JPH05194599A - 哺乳類の糖蛋白質 - Google Patents
哺乳類の糖蛋白質Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
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- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】感染性単核症の診断に用いる糖蛋白質を提供す
る。 【構成】牛、馬および羊のような哺乳類からの精製した
赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好抗体の検出に
対する免疫検査におけるこれら製剤の使用およびロゼッ
テ リンパ球（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅｓ）の算出に対する安定な標準化しうる試薬の製造
におけるこれらの糖蛋白質類の使用。
る。 【構成】牛、馬および羊のような哺乳類からの精製した
赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好抗体の検出に
対する免疫検査におけるこれら製剤の使用およびロゼッ
テ リンパ球（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅｓ）の算出に対する安定な標準化しうる試薬の製造
におけるこれらの糖蛋白質類の使用。
Description
【０００１】本発明は牛、馬および羊のような哺乳類か
らの精製した赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好
抗体の検出に対する免疫検査におけるこれら製剤の使用
およびロゼッテ リンパ球（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ｌｙ
ｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の算出に対する安定な標準化しう
る試薬の製造におけるこれらの糖蛋白質類の有用性に関
する。免疫学的診断における試みまたは感染性単核症の
経路監視がこれまで全赤血球画分の使用を重要視してき
た。赤血球は多くの異った細胞膜蛋白質を含むことが知
られており、それらはそれぞれ一つまたは一つ以上の異
なる抗体と反応性である〔Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｖ．
Ｔ．，Ｈ．Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ ａｎｄ Ｍ，Ｔｏｍｉ
ｔａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４５，６６７
６９８（１９７６）〕、全赤血球、または粗赤血球画分
は、多くのＩＭ（感染性単核症）とは無関係のものを含
めて、広く異なる特性を有する抗体によって凝集反応を
起こすであろうから、正の誤りが問題であった。正の誤
りの回避は有効かつ信頼しうる臨床診断に対しては明ら
かに重要である。本発明は、その望ましい形において、
牛、馬または羊の均質な糖蛋白質を含み、それらの総て
はそれらが均質であるためにＩＭ抗体に対して大きな特
異性と敏感性を有する。
らの精製した赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好
抗体の検出に対する免疫検査におけるこれら製剤の使用
およびロゼッテ リンパ球（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ｌｙ
ｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の算出に対する安定な標準化しう
る試薬の製造におけるこれらの糖蛋白質類の有用性に関
する。免疫学的診断における試みまたは感染性単核症の
経路監視がこれまで全赤血球画分の使用を重要視してき
た。赤血球は多くの異った細胞膜蛋白質を含むことが知
られており、それらはそれぞれ一つまたは一つ以上の異
なる抗体と反応性である〔Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｖ．
Ｔ．，Ｈ．Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ ａｎｄ Ｍ，Ｔｏｍｉ
ｔａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４５，６６７
６９８（１９７６）〕、全赤血球、または粗赤血球画分
は、多くのＩＭ（感染性単核症）とは無関係のものを含
めて、広く異なる特性を有する抗体によって凝集反応を
起こすであろうから、正の誤りが問題であった。正の誤
りの回避は有効かつ信頼しうる臨床診断に対しては明ら
かに重要である。本発明は、その望ましい形において、
牛、馬または羊の均質な糖蛋白質を含み、それらの総て
はそれらが均質であるためにＩＭ抗体に対して大きな特
異性と敏感性を有する。
【０００２】感染性単核症の免疫学的診断は１９３２年
にＰａｕｌおよびＢｕｎｎｅｌによってＡｍｅｒ．Ｊ．
Ｍｅｄ，Ｓｃｉ．１８３，９０−１０４（１９３２）中
に始めて報告された。彼等は羊のような種からの赤い血
液細胞または赤血球は活性感染性単核症を有する患者か
らの血清中に含まれるＩＭ異好（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌ
ｅ）抗体によって凝集反応を起こすことができることを
教えた。これらの異好抗体を検出するための多くの試験
が引続き展開された、例えば次のものを参照のこと：米
国特許第３，４２６，１２３号および第３，７０８，５
７２号。そのうちに患者の血清のモルモットの腎臓によ
る予備培養はいわゆるフオルスマン（Ｆｏｒｓｓｍａ
ｎ）抗体を吸収しまたは析出したと報告され、偏在する
抗体は異好抗体の検出を妨げた。〔Ｄａｖｉｄｉｓｏ
ｎ，Ｉ＆Ｐ．Ｈ．Ｗａｌｋｅｒ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５，４５５−６５（１９３５）〕。
モルモット腎臓によるＩＭの吸収または予備培養は凝集
反応試験の特異性を増したが凝集反応が開始する前に吸
収段階を必要とした（参照、例えば、米国特許第３，９
５９，４５６および３，８６４，４６７各号）。
にＰａｕｌおよびＢｕｎｎｅｌによってＡｍｅｒ．Ｊ．
Ｍｅｄ，Ｓｃｉ．１８３，９０−１０４（１９３２）中
に始めて報告された。彼等は羊のような種からの赤い血
液細胞または赤血球は活性感染性単核症を有する患者か
らの血清中に含まれるＩＭ異好（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌ
ｅ）抗体によって凝集反応を起こすことができることを
教えた。これらの異好抗体を検出するための多くの試験
が引続き展開された、例えば次のものを参照のこと：米
国特許第３，４２６，１２３号および第３，７０８，５
７２号。そのうちに患者の血清のモルモットの腎臓によ
る予備培養はいわゆるフオルスマン（Ｆｏｒｓｓｍａ
ｎ）抗体を吸収しまたは析出したと報告され、偏在する
抗体は異好抗体の検出を妨げた。〔Ｄａｖｉｄｉｓｏ
ｎ，Ｉ＆Ｐ．Ｈ．Ｗａｌｋｅｒ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５，４５５−６５（１９３５）〕。
モルモット腎臓によるＩＭの吸収または予備培養は凝集
反応試験の特異性を増したが凝集反応が開始する前に吸
収段階を必要とした（参照、例えば、米国特許第３，９
５９，４５６および３，８６４，４６７各号）。
【０００３】Ｓｔｕａｒｔ等およびＢｅｅｒは馬の糖蛋
白質が感染性単核症を持つ患者の区域に見出された異好
抗体と反応したことを報告した。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅ
ｘｐ．Ｂｉｏｌ．３４：２１２，２１５（１９３６）お
よびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１５：５９１−５９
９を参照のこと。牛の赤血球もＩＭ異好抗体の検出に独
特のものであることが判明した。この種の赤色血液細胞
についての初期の仕事において、ＢａｉｌｅｙおよびＲ
ａｆｆｅｌ〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１４，２２
８−２４４（１９３５）〕は野性の牛の赤血球はＩＭ抗
体を含む血清によって凝集反応を起こさないが、これら
の赤血球は異染色性抗体を吸収しそして補体の存在にお
いて溶解することを見出した。この牛の赤血球溶血素試
験は、モルモット腎臓による予備吸収段階が利用された
場合でさえ、馬または羊の赤血球を使用する凝集反応試
験よりも異好抗体に対してはより独特なものであると後
に報告された。〔Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３２，５４６−５５４（１９７
５）〕。エバンス（Ｅｖａｎｓ）等は牛の赤血球は免疫
学的因子を含みこれはやぎ、羊または馬のようなその他
の種からの赤血球中に存在する免疫学的因子よりも特異
的に異好抗体に結合することを示唆した。
白質が感染性単核症を持つ患者の区域に見出された異好
抗体と反応したことを報告した。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅ
ｘｐ．Ｂｉｏｌ．３４：２１２，２１５（１９３６）お
よびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１５：５９１−５９
９を参照のこと。牛の赤血球もＩＭ異好抗体の検出に独
特のものであることが判明した。この種の赤色血液細胞
についての初期の仕事において、ＢａｉｌｅｙおよびＲ
ａｆｆｅｌ〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１４，２２
８−２４４（１９３５）〕は野性の牛の赤血球はＩＭ抗
体を含む血清によって凝集反応を起こさないが、これら
の赤血球は異染色性抗体を吸収しそして補体の存在にお
いて溶解することを見出した。この牛の赤血球溶血素試
験は、モルモット腎臓による予備吸収段階が利用された
場合でさえ、馬または羊の赤血球を使用する凝集反応試
験よりも異好抗体に対してはより独特なものであると後
に報告された。〔Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３２，５４６−５５４（１９７
５）〕。エバンス（Ｅｖａｎｓ）等は牛の赤血球は免疫
学的因子を含みこれはやぎ、羊または馬のようなその他
の種からの赤血球中に存在する免疫学的因子よりも特異
的に異好抗体に結合することを示唆した。
【０００４】哺乳類赤血球とＩＭ異好抗体との免疫学的
反応性に対するこれらの観察は単離しそして精製した哺
乳類赤血球からの糖蛋白質を使用する免疫試験による感
染性単核症の免疫化学的診断に対する基礎を与えた。部
分的精製の一方法は羊からの材料を使用して熱フェノー
ル抽出段階を用いる〔Ｃａｌｌｉｈａｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｉ
