝子が３つの十分に保存
された領域を含有し、ヒト病原性ジアルジア（Ｇｉａｒ
ｄｉａ）菌株だけでなくその他のジアルジア（Ｇｉａｒ
ｄｉａ）種、例えばＧ．ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉ
ａ）〔＝Ｇ．インテスティナリス（Ｇ．ｉｎｔｅｓｔｉ
ｎａｌｉｓ）〕、Ｇ．ドウデナリス（Ｇ．ｄｕｏｄｅｎ
ａｌｉｓ）およびＧ．ムリス（Ｇ．ｍｕｒｉｓ）のＰＣ
Ｒ増幅および遺伝子プローブ検出を可能にし、そしてこ
の保存領域がその他の原生動物、藻類、バクテリア、菌
体およびヒトＤＮＡに存在しないこと；および（２）ジ
アルジン遺伝子が十分に超可変性の領域を含有するの
で、ヒト病原性のＧ．ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉ
ａ）を含むが非ヒト病原性の種であるＧ．ムリス（Ｇ．
ｍｕｒｉｓ）およびＧ．アルデア（Ｇ．ａｒｄｅａｅ）
を含まないＧ．ドウデナリス（Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉ
ｓ）類だけのＰＣＲ増幅および遺伝子プローブ検出を可
能にする。更に、この超可変性領域は、その他の原生動
物、藻類、バクテリア、菌体およびヒトＤＮＡには存在
せず、従ってこのジアルジン配列は、ジアルジア（Ｇｉ
ａｒｄｉａ）のヒト病原性菌株を検出するのに好適な標
的である。

【００５１】より詳しくは、本発明の方法に使用するの
に好ましい遺伝子サブ配列は、表１に示されたプライマ
ー対によって定義される。ジアルジン遺伝子Ｇ．ランブ
リア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）の４つの別の領域が４つの
増幅プライマー対によって増幅される。ジアルジン配列
に関する位置数は、ＮＩＨ−ＢＩＯＮＥＴデータバンク
に寄託されたものに基づいている。ジアルジン遺伝子の
配列は、公然に利用可能であり、そしてＢａｋｅｒ等Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：７１７７，１９
８８年により公開されている。慣習により、上流または
左プライマー（ＧＧＬ）は、公開された配列と同一であ
り、そして下流または右は、公開された配列と相補性で
ある。

【００５２】表１．増幅プライマー１．ＧＧＬ７８−９７５’−ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１７）および２．ＧＧＲ１７１−１９０５’−ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴ−３’（配列番号１８）、または３．ＧＧＬ２６７−２８６５’−ＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号１９）および４．ＧＧＲ３６６−３８５５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号２０）、または

【００５３】５．ＧＧＬ６３９−６５８５’−ＡＡＧＴＧＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号２１）および６．ＧＧＲ７８９−８０９５’−ＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡ−３’（配列番号２２）〔ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属に関する。〕７．ＧＧＬ４０５−４３３５’−ＣＡＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２３）、および８．ＧＧＲ５９２−６２２５’−ＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＡ−３’（配列番号２４）〔Ｇ．ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）およびＧ．ドウデナリス（Ｇ．ｄｏｕｄｅｎａｌｉｓ）に関する。〕

【００５４】また、有効なプライマーは、これらのサブ
配列からだけでなくこれらに含まれる配列、実質的にす
なわち約１０ｂｐこれらと重なる配列、標的遺伝子内の
配列、および標的遺伝子を含有する配列からも構成する
ことができる。また、ＰＣＲ機能が適当に機能すること
を保証するために内部陽性対照配列（ＩＰＣ）を包含し
てもよい。ＩＰＣは、ジアルジア標的核酸が存在するか
否かに無関係に陽性対照として作用する増幅可能な標的
を含んでなる。好ましい態様において、ＩＰＣは、ヒト
ＨＬＡＤＱα遺伝子の部分から選択された非天然配列
を含んでなる。この遺伝子配列は、いずれかの標的配列
のサブ配列を増幅するのに使用される上流プライマー及
び下流プライマーに相補性の配列に挟まれている。

【００５５】ヒトＨＬＡＤＱαは、水サンプルに比較
的まれで且つ検出可能なレベルでサンプル中に存在しそ
うにない配列である。好ましいＩＰＣに関する配列を表
２に示す。ＩＰＣは二重鎖かあるいは一重鎖のいずれか
であることができ、そして増幅反応混合物中にまたは別
の容器内で保存することができる。典型的には、ＩＰＣ
は１，０００，０００ないし１０，０００，０００コピ
ーで増幅反応混合物に添加される。サンプル中に存在す
るジアルジアの定量に関して、より低い量のＩＰＣ、例
えば５０〜１００コピーを使用することができる。Ｔａ
ｑポリメラーゼの活性化により反応を開始するために２
５ｍＭＭｇＣｌ₂溶液が含められる。

【００５６】表２．内部陽性標準配列（ＩＰＣ）および
プローブ

【化１】 ^*は単一ミスマッチ塩基対を表す。

【００５７】非−増幅標的遺伝子サブ配列および増幅さ
れた遺伝子サブ配列を検出する方法は本質的に同一であ
る。唯一の相違は、非−増幅標的が、感度の低い検出手
段の使用を可能にするほど十分な量では一般に得られな
いことである。例えば、標的配列の検出は、エイチジウ
ムブロマイド染色後のゲルの直接の可視化により、ある
いは特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用
する間接的手段により達成することができる。しかしな
がら、間接的手段は、より感受性であり、従って増幅標
的および非増幅標的の両方に推奨される。これらの方法
は、当業者に周知であり、そしてかゝる技術の一般的レ
ビューは、ＮｕｃｋｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ，ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ，ＴＲＬＰｒ
ｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８５
年に見出すことができる。

【００５８】標的遺伝子配列の検出がサザンブロットの
ようなハイブリダイゼーションによる場合、増幅された
領域のサブ配列に特異に相補性の核酸が使用される。か
ゝるプローブは、増幅されたセグメントの配列から直ち
に得られる。プローブは、プライマー配列とプローブ配
列との重なりを避けるためにプライマー結合サブ配列間
に位置するＤＮＡサブ配列にハイブリダイゼーションす
るのが好ましい。表１に示したプライマーと共に使用す
るのに好ましいプローブを表３に示す。当業者は、長さ
および結合部位が変更された別のプローブを使用できる
ということを直ちに認識するであろう。

