JPH05192178A - 抗破骨細胞モノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブリドーマ - Google Patents
抗破骨細胞モノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブリドーマInfo
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- JPH05192178A JPH05192178A JP3207547A JP20754791A JPH05192178A JP H05192178 A JPH05192178 A JP H05192178A JP 3207547 A JP3207547 A JP 3207547A JP 20754791 A JP20754791 A JP 20754791A JP H05192178 A JPH05192178 A JP H05192178A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、哺乳類の破骨細胞、特に骨
吸収能の高い破骨細胞を直接的に検出及び定量的に測定
することを可能にする、哺乳類の破骨細胞に特異的に結
合するモノクローナル抗体を提供すること。 【構成】 哺乳類の破骨細胞を認識し、これに特異的に
結合するモノクローナル抗体を提供した。
吸収能の高い破骨細胞を直接的に検出及び定量的に測定
することを可能にする、哺乳類の破骨細胞に特異的に結
合するモノクローナル抗体を提供すること。 【構成】 哺乳類の破骨細胞を認識し、これに特異的に
結合するモノクローナル抗体を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物の破骨細胞に
特異的なモノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブ
リドーマに関する。
特異的なモノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブ
リドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨
細胞による骨吸収が常にバランス良く行なわれることに
よって維持されている。この骨吸収が骨形成量を上回る
と、次第に骨量が減少し、骨粗鬆症に代表される代謝性
骨疾患を生じる。
細胞による骨吸収が常にバランス良く行なわれることに
よって維持されている。この骨吸収が骨形成量を上回る
と、次第に骨量が減少し、骨粗鬆症に代表される代謝性
骨疾患を生じる。
【０００３】従来の骨疾患の生化学的な検査法として
は、血清カルシウム、リン、アルカリフォスファター
ゼ、オステオカルシン、副甲状腺ホルモン、カルシトニ
ン及び活性型ビタミンＤ3 等の測定が行なわれている。
は、血清カルシウム、リン、アルカリフォスファター
ゼ、オステオカルシン、副甲状腺ホルモン、カルシトニ
ン及び活性型ビタミンＤ3 等の測定が行なわれている。
【０００４】しかし、上述の検査は間接的に破骨細胞の
状態を反映するものであるため、直接的な骨吸収の活性
を反映していない欠点があり、従って破骨細胞に特異的
な検査診断法が望まれている。
状態を反映するものであるため、直接的な骨吸収の活性
を反映していない欠点があり、従って破骨細胞に特異的
な検査診断法が望まれている。
【０００５】従来の破骨細胞に対するモノクローナル抗
体としては、ユスラー（Ｏｕｒｓｌｅｒ）らがニワトリ
破骨細胞に対するモノクローナル抗体を報告しており
（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１００， １５９２−１６
６０，１９８５）、また、ネーバイド（Ｎｉｊｗｅｉｄ
ｅ）らがウズラの破骨細胞に対するモノクローナル抗体
を報告している（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８
３，３１５−３２４，１９８５）。しかしながら、鳥類
では哺乳類の破骨細胞の重要な判定基準であるカルシト
ニンレセプターを有さない等の点から、哺乳類の骨代謝
とは異なる調節機能を有していると考えられている。
体としては、ユスラー（Ｏｕｒｓｌｅｒ）らがニワトリ
破骨細胞に対するモノクローナル抗体を報告しており
（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１００， １５９２−１６
６０，１９８５）、また、ネーバイド（Ｎｉｊｗｅｉｄ
ｅ）らがウズラの破骨細胞に対するモノクローナル抗体
を報告している（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８