ｎｔ．Ａｒｃｈｓ，Ａｌｌｅｒａｙ Ａｐｐｌ，Ｉｍｍ
ｕｎ．５１：６９６−７０８（１９７６）〕。この方法
はもしも肉基質がヘモグロビンを含む場合には編成のた
めに熱フェノールによる抽出はヘモグロビンの実質的除
去を妨げるであろうという問題に悩む。本発明は牛、羊
または馬の肉基質をヘモグロビンを含まないように分離
する方法を含み、そして次いで生成肉基質を熱エタノー
ル抽出に当てる。その結果生じる糖蛋白質生成物は純粋
でありそしてＩＭ異好抗体と高い反応性を有する。
反応性に対するこれらの観察は単離しそして精製した哺
乳類赤血球からの糖蛋白質を使用する免疫試験による感
染性単核症の免疫化学的診断に対する基礎を与えた。部
分的精製の一方法は羊からの材料を使用して熱フェノー
ル抽出段階を用いる〔Ｃａｌｌｉｈａｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｉ
ｎｔ．Ａｒｃｈｓ，Ａｌｌｅｒａｙ Ａｐｐｌ，Ｉｍｍ
ｕｎ．５１：６９６−７０８（１９７６）〕。この方法
はもしも肉基質がヘモグロビンを含む場合には編成のた
めに熱フェノールによる抽出はヘモグロビンの実質的除
去を妨げるであろうという問題に悩む。本発明は牛、羊
または馬の肉基質をヘモグロビンを含まないように分離
する方法を含み、そして次いで生成肉基質を熱エタノー
ル抽出に当てる。その結果生じる糖蛋白質生成物は純粋
でありそしてＩＭ異好抗体と高い反応性を有する。
【０００５】糖蛋白質画分はクロロホルム メタノール
抽出によって馬から分離された。これらの画分はある種
の血液群抗原と密接に関連した。〔Ｇｕｅｒｔｌｅｒ，
Ｋ．Ｇ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄ．Ｏ．，Ｙｅｂｏｕ，Ｄ．
Ａ．およびＣｌｅｖｅ，Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｐｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔｓ．９：４１−４５（１９
７８）〕。しかし、得られた生成物はＩＭまたはその他
のＰａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ陽性抗体との反応性は何等試
験をしなかった。報告されたデータを検討したところ単
離された糖蛋白質は不純であり従って放射線免疫試験ほ
ど敏感なものとして試験に使うには不適当であった。そ
の他の研究者も種々の哺乳類の種から糖蛋白質を単離し
そして「精製された」糖蛋白質を得たと報告した。例え
ばハマグチおよびＣｌｅｖｅは人間、牛、豚、馬および
羊の赤血球からクロロホルム−メタノール抽出によって
糖蛋白質を単離する方法を報告した。しかし単離された
抽出物は本発明の精製した糖蛋白質と比べると粗製品で
あった。ハマグチ製造の血清学的活性は本発明のものの
１０００倍も低かった。〔なおＦｕｊｉｔａ，Ｓ．，Ｃ
ｌｅｖｅ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ ４０６：２０６−２１３（１９７５）；Ｇｒａ
ｎｔ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｇ．およびＡｎａ
ｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４２（１７）：３９１２−３９１８（１９６
７）；Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｈｏｔｔａ．Ｋ．，Ｋ
ｏｎｉｓｈｉ，Ｊ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ ５５Ｂ：３７−４４（１９７６）〕を参照
のこと。
抽出によって馬から分離された。これらの画分はある種
の血液群抗原と密接に関連した。〔Ｇｕｅｒｔｌｅｒ，
Ｋ．Ｇ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄ．Ｏ．，Ｙｅｂｏｕ，Ｄ．
Ａ．およびＣｌｅｖｅ，Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｐｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔｓ．９：４１−４５（１９
７８）〕。しかし、得られた生成物はＩＭまたはその他
のＰａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ陽性抗体との反応性は何等試
験をしなかった。報告されたデータを検討したところ単
離された糖蛋白質は不純であり従って放射線免疫試験ほ
ど敏感なものとして試験に使うには不適当であった。そ
の他の研究者も種々の哺乳類の種から糖蛋白質を単離し
そして「精製された」糖蛋白質を得たと報告した。例え
ばハマグチおよびＣｌｅｖｅは人間、牛、豚、馬および
羊の赤血球からクロロホルム−メタノール抽出によって
糖蛋白質を単離する方法を報告した。しかし単離された
抽出物は本発明の精製した糖蛋白質と比べると粗製品で
あった。ハマグチ製造の血清学的活性は本発明のものの
１０００倍も低かった。〔なおＦｕｊｉｔａ，Ｓ．，Ｃ
ｌｅｖｅ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ ４０６：２０６−２１３（１９７５）；Ｇｒａ
ｎｔ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｇ．およびＡｎａ
ｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４２（１７）：３９１２−３９１８（１９６
７）；Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｈｏｔｔａ．Ｋ．，Ｋ
ｏｎｉｓｈｉ，Ｊ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ ５５Ｂ：３７−４４（１９７６）〕を参照
のこと。
【０００６】１９７１には早くも現発明者と協力者達
〔Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，およびＷｏｏｌｆｏｌ
ｋ，Ｂ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：８４２−
８５３（１９７１）〕は７５％エタノールによる牛の赤
血球の部分的精製は粗糖蛋白質抽出物を生じこれは異好
抗体と高い反応性を示した。反応性は血球凝集阻害物
質、定量的沈澱および寒天ゲル拡散を測定する三試験方
法のそれぞれの結果に基づいた。ＩＭに対するいくつか
の診断的試験が報告されそれらは牛の赤血球抗原に基き
そしてそれらは牛の赤血球中の反応性特質の最純形態と
して粗抽出物を使用する。例えば米国特許第３，８２
６，８２１；３，８４０，６５５；３，９５９，４５６
および４，２２８，１４８各号を参照のこと。
〔Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，およびＷｏｏｌｆｏｌ
ｋ，Ｂ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：８４２−
８５３（１９７１）〕は７５％エタノールによる牛の赤
血球の部分的精製は粗糖蛋白質抽出物を生じこれは異好
抗体と高い反応性を示した。反応性は血球凝集阻害物
質、定量的沈澱および寒天ゲル拡散を測定する三試験方
法のそれぞれの結果に基づいた。ＩＭに対するいくつか
の診断的試験が報告されそれらは牛の赤血球抗原に基き
そしてそれらは牛の赤血球中の反応性特質の最純形態と
して粗抽出物を使用する。例えば米国特許第３，８２
６，８２１；３，８４０，６５５；３，９５９，４５６
および４，２２８，１４８各号を参照のこと。
【０００７】出願人は牛の赤血球膜糖蛋白質を本質的に
均質な形に精製した。この牛の糖蛋白質の均一性は種々
の方法で示され、それにはドデシル硫酸ナトリウムの存
在におけるポリアクリルアミド ゲル電気泳動法を含
む。ＩＭ検出に対するこの牛の糖蛋白質の精製した形の
ものは血球凝集阻害防止試験において１９７１年にＦｌ
ｅｔｃｈｅｒ等によって記述された牛の赤血球の粗抽出
物によって得た結果と比べて感度において少なくとも１
０倍の増加を生じた。部分的に精製した形におけるこの
糖蛋白質によって得られた結果は１９８０年３月２７日
に現発明者によってＬｅｖｅｙ Ｂ．Ａ．等Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．１１，２５６−２６２（１９８
０）に報告された。
均質な形に精製した。この牛の糖蛋白質の均一性は種々
の方法で示され、それにはドデシル硫酸ナトリウムの存
在におけるポリアクリルアミド ゲル電気泳動法を含
む。ＩＭ検出に対するこの牛の糖蛋白質の精製した形の
ものは血球凝集阻害防止試験において１９７１年にＦｌ
ｅｔｃｈｅｒ等によって記述された牛の赤血球の粗抽出
物によって得た結果と比べて感度において少なくとも１
０倍の増加を生じた。部分的に精製した形におけるこの
糖蛋白質によって得られた結果は１９８０年３月２７日
に現発明者によってＬｅｖｅｙ Ｂ．Ａ．等Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．１１，２５６−２６２（１９８
０）に報告された。
【０００８】現在の発明は牛、馬および羊の赤血球から
の糖蛋白質の単離を含みこの糖蛋白質はＩＭと反応する
がフオルスマン抗体とは反応しない。二つの形態の牛の
糖蛋白質が記載され、一つは約１０％の錯体糖脂質を含
む部分的に精製した形でありそしてもう一つは本質的に
均質な形である。この発明の馬および羊の糖蛋白質は本
質的に均質である。ＩＭ活性はある種のシアログリコプ
ロテインと関連しそしてノイラミニダーゼ処理によって
完全にだめになる。この発明の糖蛋白質はポール−ブン
ネル（Ｐａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ）抗体との反応に信頼の
できる抗原的要素を保持する。この特性はＩＭに対する
ある種の血清学的診断試験の発展を可能にしたがこれは
これまで完全な赤血球および複雑な時間を消費する吸収
方法が必要であった。例えば、レイビィ（Ｌｅｖｅｙ）
等、上記を参照。ここに単離された馬および羊の糖蛋白
質の付加的受容者特性は末梢血液リンパ細胞と相互反応
して試験管内で「Ｅロゼッテ（ｒｏｓｅｔｔｅｓ）」を
形成する能力である。「Ｅロゼッテ」は末梢血液リンパ
細胞でこれに三またはそれ以上の羊の赤血球が付着する
ようになる。ロゼット形成は人間のＴリンパ細胞および
胸腺細胞に対する受容された標識である。この発明にお
いてはロゼット形成能力のある受容体が馬および羊の赤
血球糖蛋白質から単離された。従って、精製した馬およ
び羊の試薬はロゼット形成リンパ細胞の算出に対する標
準化しうる試薬の製造に有用であろう。
の糖蛋白質の単離を含みこの糖蛋白質はＩＭと反応する
がフオルスマン抗体とは反応しない。二つの形態の牛の
糖蛋白質が記載され、一つは約１０％の錯体糖脂質を含
む部分的に精製した形でありそしてもう一つは本質的に
均質な形である。この発明の馬および羊の糖蛋白質は本
質的に均質である。ＩＭ活性はある種のシアログリコプ
ロテインと関連しそしてノイラミニダーゼ処理によって