【００５９】測定方式に依存して、増幅された生成物を
検出するために、ラベルされたプローブを機能させるの
が有効であろう。プローブは当業的において知られてい
る任意の方法によりラベルすることができる。放射性ラ
ベル及び酵素ラベルが好ましい。酵素ラベルが好まし
い。最も好ましいのは、好適な物質の存在下に着色され
た生成物を生成するものであり、例えば、ホースラディ
ッシュペルオキシターゼおよびアルカリホスファターゼ
が挙げられる。色の発現は、種々の公知の物質を使用す
る種々の手段により達成することができる。ホースラデ
ィッシュペルオキシターゼに好ましい方法は、Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．３３（８）：第１３６８〜１３７１頁、
１９８７年に記載の通りテトラメチルベンジジンを使用
することを包含する。別の検出系は、市販されているＥ
ｎｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
（ＥＣＬ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔである。

【００６０】電気泳動条件および個々の増幅されたオリ
ゴヌクレオチドを検出する手段は、周知であり、そして
本発明の臨界的観点ではない。当業者により認められる
あらゆる手段が本発明に適当である。増幅された生成物
の検出の別の態様は、膜小片上へのサンドイッチハイブ
リダイゼーションによるものである。代表的配置におい
て、小片は、ナイロン製であり、そして分離したスポッ
トに共有結合したオリゴヌクレオチド捕捉プローブを有
している。捕捉プローブおよび検出プローブは、両者と
も標的領域の相補性サブ配列に結合することによって機
能するので本質的に同一である。従って、表３のプロー
ブは、捕捉プローブとして機能する。

【００６１】オリゴヌクレオチド捕捉プローブをナイロ
ンに結合させるために、これらに先ず約１００塩基のオ
リゴチミジン酸で尾部を付ける。テーリングは、末端ト
ランスフェラーゼ、例えばコウシ−胸腺末端デオキシニ
クレオチジルトランスフェラーゼを使用して達成でき、
あるいはポリチミジンオリゴヌクレオチドをプローブと
一緒に合成することができる。テーリングされたオリゴ
ヌクレオチドは、ナイロン小片上にスポットされる。こ
の小片を一晩乾燥し、そして紫外線照射に暴露する。次
いで、この小片をハイブリダイゼーション検定を行うま
で保存する。

【００６２】捕捉プローブは、ジアルジア（Ｇｉａｒｄ
ｉａ）ゲノムの増幅された生成物に結合することができ
る。増幅された生成物をハイブリダイゼーションを通じ
て捕捉プローブに結合させる。増幅された生成物の検出
の好ましい手段は、増幅された生成物がストレプタビジ
ン−ホースラディッシュペルオキシターゼ複合体に結合
できるように各プライマーをビオチン化することであ
る。次いで、この複合体は、市販の基質を使用するクロ
モゲン発色により増幅された生成物の検出を可能にす
る。プライマー対は、ＬｅｖｅｎｓｏｎＣ．および
Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｎｏｎｉｓｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ
ＬａｂｅｌｅｄＰｒｏｂｅｓａｎｄＰｒｉｍｅｒ
ｓｉｎＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ等
編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，第９９
〜１１２頁，１９９０年に記載の方法を使用してビオチ
ン化することができる。

【００６３】また、増幅された標的ＤＮＡも、高圧液体
クロマトグラフィー〔ＨＰＬＣ〕によって検出できる。
増幅された標的ＤＮＡ生成物、副生成物およびＨＰＬＣ
による未反応試薬の分離により、期待されるサイズ範囲
の増幅されたＤＮＡの存在または不存在についての迅速
な定量的レポートが提供される。ＨＰＬＣカラムは、例
えばイオン交換、対イオン逆相またはサイズ除外分離に
基づくものであってよい。

【００６４】蛍光ＤＮＡ−結合染料との後カラム誘導体
化後の蛍光追跡および電気化学的検出も可能であり、そ
して一般に分光法より潜在的により高感受性であるが、
カラム流出液は、一般に最も単純に検出することがで
き、そして２５０〜２８０ｎｍスペクトル領域中での紫
外線吸収により定量される。増幅された標的ＤＮＡ生成
物、副生成物およびＨＰＬＣによる未反応試薬の分離、
引き続いての蛍光または吸収性染料でのＤＮＡ染色も、
期待されるサイズ範囲の増幅されたＤＮＡの存在または
不存在についてレポートする。

【００６５】表３．ジアルジンをコードする標的ＤＮＡ
遺伝子配列の捕捉または検出に好適な遺伝子プローブＧＧＰ１０５〜１４５ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属のためのプライマーＧ
ＧＬ７８−７９およびＧＧＲ１７１−１９０を使用して
生成したＰＣＲ増幅された生成物について５’−ＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧ
ＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧ−３’（配列
番号５）ＧＧＰ３１８〜３４２ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属のためのプライマーＧ
ＧＬ２６７−２８６およびＧＧＲ３６６−３８５を使用
して生成したＰＣＲ増幅された生成物について５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴ
ＣＣＣ−３’（配列番号６）ＧＧＰ７５１〜７７６

【００６６】ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属のための
プライマーＧＧＬ６３９−６５８およびＧＧＲ７８９−
８０９を使用して生成したＰＣＲ増幅された生成物につ
いて５’−ＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＡＧＡＴ
ＣＣＡＧ−３’（配列番号７）ＧＧＰ５１０〜５３７Ｇ．ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）の特異的検出の
ためのプライマーＧＧＬ４０５−４３３およびＧＧＲ５
９２−６２２を使用して生成したＰＣＲ増幅された生成
物について５’−ＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡ
ＧＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８）

【００６７】本発明の更に別の観点は、本発明のＰＸＲ
増幅および検出法を行うのに使用するのに好適なキット
を含んでなる。かゝるテストキットは、水媒体病原体の
増幅および検出を促進することを意図するが、一般に上
記病原体の標的遺伝子中の標的とするＲＮＡまたはＤＮ
Ａ配列の相補性鎖上の約１０〜２０ヌクレオチド配列に
相補性の２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマー
対および標的とするサブ配列の検出のためのプローブ配
列および場合により上記標的とするサブ配列の対照ＤＮ
Ａ鋳型を含んでなる。このテストキットは更に、出版さ
れた指示並びに標的とするＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅およ
び検出のための試薬を含んでなることができる。