３，３１５−３２４，１９８５）。しかしながら、鳥類
では哺乳類の破骨細胞の重要な判定基準であるカルシト
ニンレセプターを有さない等の点から、哺乳類の骨代謝
とは異なる調節機能を有していると考えられている。
【０００６】一方、ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）らは、ヒ
トのオステオクラストーマを抗原として、ヒト破骨細胞
に特異的なモノクローナル抗体を取得したと報告してい
る（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５， ５６６３−５６
６９，１９８５）。しかしながら、ホートンらのモノク
ローナル抗体は、その認識抗原がヴィトロネクチンレセ
プターに対するものであり、破骨細胞に特異的なもので
ないことが判明した。
トのオステオクラストーマを抗原として、ヒト破骨細胞
に特異的なモノクローナル抗体を取得したと報告してい
る（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５， ５６６３−５６
６９，１９８５）。しかしながら、ホートンらのモノク
ローナル抗体は、その認識抗原がヴィトロネクチンレセ
プターに対するものであり、破骨細胞に特異的なもので
ないことが判明した。
【０００７】現状では、哺乳類由来の破骨細胞を認識
し、特異的に結合するモノクローナル抗体が作製されて
いるという報告はない。
し、特異的に結合するモノクローナル抗体が作製されて
いるという報告はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、哺乳類の破骨細胞、特に骨吸収能の高い破骨細胞を
直接的に検出及び定量的に測定することを可能にする、
哺乳類の破骨細胞に特異的に結合するモノクローナル抗
体を提供することである。
は、哺乳類の破骨細胞、特に骨吸収能の高い破骨細胞を
直接的に検出及び定量的に測定することを可能にする、
哺乳類の破骨細胞に特異的に結合するモノクローナル抗
体を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、骨吸収能の高い破骨細胞の形成法を開発し
（久木田ら、第８回日本骨代謝学会 骨代謝学会誌第８
巻１１２ １９９０）、また、多核かつ骨吸収能のない
異物巨細胞（マクロファージポリカリオン）の形成法を
開発した（久木田ら、第８回日本骨代謝学会 骨代謝学
会誌第８巻１０７１９９０）。本願発明者らは、骨吸収
能の高い破骨細胞を免疫原として用い、モノクローナル
抗体のスクリーニングにマクロファージポリカリオンを
陰性対照として用いることにより、破骨細胞、特に骨吸
収能の高い破骨細胞を認識し、これに特異的に結合する
モノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成
した。
究の結果、骨吸収能の高い破骨細胞の形成法を開発し
（久木田ら、第８回日本骨代謝学会 骨代謝学会誌第８
巻１１２ １９９０）、また、多核かつ骨吸収能のない
異物巨細胞（マクロファージポリカリオン）の形成法を
開発した（久木田ら、第８回日本骨代謝学会 骨代謝学
会誌第８巻１０７１９９０）。本願発明者らは、骨吸収
能の高い破骨細胞を免疫原として用い、モノクローナル
抗体のスクリーニングにマクロファージポリカリオンを
陰性対照として用いることにより、破骨細胞、特に骨吸
収能の高い破骨細胞を認識し、これに特異的に結合する
モノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成
した。
【００１０】すなわち、本発明は、哺乳類の破骨細胞を
認識し、これに特異的に結合するモノクローナル抗体を
提供する。さらにまた、本発明は、上記本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
認識し、これに特異的に結合するモノクローナル抗体を
提供する。さらにまた、本発明は、上記本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
【００１１】上述のように、本発明のモノクローナル抗
体は、哺乳類の破骨細胞、好ましくは骨吸収能の高い破
骨細胞を認識し、これに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体である。なお、この明細書において、骨吸収能が
高い破骨細胞とはヒト象牙質上に１〜２日で吸収窩を形
成する破骨細胞をいう。
体は、哺乳類の破骨細胞、好ましくは骨吸収能の高い破
骨細胞を認識し、これに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体である。なお、この明細書において、骨吸収能が
高い破骨細胞とはヒト象牙質上に１〜２日で吸収窩を形