完全にだめになる。この発明の糖蛋白質はポール−ブン
ネル（Ｐａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ）抗体との反応に信頼の
できる抗原的要素を保持する。この特性はＩＭに対する
ある種の血清学的診断試験の発展を可能にしたがこれは
これまで完全な赤血球および複雑な時間を消費する吸収
方法が必要であった。例えば、レイビィ（Ｌｅｖｅｙ）
等、上記を参照。ここに単離された馬および羊の糖蛋白
質の付加的受容者特性は末梢血液リンパ細胞と相互反応
して試験管内で「Ｅロゼッテ（ｒｏｓｅｔｔｅｓ）」を
形成する能力である。「Ｅロゼッテ」は末梢血液リンパ
細胞でこれに三またはそれ以上の羊の赤血球が付着する
ようになる。ロゼット形成は人間のＴリンパ細胞および
胸腺細胞に対する受容された標識である。この発明にお
いてはロゼット形成能力のある受容体が馬および羊の赤
血球糖蛋白質から単離された。従って、精製した馬およ
び羊の試薬はロゼット形成リンパ細胞の算出に対する標
準化しうる試薬の製造に有用であろう。
【０００９】本発明の均質な糖蛋白質および敏感な免疫
試験の発展に対してそれらが提供する機会は、先行技術
の試験方法によって見出された異好抗体から認められる
ようにエプスタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ）ビールスそれ自身に対する抗体の検出および定量の
急速かつ有用な手段を可能にするであろう。そのような
実際的試験に対する要求は、例えば最近のＢｒｉｔ．Ｍ
ｅｄ．Ｊ．２８０，１１５３−１１５４（１９８０）中
の論説中で認められた。本発明は牛の赤血球から牛の糖
蛋白質（ＢＧＰ）の二つの形を得るためのおよび馬の赤
血球から本質的に均一な形の馬糖蛋白質（ＨＧＰ）を得
るための、および羊の赤血球から本質的に均質な形の羊
の糖蛋白質を得るための新規な精製手順を提供し、それ
らはそれぞれ人の感染性単核症の異好抗体の存在に対す
る試験において抗原として作用する。
試験の発展に対してそれらが提供する機会は、先行技術
の試験方法によって見出された異好抗体から認められる
ようにエプスタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ）ビールスそれ自身に対する抗体の検出および定量の
急速かつ有用な手段を可能にするであろう。そのような
実際的試験に対する要求は、例えば最近のＢｒｉｔ．Ｍ
ｅｄ．Ｊ．２８０，１１５３−１１５４（１９８０）中
の論説中で認められた。本発明は牛の赤血球から牛の糖
蛋白質（ＢＧＰ）の二つの形を得るためのおよび馬の赤
血球から本質的に均一な形の馬糖蛋白質（ＨＧＰ）を得
るための、および羊の赤血球から本質的に均質な形の羊
の糖蛋白質を得るための新規な精製手順を提供し、それ
らはそれぞれ人の感染性単核症の異好抗体の存在に対す
る試験において抗原として作用する。
【００１０】その部分的に精製した形においてＢＧＰは
約１０重量％までの錯体糖脂質を含む。それはクマシー
ブルーまたは過沃素酸を含むシッフ試薬で着色した場合
ドデシル硫酸ナトリウムのような希釈洗剤中の燐酸塩−
緩衝のポリアクリルアミドゲル上でｐＨ７．０における
ゲル電気泳動に際し単一バンドを与える。その好ましい
最も精製した、または均質な形において本発明のＢＧＰ
は本質的に錯体糖脂質を含まない。本発明の均質ＢＧＰ
はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシッフ試薬で
着色した場合ドデシル硫酸ナトリウムのような希釈洗剤
中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルアミド上でｐＨ７．０
におけるゲル電気泳動に際し実質的に単一バンドを形成
する。
約１０重量％までの錯体糖脂質を含む。それはクマシー
ブルーまたは過沃素酸を含むシッフ試薬で着色した場合
ドデシル硫酸ナトリウムのような希釈洗剤中の燐酸塩−
緩衝のポリアクリルアミドゲル上でｐＨ７．０における
ゲル電気泳動に際し単一バンドを与える。その好ましい
最も精製した、または均質な形において本発明のＢＧＰ
は本質的に錯体糖脂質を含まない。本発明の均質ＢＧＰ
はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシッフ試薬で
着色した場合ドデシル硫酸ナトリウムのような希釈洗剤
中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルアミド上でｐＨ７．０
におけるゲル電気泳動に際し実質的に単一バンドを形成
する。
【００１１】部分的に精製したそして均質なＢＧＰのア
ミノ酸組成は１００モルのＢＧＰについてのモル数で、
アスパラギン酸約７．２、トレオニン約８．０、セリン
約７．２、グルタミン酸約１６．５、プロリン約１２．
９、グリシン約８．９、アラニン約５．６、バリン約
５．４、メチオニン約１．２、イソロイシン約６．４、
ロイシン約９．２、チロシン約０．９、フェニルアラニ
ン約２．８、ヒスチジン約１．３、リシン約１．８およ
びアルギニン約４．８である。見本源として使用した個
々の牛間の差異に主として基づく少々の変化が、もちろ
ん、観察されるであろうことはこの技術に熟練した普通
の熟練を有する人々には容易に理解できるであろう。精
製した馬の糖蛋白質のアミノ酸組成は１００モルのＨＧ
Ｐにつきモル数で次の通りである：アスパラギン酸約
８．１、トレオニン約１０．６、セリン約１０．８、グ
ルタミン酸約９．４、プロリン約１２．３、グリシン約
９．２、アラニン約１１．３、バリン約４．４、メチオ
ニン約０．８、イソロイシン約３．５、ロイシン約８．
２、チロシン約１．１、フェニルアラニン約２．９、ヒ
スチジン約１．２、リシン約１．３、およびアルギニン
約４．８。トレオニンの組成は加水分解に際し約５％の
損失に対し修正しそしてセリンのそれは加水分解に際し
ての約１０％の損失に対し修正した。
ミノ酸組成は１００モルのＢＧＰについてのモル数で、
アスパラギン酸約７．２、トレオニン約８．０、セリン
約７．２、グルタミン酸約１６．５、プロリン約１２．
９、グリシン約８．９、アラニン約５．６、バリン約
５．４、メチオニン約１．２、イソロイシン約６．４、
ロイシン約９．２、チロシン約０．９、フェニルアラニ
ン約２．８、ヒスチジン約１．３、リシン約１．８およ
びアルギニン約４．８である。見本源として使用した個
々の牛間の差異に主として基づく少々の変化が、もちろ
ん、観察されるであろうことはこの技術に熟練した普通
の熟練を有する人々には容易に理解できるであろう。精
製した馬の糖蛋白質のアミノ酸組成は１００モルのＨＧ
Ｐにつきモル数で次の通りである：アスパラギン酸約
８．１、トレオニン約１０．６、セリン約１０．８、グ
ルタミン酸約９．４、プロリン約１２．３、グリシン約
９．２、アラニン約１１．３、バリン約４．４、メチオ
ニン約０．８、イソロイシン約３．５、ロイシン約８．
２、チロシン約１．１、フェニルアラニン約２．９、ヒ
スチジン約１．２、リシン約１．３、およびアルギニン
約４．８。トレオニンの組成は加水分解に際し約５％の
損失に対し修正しそしてセリンのそれは加水分解に際し
ての約１０％の損失に対し修正した。
【００１２】精製した羊の糖蛋白質のアミノ酸組成は１
００モルのＳＧＰにつきモル数で次のようである：アス
パラギン酸約５．６、トレオニン約８．１、セリン約１
２．９、グルタミン酸約１３．０、プロリン約１１．
６、グリシン約７．７、アラニン約９．６、バリン約
６．２、メチオニン約０．５、イソロイシン約４．６、
ロイシン約８．３、チロシン約１．６、フェニルアラニ
ン約１．２、ヒスチジン約１．６、リシン約３．２、ア
ルギニン約４．０およびトリプトフアン約０．３。カル
ボヒドラートは均質な牛の糖蛋白質の約２５重量％、均
質な馬の糖蛋白質の約５５重量％そして均質な羊の糖蛋
白質の約５７重量％になる。蛋白質は実質的に各糖蛋白
質における差になる。本発明の均質な高度に純粋な赤血
球糖蛋白質は安定な標準化しうる試薬を与えこれは室温
において生物学的活性の損失なしでいつまでも保たれ
る。これらの糖蛋白質は不活性支持体に付着させそして
放射性付箋のような付箋を標示し、そして放射線免疫試
験のような免疫試験に、ポール−ブンネル抗体の検出に
対しそしてリンパ細胞のある種の小住民（Ｓｕｂｐｏｌ
ａｔｉｏｎｓ）の検出に使われる。
００モルのＳＧＰにつきモル数で次のようである：アス
パラギン酸約５．６、トレオニン約８．１、セリン約１
２．９、グルタミン酸約１３．０、プロリン約１１．
６、グリシン約７．７、アラニン約９．６、バリン約
６．２、メチオニン約０．５、イソロイシン約４．６、
ロイシン約８．３、チロシン約１．６、フェニルアラニ
ン約１．２、ヒスチジン約１．６、リシン約３．２、ア
ルギニン約４．０およびトリプトフアン約０．３。カル
ボヒドラートは均質な牛の糖蛋白質の約２５重量％、均
質な馬の糖蛋白質の約５５重量％そして均質な羊の糖蛋
白質の約５７重量％になる。蛋白質は実質的に各糖蛋白
質における差になる。本発明の均質な高度に純粋な赤血
球糖蛋白質は安定な標準化しうる試薬を与えこれは室温
において生物学的活性の損失なしでいつまでも保たれ
る。これらの糖蛋白質は不活性支持体に付着させそして
放射性付箋のような付箋を標示し、そして放射線免疫試
験のような免疫試験に、ポール−ブンネル抗体の検出に
対しそしてリンパ細胞のある種の小住民（Ｓｕｂｐｏｌ
ａｔｉｏｎｓ）の検出に使われる。
【００１３】本発明の特別の実施態様は羊および馬の赤
血球の単離された糖蛋白質の受容体特性を含みこれはこ
の受容体が人のＴリンパ細胞と相互作用する能力であ
り、そしてこのようにしてロゼッテの形成を妨げる。ロ
ゼッテ リンパ細胞の生成および算出は新鮮な羊の血液
の入手しやすさを要求しこれは出荷および貯蔵に対する
特別な取扱いを必要とする。その上、新鮮な羊の血液は
４℃で貯蔵する場合でさえ限られた貯蔵寿命である。こ
こに記載する生成物は感染性単核症の検出における診断
試薬として有用な精製した糖蛋白質である。この発明に
よって達成される製品純度はこれまで他のＩＭ診断用製
剤では不可能であった水準の抗原的敏感性および特殊性
を提供する。ここに記載する抗原は牛、羊または馬の赤
血球から複雑な一連の段階において単離しそして精製さ
れ、それはとりわけ、エタノール沈澱、ホスホセルロー
ス クロマトグラフィー、脂質溶剤抽出およびジエチル
アミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィーを含
む。牛、羊または馬の何れを問わず各種に対しては実質
的に同一精製を行ったことは理解されるであろう。
血球の単離された糖蛋白質の受容体特性を含みこれはこ
の受容体が人のＴリンパ細胞と相互作用する能力であ
り、そしてこのようにしてロゼッテの形成を妨げる。ロ
ゼッテ リンパ細胞の生成および算出は新鮮な羊の血液
の入手しやすさを要求しこれは出荷および貯蔵に対する
特別な取扱いを必要とする。その上、新鮮な羊の血液は
４℃で貯蔵する場合でさえ限られた貯蔵寿命である。こ
こに記載する生成物は感染性単核症の検出における診断
試薬として有用な精製した糖蛋白質である。この発明に
よって達成される製品純度はこれまで他のＩＭ診断用製
剤では不可能であった水準の抗原的敏感性および特殊性
を提供する。ここに記載する抗原は牛、羊または馬の赤
血球から複雑な一連の段階において単離しそして精製さ