【００６８】標的とするＲＮＡまたはＤＮＡ配列のＰＣ
Ｒ増幅のための試薬は、デオキシリボヌクレアーゼ、リ
バーストランスクリプターゼ、ＰＣＲ増幅ポリメラーゼ
等および水サンプル回収用の濾過装置を包含する。ま
た、このキットは、至適濃度の耐熱性核酸ポリメラー
ゼ、選択プライマー、ｄＮＴＰ、ＩＰＣおよび緩衝塩を
含有するポリメラーゼ鎖増幅反応混合物バルクを含んで
もよい。

【００６９】本発明による好ましい検出キットは、上記
の好ましいプライマー対および以下に記載する対応する
好ましいプローブ配列、並びに場合により標的とするＤ
ＮＡ配列の対照ＤＮＡ鋳型を含んでなる。例えば、ジア
ルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属の検出用のテストキット
は、プライマー対５’−ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴ
ＧＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１７）および５’−ＡＴ
ＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴ−３’（配列番
号１８）並びに遺伝子プローブ５’−ＡＧＣＡＧＧＴＴ
ＣＣＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣ
ＧＡＧＧＴＣＣＧ−３’（配列番号５）またはジアルジ
ン遺伝子中の配列の増幅のためのそして上記ジアルジン
遺伝子中の増幅された配列の検出のためのこの配列の相
補体を含んでなることができる。

【００７０】Ｇ．ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）ま
たはＧ．ドデナリス（Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）専用
のテストキットは、プライマー対５’−ＣＡＴＡＡＣＧ
ＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡ−３’
（配列番号２３）および５’−ＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣ
ＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＡ−３’（配
列番号２４）、遺伝子対プローブ５’−ＡＧＣＴＣＡＡ
ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＴ−３’
（配列番号８）またはジアルジン遺伝子中の配列の増幅
のためのそして上記ジアルジン遺伝子中の増幅された配
列の検出のためのこの配列の相補体を含んでなることが
できる。

【００７１】また、このテストキットは、増幅された生
成物を検出する手段を含んでなることもできる。ハイブ
リダイゼーションドットブロットまたはアガロースアク
リルアミドゲル電気泳動等のいずれの標準検出手段をも
使用できるが、好ましい方法は、増幅された標的に特異
的に結合する捕捉オリゴヌクレオチドを有するディップ
スティックを使用するものである。このディップスティ
ックは、標的を捕捉し、そして非−同位元素検出系によ
り検出される。例えば、延長の前にプライマーをビオチ
ン化し、そしてホースラディッシュペルオキシターゼ−
ストレプトアビジン複合体を使用して増幅された標的の
捕捉部位に上記酵素を特異的に結合することができる。
好適な基質／緩衝液の組み合わせは、ｐＨ５．０の１０
０ｍＭクエン酸Ｎａ中の３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジン（ＴＭＢ）である。

【００７２】直ちに想像されるように、ジアルジンをコ
ードする遺伝子のサブ配列を増幅する反応試薬は、別々
の区画にあることができ、あるいは増幅管中で一緒にす
ることができる。例えば、管は、増幅混合物、特異的プ
ライマーおよびＴａｑポリメラーゼを含有してよい。使
用前に、この管を単に開放し、そしてテストサンプルを
包含する残りの試薬を添加する。本発明を、以下の水媒
体ジアルジアの回収、ＰＣＲ増幅および検出に関する例
示的試験およびその結果により説明する。。種々の置換
および変更が本発明の範囲および精神を逸脱することな
しに本明細書に開示された発明になされることは当業者
に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的で提供
されたものであり、本発明の限定として解釈されるもの
ではない。

【００７３】

【実施例】

Ａ．一般的方法１．３種類の方法がジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）細
胞からＤＮＡを回収するのに有効である。第１の方法に
おいて、全ゲノムＤＮＡを、先ずｐＨ７．２（ＨＣｌに
よる）の０．１４５ＭＮａＣｌ、０．７６ｍＭＮａ
Ｈ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、２．２４ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・
７Ｈ₂Ｏの冷たい燐酸緩衝生理食塩〔ＰＢＳ〕緩衝液中
でこの細胞を洗浄することによってトロフォゾイト（ｔ
ｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）から抽出し、ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）処理によるアルカリ細胞分解により放
出する（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等編，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，ＪｈｏｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．ＮＹ，１９８７年を参照のこと）。

【００７４】プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を使用してタンパク質を除去
し、そしてクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）およびフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：２４：１）抽出を使用してＤＮＡを
更に精製し、引き続いてイソプロパノールで沈降させ
た。１２，０００×ｇで１５分間遠心した後に、ペレッ
ト化したＤＮＡを一度冷７０％アルコールで洗浄しそし
て減圧下に乾燥した。ジアルジアシストからの標的ＤＮ
Ａの回収の二つの単純な細胞溶解法においては、シスト
を、１６，０００×ｇで５分間遠心することによって回
収し、水中の０．１％ＤＥＰＣ５０μＬに再懸濁
し、そして９０℃に５分間加熱し続いて氷中で急冷する
かあるいは凍結−解凍サイクルを行うことによって細胞
溶解した。

【００７５】２．ＤＮＡサーモサーキュラーおよびＴ
ａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅をを行った。Ｐ
ＣＲ溶液は、１×ＰＸＲ増幅緩衝液（１０×緩衝液は５
０ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリスＣｌ，ｐＨ８．
１３、１５ｍＭＭｇＣｌｏ０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ンを含有する）、各２００μＭのｄＮＴＰ、各０．１〜
１μＭのプライマー、１ａｇ（１０〜１８ｇ）〜１μｇ
鋳型ＤＮＡ、２．５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよ
び０．１％ＤＥＰＣを含有する二重蒸留水を含有して
いた。鋳型標的ＤＮＡを先ず９４℃で１〜３分間変性し
た。次いで、以下の条件、すなわち、９４℃で１分間の
変性、５０℃または６０℃で１分間のプライマーアニー
リングおよび延長を使用して総計２５〜４０回のサイク
ルを行った。

【００７６】ＤＮＡシンセサイザーを使用してオリゴヌ
クレオチドヌクレオチドプライマーを合成し、そして少
量サンプルについてはオリゴヌクレオチド精製カートリ
ッジ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓ
ｔｅｒＣｉｔｙ，ＵＳＡ）および多量のサンプルにつ
いてはＣ−３ミクロン逆層をカラムを用いる逆層ＨＰＬ
Ｃを使用して精製した。