成する破骨細胞をいう。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、以下に記
載する方法により得ることができる。先ず、骨吸収能の
高い哺乳類由来破骨細胞を調製する。哺乳類は、ラッ
ト、マウス、ヒト等いずれの哺乳類であってもよい。骨
吸収能の高い破骨細胞は久木田ら、第８回日本骨代謝学
会 骨代謝学会誌第８巻１１２ １９９０に記載の方法
により調製することができる。すなわち、哺乳類由来の
骨髄細胞を破骨細胞分化誘導培地で培養することにより
調製することができる。破骨細胞分化誘導培地は、基礎
培地として例えば１０-8Ｍ程度の活性型ビタミンＤ3
（１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ）と例えば１０％程度のウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含むαＭＥＭ培地に、誘導促進
物質としてＩＬ−３（濃度１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、
ＩＬ−６（濃度１０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ（濃度１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、デキサメタゾン
（濃度５〜５００ｎｇ／ｍｌ）又は骨芽細胞株由来のコ
ンディションド培地（以下、ＣＭ培地という）のいずれ
かを単独又は組合せて調製することができる。ここで、
ＣＭ培地は、骨芽細胞の培養上清から分子量約１万以上
の画分を集め、例えば９５℃、５分間の熱処理を施した
ものであってよい。下記実施例では、ＣＭ培地を用いて
いる。骨髄細胞の培養は３７℃程度で行なうことが好ま
しい。上記の破骨細胞分化誘導培地中で哺乳類由来の骨
髄細胞を培養することにより、骨吸収能の高い破骨細胞
を得ることができる。
載する方法により得ることができる。先ず、骨吸収能の
高い哺乳類由来破骨細胞を調製する。哺乳類は、ラッ
ト、マウス、ヒト等いずれの哺乳類であってもよい。骨
吸収能の高い破骨細胞は久木田ら、第８回日本骨代謝学
会 骨代謝学会誌第８巻１１２ １９９０に記載の方法
により調製することができる。すなわち、哺乳類由来の
骨髄細胞を破骨細胞分化誘導培地で培養することにより
調製することができる。破骨細胞分化誘導培地は、基礎
培地として例えば１０-8Ｍ程度の活性型ビタミンＤ3
（１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ）と例えば１０％程度のウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含むαＭＥＭ培地に、誘導促進
物質としてＩＬ−３（濃度１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、
ＩＬ−６（濃度１０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ（濃度１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、デキサメタゾン
（濃度５〜５００ｎｇ／ｍｌ）又は骨芽細胞株由来のコ
ンディションド培地（以下、ＣＭ培地という）のいずれ
かを単独又は組合せて調製することができる。ここで、
ＣＭ培地は、骨芽細胞の培養上清から分子量約１万以上
の画分を集め、例えば９５℃、５分間の熱処理を施した
ものであってよい。下記実施例では、ＣＭ培地を用いて
いる。骨髄細胞の培養は３７℃程度で行なうことが好ま
しい。上記の破骨細胞分化誘導培地中で哺乳類由来の骨
髄細胞を培養することにより、骨吸収能の高い破骨細胞
を得ることができる。
【００１３】次いで、上記操作により得た骨吸収能の高
い破骨細胞を免疫原として、哺乳動物を体内免疫し、又
は哺乳動物由来の脾細胞を体外免疫する。この操作は常
法により行なうことができ、哺乳動物としては霊長類、
げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ等）、ウシ、
ヒツジ及びイヌ等を採用することができる。
い破骨細胞を免疫原として、哺乳動物を体内免疫し、又
は哺乳動物由来の脾細胞を体外免疫する。この操作は常
法により行なうことができ、哺乳動物としては霊長類、
げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ等）、ウシ、
ヒツジ及びイヌ等を採用することができる。
【００１４】次いで、体内免疫した動物の脾細胞やリン
パ球のような抗体産生細胞又は体外免疫した脾細胞とミ
エローマ細胞とを融合する。ミエローマ細胞としては、