れ、それはとりわけ、エタノール沈澱、ホスホセルロー
ス クロマトグラフィー、脂質溶剤抽出およびジエチル
アミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィーを含
む。牛、羊または馬の何れを問わず各種に対しては実質
的に同一精製を行ったことは理解されるであろう。
【００１４】次々と、牛、馬または羊からヘモグロビン
蛋白質が赤色細胞膜からまず除去され、これを次いで逐
次的有機溶剤処理によって抽出しこれは７５％エタノー
ル抽出物を含む粗ＧＰを生じる。これらの前段階は始め
に出願人および協力者によって１９７１年に記載した；
前掲のフレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）等を参照のこ
と。本発明に従えば、７５％エタノールで得た抽出物を
さらにカチオン交換カラム上でクロマトグラフによって
処理し次いで一連の少なくとも二つの異なる脂質溶剤に
よって抽出して生成物を生じるがこれは均質糖蛋白質に
混った約１０重量％までの錯体糖脂質を含む。生成物は
ｐＨ７．０においてゲル電気泳動試験で単一バンドを示
しそこでは生成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を
含むシッフ試薬によって着色され、そしてゲルは希釈洗
剤溶液、例えば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩
−緩衝のポリアクリルアミドである。
蛋白質が赤色細胞膜からまず除去され、これを次いで逐
次的有機溶剤処理によって抽出しこれは７５％エタノー
ル抽出物を含む粗ＧＰを生じる。これらの前段階は始め
に出願人および協力者によって１９７１年に記載した；
前掲のフレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）等を参照のこ
と。本発明に従えば、７５％エタノールで得た抽出物を
さらにカチオン交換カラム上でクロマトグラフによって
処理し次いで一連の少なくとも二つの異なる脂質溶剤に
よって抽出して生成物を生じるがこれは均質糖蛋白質に
混った約１０重量％までの錯体糖脂質を含む。生成物は
ｐＨ７．０においてゲル電気泳動試験で単一バンドを示
しそこでは生成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を
含むシッフ試薬によって着色され、そしてゲルは希釈洗
剤溶液、例えば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩
−緩衝のポリアクリルアミドである。
【００１５】本発明に従って行われる最終シリーズの段
階において、錯体糖脂質は生成物をアニオン交換カラム
上で結合しそして高塩緩衝液で溶出することによつて実
質的に完全に除去する。この生成物はｐＨ７．０におい
てゲル電気泳動において実質的に単一バンドを示し、そ
こでは生成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含む
シッフ試薬によって着色し、そしてゲルは薄い洗剤溶
液、例えば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩
衝のポリアクリルアミドである。本発明の均質な糖蛋白
質は本質的に糖脂質を含まないことが判明した。均質Ｂ
ＧＰはおよそ２５％のカルボヒドラートを含むのに対
し、均質ＨＧＰはおよそ５５％のカルボヒドラートを含
み、そして均質ＳＧＰはおよそ５７％のカルボヒドラー
トを含む。各糖蛋白質の残りは実質的に蛋白質である。
階において、錯体糖脂質は生成物をアニオン交換カラム
上で結合しそして高塩緩衝液で溶出することによつて実
質的に完全に除去する。この生成物はｐＨ７．０におい
てゲル電気泳動において実質的に単一バンドを示し、そ
こでは生成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含む
シッフ試薬によって着色し、そしてゲルは薄い洗剤溶
液、例えば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩
衝のポリアクリルアミドである。本発明の均質な糖蛋白
質は本質的に糖脂質を含まないことが判明した。均質Ｂ
ＧＰはおよそ２５％のカルボヒドラートを含むのに対
し、均質ＨＧＰはおよそ５５％のカルボヒドラートを含
み、そして均質ＳＧＰはおよそ５７％のカルボヒドラー
トを含む。各糖蛋白質の残りは実質的に蛋白質である。
【００１６】この一連の段階で除去した糖脂質は人の感
染性単核症の特徴である抗体に対して本質的に非反応性
であることもまた判明した。それの除去は実際上の免疫
検査法の達成に対しては特に重要である、しかし、これ
らの方法において、標示（放射性同位体、フルオロゲ
ン、クロモゲン、発光物質またはその他の型の標示の何
れであっても）は全く特殊な免疫化学反応体に結合する
ことを当然としなければならない。不注意な標示は、た
とえ存在する総ての他の物質に対して不活性であって
も、この前提を無効にしそして無効であるかまたは信頼
できる分析を不可能とする結果に導く。それ以上に標示
した汚染物質は、たとえ検査される免疫化学的本質と非
反応性であるとしても、試験試料中の他の成分と充分反
応性であろうしそれによって得られる読みの大きさに寄
与し、それによって試験を混乱させそして誤った情報を
与える原因になる。従って錯体糖脂質は粗のような免疫
試験において使用すべきＢＧＰから本質的に完全に除去
することが診断に対する成功的免疫試験の発展および人
のＩＭの監視に対して不可欠のことである。
染性単核症の特徴である抗体に対して本質的に非反応性
であることもまた判明した。それの除去は実際上の免疫
検査法の達成に対しては特に重要である、しかし、これ
らの方法において、標示（放射性同位体、フルオロゲ
ン、クロモゲン、発光物質またはその他の型の標示の何
れであっても）は全く特殊な免疫化学反応体に結合する
ことを当然としなければならない。不注意な標示は、た
とえ存在する総ての他の物質に対して不活性であって
も、この前提を無効にしそして無効であるかまたは信頼
できる分析を不可能とする結果に導く。それ以上に標示
した汚染物質は、たとえ検査される免疫化学的本質と非
反応性であるとしても、試験試料中の他の成分と充分反
応性であろうしそれによって得られる読みの大きさに寄
与し、それによって試験を混乱させそして誤った情報を
与える原因になる。従って錯体糖脂質は粗のような免疫
試験において使用すべきＢＧＰから本質的に完全に除去
することが診断に対する成功的免疫試験の発展および人
のＩＭの監視に対して不可欠のことである。
【００１７】本発明の部分的に精製したＢＧＰは燐酸塩
−緩衝のＳＤＳ−変成ポリアクリルアミド ゲル上でｐ
Ｈ７．０における電気泳動試験において単一バンドを示
すばかりでなく、またその組成は１９７１年に出願人と
協力者によつて記述した粗製の牛の抗原製剤の粗製と著
しく異なる。下記の表は粗製および部分的精製製品中に
存在する構成糖類のモル比を比較する：
−緩衝のＳＤＳ−変成ポリアクリルアミド ゲル上でｐ
Ｈ７．０における電気泳動試験において単一バンドを示
すばかりでなく、またその組成は１９７１年に出願人と
協力者によつて記述した粗製の牛の抗原製剤の粗製と著
しく異なる。下記の表は粗製および部分的精製製品中に
存在する構成糖類のモル比を比較する：
【表１】
【００１８】第ＩＩ表は本発明の部分的に精製したＢＧ
Ｐのカルボヒドラート組成を示し、なお約１０％の錯体
糖脂質を含む、蛋白質のミリグラムにつきミクロモル
で：
Ｐのカルボヒドラート組成を示し、なお約１０％の錯体
糖脂質を含む、蛋白質のミリグラムにつきミクロモル
で：
【表２】 第ＩＩ表中の値は、シアリン酸の値を除いて、まず糖を
１００℃で３時間ＮＨＣｌ中で加水分解した後に通例の
ガス−液クロマトグラフィーによって得た。シアリン酸
に対する値は通例のようにアルカリ性−エールリッヒ
（Ｅｈｒｌｉｃｈ）試験によって測定しそしてＮ−グリ
コリル ノイラミン酸として計算した。第ＩＩ表はＬｅ
ｖｅｙ，Ｂ．Ａ．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ．１１，２５６（１９８１）中に報告された。
１００℃で３時間ＮＨＣｌ中で加水分解した後に通例の
ガス−液クロマトグラフィーによって得た。シアリン酸
に対する値は通例のようにアルカリ性−エールリッヒ
（Ｅｈｒｌｉｃｈ）試験によって測定しそしてＮ−グリ
コリル ノイラミン酸として計算した。第ＩＩ表はＬｅ
ｖｅｙ，Ｂ．Ａ．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ．１１，２５６（１９８１）中に報告された。
【００１９】第ＩＩａ表は異なった牛の固体からとった
別の試料について得られた本発明の均質ＢＧＰのカルボ
ヒドラート組成を示しそれから第ＩおよびＩＩ表の数値
を得た。
別の試料について得られた本発明の均質ＢＧＰのカルボ
ヒドラート組成を示しそれから第ＩおよびＩＩ表の数値
を得た。
【表３】 第ＩＩａ表中の値は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸およ
びポリペプチド含量に対するものを除いて、１００℃に
おいて約３時間３ＮＨＣｌ中でまず糖を加水分解した後
に通例のガス−液クロマトグラフィーによって得た。Ｎ
−グリコリルノイラミン酸に対する値は通例のようにア
ルカリ性−エーリッヒ試験によつて測定した。
びポリペプチド含量に対するものを除いて、１００℃に
おいて約３時間３ＮＨＣｌ中でまず糖を加水分解した後
に通例のガス−液クロマトグラフィーによって得た。Ｎ
−グリコリルノイラミン酸に対する値は通例のようにア
ルカリ性−エーリッヒ試験によつて測定した。
【００２０】均質の牛の糖蛋白質はおよそ７５重量％の
蛋白質と２５重量％のカルボヒドラートを有する。これ
らのような測定における少量の変動はあった。一つの変
化は第ＩおよびＩＩ表間に使用した試料、および第ＩＩ
ａおよびＩＩｂ表間に使用した試料であった。特に第Ｉ
およびＩＩ表に使った試料は蛋白質の重量％はおよそ７
７％に等しくそしてカルボヒドラートの重量％はおよそ
２３％に等しかったのに対し第ＩＩａおよびＩＩｂ表に
使った試料は蛋白質の重量％はおよそ７３％そしてカル
ボヒドラートの重量％はおよそ２７％に等しかった。生
物学技術に熟練した人々には容易に理解できるように、
個人間のそのような差は小さなものでありそして個々の
源泉の試料からに予期される。蛋白質の重量％はアミノ
酸分析に供したアミノ酸のモル数から概算したのである
から、観察された重量％の差はまた、もちろん、各試料
に対して使用した異なるアミノ酸分析器およびアミノ酸
分析器に使用した異なる緩衝剤系に依るものである。
蛋白質と２５重量％のカルボヒドラートを有する。これ
らのような測定における少量の変動はあった。一つの変
化は第ＩおよびＩＩ表間に使用した試料、および第ＩＩ
ａおよびＩＩｂ表間に使用した試料であった。特に第Ｉ
およびＩＩ表に使った試料は蛋白質の重量％はおよそ７
７％に等しくそしてカルボヒドラートの重量％はおよそ
２３％に等しかったのに対し第ＩＩａおよびＩＩｂ表に
使った試料は蛋白質の重量％はおよそ７３％そしてカル
ボヒドラートの重量％はおよそ２７％に等しかった。生