【００７７】第１の領域は、２０量体プライマーＧＧＬ
７８〜９７、５’−ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡ
ＡＣＣＡ−３’（配列表１７）およびＧＧＲ１７１〜１
９０、５’−ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴ
Ｔ−３’（配列表１８）を使用することによって増幅さ
れたジアルジン遺伝子の１１３ｂｐ領域である。プライ
マーＧＧＬ７８〜９７は、ジアルジン遺伝子のコード配
列内で７８ｂｐないし９７ｂｐに位置し、そしてＧＧＲ
１７１〜１９０は、１７１ｂｐないし１９０ｂｐに位置
する。

【００７８】１１９ｂｐ長のジアルジン遺伝子の第２の
領域は、プライマーＧＧＬ２６７〜２８６、５’−ＡＡ
ＧＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番
号１９）およびＧＧＲ３６６〜３８５、５’−ＡＧＡＴ
ＴＴＧＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号２
０）を使用することによって増幅された。プライマーＧ
ＧＬ２６７〜２８６は、ジアルジン遺伝子のコード配列
内で２６７ｂｐないし２８６ｂｐに位置し、そしてＧＧ
Ｒ３６６−３８５は、３６６ｂｐないし３８５ｂｐに位
置する。

【００７９】２１８ｂｐ長のジアルジン遺伝子の第３の
領域は、プライマーＧＧＬ４０５〜４３３、５’−ＣＡ
ＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ
ＡＡ−３’およびＧＧＲ４９２〜６２２、５’−ＴＴＴ
ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣ
ＴＡＡ−３’を使用することによって増幅された。プラ
イマーＧＧＬ４０５〜４３３は、ジアルジン遺伝子のコ
ード配列内で４０５ｂｐないし４３３ｂｐに位置し、そ
してＧＧＲ５９２〜６２２は、５９２ｂｐないし６２２
ｂｐに位置する。

【００８０】１７１ｂｐ長のジアルジン遺伝子の第４の
領域は、プライマーＧＧＬ６３９〜６５８、５’−ＡＡ
ＧＴＧＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴ−３’およびＧ
ＧＲ７８９−８０９、５’−ＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴ
ＧＡＣＣＡＴＣＧＡ−３’を使用することによって増幅
された。プライマーＧＧＬ６３９〜６５８は、ジアルジ
ン遺伝子のコード配列内で６３９ｂｐないし６５８ｂｐ
に位置し、そしてＧＧＲ７８９〜８０９は、７８９ｂｐ
ないし８０９ｂｐに位置する。

【００８１】多段階ＰＣＲを利用する例において、ジア
ルジン遺伝子の２つの領域を２組のプライマーの混合物
を使用して同時に増幅する場合、一方のプライマー組
は、ＧＧＬ４０５〜４３３およびＧＧＲ５９２〜６２２
とし、そして他方のプライマー組は、上記の別の３組の
うちのいずれか１組とした。当量の２組のプライマーを
利用した。

【００８２】３．ＰＣＲ増幅された標的としてのジア
ルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）ＤＮＡ配列を、ゲル電気泳動
および放射線標識された遺伝子プローブを使用して検出
する。増幅された標的ＤＮＡ対照を０．８〜１％水平ア
ガロースゲルまたは１０％垂直ポリアクリルアミドゲル
を使用して分離する。アガロースゲルは、ＴＡＥ緩衝液
（０．０４Ｍトリス−アセテートおよび０．００１Ｍ
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中で操作される。ポリアクリ
ルアミドゲルは、ＴＢＥ緩衝液（０．８９Ｍトリスボ
レート、０．８９Ｍ硼酸および０．００２ＭＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）中で５．７〜９．０Ｖ／ｃｍで２〜４
時間操作される。ゲルを２×１０^-4％エチジウムブロマ
イド溶液中で染色し、そしてＰｈｏｔｏ／ＰｒｅｐＩラ
イトボックス（ＦｏｔｏｄｙｎｅＩｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｂｅｒｌｉｎ，ＵＳＡ）で可視化し、そして写真を撮
る。

【００８３】サザンブロットに関して、増幅された標的
ＤＮＡ配列を、０．４ＭＮａＯＨを使用してナイロン
膜（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ
Ｍｅｓａ，ＵＳＡまたはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄ，ＵＳＡ）上に移し、そして１時間８０℃でベーク
することによってあるいはＵＶ照射によって上記膜上に
固定する。ドットブロットに関して、二重鎖の増幅され
た標的ＤＮＡを、０．１容量３ＭＮａＯＨおよび０．
１ＭＮａ₂ＥＤＴＡを含有する変性溶液を添加するこ
とによって変性し、そして６０℃で１５分ないし１時間
インキュベートし、そして１容量冷２Ｍ酢酸アンモニ
ウムで中和する。次いで４〜５ｐｓｉ真空圧で（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）ドットブロットマニホールドを使用してサン
プルをＺｅｔａプローブナイロン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
上にスポットする。ＩＣＮナイロン膜に固定された増
幅されたＤＮＡを、５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１０
ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．０、０．１８ｍＭＮａ
Ｃｌ、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡである）、０．５％ダ
ーウェント溶液および１００μｇ／ｍＬフェノール抽
出、変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）または５０μｇ
／ｍＬタイプＸベーカー酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を
含有するハイブリダイゼーション溶液で予備ハイブリダ
イゼーションした。

【００８４】予備ハイブリダイゼーションは、５５〜６
０℃で３〜１６時間行った。ブロットを２度２×ＳＳＰ
Ｅ、０．５％中で室温で１０分間、各一度づつ０．１×
ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで５５℃で３〜５分間穏やか
に攪拌しながら洗浄する。³²Ｐ−標識されたＤＮＡを検
出するために、ブロットをサランラップ（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｕ
ＳＡ）およびｘ−線フィルム（これらの上に置く；フィ
ルム暴露は、−７０℃で１〜４８時間行う）で被覆す
る。