モノクローナル抗体の作製のためにこの分野で常用され
ている公知の細胞を用いることができ、例えばマウス由
来のＮＳ−０細胞、ＮＳ−１細胞、ＳＰ２・０−Ａｇ１
４細胞等を用いることができる。下記実施例では、マウ
スＰ３Ｕ１株（入手先：理化学研究所）を用いている。
パ球のような抗体産生細胞又は体外免疫した脾細胞とミ
エローマ細胞とを融合する。ミエローマ細胞としては、
モノクローナル抗体の作製のためにこの分野で常用され
ている公知の細胞を用いることができ、例えばマウス由
来のＮＳ−０細胞、ＮＳ−１細胞、ＳＰ２・０−Ａｇ１
４細胞等を用いることができる。下記実施例では、マウ
スＰ３Ｕ１株（入手先：理化学研究所）を用いている。
【００１５】次いで、常法によりハイブリドーマを選択
し、所望のモノクローナル抗体を産生しているハイブリ
ドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、免疫
原として用いた骨吸収能の高い破骨細胞と反応し、か
つ、マクロファージポリカリオンと反応しないモノクロ
ーナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択するこ
とにより行なうことができる。マクロファージポリカリ
オンと反応するモノクローナル抗体を除外することによ
り、破骨細胞とのみ特異的に反応するモノクローナル抗
体をスクリーニングすることができる。なお、マクロフ
ァージポリカリオンは、下記参考例２に示すように、破
骨細胞を調製する方法において、１０-7Ｍ程度の１２−
ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート
（ＴＰＡ）を添加した培地で骨髄細胞を培養することに
より調製することができる。スクリーニング方法自体
は、常法である酵素抗体法等により行なうことができ
る。すなわち、アルカリフォスファターゼ、グルコース
オキシダーゼ又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのような酵
素で標識した二次抗体を用い、３，３−ジアミノベンチ
ジン、２，２−アジノビス、ｏ−ジアニシジン、４−ク
ロロナフトール又は４−アミノアンチピリンのような基
質と反応させてその発色の強さを測定することによりス
クリーニングを行なうことができる。
し、所望のモノクローナル抗体を産生しているハイブリ
ドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、免疫
原として用いた骨吸収能の高い破骨細胞と反応し、か
つ、マクロファージポリカリオンと反応しないモノクロ
ーナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択するこ
とにより行なうことができる。マクロファージポリカリ
オンと反応するモノクローナル抗体を除外することによ
り、破骨細胞とのみ特異的に反応するモノクローナル抗
体をスクリーニングすることができる。なお、マクロフ
ァージポリカリオンは、下記参考例２に示すように、破
骨細胞を調製する方法において、１０-7Ｍ程度の１２−
ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート
（ＴＰＡ）を添加した培地で骨髄細胞を培養することに
より調製することができる。スクリーニング方法自体
は、常法である酵素抗体法等により行なうことができ
る。すなわち、アルカリフォスファターゼ、グルコース
オキシダーゼ又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのような酵
素で標識した二次抗体を用い、３，３−ジアミノベンチ
ジン、２，２−アジノビス、ｏ−ジアニシジン、４−ク
ロロナフトール又は４−アミノアンチピリンのような基
質と反応させてその発色の強さを測定することによりス
クリーニングを行なうことができる。
【００１６】スクリーニングにより選択されたハイブリ
ドーマは、常法により、血清培地又は無血清培地を用い
て大量培養することができ、本発明のモノクローナル抗
体はその培養上清から回収することができる。あるい
は、マウスの腹腔にハイブリドーマを接種し、本発明の
モノクローナル抗体をマウスの腹水から回収することが
できる。
ドーマは、常法により、血清培地又は無血清培地を用い
て大量培養することができ、本発明のモノクローナル抗
体はその培養上清から回収することができる。あるい
は、マウスの腹腔にハイブリドーマを接種し、本発明の
モノクローナル抗体をマウスの腹水から回収することが
できる。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体は、破骨細
胞、特に骨吸収能の高い活性状態にある破骨細胞と特異