物学技術に熟練した人々には容易に理解できるように、
個人間のそのような差は小さなものでありそして個々の
源泉の試料からに予期される。蛋白質の重量％はアミノ
酸分析に供したアミノ酸のモル数から概算したのである
から、観察された重量％の差はまた、もちろん、各試料
に対して使用した異なるアミノ酸分析器およびアミノ酸
分析器に使用した異なる緩衝剤系に依るものである。
【００２１】第ＩＩｂ表は部分的に精製したＢＧＰ中お
よび均質ＢＧＰ中に存在する構成糖類のモル比を比較す
る。
よび均質ＢＧＰ中に存在する構成糖類のモル比を比較す
る。
【表４】 本発明の均質ＢＧＰはＮ−アセチルグルコースアミン対
Ｎ−グリコリルノイラミン酸の実質的に高いモル比を有
するが、これは部分的に精製したＢＧＰからの錯体糖脂
質の除去が著しくカルボヒドラートの組成を変えたこと
を示すことに注意する。この比較は異なる牛の固体から
得た異なる二つの試料を使用して行ったこと、そして生
きもの間の個々の差は或る程度常に得られる数値に影響
することを心にとめるべきである。
Ｎ−グリコリルノイラミン酸の実質的に高いモル比を有
するが、これは部分的に精製したＢＧＰからの錯体糖脂
質の除去が著しくカルボヒドラートの組成を変えたこと
を示すことに注意する。この比較は異なる牛の固体から
得た異なる二つの試料を使用して行ったこと、そして生
きもの間の個々の差は或る程度常に得られる数値に影響
することを心にとめるべきである。
【００２２】第ＩＩｃおよびＩＩｄ表はそれぞれ均質な
馬の糖蛋白質（ＨＧＰ）と均質な羊の糖蛋白質のカルボ
ヒドラート組成を与える。
馬の糖蛋白質（ＨＧＰ）と均質な羊の糖蛋白質のカルボ
ヒドラート組成を与える。
【表５】
【００２３】
【表６】 第ＩＩｃおよびＩＩｄ表のカルボヒドラート組成は第Ｉ
Ｉａ表に対して用いた方法によって測定した。第ＩＩＩ
表は本発明の部分的に精製したＢＧＰと１９７１年に出
願人と協力者によって報告された粗ＢＧＰの比較をアミ
ノ酸組成について存在する全ＢＧＰの１００モルに対す
るモル数で行った。これらの値は試料を６ＮＨＣｌ中で
１１０℃において封入し真空にした管中で２４時間加水
分解し、そのようにして得た生成物をクロマトグラフで
処理しそしてＤｕｒｒａｎ５００自動アミノ酸分析器に
よって分析した。加水分解に基づく損失に対しては補正
は行わなかった。
Ｉａ表に対して用いた方法によって測定した。第ＩＩＩ
表は本発明の部分的に精製したＢＧＰと１９７１年に出
願人と協力者によって報告された粗ＢＧＰの比較をアミ
ノ酸組成について存在する全ＢＧＰの１００モルに対す
るモル数で行った。これらの値は試料を６ＮＨＣｌ中で
１１０℃において封入し真空にした管中で２４時間加水
分解し、そのようにして得た生成物をクロマトグラフで
処理しそしてＤｕｒｒａｎ５００自動アミノ酸分析器に
よって分析した。加水分解に基づく損失に対しては補正
は行わなかった。
【００２４】
【表７】
【００２５】本発明の均質ＢＧＰは本発明の部分的精製
ＢＧＰと本質的に同一アミノ酸組成を有し、異なる動物
からの試料において個々の変化が許されることが理解さ
れるであろう。二つの形態は主として前者を生産するた
めに後者から錯体糖脂質を実質的に完全に除去したとこ
ろが主として異なる。従って、第ＩＩＩ表を与えた異な
る牛の固体からの試料について測定した均質ＢＧＰが次
の第ＩＶ中に与えられるアミノ酸組成を有することが判
った。第ＩＶ表は本発明の各均質糖蛋白質のアミノ酸組
成を存在するアミノ酸の１００モルに対するモル数で与
える。
ＢＧＰと本質的に同一アミノ酸組成を有し、異なる動物
からの試料において個々の変化が許されることが理解さ
れるであろう。二つの形態は主として前者を生産するた
めに後者から錯体糖脂質を実質的に完全に除去したとこ
ろが主として異なる。従って、第ＩＩＩ表を与えた異な
る牛の固体からの試料について測定した均質ＢＧＰが次
の第ＩＶ中に与えられるアミノ酸組成を有することが判
った。第ＩＶ表は本発明の各均質糖蛋白質のアミノ酸組
成を存在するアミノ酸の１００モルに対するモル数で与
える。
【００２６】
【表８】
【００２７】個々のアミノ酸は６ＮＨＣｌ中で１１０℃
で封入し脱気した中で２４時間加水分解した後ＪＯＥＬ
５ＡＨアミノ酸分析器で測定した。Ｎ−末端アミノ酸分
析はダンシル法によって行った〔Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５，３３３（１９７
２）〕。ＤＮＳ−アミノ酸はＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．等
〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３
３，３６９（１９６７）〕によつて記述されたようにＴ
ＬＣによって固定した。牛および羊の糖蛋白質のアミノ
酸分析に対しては、トリプトフアンは１００℃で２０時
間４Ｎメタン−スルホン酸中で加水分解した後に測定し
た。ＢＧＰに対するシスタイン値は加水分解前に均質Ｂ
ＧＰをジアスターゼでアルキル化して測定した。部分的
精製ＢＧＰ（第ＩＩＩ表）と均質ＢＧＰ（第ＩＶ）間の
アミノ酸組成の観察される差違は重大ではなくそして、
なかんずく、巨大糖蛋白質の存在によるＨＣｌ加水分解
の延引、ＢＧＰの各形態を分析するのに使用した異なる
アミノ酸分析器、および各形態のＢＧＰをつくるのに使
用した牛の個々のよく知られた差違によるものである。
部分精製ＢＧＰのアミノ酸組成は実質的に均質ＢＧＰの
それと同じであることが理解されるであろう。
で封入し脱気した中で２４時間加水分解した後ＪＯＥＬ
５ＡＨアミノ酸分析器で測定した。Ｎ−末端アミノ酸分
析はダンシル法によって行った〔Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５，３３３（１９７
２）〕。ＤＮＳ−アミノ酸はＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．等
〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３
３，３６９（１９６７）〕によつて記述されたようにＴ
ＬＣによって固定した。牛および羊の糖蛋白質のアミノ
酸分析に対しては、トリプトフアンは１００℃で２０時
間４Ｎメタン−スルホン酸中で加水分解した後に測定し
た。ＢＧＰに対するシスタイン値は加水分解前に均質Ｂ
ＧＰをジアスターゼでアルキル化して測定した。部分的
精製ＢＧＰ（第ＩＩＩ表）と均質ＢＧＰ（第ＩＶ）間の
アミノ酸組成の観察される差違は重大ではなくそして、
なかんずく、巨大糖蛋白質の存在によるＨＣｌ加水分解
の延引、ＢＧＰの各形態を分析するのに使用した異なる
アミノ酸分析器、および各形態のＢＧＰをつくるのに使
用した牛の個々のよく知られた差違によるものである。
部分精製ＢＧＰのアミノ酸組成は実質的に均質ＢＧＰの
それと同じであることが理解されるであろう。
【００２８】本発明の特別の実施態様は測定されるべき
抗源またはその結合される相手には付箋を付けることを
要求する。放射性同位体付箋は、例えば、１２５Ｉ、
１３１Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃ、がまたはその他の容易に
そして便利に使用できるものが好ましい。蛋白質のトリ
トリウム付箋は、例えば、この目的に対してしばしば用
いられる周知の試薬である〔３Ｈ〕−無水酸によって行
うことができる。アイソトープ１２５Ｉは最も望まし
い。それはその高い比放射能のためおよびその比較的長
い半減期のためである。抗体または蛋白質性抗原はこの
技術で知られている種々の方法の一つ、例えばラクトペ
ルオキシダーゼ、クロルアミン−Ｔ〔Ｈｕｎｔｅｒ，
Ｗ，Ｍ等Ｎａｔｕｒｅ １９４，４０５（１９６
２）〕、イオドーゲン〔Ｆｒａｋｅｒ，Ｐ．Ｊ．等Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８
０，８４９（１９７８）〕、またはＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕ
ｎｔｅｒ試薬〔Ｂｏｌｔｏｎ，Ａ．Ｅ等 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．１３３，５２９（１９７３）〕によって約５０
ミクロＣｉ／ミクログラム蛋白質の比放射能に対し
１２５Ｉで標示することができる。標示した蛋白質は未
反応遊離１２５Ｉからゲル濾過によって分けることがで
きる。
抗源またはその結合される相手には付箋を付けることを
要求する。放射性同位体付箋は、例えば、１２５Ｉ、
１３１Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃ、がまたはその他の容易に
そして便利に使用できるものが好ましい。蛋白質のトリ
トリウム付箋は、例えば、この目的に対してしばしば用
いられる周知の試薬である〔３Ｈ〕−無水酸によって行
うことができる。アイソトープ１２５Ｉは最も望まし
い。それはその高い比放射能のためおよびその比較的長
い半減期のためである。抗体または蛋白質性抗原はこの
技術で知られている種々の方法の一つ、例えばラクトペ
ルオキシダーゼ、クロルアミン−Ｔ〔Ｈｕｎｔｅｒ，
Ｗ，Ｍ等Ｎａｔｕｒｅ １９４，４０５（１９６
２）〕、イオドーゲン〔Ｆｒａｋｅｒ，Ｐ．Ｊ．等Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８
０，８４９（１９７８）〕、またはＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕ
ｎｔｅｒ試薬〔Ｂｏｌｔｏｎ，Ａ．Ｅ等 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．１３３，５２９（１９７３）〕によって約５０
ミクロＣｉ／ミクログラム蛋白質の比放射能に対し
１２５Ｉで標示することができる。標示した蛋白質は未
反応遊離１２５Ｉからゲル濾過によって分けることがで
きる。
【００２９】チロシンを含む蛋白質を放射性標示する好
ましい方法はクロラミン−Ｔである。これは放射性付箋
によって蛋白質を標示する最もしばしば用いる方法であ
る。別法として、チロシン残渣は始めに蛋白質をＮａＩ
と反応させ、次いでトリトリウム ガスによって接触水
添することによつて２段階法でトリトリウムによつて標
示することができる。リシンまたはアルギニンの遊離ア
ミノ基の側鎖は３Ｈ−無水酢酸またはボルトン−ハンタ
ー試薬によって標示することができる。放射性付箋の代
りに多くの種類の他の付箋を使うことができる。付箋を
つけるその他の方法にはフルオロゲン、クロモフォア、
酵素または発光生付箋を含む。例えば、馬のラディシュ
ペルオキシダーゼまたはベーターガラクトシダーゼは
Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．Ｈ．等Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍ
ｉｃａ Ａｃｔａ ７０，１（１９７６）中で検討され
る多くの方法によって蛋白質性抗原にカプルすることが
できる。フルオレッセン イソチオシアナートは蛋白質
に結合できる周知のフルオゲニック基である〔Ａｃｋｒ
ｏｙｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｓ Ｏｘｆｏｒｄ