【００８５】本発明に使用するのに好ましいプローブを
表３に示す。これらは、プライマーＧＧＬ７８〜９７お
よびＧＧＲ１７１−１９０を使用して増幅されたジアル
ジン遺伝子の検出に使用される４１量体遺伝子プローブ
ＧＧＰ１０５〜１４５；プライマーＧＧＬ２６７〜２８
６およびＧＧＲ３６６〜３８５を使用して増幅されたジ
アルジン遺伝子の検出に使用される２５量体遺伝子プロ
ーブＧＧＰ３１８−３４２；プライマーＧＧＬ４０５〜
７７６およびＧＧＲ５９２〜６２２を使用して増幅され
たジアルジン遺伝子の検出に使用される２８量体遺伝子
プローブＧＧＰ５１０−５３７、５’−ＡＧＣＴＣＡＡ
ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＴ−３’；
およびプライマーＧＧＬ６３９−６５８およびＧＧＲ７
８９〜０９を使用して増幅されたジアルジン遺伝子の検
出に使用される２６量体遺伝子プローブＧＧＰ７５１〜
７７６を包含する。

【００８６】全ての遺伝子プローブは、増幅された標的
ＤＮＡ配列の各領域内に位置する標的配列にハイブリダ
イゼーションする。３０μＬ反応溶液が５０ｍＭトリ
スＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭ
ＤＴＴ、ｍＭＫＣｌ、１〜１０μｇオリゴヌクレオ
チド遺伝子プローブ、１２０ｐモル〔³²Ｐ〕ＡＴＰ（特
異活性＞３０００Ｃｉ／ｍモル）、１ｍＭスペルミジ
ン（二ナトリウム塩）および２０単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを含有する方法により、〔³²Ｐ〕ＡＴＰ
（＞３０００Ｃｉ／ｍモル）でこれらの遺伝子プローブ
を５−末端放射線標識する。この反応混合物を３７℃で
１時間インキュベートし、そして放射線標識されたプロ
ーブを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムおよびＴＥ
緩衝液（１０ｍＭトリスＣｌ，ｐＨ７．６、１ｍＭＮ
ａ₂ＥＤＴＡ）を使用して精製した。

【００８７】Ｂ．ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）検出
の特異性ＰＣＲ増幅によるジアルジア（Ｇｉａｒｄｉ
ａ）検出の特異性を説明するために、上記の４組のプラ
イマーおよび表４に示すプロトザンおよび非プロトザン
ＤＮＡを使用して試験を行った。表４ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia ）vis-CD
C Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）H-1-P Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）H-2-P Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）WB (FG) Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）MR-4 Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）Be-1 Ｇ．ムリス（G. muris ）Ｇ．インテスティナリス（G. intestinalis）50137 Ｇ．インテスティナリス（G. intestinalis）50114

【００８８】アカンサモエバ・カステライス（Acantham
oeba castellais）30011 エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytic
a ）HM-1 エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytic
a ）30015 クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium
parvum）Ｃ．ムリス（C. muris ）ジエンタモエバ・フラギリス（Dientamoeba fragili
s）40948 エンタモエバ・コリ（Entamoeba coli）30496 ブラストジウム・ホミニス（Blastodium hominis ）50
177 トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis
）30001 エイメリア・ニエスチュリチ（Eimeria nieschulzi）クロレラ（Chlorella ）シェネデスムス（Scenedesmus ）

【００８９】クロロコッカム（Chlorococcum）エッシェリシア・コリ（Escherichia coli）レジノメラ・ニュモフィラ（Leginonella pneumophi
a）サルモネラ・ティピムリウム（Salmonella typhimuriu
m ）シゲラ（Shigella）シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）Ｐ．ジミヌタ（P. diminuta）Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens ）Ｐ．アエルギノーサ（P. aeroginosa）アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecali
s）サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cere
visiae）ウスチラゴ・ビオラカア（Ustilago violacea）ヒト DNA

【００９０】ＤＮＡをこれらの株の培養液から抽出し、
そして回収されたＤＮＡ５０ｎｇないし１μｇを、Ｐ
ＣＲ法の際に種々のアニーリング温度を使用して記述の
ＰＣＲ増幅に供した。遺伝子プローブを使用して、以下
に記載するサザンブロットおよびドットブロットの両方
により増幅されたＤＮＡ配列を検出した。放射線標識さ
れたプローブの特異活性は、６８，０００〜１６７，０
００ＤＭＰ／μｇであった。

【００９１】プライマーＧＧＬ６３９〜６５８およびＧ
ＧＲ７８９〜８０９並びに６０℃のプライマーアニーリ
ング温度を使用したＰＣＲ増幅は、試験した全てのジア
ルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）菌株についで増幅されたＤＮ
Ａバンドをもたらした。試験した非−ジアルジア種は、
ジアルジン遺伝子（表５参照）に関するプライマーを使
用してＤＮＡ増幅を示した。遺伝子プローブＧＧＰ７５
１〜７７６によるサザンブロットハイブリダイゼーショ
ンは、ターゲット配列の増幅がジアルジアに特異である
ことを示した。

【００９２】表５ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia ）vis-CDC + + Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）H-1-P + + Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）H-2-P + + Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）EB (FG) + + Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）MR-4 + + Ｇ．ランブリア（G. lamblia ）Be-1 + + Ｇ．ムリス（G. muris ） + - Ｇ．インテスティナリス（G. intestinalis）50137 + + Ｇ．インテスティナリス（G. intestinalis）50114 + +

【００９３】アカンサモエバ・カステライス（Acanthamoeba castellais）30011 - - エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica ）HM-1 - - エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica ）30015 - - クリプトポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum） - - Ｃ．ムリス（C. muris ） - - ジエンタモエバ・フラギリス（Dientamoeba fragilis）40948 - - エンタモエバ・コリ（Entamoeba coli）30496 - - ブラストジウム・ホミニス（Blastodium hominis ）50177 - - トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis ）30001 - - エイメリア・ニエスチュルチ（Eimeria nieschulzi） - - クロレラ（Chlorella ） - - シェネデスムス（Scenedesmus ） - -

【００９４】クロロコッカム（Chlorococcum） - - エッシェリシア・コリ（Escherichia coli） - - レギノメラ・ニューモフィア（Leginonella pneumophia） - - サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium ） - - シゲラ（Shigella） - - シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia ） - - Ｐ．ジミヌタ（P. diminuta） - - Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens ） - - Ｐ．アエルギノサ（P. aeroginosa） - - アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis） - - サッカロミカス・セレビシエー（ Saccharomyces cerevisiae） - - ウスチラゴ・ビオラセア（Ustilago violacea） - - ヒト DNA - -