的に結合するので、活性状態にある破骨細胞を特異的に
検出するために用いることができる。従って、本発明の
モノクローナル抗体は破骨細胞の活性状態に関わる疾病
の診断及び治療への応用が可能になる。
胞、特に骨吸収能の高い活性状態にある破骨細胞と特異
的に結合するので、活性状態にある破骨細胞を特異的に
検出するために用いることができる。従って、本発明の
モノクローナル抗体は破骨細胞の活性状態に関わる疾病
の診断及び治療への応用が可能になる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１９】参考例１ 骨芽細胞ＣＭ培地の調製及びＣ
Ｍ培地の破骨細胞形成に対する効果 ラット骨肉腫由来の骨芽細胞ＲＯＳ１７／２．８を６０
ｍｍのシャーレ中で、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ培
地中で３７℃で培養した。３〜４日培養ごとに培地交換
して、増殖させた。シャーレ面に増殖が認められるまで
培養した後、培養液を回収し、２５００ｒｐｍ、１５分
間遠心分離し、細胞を除去した。セントリプレップフィ
ルター（アミコン社製）を用い、遠心上清から分子量１
万以上の画分を回収し、１０倍濃度に濃縮した。得られ
た濃縮液を９５℃、５分間熱処理し、ＣＭ培地を得た。
Ｍ培地の破骨細胞形成に対する効果 ラット骨肉腫由来の骨芽細胞ＲＯＳ１７／２．８を６０
ｍｍのシャーレ中で、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ培
地中で３７℃で培養した。３〜４日培養ごとに培地交換
して、増殖させた。シャーレ面に増殖が認められるまで
培養した後、培養液を回収し、２５００ｒｐｍ、１５分
間遠心分離し、細胞を除去した。セントリプレップフィ
ルター（アミコン社製）を用い、遠心上清から分子量１
万以上の画分を回収し、１０倍濃度に濃縮した。得られ
た濃縮液を９５℃、５分間熱処理し、ＣＭ培地を得た。
【００２０】一方、ラット（４〜６週令、雄）より脛骨
及び大腿骨を採取し、常法に従い骨髄細胞を採取した。
これを、２４穴フラスコ中で、１０％ＦＣＳ及び１０-8
Ｍの活性型ビタミンＤ3 並びに２０％の上記ＣＭ培地を
含むα−ＭＥＭ培地で３７℃で培養した。培養は、骨髄
細胞２ｘ１０6 個／ｍｌの細胞を０．５ｍｌずつ２４穴
フラスコに巻きこんで行なった。なお、比較のため、Ｃ
Ｍ培地を添加しない培地中でも同様に培養を行なった。
及び大腿骨を採取し、常法に従い骨髄細胞を採取した。
これを、２４穴フラスコ中で、１０％ＦＣＳ及び１０-8
Ｍの活性型ビタミンＤ3 並びに２０％の上記ＣＭ培地を
含むα−ＭＥＭ培地で３７℃で培養した。培養は、骨髄
細胞２ｘ１０6 個／ｍｌの細胞を０．５ｍｌずつ２４穴
フラスコに巻きこんで行なった。なお、比較のため、Ｃ
Ｍ培地を添加しない培地中でも同様に培養を行なった。
【００２１】４日後、細胞を酒石酸耐性酸性フォスファ
ターゼ（ＴＲＡＣＰ）染色し、破骨細胞数を測定した。
ＴＲＡＣＰ染色は、白血球酸フォスファターゼキット
（シグマ社製）を用いて行なった。形成された破骨細胞
の数並びにその運動性及び骨吸収性を測定した。結果を
表１に示す。
ターゼ（ＴＲＡＣＰ）染色し、破骨細胞数を測定した。
ＴＲＡＣＰ染色は、白血球酸フォスファターゼキット
（シグマ社製）を用いて行なった。形成された破骨細胞
の数並びにその運動性及び骨吸収性を測定した。結果を
表１に示す。
【００２２】参考例２ 骨吸収能の高い破骨細胞及びマ
クロファージポリカリオンの形成 上記参考例１と同じ方法で骨吸収能の高い破骨細胞を調
製した。一方、参考例１のＣＭ無添加培地中に１０-7Ｍ
のＴＰＡを添加し、６日間骨髄細胞を培養し、マクロフ
ァージポリカリオンを得た。形成された破骨細胞数並び
にその運動性及び骨吸収性を表２に示す。
クロファージポリカリオンの形成 上記参考例１と同じ方法で骨吸収能の高い破骨細胞を調
製した。一方、参考例１のＣＭ無添加培地中に１０-7Ｍ
のＴＰＡを添加し、６日間骨髄細胞を培養し、マクロフ
ァージポリカリオンを得た。形成された破骨細胞数並び
にその運動性及び骨吸収性を表２に示す。
【００２３】実施例１ 抗破骨細胞モノクローナル抗体
の調製 上記参考例２で調製した骨吸収能の高い破骨細胞を０．
２５％グルタルアルデヒド、０．８％ＮａＣｌ及び２ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５分間、室温で
固定した後、ＩＭＤＭ培地で４回洗浄したものを免疫原
として用いた。
の調製 上記参考例２で調製した骨吸収能の高い破骨細胞を０．
２５％グルタルアルデヒド、０．８％ＮａＣｌ及び２ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５分間、室温で