（１９６４）１５５−１７４頁。 Ａ．牛、馬または羊の赤血球から粗抗源の製造
ましい方法はクロラミン−Ｔである。これは放射性付箋
によって蛋白質を標示する最もしばしば用いる方法であ
る。別法として、チロシン残渣は始めに蛋白質をＮａＩ
と反応させ、次いでトリトリウム ガスによって接触水
添することによつて２段階法でトリトリウムによつて標
示することができる。リシンまたはアルギニンの遊離ア
ミノ基の側鎖は３Ｈ−無水酢酸またはボルトン−ハンタ
ー試薬によって標示することができる。放射性付箋の代
りに多くの種類の他の付箋を使うことができる。付箋を
つけるその他の方法にはフルオロゲン、クロモフォア、
酵素または発光生付箋を含む。例えば、馬のラディシュ
ペルオキシダーゼまたはベーターガラクトシダーゼは
Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．Ｈ．等Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍ
ｉｃａ Ａｃｔａ ７０，１（１９７６）中で検討され
る多くの方法によって蛋白質性抗原にカプルすることが
できる。フルオレッセン イソチオシアナートは蛋白質
に結合できる周知のフルオゲニック基である〔Ａｃｋｒ
ｏｙｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｓ Ｏｘｆｏｒｄ
（１９６４）１５５−１７４頁。 Ａ．牛、馬または羊の赤血球から粗抗源の製造
【００３０】Ｆｌｅｔｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍ．１０
７，８４２（１９７１）中に一般的に記載されるように
して肉基質、例えば細胞膜の抽出によってヘモグロビン
を含まない肉基質を単離する。さらに特に、新たに殺し
た牛からの新鮮な血液に凝固を防ぐために抗凝固剤を加
える。ヘパリンおよびエチレンジアミン四酢酸を避ける
ほかはほとんど通例の抗凝固剤は使うことができる。望
ましい抗凝固剤には酸性化シトラート−デキストロー
ス、オキザラートおよびＡｌｓｉｅｖｅｒを含む。血液
は普通の冷蔵温度で約２４時間まで貯蔵できる。次いで
普通の等張緩衝剤の何れかによって細胞膜を無傷に保つ
ｐＨにおいて、即ち約５．０から約９．０、好ましくは
約６．０から約８．０まで例えば燐酸塩−緩衝の塩水の
ｐＨ約７．４またはトリス−緩衝塩水のｐＨ約７．４に
おいて充分に洗う。もしも血液試料を洗浄前に約２４時
よりも認めうる程長い時間放置すると、試料は細菌また
は白色血液細胞からのリソソマル（ｌｙｓｏｓｏｍａ
ｌ）酵素によって汚染されるであろう。各洗滌段階で細
胞は緩衝液中に懸濁させ次いで遠心分離する。遠心分離
後上澄および軟膜はアスピレーターで除く。これらの洗
浄−遠心分離−アスピレーション段階は軟膜が完全に除
去されそして上澄が完全に明澄で着色がなくなるまで続
ける。実質的に総ての軟膜を除去することはそれが加水
分解性酵素源だから重要である。洗浄段階中に赤血球の
全体積のおよそ１／４がなくなる。
７，８４２（１９７１）中に一般的に記載されるように
して肉基質、例えば細胞膜の抽出によってヘモグロビン
を含まない肉基質を単離する。さらに特に、新たに殺し
た牛からの新鮮な血液に凝固を防ぐために抗凝固剤を加
える。ヘパリンおよびエチレンジアミン四酢酸を避ける
ほかはほとんど通例の抗凝固剤は使うことができる。望
ましい抗凝固剤には酸性化シトラート−デキストロー
ス、オキザラートおよびＡｌｓｉｅｖｅｒを含む。血液
は普通の冷蔵温度で約２４時間まで貯蔵できる。次いで
普通の等張緩衝剤の何れかによって細胞膜を無傷に保つ
ｐＨにおいて、即ち約５．０から約９．０、好ましくは
約６．０から約８．０まで例えば燐酸塩−緩衝の塩水の
ｐＨ約７．４またはトリス−緩衝塩水のｐＨ約７．４に
おいて充分に洗う。もしも血液試料を洗浄前に約２４時
よりも認めうる程長い時間放置すると、試料は細菌また
は白色血液細胞からのリソソマル（ｌｙｓｏｓｏｍａ
ｌ）酵素によって汚染されるであろう。各洗滌段階で細
胞は緩衝液中に懸濁させ次いで遠心分離する。遠心分離
後上澄および軟膜はアスピレーターで除く。これらの洗
浄−遠心分離−アスピレーション段階は軟膜が完全に除
去されそして上澄が完全に明澄で着色がなくなるまで続
ける。実質的に総ての軟膜を除去することはそれが加水
分解性酵素源だから重要である。洗浄段階中に赤血球の
全体積のおよそ１／４がなくなる。
【００３１】洗浄しそして包装した血液は次いでアルカ
リ性ｐＨ、即ち約８．０以上の低張性緩衝液中に溶か
す。溶解する緩衝液はヘモグロビンの変性および変性し
たヘモグロピンが細胞膜に望ましくない結合をするのを
防ぐためアルカリ性でなければならない。細胞肉基質ま
たは細胞膜は約１３，０００×ｇにおいて１時間約４℃
から約１５℃まで程度の温において遠心分離によって一
緒に包装する。上澄はアスピレートして捨て、その際ゆ
るく包まれた細胞膜層は赤色ペレットから斜瀉される。
このアルカリ性洗浄に続く冷遠心分離および分離段階は
斜瀉した細胞膜層がクリーム白、即ち目に見えるヘモグ
ロビン汚染がなくなるまで繰り返す。精製した肉基質は
次の段階実施のため例えば凍結−乾燥によって乾かさね
ばならない。
リ性ｐＨ、即ち約８．０以上の低張性緩衝液中に溶か
す。溶解する緩衝液はヘモグロビンの変性および変性し
たヘモグロピンが細胞膜に望ましくない結合をするのを
防ぐためアルカリ性でなければならない。細胞肉基質ま
たは細胞膜は約１３，０００×ｇにおいて１時間約４℃
から約１５℃まで程度の温において遠心分離によって一
緒に包装する。上澄はアスピレートして捨て、その際ゆ
るく包まれた細胞膜層は赤色ペレットから斜瀉される。
このアルカリ性洗浄に続く冷遠心分離および分離段階は
斜瀉した細胞膜層がクリーム白、即ち目に見えるヘモグ
ロビン汚染がなくなるまで繰り返す。精製した肉基質は
次の段階実施のため例えば凍結−乾燥によって乾かさね
ばならない。
【００３２】遠心分離に対する別法はＲｏｓｅｎｂｅｒ
ｒｙ，Ｔ．Ｌ．等Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｍｅｔｈ．４，３９（１９８１）中に人の血液から
細胞膜の調製に記載されたようにＰｅｌｌｉｃｏｎ上で
の濾過である。その後、約１ｇの肉基質を好ましくは約
２００ｍｌのアセトンと共に乳鉢と乳棒によって磨砕し
て牛、馬または羊の赤血球からの凍結乾燥したヘモグロ
ビンを含まない肉基質のアセトン中の均等懸濁をつく
る。アセトンは無水で新しく開いた瓶からとらねばなら
ぬ。１ｇの肉基質当りのアセトンの容量は約１００ｍｌ
の少量から実質的に２００ｍｌより多い量まで変化して
よい。懸濁物は普通約３時間還流させることができる
が、時間は約１ないし６時間に変化するであろう。懸濁
物がなお温かい間にアセトンを濾して残渣を集める；そ
うしなければ濾器上に若干の望ましくないアセトン可溶
の中性脂質が沈澱する。残渣は好ましくは温アセトンに
よって充分洗いそして風乾する。
ｒｙ，Ｔ．Ｌ．等Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｍｅｔｈ．４，３９（１９８１）中に人の血液から
細胞膜の調製に記載されたようにＰｅｌｌｉｃｏｎ上で
の濾過である。その後、約１ｇの肉基質を好ましくは約
２００ｍｌのアセトンと共に乳鉢と乳棒によって磨砕し
て牛、馬または羊の赤血球からの凍結乾燥したヘモグロ
ビンを含まない肉基質のアセトン中の均等懸濁をつく
る。アセトンは無水で新しく開いた瓶からとらねばなら
ぬ。１ｇの肉基質当りのアセトンの容量は約１００ｍｌ
の少量から実質的に２００ｍｌより多い量まで変化して
よい。懸濁物は普通約３時間還流させることができる
が、時間は約１ないし６時間に変化するであろう。懸濁
物がなお温かい間にアセトンを濾して残渣を集める；そ
うしなければ濾器上に若干の望ましくないアセトン可溶
の中性脂質が沈澱する。残渣は好ましくは温アセトンに
よって充分洗いそして風乾する。
【００３３】アセトン抽出残渣について同一還流手順を
繰り返し、このときには無水アセトンを１００％エタノ
ールで置き換える。１００％エタノールによる抽出は総
てではないがいくらかの糖脂質を除去する。エタノール
抽出液を明け、そして残渣を乾かす。アセトンおよびエ
タノール抽出残渣は再び還流させるが、好ましくは約７
５％水性エタノールにより、しかし約５０％と約８０％
の間の水性エタノールの溶液を使うことができる。上澄
液を濾し分けて傍におく。次いで等量の水性エタノール
で残渣を洗う。洗った残渣は捨てる。抽出液および総て
の洗浄液は合体し、濃縮し透析して塩を除きそして普通
のやり方で凍結乾燥させる。別法として、水性エタノー
ル抽出液およびその洗滌液は合体し、濃縮し、水に対し
て透析しそして普通の冷凍温度で貯蔵してよい。
繰り返し、このときには無水アセトンを１００％エタノ
ールで置き換える。１００％エタノールによる抽出は総
てではないがいくらかの糖脂質を除去する。エタノール
抽出液を明け、そして残渣を乾かす。アセトンおよびエ
タノール抽出残渣は再び還流させるが、好ましくは約７
５％水性エタノールにより、しかし約５０％と約８０％
の間の水性エタノールの溶液を使うことができる。上澄
液を濾し分けて傍におく。次いで等量の水性エタノール
で残渣を洗う。洗った残渣は捨てる。抽出液および総て
の洗浄液は合体し、濃縮し透析して塩を除きそして普通
のやり方で凍結乾燥させる。別法として、水性エタノー
ル抽出液およびその洗滌液は合体し、濃縮し、水に対し
て透析しそして普通の冷凍温度で貯蔵してよい。
【００３４】Ｂ．牛、馬または羊の糖蛋白質を均質物に
精製 Ａ段階からの凍結乾燥したエタノール抽出物を水に再び
溶かしそして約９０％の水性エタノールで再沈澱させ
る。少なくとも２時間氷の上に置きそして塩、例えば酢
酸ナトリウムまたはその他の普通の塩の結晶３−４個を
加えると沈澱の開始を助ける。典型的には白色の嵩張っ
た沈澱が現れる。この沈澱を遠心分離しそして上澄液は
除去して捨てる。沈澱は次いで通例の低イオン濃度でそ
してカチオン系交換カラムを通過させてつくった低ｐＨ
の緩衝液に対して透析する。カチオン系交換樹脂上のク
ロマトグラフィーは約４から約６までのｐＨ、例えば糖
蛋白質が異好抗体と反応性になる等電焦点の上で行うの
が最良である。この段階に好適な樹脂にはホスホセルロ
ース、カルボキシメチル セルロースおよび蛋白質の精
製に普通使われる弱酸性アクリル樹脂の何れをも含む。
樹脂が低イオン濃度、低ｐＨ緩衝液で予め平衝化した後
に透析した蛋白質試料をカラムに通す。中性および塩基
性汚染物質はカラムによって結合されそして捨てられ
る。シアリン酸を含みそしてカラムに結合しないこれら
の画分を集める。これらは水に対して透析することがで
きもしも望むなら凍結乾燥させる。
精製 Ａ段階からの凍結乾燥したエタノール抽出物を水に再び
溶かしそして約９０％の水性エタノールで再沈澱させ
る。少なくとも２時間氷の上に置きそして塩、例えば酢
酸ナトリウムまたはその他の普通の塩の結晶３−４個を
加えると沈澱の開始を助ける。典型的には白色の嵩張っ
た沈澱が現れる。この沈澱を遠心分離しそして上澄液は
除去して捨てる。沈澱は次いで通例の低イオン濃度でそ
してカチオン系交換カラムを通過させてつくった低ｐＨ
の緩衝液に対して透析する。カチオン系交換樹脂上のク