【００９５】Ｃ．ＲＡＮを使用した生存および死亡ジア
ルジア（Ｇｉａｒｒｄｉａ）シストの識別１．ジアルジア（Ｇｉａｒｒｄｉａ）シストを、１
６，０００ｇで５分間遠心することによって回収し、そ
して０．１％ＤＥＰＣを含有する水５０μＬに再懸濁
する。細胞を９０℃に５分間加熱し、引き続いて５℃で
２分間または氷中で冷却する。１０×ＰＣＲ緩衝液（上
記）１０ＭＬを、ＲＮアシン１μＬおよびデオキシリ
ボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）１μＬとともに添加し、
そして９９℃で５分間インキュベートし、引き続いて５
℃で２分間または氷中で冷却する。ＲＮＡを、死亡シス
ト（凍結により殺処理）から、生存非誘導シストおよび
生存誘導シストからＰｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡからのＲＮ
Ａ剤トータルＲＮＡ単離キットを使用して抽出した。Ｒ
ＮＡの濃度を分光光度計を使用して測定した。

【００９６】２．ＭＭＬＶリバーストランスクリプタ
ーゼを使用して未変性ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し
た。ＤＮアーゼインキュベーションの後、各々２００μ
ｌのｄＮＴＰ、１μＭのプライマーＧＧＲ７８９〜８０
９および１μＬＭＭＬＶリバーストランスクリプター
ゼを添加し、そして反応混合物を４２℃で３０分間イン
キュベートし、引き続いて９９℃で５分間の酵素のイン
キュベーションおよび５℃で２分間または氷中での冷却
を行った。

【００９７】３．プライマーＧＧＬ６３９〜６５８
（１μＭ）を、Ｔａｑポリメラーゼ１μＬと一緒に添加
し、そして３５回のサイクルのＰＣＲ増幅に供した。増
幅法のパラメーターは、初期時間遅れ９５℃２分間、変
性９５℃１分間、６０℃で１分間のアニーリングおよび
延長並びに６０℃で７分間の最終延長とした。

【００９８】４．細胞溶解したシストのＤＮアーゼ処
理および引続くＣＤＮＡ合成後のＰＣＲ増幅により増幅
されたＤＮＡバンドが生成し、シスト中のｍＲＮＡの存
在を示した。死亡シストから抽出されたＲＮＡは、増幅
を示さず、従って生存シストと死亡シストが識別され
る。ＤＮＡ−ＰＣＲは死亡シストおよび生存シストの両
方に対する増幅を示すが、ＲＮＡ−ＰＣＲＨＡは、生存
シストしか増幅しない。これらの実験の結果を表６に示
す。

【００９９】表６．ＲＮＡ収量 10⁶ シストから DNA-PCR RNA-PCR 死亡シスト１μｇ＋ − 非誘導生存シスト２μｇ＋＋インキュベーションの段階１１６μｇ＋＋生存シストを還元溶液およびＮａＨＣＯ₃で３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの段階２１２５μｇ＋＋生存シストを上記のとおりにインキュベートし、そして一度トリプシン−タイロード溶液で洗浄した。インキュベーションの段階３１２７μｇ＋＋上記の通りに処理した生存シストを３７℃で３０分間トリプシン−タイロード溶液中でインキュベーションした。

【０１００】Ｄ．ＰＣＲ増幅によるジアルジア（Ｇｉ
ａｒｄｉａ）検出の感度ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）のＰＣＲ増幅−遺伝子プ
ローブ検出の感度を説明するために、単一シストをＺｅ
ｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ３５倒立顕微鏡下にｄｅ
Ｆｏｎｂｒｕｎｅ空気管式マイクロマニュプレーターを
使用して分離した。シストを９０℃に５分間加熱し、５
℃に２分間冷却し、そしてプライマーＧＧＬ６３９〜６
５８およびＧＧＲ７８９〜８０９（表１）を使用してＰ
ＣＲ増幅に供した。増幅されたＤＮＡを、遺伝子プロー
ブＧＧＰ７５１〜７７６（表３）を使用してポリアクリ
ルアミドゲルおよびサザンブロットにより分析した。１
５回の試験において、プライマーは、繰り返し単一シス
トを検出することができた。

【０１０１】Ｅ．Ｇ．ムリス（Ｇ．ｍｕｒｉｓ）シス
トからのｃＤＮＡの増幅Ｇ．ムリス（Ｇ．ｍｕｒｉｓ）シストを、誘導およびエ
クシステーション（ｅｘｃｙｓｔａｔｉｏｎ）の３つの
前進的段階に導いた。段階１において、嚢子を還元溶液
（グルタチオン０．１ｇ、１×ハンクバランス塩溶液１
０ｍＬ中のＬ−システイン−ＨＣｌ１ｇ）および０．
１Ｍ重炭酸ナトリウム中での３７℃で３０分間のインキ
ュベーションにより誘導した（エクシステーションな
し）。段階２において、シストを段階１の通りに誘導
し、そして一度トリプシン−タイロード溶液（トリプシ
ン０．５ｇ、１×タイロード溶液１００ｍＬ中のＮａＨ
ＣＯ₃０．１５ｇ）中で洗浄した。１０×タイロード溶
液は、ＮａＣｌ１６０ｇ、ＫＣｌ４ｇ、ＣａＣｌ₂
４ｇ、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ２ｇ、ＮａＨ₂ＰＯ ₄
・Ｈ₂Ｏ１ｇおよびＨ₂Ｏ１Ｌ中のグルコース２０
ｇを含有している。段階３において、シストを段階２の
通りに処理し、そしてトリプシン−タイロード溶液中で
の３７℃で３０分間のインキュベーションによりエクシ
ステーションした。

【０１０２】死亡シスト、生存非誘シストおよび３つの
異なる段階に誘導された生存シストから抽出されたＧ．
ムリス（Ｇ．ｍｕｒｉｓ）ＤＮＡ不含有ＲＮＡは、誘導
後のＲＮＡの収量の増加を示し、そして段階２の誘導で
平坦域に到達した（表６）。プライマーＧＧＬ６３９−
６５８およびＧＧＲ７８９−８０９（表１）を使用して
ＲＮＡＰＣＲを、これらのＲＮＡに対して行った。増
幅は、生存誘導シストおよび非誘導シストでしか見られ
ず、死亡シストＲＮＡでは見られなかった。

【０１０３】

【配列表】

配列番号１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：41塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..41 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ結合部位" ／labe
l=GGP105-145 （xi）配列 CGGACCTCGA TCTCGTTCTC CATCTTGTCG TGGAACCTGC T 41