固定した後、ＩＭＤＭ培地で４回洗浄したものを免疫原
として用いた。
【００２４】予め採取しておいたＢａｌｂ／ｃマウス
（８週令、雌）の脾細胞にアジュバントペプチドＭＤＰ
２０μｇ／ｍｌ濃度となるように添加したものを、上述
の方法により固定した破骨細胞の細胞層に重層して体外
免疫法による免疫感作を４日間実施した。用いた脾細胞
の総数は１０8 個であった。
（８週令、雌）の脾細胞にアジュバントペプチドＭＤＰ
２０μｇ／ｍｌ濃度となるように添加したものを、上述
の方法により固定した破骨細胞の細胞層に重層して体外
免疫法による免疫感作を４日間実施した。用いた脾細胞
の総数は１０8 個であった。
【００２５】脾細胞を回収後、常法に従いマウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合を行ない、ＨＡＴ選択培地
にてハイブリドーマを選択した。脾細胞とミエローマ細
胞は１０：１の割合で融合した。また、融合細胞は、１
０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭ培地液で細胞数を１０6 個／ｍ
ｌとなるように調製し、２４穴フラスコの８７ウェルに
まきこんで培養した（培養液量：１ｍｌ）
ーマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合を行ない、ＨＡＴ選択培地
にてハイブリドーマを選択した。脾細胞とミエローマ細
胞は１０：１の割合で融合した。また、融合細胞は、１
０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭ培地液で細胞数を１０6 個／ｍ
ｌとなるように調製し、２４穴フラスコの８７ウェルに
まきこんで培養した（培養液量：１ｍｌ）
【００２６】ハイブリドーマの生育したウェルの上清を
使用し、参考例２で調製した骨吸収能の高い破骨細胞及
びマクロファージポリカリオンをＡＢＣ−ＡＰキットに
より染色し、上記破骨細胞陽性でかつマクロファージポ
リカリオン陰性のウェルを選抜した。
使用し、参考例２で調製した骨吸収能の高い破骨細胞及
びマクロファージポリカリオンをＡＢＣ−ＡＰキットに
より染色し、上記破骨細胞陽性でかつマクロファージポ
リカリオン陰性のウェルを選抜した。
【００２７】スクリーニングの結果、陽性と判定したウ
ェルから細胞を取り出し、限界希釈法によるクローニン
グを２回実施した。クローニング培地としては、上記Ｆ
ＣＳ添加ＩＭＤＭ培地にヒト組換え型ＩＬ−６（アール
アンド デイ システムズ社製）を最終濃度１０ｎｇ
／ｍｌとなるように添加したものを使用した。
ェルから細胞を取り出し、限界希釈法によるクローニン
グを２回実施した。クローニング培地としては、上記Ｆ
ＣＳ添加ＩＭＤＭ培地にヒト組換え型ＩＬ−６（アール
アンド デイ システムズ社製）を最終濃度１０ｎｇ
／ｍｌとなるように添加したものを使用した。
【００２８】さらに、上記スクリーニングを実施し、上
記判定基準を満たすウェルの細胞を目的のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマとした。その結果、目的の抗
体産生細胞１個を取得し、この細胞及びこれが産生する
モノクローナル抗体をＫａｔ１と命名した。この細胞は
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２３６６（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２３６６）として寄託されている。
記判定基準を満たすウェルの細胞を目的のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマとした。その結果、目的の抗
体産生細胞１個を取得し、この細胞及びこれが産生する
モノクローナル抗体をＫａｔ１と命名した。この細胞は
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２３６６（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２３６６）として寄託されている。
【００２９】実施例２ Ｋａｔ１と破骨細胞及び各種細
胞に対する反応特異性 上記のようにしてクローン化したＫａｔ１細胞の培養上
清を用い、破骨細胞及び各種細胞との反応性を調べた。
反応性はＡＢＣ−ＡＰキット（ベクターラボラトリー社
製）を用いて調べた。その結果、Ｋａｔ１細胞は、破骨
細胞とは反応したが、腹腔マクロファージ、単球、顆粒
球、赤血球、胸腺細胞、脾細胞、骨髄細胞、骨芽細胞Ｒ
ＯＳ １７／２．８及びＬ８細胞とは反応しなかった。
この結果から、Ｋａｔ１は破骨細胞を特異的に認識して
いることが確認された。また、マウス免疫グロブリンＩ