ロマトグラフィーは約４から約６までのｐＨ、例えば糖
蛋白質が異好抗体と反応性になる等電焦点の上で行うの
が最良である。この段階に好適な樹脂にはホスホセルロ
ース、カルボキシメチル セルロースおよび蛋白質の精
製に普通使われる弱酸性アクリル樹脂の何れをも含む。
樹脂が低イオン濃度、低ｐＨ緩衝液で予め平衝化した後
に透析した蛋白質試料をカラムに通す。中性および塩基
性汚染物質はカラムによって結合されそして捨てられ
る。シアリン酸を含みそしてカラムに結合しないこれら
の画分を集める。これらは水に対して透析することがで
きもしも望むなら凍結乾燥させる。
【００３５】集めた画分、しかし好ましくは必ずしも凍
結乾燥させなかったものを次に処理する。もしも凍結乾
燥させまたは乾かしたときは画分はまず水にとかし、約
５容量のエーテル：エタノール（容量対容量比で約４：
１ないし約１：１）を次に加えそして混合物を遠心分離
しそして沈降させる。二相が現れ、一相はジエチルエー
テルを含む。水性相を除きそして凍結乾燥させて残留エ
ーテルおよび水を除く。ジエチル エーテルと異なる別
の抽出を次いで通例の化学の技法に従って行う。この手
順において、第一抽出段階からの凍結乾燥した抽出物を
水に溶かしそしてクロロホルム／メタノールの約２：１
ｖ／ｖの比の約９容量中で再抽出する。混合物は再び遠
心分離しそして水性相と有機相に分ける。分離した水性
相をとり出して凍結乾燥する。もしも凍結乾燥した物質
が牛から出発したものであればそれは本発明の部分的精
製ＢＧＰである。
結乾燥させなかったものを次に処理する。もしも凍結乾
燥させまたは乾かしたときは画分はまず水にとかし、約
５容量のエーテル：エタノール（容量対容量比で約４：
１ないし約１：１）を次に加えそして混合物を遠心分離
しそして沈降させる。二相が現れ、一相はジエチルエー
テルを含む。水性相を除きそして凍結乾燥させて残留エ
ーテルおよび水を除く。ジエチル エーテルと異なる別
の抽出を次いで通例の化学の技法に従って行う。この手
順において、第一抽出段階からの凍結乾燥した抽出物を
水に溶かしそしてクロロホルム／メタノールの約２：１
ｖ／ｖの比の約９容量中で再抽出する。混合物は再び遠
心分離しそして水性相と有機相に分ける。分離した水性
相をとり出して凍結乾燥する。もしも凍結乾燥した物質
が牛から出発したものであればそれは本発明の部分的精
製ＢＧＰである。
【００３６】なお残存する主として錯体糖脂質を含む汚
染物を除去するために、次いで凍結乾燥した糖蛋白質を
ＥｍｕｌｐｈｏｇｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００
のような約１％の中性洗剤を含む低イオン濃度の緩衝液
に溶かす。この洗剤は錯体糖脂質の溶解を助ける。低イ
オン濃度緩衝液で予め平衝化させたアニオン交換カラム
にこの溶液を通す。種々の好適なアニオン交換樹脂が購
入でき、それらにはＤＥ−５２セルロース、ＤＥＡＥ
ＢＩＯ−ＧＥＬ Ａ およびＣｅｌｌｅｘ Ｄを含む。
カラムは低イオン濃度水性緩衝液によって遂に溶出され
た画分の光学的密度が緩衝液単独からなるブランク溶液
水準、普通は２８０ナノメーターにおいて０．１単位よ
りも少ない、に戻るまで洗浄する。次いでカラムを高塩
分濃度、即ち０．３モル濃度以上のＮａＣｌ、酢酸ナト
リウム、ＫＣｌ、等のような通常の塩を含む水性緩衝液
で溶出する。高濃度の塩は糖蛋白質とカチオン系樹脂間
の静電的相互反応と競合し、それによって物質の単一ピ
ークがプールされる。物質はＨ２Ｏに対して透析し、凍
結乾燥しそして使用のために保存する。
染物を除去するために、次いで凍結乾燥した糖蛋白質を
ＥｍｕｌｐｈｏｇｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００
のような約１％の中性洗剤を含む低イオン濃度の緩衝液
に溶かす。この洗剤は錯体糖脂質の溶解を助ける。低イ
オン濃度緩衝液で予め平衝化させたアニオン交換カラム
にこの溶液を通す。種々の好適なアニオン交換樹脂が購
入でき、それらにはＤＥ−５２セルロース、ＤＥＡＥ
ＢＩＯ−ＧＥＬ Ａ およびＣｅｌｌｅｘ Ｄを含む。
カラムは低イオン濃度水性緩衝液によって遂に溶出され
た画分の光学的密度が緩衝液単独からなるブランク溶液
水準、普通は２８０ナノメーターにおいて０．１単位よ
りも少ない、に戻るまで洗浄する。次いでカラムを高塩
分濃度、即ち０．３モル濃度以上のＮａＣｌ、酢酸ナト
リウム、ＫＣｌ、等のような通常の塩を含む水性緩衝液
で溶出する。高濃度の塩は糖蛋白質とカチオン系樹脂間
の静電的相互反応と競合し、それによって物質の単一ピ
ークがプールされる。物質はＨ２Ｏに対して透析し、凍
結乾燥しそして使用のために保存する。
【００３７】ＳＤＳのような洗剤中の、前にアニオン交
換カラム上でクロマトグラフ処理をし、透析した凍結乾
燥した物質のポリアクリルアミド ゲル電気泳動は、ク
マシー ブルー染料または過沃素酸シッフ試薬で着色し
た本質的に一つのバンドを生じる。洗剤中のポリアクリ
ルアミド ゲル電気泳動は蛋白質試料の均質性を確かめ
るためおよび分子量を推定するための周知の技法であ
る。例えば次を参照のこと：Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．
Ａ．等Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ．２
７８，１６３（１９７２）。 Ｃ．本発明の精製した糖蛋白質の使用 出願人が行った実験において、本発明の糖蛋白質製品は
感染性単核症の患者からの血清による羊の赤血球の凝集
反応の強い防止剤であった。受容者の特性は糖蛋白質の
ノイラミニダーゼによる前処理によって終った。
換カラム上でクロマトグラフ処理をし、透析した凍結乾
燥した物質のポリアクリルアミド ゲル電気泳動は、ク
マシー ブルー染料または過沃素酸シッフ試薬で着色し
た本質的に一つのバンドを生じる。洗剤中のポリアクリ
ルアミド ゲル電気泳動は蛋白質試料の均質性を確かめ
るためおよび分子量を推定するための周知の技法であ
る。例えば次を参照のこと：Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．
Ａ．等Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ．２
７８，１６３（１９７２）。 Ｃ．本発明の精製した糖蛋白質の使用 出願人が行った実験において、本発明の糖蛋白質製品は
感染性単核症の患者からの血清による羊の赤血球の凝集
反応の強い防止剤であった。受容者の特性は糖蛋白質の
ノイラミニダーゼによる前処理によって終った。
【００３８】ここに記述するいずれの免疫的試験も、ま
たはその明らかな変更も本発明の糖蛋白質の精製した形
態に適用できる、その形態には部分的に精製したＢＧ
Ｐ、本質的に均質なＢＧＰ、本質的に均質なＨＧＰ、お
よび本質的に均質なＳＧＰを含む。本発明の何れの糖蛋
白質生成物も人の伝染性単核症の診断および／または監
視のためのラテックス ビーズ試験に使用できる。
たはその明らかな変更も本発明の糖蛋白質の精製した形
態に適用できる、その形態には部分的に精製したＢＧ
Ｐ、本質的に均質なＢＧＰ、本質的に均質なＨＧＰ、お
よび本質的に均質なＳＧＰを含む。本発明の何れの糖蛋
白質生成物も人の伝染性単核症の診断および／または監
視のためのラテックス ビーズ試験に使用できる。
【００３９】１．ラテックス ビーズ試験 本発明の何れの精製した糖蛋白質の担体粒子への化学的
結合も種々の方法で達成できる。ポリスチレン、ポリ
（メチルメタクリレート）のような合成ポリマーで成る
粒子または何れの合成ラテックスもそれらが長期の貯蔵
間に高い安定性があるために微小細胞よりも好ましい。
一般にビーズまたは粒子は一つまたは一つ以上の第一ア
ミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはヒドロキシ
ル基のような遊離官能基を有すべきである。蛋白質を合
成ポリマーから成る担体粒子へのカプリングの種々の方
法は、なかでも米国特許第４，０４６，７２３；３，８
８２，２２４；３，８５７，９３１；３，６３９，５５
８各号を含む文献中に検討されている。ラテックス ビ
ーズを本発明の糖蛋白質にカプリングする好ましい方法
において、糖蛋白質を約０．２５％（水中）のカルボキ
シル−変性、均質ラテックス粒子に添加する。混合物は
少なくとも約３０分かきまぜる。ｐＨは約４ないし約６
の間に保つ。次いで、例えば１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒドロクロリ
ドのような置換カルボジイミドの最少量の水に新たにつ
くった溶液を加える。このカルボジイミドはその最終濃
度が約０．１Ｍ程度になるような量で加える。７より下
のｐＨを少なくとも１時間保ち、次いで混合物を一晩ま
たはそれ以上かきまぜる。粒子は交互に低ｐＨ（約４）
の水性緩衝液次いで高ｐＨ（約８）の水性緩衝液で洗
い、そして最後に２回蒸溜水で洗う。本発明のカプルし
た糖蛋白質を含むビーズは次いで高い水性ｐＨ緩衝液
（約８）中に約１％の濃度で貯蔵する。
結合も種々の方法で達成できる。ポリスチレン、ポリ
（メチルメタクリレート）のような合成ポリマーで成る
粒子または何れの合成ラテックスもそれらが長期の貯蔵
間に高い安定性があるために微小細胞よりも好ましい。
一般にビーズまたは粒子は一つまたは一つ以上の第一ア
ミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはヒドロキシ
ル基のような遊離官能基を有すべきである。蛋白質を合
成ポリマーから成る担体粒子へのカプリングの種々の方
法は、なかでも米国特許第４，０４６，７２３；３，８
８２，２２４；３，８５７，９３１；３，６３９，５５
８各号を含む文献中に検討されている。ラテックス ビ
ーズを本発明の糖蛋白質にカプリングする好ましい方法
において、糖蛋白質を約０．２５％（水中）のカルボキ
シル−変性、均質ラテックス粒子に添加する。混合物は
少なくとも約３０分かきまぜる。ｐＨは約４ないし約６
の間に保つ。次いで、例えば１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒドロクロリ
ドのような置換カルボジイミドの最少量の水に新たにつ
くった溶液を加える。このカルボジイミドはその最終濃
度が約０．１Ｍ程度になるような量で加える。７より下
のｐＨを少なくとも１時間保ち、次いで混合物を一晩ま
たはそれ以上かきまぜる。粒子は交互に低ｐＨ（約４）
の水性緩衝液次いで高ｐＨ（約８）の水性緩衝液で洗
い、そして最後に２回蒸溜水で洗う。本発明のカプルし
た糖蛋白質を含むビーズは次いで高い水性ｐＨ緩衝液
（約８）中に約１％の濃度で貯蔵する。
【００４０】感染性単核症の試験を行うために、糖蛋白
質ラテックス ビーズを約０．２５％（ｗ／ｖ）程度の
濃度に緩衝液中で希釈する。認めうる程の低い濃度の試
薬は容易に目視できる凝集し、一方認めうる高濃度は蛋
白質結合担体粒子の浪費を来らせる。緩衝液中の順次的
希釈を試験抗血清または血清のような生物学的液体で行
う。そのような希釈液の１滴を血清学的環スライド中の
溜めのセラミック環内の糖蛋白質ラテックス ビーズ試
薬の１滴に加える。スライドを短かく回転させて抗血清
または血清とラテックス試薬を混合し、そして凝集反応
を目視によって測定する。滴定の終点は可視凝集を与え