【０１０４】配列番号２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：25塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..25 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ結合部位" ／labe
l=GGP318-342 （xi）配列 GGGACTTGCG GAAGTTTGCA GCCAT 25

【０１０５】配列番号３：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..26 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ結合部位" ／labe
l=GGP751-776 （xi）配列 CTGGATCTTC GAGACGACGT CCTCGA 26

【０１０６】配列番号４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：28塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..28 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ結合部位" ／labe
l=GGP510-537 （xi）配列 AAGCCCTCTG CGACCTTCTC GTTGAGCT 28

【０１０７】配列番号５：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：41塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..41 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ" ／label=GGP105
-145 （xi）配列 AGCAGGTTCC ACGACAAGAT GGAGAACGAG ATCGAGGTCC G 41

【０１０８】配列番号６：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：25塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..25 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ" ／label=GGP318
-342 （xi）配列 ATGGCTGCAA ACTTCCGCAA GTCCC 25

【０１０９】配列番号７：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..26 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ" ／label=GGP751
-776 （xi）配列 TCGAGGACGT CGTCTCGAAG ATCCAG 26

【０１１０】配列番号８：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：28塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..28 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プローブ" ／label=GGP510
-537 （xi）配列 AGCTCAACGA GAAGGTCGCA GAGGGCTT 28

【０１１１】配列番号９：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGL78-97（xi）配列 TGGTTCATGT TGCTGAGCTT
20

【０１１２】配列番号10：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGR171-190 （xi）配列 AAGATGATCA AGGACGCCAT 20

【０１１３】配列番号11：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGL267-286 （xi）配列 ATGTTGTCGG CGGACTTCTT 20

【０１１４】配列番号12：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGR366-385 （xi）配列 AACAACGTTG AGACAAATCT 20

【０１１５】配列番号13：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGL639-658 （xi）配列 AGCTGCTCGT TGACGCACTT 20

【０１１６】配列番号14：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：21塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..21 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGR789-809 （xi）配列 TCGATGGTCA CAAAGCACTA A 21

【０１１７】配列番号15：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：29塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..29 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGL405-433 （xi）配列 TTCCTGAGAG CCGCGATGGC GTCGTTATG 29

【０１１８】配列番号16：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：31塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..31 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー結合領域" ／la
bel=GGR592-622 （xi）配列 TTAGCGCTGC CACGACAGAA GCGCTCACAA A 31

【０１１９】配列番号17：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGL7
8-97 （xi）配列 AAGCTCAGCA ACATGAACCA 20

【０１２０】配列番号18：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGR1
71-190 （xi）配列 ATGGCGTCCT TGATCATCTT 20

【０１２１】配列番号19：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGL2
67-286 （xi）配列 AAGAAGTCCG CCGACAACAT 20

【０１２２】配列番号20：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGR3
66-385 （xi）配列 AGATTTGTCT CAACGTTGTT 20

【０１２３】配列番号21：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGL6
39-658 （xi）配列 AAGTGCGTCA ACGAGCAGCT 20

【０１２４】配列番号22：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：21塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..21 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGR7
89-809 （xi）配列 TTAGTGCTTT GTGACCATCG A 21

【０１２５】配列番号23：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：29塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..29 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGL4
05-433 （xi）配列 CATAACGACG CCATCGCGGC TCTCAGGAA 29

【０１２６】配列番号24：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：31塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..31 （Ｄ）他の情報：／機能＝ "プライマー" ／label=GGR5
92-622 （xi）配列 TTTGTGAGCG CTTCTGTCGT GGCAGCGCTA A 31

【０１２７】配列番号25：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：88塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..88 （Ｄ）他の情報：／注＝ "上流プライマー結合部位" （xi）配列 TTTGATGGAG ATGAGGAGTT CTACGTGGAC CTGGAGAGGA AGGAGACTGC 50 CTGGCGGTGG CCTGAGTTCA GCAAATTTGG AGGTTTTG 88

【０１２８】配列番号26：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..20 （Ｄ）他の情報：／注＝ "陽性対照" （xi）配列 TGAGTTCAGC AAATTTGGAG 20

【０１２９】配列番号27：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：１..19 （Ｄ）他の情報：／注＝ "陰性対照" （xi）配列 GATGAGCAGT TCTACGTGG 19

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アシムケー．ベイアメリカ合衆国，ケンタッキー 40217, ルイスビル，デビッドフェアレイコート 778 (72)発明者ミーナエイチ．マーブバニアメリカ合衆国，ケンタッキー 40217, ルイスビル，デビッドフェアレイコート 778