ｇＡ、ＩｇＧ1 、ＩｇＧ2 、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3 及びＩ
ｇＭに対するウサギ抗体を用いてオクターローニー法及
び酵素免疫吸着法によりＫａｔ１の免疫グロブリンクラ
スを決定したところＩｇＭであった。
胞に対する反応特異性 上記のようにしてクローン化したＫａｔ１細胞の培養上
清を用い、破骨細胞及び各種細胞との反応性を調べた。
反応性はＡＢＣ−ＡＰキット（ベクターラボラトリー社
製）を用いて調べた。その結果、Ｋａｔ１細胞は、破骨
細胞とは反応したが、腹腔マクロファージ、単球、顆粒
球、赤血球、胸腺細胞、脾細胞、骨髄細胞、骨芽細胞Ｒ
ＯＳ １７／２．８及びＬ８細胞とは反応しなかった。
この結果から、Ｋａｔ１は破骨細胞を特異的に認識して
いることが確認された。また、マウス免疫グロブリンＩ
ｇＡ、ＩｇＧ1 、ＩｇＧ2 、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3 及びＩ
ｇＭに対するウサギ抗体を用いてオクターローニー法及
び酵素免疫吸着法によりＫａｔ１の免疫グロブリンクラ
スを決定したところＩｇＭであった。
【００３０】実施例３ Ｋａｔ１の破骨細胞に対する認
識性の検討 破骨細胞は、参考例１で調製した骨吸収能の高いものと
（活性型ビタミンＤ3（ＶＤ3 ）及びＣＭ培地存在下で
培養）、骨吸収能の低いもの（ＶＤ3 存在下、ＣＭ培地
非存在下で培養）を用いた。また、比較のため、マクロ
ファージポリカリオンに対する反応性も調べた。Ｋａｔ
１とこれらの細胞との反応性は実施例２の方法により行
なった。結果を表３に示す。表３には各細胞の運動性及
び骨吸収能も併せて示した。 表３に示す結果から、Ｋａｔ１は骨吸収能の高い破骨細
胞を特異的に認識していることが判明した。
識性の検討 破骨細胞は、参考例１で調製した骨吸収能の高いものと
（活性型ビタミンＤ3（ＶＤ3 ）及びＣＭ培地存在下で
培養）、骨吸収能の低いもの（ＶＤ3 存在下、ＣＭ培地
非存在下で培養）を用いた。また、比較のため、マクロ
ファージポリカリオンに対する反応性も調べた。Ｋａｔ
１とこれらの細胞との反応性は実施例２の方法により行
なった。結果を表３に示す。表３には各細胞の運動性及
び骨吸収能も併せて示した。 表３に示す結果から、Ｋａｔ１は骨吸収能の高い破骨細
胞を特異的に認識していることが判明した。
【００３１】実施例４ Ｋａｔ１の破骨細胞抗原の認識
部分 常法によりラット骨細胞より単離した破骨細胞を実施例
２の方法でＫａｔ１で染色した。２次抗体として、ＦＩ
ＴＣ標識した抗マウスＩｇＭ（ザイメット社製）で検出
した。その結果、膜表面が強く染色し、Ｋａｔ１の認識
抗原が膜抗原であることが示唆された。
部分 常法によりラット骨細胞より単離した破骨細胞を実施例
２の方法でＫａｔ１で染色した。２次抗体として、ＦＩ
ＴＣ標識した抗マウスＩｇＭ（ザイメット社製）で検出
した。その結果、膜表面が強く染色し、Ｋａｔ１の認識
抗原が膜抗原であることが示唆された。
【００３２】実施例５ Ｋａｔ１の生体内での染色性 ラットの新生児の腹腔内にＫａｔ１又は対照抗体Ｅｎ１
（ＩｇＭ）（いずれもマウス腹水の硫安分画、抗体量：
約１ｍｇ）を注入し、２４時間放置した。なお、対照抗
体Ｅｎ１は抗アメロジエニン抗体（稲井ら、Ａｎｎｔ．
Ｒｅｃ．２２９２５９−２７０ １９９１）であった。
パーアイオデイトリジンパラホルムアルデヒド（ＰＬ
Ｐ）溶液によりかん流固定した後、下顎骨を切り出し、
一夜ＰＬＰ溶液浸漬固定した後、酢酸による脱灰を行な
い、パラフィンに包埋後、切片を作製した。２次抗体と
してＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＭで染色した。その結
果、対照抗体は破骨細胞とは反応しなかった。Ｋａｔ１
は、骨表面に付着し骨吸収している破骨細胞の膜表面に
特異的に反応するが、他の細胞とは反応しなかった。こ
のことから、Ｋａｔ１の特異性は極めて高く、生体内で
も破骨細胞を認識でき、破骨細胞認識抗体としての応用
が広いことが示唆された。
（ＩｇＭ）（いずれもマウス腹水の硫安分画、抗体量：
約１ｍｇ）を注入し、２４時間放置した。なお、対照抗
体Ｅｎ１は抗アメロジエニン抗体（稲井ら、Ａｎｎｔ．
Ｒｅｃ．２２９２５９−２７０ １９９１）であった。
パーアイオデイトリジンパラホルムアルデヒド（ＰＬ
Ｐ）溶液によりかん流固定した後、下顎骨を切り出し、
一夜ＰＬＰ溶液浸漬固定した後、酢酸による脱灰を行な
い、パラフィンに包埋後、切片を作製した。２次抗体と
してＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＭで染色した。その結
果、対照抗体は破骨細胞とは反応しなかった。Ｋａｔ１
は、骨表面に付着し骨吸収している破骨細胞の膜表面に
特異的に反応するが、他の細胞とは反応しなかった。こ
のことから、Ｋａｔ１の特異性は極めて高く、生体内で
も破骨細胞を認識でき、破骨細胞認識抗体としての応用
が広いことが示唆された。
【００３３】
【発明の効果】以上、詳述したように、本発明のモノク
ローナル抗体は、破骨細胞、特に骨吸収能の高い活性状
態にある破骨細胞と特異的に結合するので、活性状態に
ある破骨細胞を特異的に検出するために用いることがで
きる。従って、本発明のモノクローナル抗体は破骨細胞
の活性状態に関わる疾病の診断及び治療への応用が可能
であり、医療分野におおいに貢献するものと考えられ
る。
ローナル抗体は、破骨細胞、特に骨吸収能の高い活性状
態にある破骨細胞と特異的に結合するので、活性状態に
ある破骨細胞を特異的に検出するために用いることがで
きる。従って、本発明のモノクローナル抗体は破骨細胞
の活性状態に関わる疾病の診断及び治療への応用が可能
であり、医療分野におおいに貢献するものと考えられ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】哺乳類の破骨細胞を認識し、これに特異的
に結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を分泌
するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3207547A JPH05192178A (ja) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | 抗破骨細胞モノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3207547A JPH05192178A (ja) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | 抗破骨細胞モノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブリドーマ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192178A true JPH05192178A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=16541543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3207547A Pending JPH05192178A (ja) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | 抗破骨細胞モノクローナル抗体及びそれを分泌するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192178A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000056860A3 (en) * | 1999-03-19 | 2001-01-18 | Univ Newcastle Ventures Ltd | Diagnosis and therapy of bone conditions |
| US7087431B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-08-08 | University Of Rochester | Ex vivo generation of functional leukemia cells in a three-dimensional bioreactor |
-
1991
- 1991-07-24 JP JP3207547A patent/JPH05192178A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000056860A3 (en) * | 1999-03-19 | 2001-01-18 | Univ Newcastle Ventures Ltd | Diagnosis and therapy of bone conditions |
| US7087431B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-08-08 | University Of Rochester | Ex vivo generation of functional leukemia cells in a three-dimensional bioreactor |
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