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジアルジンをコードする遺伝子のコピー
を有するジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属の種の検出法
において、（ａ）核酸プローブを、ジアルジンをコードする遺伝
子の相補性部分にハイブリダイズせしめ；そして（ｂ）ジアルジンをコードする遺伝子への該プローブの
ハイブリダイゼーションを検出することを含んでからな
る方法。
【請求項２】段階（ａ）の前にジアルジン遺伝子のサ
ブ配列を増幅する段階を更に含んでなる請求項１に記載
の方法。
【請求項３】増幅がポリメラーゼ鎖反応法を使用する
ことによって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項４】上記プローブがジアルジンをコードする
遺伝子の保存された領域に結合する請求項１ないし３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】上記プローブがジアルジンをコードする
遺伝子の超可変性領域に結合する請求項１ないし３のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項６】上記プローブが（ａ）３’−ＴＣＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴ
ＡＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣ−５’
（配列番号１）；（ｂ）３’−ＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＧＴ
ＴＣＡＧＧＧ−５’（配列番号２）；および（ｃ）３’−ＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴ
ＣＴＡＧＧＴＣ−５’（配列番号３）からなる群から選
択された配列またはその相補配列に実質的に結合する請
求項１ないし３のいずれかの方法。
【請求項７】上記プローブが３’−ＴＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴ
ＣＣＣＧＡＡ−５’（配列番号４）からなる配列またはその相補配列に実質的に結合する請
求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】上記プローブが（ａ）５’−ＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＧＡ
ＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧ−３’
（配列番号５）；（ｂ）５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡ
ＡＧＴＣＣＣ−３’（配列番号６）；および（ｃ）５’−ＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＡ
ＧＡＴＣＣＡＧ−３’（配列番号７）からなる群から選ばれた核酸サブ配列またはその相補配
列を含んでなる請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項９】上記プローブが５’−ＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡ
ＧＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８）からなる核酸サブ配
列またはその相補配列を含んでなる請求項１ないし３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】（ａ）５’−ＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡ
ＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧ
ＧＴＣＣＧ−３’（配列番号５）；（ｂ）５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡ
ＡＧＴＣＣＣ−３’（配列番号６）；（ｃ）５’−ＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＡ
ＧＡＴＣＣＡＧ−３’（配列番号７）；および（ｄ）５’−ＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣ
ＡＧＡＧＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８）からなるサブ
配列またはその相補配列を含んでなる組換体核酸ハイブ
リダイゼーションプローブ。
【請求項１１】少なくとも１つのプライマーが（ａ）３’−ＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧ
Ｔ−５’（配列番号９）；（ｂ）３’−ＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡ
Ａ−５’（配列番号１０）；（ｃ）３’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴ
Ａ−５’（配列番号１１）；（ｄ）３’−ＴＣＴＡＡＡＣＡＧＡＧＴＴＧＣＡＡＣＡ
Ａ−５’（配列番号１２）；（ｅ）３’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＧ
Ａ−５’（配列番号１３）；（ｆ）３’−ＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＴＡＧ
ＣＴ−５’（配列番号１４）からなる群から選択された核酸サブ配列に実質的に結合
する請求項３に記載の方法。
【請求項１２】少なくとも１つのプライマーが（ａ）３’−ＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＧＧＴＡＧＣＧＣＣ
ＧＡＧＡＧＴＣＣＴＴ−５’（配列番号１５）；および（ｂ）３’−ＡＡＡＣＡＣＴＣＧＣＧＡＡＧＡＣＡＧＣ
ＡＣＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴ−５’（配列番号１６）からなる群から選択された核酸サブ配列に実質的に結合
する請求項３に記載の方法。
【請求項１３】上記プライマーが、（ａ）５’−ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣ
Ａ−３’（配列番号１７）；（ｂ）５’−ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴ
Ｔ−３’（配列番号１８）；（ｃ）５’−ＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡ
Ｔ−３’（配列番号１９）；（ｄ）５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴ
Ｔ−３’（配列番号２０）；（ｅ）５’−ＡＡＧＴＧＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＣ
Ｔ−３’（配列番号２１）；および（ｆ）５’−ＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣ
ＧＡ−３’（配列番号２２）からなる群から選ばれる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】上記プライマーが（ａ）５’−ＣＡＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧ
ＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２３）；および（ｂ）５’−ＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧ
ＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＡ−３’（配列番号２４）からなる群から選ばれる請求項１２の方法。
【請求項１５】ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種から
の核酸のサブ配列の増幅用の核酸ポリメラーゼプライマ
ーであって、（ａ）３’−ＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧ
Ｔ−５’（配列番号９）；（ｂ）３’−ＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡ
Ａ−５’（配列番号１０）；（ｃ）３’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴ
Ａ−５’（配列番号１１）；（ｄ）３’−ＴＣＴＡＡＡＣＡＧＡＧＴＴＧＣＡＡＣＡ
Ａ−５’（配列番号１２）；（ｅ）３’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＧ
Ａ−５’（配列番号１３）；（ｆ）３’−ＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＴＡＧ
ＣＴ−５’（配列番号１４）からなる群から選択された核酸サブ配列に実質的に結合
するプライマー。
【請求項１６】ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種から
の核酸のサブ配列の増幅用の核酸ポリメラーゼプライマ
ーであって、（ａ）３’−ＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＧＧＴＡＧＣＧＣＣ
ＧＡＧＡＧＴＣＣＴＴ−５’（配列番号１５）；および（ｂ）３’−ＡＡＡＣＡＣＴＣＧＣＧＡＡＧＡＣＡＧＣ
ＡＣＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴ−５’（配列番号１６）からなる群から選択された核酸サブ配列に実質的に結合
するプライマー。
【請求項１７】上記プライマーが、（ａ）５’−ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣ
Ａ−３’（配列番号１７）；（ｂ）５’−ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴ
Ｔ−３’（配列番号１８）；（ｃ）５’−ＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡ
Ｔ−３’（配列番号１９）；（ｄ）５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴ
Ｔ−３’（配列番号２０）；（ｅ）５’−ＡＡＧＴＧＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＣ
Ｔ−３’（配列番号２１）；および（ｆ）５’−ＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣ
ＧＡ−３’（配列番号２２）からなる群から選ばれる請求項１５の核酸ポリメラーゼ
プライマー。
【請求項１８】上記プライマーが（ａ）５’−ＣＡＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧ
ＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２３）；および（ｂ）５’−ＴＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧ
ＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＡ−３’（配列番号２４）からなる群から選ばれる請求項１６の核酸ポリメラーゼ
プライマー。
【請求項１９】請求項８および／または９記載の少な
くとも１種類の核酸プローブを含んでなるジアルジア
（Ｇｉａｒｄｉａ）種に特異な核酸の検出用のキット。
【請求項２０】請求項１７および／または１８記載の
少なくとも１種類のポリメラーゼ鎖反応増幅プライマー
を更に含んでなる請求項１９のキット。
【請求項２１】生存微生物を含有する疑いのあるサン
プル中の死亡微生物から生存微生物を検出する方法であ
って、（ａ）上記サンプルを、別の方法では転写されないタン
パク質をコードする遺伝子の転写を誘導するのに充分な
熱で処理し；（ｂ）シストを溶解してｍＲＮＡを放出し；（ｃ）ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；（ｄ）熱誘導される遺伝子をコードするｍＲＮＡの標的
サブ配列を増幅し；そして（ｅ）増幅された標的サブ配列を検出する；ことを含ん
でなる上記方法。
【請求項２２】上記遺伝子がヒートショック遺伝子お
よびジアルジンからなる群から選ばれる請求項２１に記
載の方法。
【請求項２３】上記生存微生物がジアルジア（Ｇｉａ
ｒｄｉａ）の種に由来するシストであり、そして（ａ）上記シストを、ジアルジンをコードする遺伝子の
転写を誘導するのに充分な熱で処理し；（ｂ）シスト溶解してｍＲＮＡを放出し；（ｃ）ｍＲＮＡをｃＲＮＡに逆転写し；（ｄ）ジアルジン遺伝子をコードするｍＤＮＡの標的サ
ブ配列を増幅し；そして（ｅ）増幅された標的サブ配列物質を検出する；ことを更に含んでなる、請求項２１または２２に記載の
方法。
【請求項２４】増幅を請求項３記載の方法によって行
う請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。