る血清の最高希釈（即ち最も薄い濃度）として決定す
る。凝集反応試験に対してはその他の容器を使うことが
できる、例えば、Ｃｏｏｋｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｃｏ．からのＵ−形状の溜めを有するポリスチレン
ミクロ滴定板があるが、そのような溜めの中で凝集反応
を読むことはより困難である。
質ラテックス ビーズを約０．２５％（ｗ／ｖ）程度の
濃度に緩衝液中で希釈する。認めうる程の低い濃度の試
薬は容易に目視できる凝集し、一方認めうる高濃度は蛋
白質結合担体粒子の浪費を来らせる。緩衝液中の順次的
希釈を試験抗血清または血清のような生物学的液体で行
う。そのような希釈液の１滴を血清学的環スライド中の
溜めのセラミック環内の糖蛋白質ラテックス ビーズ試
薬の１滴に加える。スライドを短かく回転させて抗血清
または血清とラテックス試薬を混合し、そして凝集反応
を目視によって測定する。滴定の終点は可視凝集を与え
る血清の最高希釈（即ち最も薄い濃度）として決定す
る。凝集反応試験に対してはその他の容器を使うことが
できる、例えば、Ｃｏｏｋｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｃｏ．からのＵ−形状の溜めを有するポリスチレン
ミクロ滴定板があるが、そのような溜めの中で凝集反応
を読むことはより困難である。
【００４１】２．本発明の均質糖蛋白質を使用する免疫
試験 放射線免疫試験を含めて多くの型の免疫試験がこの技術
では知られておりそして本発明の均質糖蛋白質の検出お
よび／または定量に使うことができる。免疫試験は、例
えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃ、または何
等かその他の容易にそして便利に使うことができるその
他の放射性同位体のような放射能を有する付箋を抗原に
対して用いることができる。抗原に付箋をつけるその他
の方法にはフルオロゲン、クロモフォア、酵素または発
光付箋の結合を含む。遊離の（即ち結合していない）抗
原から抗体−抗原錯体を分離する多数の方法が知られて
おりそれには抗体の沈澱（二重抗体）が含まれる。その
他の既知の技法中には固体支持マトリクスがあり、固相
試験としても知られ、そこでは抗原−抗体の対の一成分
を固定するためにガラス、シリカまたはプラスチックの
ビーズまたは単一のプラスチック インサートを使用す
る。本発明の均質糖蛋白質に付箋をつける好ましい方法
は１２５Ｉによるもの、即ち放射性標示でこれはミクロ
グラムの蛋白質につき検出しうる崩壊速度の事項で測定
して極めて高い特質的活性を有する標示した抗原を生じ
ることができる。
試験 放射線免疫試験を含めて多くの型の免疫試験がこの技術
では知られておりそして本発明の均質糖蛋白質の検出お
よび／または定量に使うことができる。免疫試験は、例
えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃ、または何
等かその他の容易にそして便利に使うことができるその
他の放射性同位体のような放射能を有する付箋を抗原に
対して用いることができる。抗原に付箋をつけるその他
の方法にはフルオロゲン、クロモフォア、酵素または発
光付箋の結合を含む。遊離の（即ち結合していない）抗
原から抗体−抗原錯体を分離する多数の方法が知られて
おりそれには抗体の沈澱（二重抗体）が含まれる。その
他の既知の技法中には固体支持マトリクスがあり、固相
試験としても知られ、そこでは抗原−抗体の対の一成分
を固定するためにガラス、シリカまたはプラスチックの
ビーズまたは単一のプラスチック インサートを使用す
る。本発明の均質糖蛋白質に付箋をつける好ましい方法
は１２５Ｉによるもの、即ち放射性標示でこれはミクロ
グラムの蛋白質につき検出しうる崩壊速度の事項で測定
して極めて高い特質的活性を有する標示した抗原を生じ
ることができる。
【００４２】糖蛋白質は１２５Ｉによって約１マイクロ
キューリー／マイクログラムの特殊な活性に、この技術
で知られた種々の方法の一つによって標示することがで
き、その方法は例えばラクトペルオキシドース、クロル
アミン−Ｔ標示、またはＩｏｄｏｇｅｎ〔Ｆｒａｋｅ
ｒ，Ｐ．Ｊ．＆Ｊ．Ｃ．Ｓｐｅｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０，８４９
（１９７８）〕である。標示した蛋白は未反応遊離
１２５Ｉからゲル濾過によって分離することができる。
１２５Ｉ−標示均質糖蛋白質、例えば１２５Ｉ−ＢＧＰ
をベースとする好ましい免疫試験は競争的放射線免疫試
験である。競争的放射線免疫試験の原理は標示抗原が非
標示抗原と血清中の抗体の同一結合部分で争うことであ
る。例えば次を参照のこと：Ｋａｂａｔ，Ｅ（１９７
６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｓｔｒｙＨｏｌｔ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｗｉｎｓｔｏ
ｎ。抗体−抗原錯体の遊離抗原からの分離は結合した抗
原の量の測定を可能にする。この周知の検査は多くの変
化があり、例えば、何れの非標示抗原が標示抗原に対し
最大の類似性を有するかを測定するために種々の非標示
抗原を試験する。他の変化は標準化した放射線標示のお
よび非標示の抗原を、多数の試験血清の多数の希釈物の
それぞれからの試料に対して、何れかの血清中の特殊な
抗体の適定量を得る目的で標準化量を試験する。これは
試験抗血清によって結合した放射性抗原の相対的量を測
定しそしてこの量を試験抗血清として同一希釈の対照抗
血清によって結合した量と比較して行われる。
キューリー／マイクログラムの特殊な活性に、この技術
で知られた種々の方法の一つによって標示することがで
き、その方法は例えばラクトペルオキシドース、クロル
アミン−Ｔ標示、またはＩｏｄｏｇｅｎ〔Ｆｒａｋｅ
ｒ，Ｐ．Ｊ．＆Ｊ．Ｃ．Ｓｐｅｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０，８４９
（１９７８）〕である。標示した蛋白は未反応遊離
１２５Ｉからゲル濾過によって分離することができる。
１２５Ｉ−標示均質糖蛋白質、例えば１２５Ｉ−ＢＧＰ
をベースとする好ましい免疫試験は競争的放射線免疫試
験である。競争的放射線免疫試験の原理は標示抗原が非
標示抗原と血清中の抗体の同一結合部分で争うことであ
る。例えば次を参照のこと：Ｋａｂａｔ，Ｅ（１９７
６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｓｔｒｙＨｏｌｔ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｗｉｎｓｔｏ
ｎ。抗体−抗原錯体の遊離抗原からの分離は結合した抗
原の量の測定を可能にする。この周知の検査は多くの変
化があり、例えば、何れの非標示抗原が標示抗原に対し
最大の類似性を有するかを測定するために種々の非標示
抗原を試験する。他の変化は標準化した放射線標示のお
よび非標示の抗原を、多数の試験血清の多数の希釈物の
それぞれからの試料に対して、何れかの血清中の特殊な
抗体の適定量を得る目的で標準化量を試験する。これは
試験抗血清によって結合した放射性抗原の相対的量を測
定しそしてこの量を試験抗血清として同一希釈の対照抗
血清によって結合した量と比較して行われる。
【００４３】本発明の範囲に入る変化はまたフルオロゲ
ン、クロマトフォア、発光物質または酵素のような糖蛋
白質に対する非−放射性付箋を使用する競争的放射線免
疫検査を含む。遊離抗原から抗体−抗原錯体を分離する
ための多くの方法がこの技術では知られている。例えば
本発明の均質ＢＧＰに利用しうる一つの方法は固相、サ
ンドイッチ型免疫試験である。この方法では、好ましく
は容易に鋏で切ることができそして円底溜めを有する物
質でつくったマイクロ滴定板を各溜の中に約２マイクロ
グラムの均質ＢＧＰを約２００マイクロ立の水性緩衝塩
溶液と共に一晩おいて被覆した。最も好適にはこの段階
は乾燥を防ぐために湿った部屋で行う。
ン、クロマトフォア、発光物質または酵素のような糖蛋
白質に対する非−放射性付箋を使用する競争的放射線免
疫検査を含む。遊離抗原から抗体−抗原錯体を分離する
ための多くの方法がこの技術では知られている。例えば
本発明の均質ＢＧＰに利用しうる一つの方法は固相、サ
ンドイッチ型免疫試験である。この方法では、好ましく
は容易に鋏で切ることができそして円底溜めを有する物
質でつくったマイクロ滴定板を各溜の中に約２マイクロ
グラムの均質ＢＧＰを約２００マイクロ立の水性緩衝塩
溶液と共に一晩おいて被覆した。最も好適にはこの段階
は乾燥を防ぐために湿った部屋で行う。
【００４４】次いで溜めをアスピレーターで空になし、
少なくとも１回水性緩衝塩で洗いそして水性緩衝塩中の
蛋白質担体の溶液で充たす。蛋白質担体は溜めの内部、
または固相の始めの段階で添加した精製したＢＧＰによ
って結合しなかった何れの部位もブロックする。溜めを
被覆するために使用する蛋白質担体の典型的溶液は、例
えば約０．０５％から約０．２％までの範囲の濃度範囲
のゼラチン、やぎの血清アルブミン、免の血清アルブ
ム、または卵黄アルブミンである。この試験においては
牛の血清アルブミンは蛋白質担体として使用すべきでは
ないなぜなればそれは均質性牛の糖蛋白質への特殊の結
合を防げるかも知れないからである。板は担体溶液を少
なくとも１時間置き溜めの均一な被覆を得るために静か
にかきまぜまたは混合する。溜めはアスピレーションに
よって再び空になし水性緩衝塩によって２−５回、好ま
しくは３回洗い、次いで約２００マイクロリッターの適
当に希釈した血清試料を各溜めに加える。この段階は抗
原を特殊の抗体に結合する。板は抗体抗原と平衡させる
ために例えば室温で一晩、好ましくは湿った部屋の中で
乾燥を防ぎながら置く。
少なくとも１回水性緩衝塩で洗いそして水性緩衝塩中の
蛋白質担体の溶液で充たす。蛋白質担体は溜めの内部、
または固相の始めの段階で添加した精製したＢＧＰによ
って結合しなかった何れの部位もブロックする。溜めを
被覆するために使用する蛋白質担体の典型的溶液は、例
えば約０．０５％から約０．２％までの範囲の濃度範囲
のゼラチン、やぎの血清アルブミン、免の血清アルブ
ム、または卵黄アルブミンである。この試験においては
牛の血清アルブミンは蛋白質担体として使用すべきでは
ないなぜなればそれは均質性牛の糖蛋白質への特殊の結
合を防げるかも知れないからである。板は担体溶液を少
なくとも１時間置き溜めの均一な被覆を得るために静か
にかきまぜまたは混合する。溜めはアスピレーションに
よって再び空になし水性緩衝塩によって２−５回、好ま
しくは３回洗い、次いで約２００マイクロリッターの適
当に希釈した血清試料を各溜めに加える。この段階は抗
原を特殊の抗体に結合する。板は抗体抗原と平衡させる
ために例えば室温で一晩、好ましくは湿った部屋の中で
乾燥を防ぎながら置く。
【００４５】溜めは三度目のアスピレーションで空にな
し５回洗い、次いで約１０，０００ｃｐｍ（１分間のカ
ウント数）の１２５Ｉ−均質ＢＧＰを適宜担蛋白質中で
希釈したものを（例えば水性緩衝塩中の０．１％卵黄ア
ルブミン）各溜めに加え全量で約２００マイクロリッタ
ーにする。一晩おく間に放射線標示蛋白質をなお抗原に
対して利用できる抗体上の結合部位と平衡させる。各溜
め中の内容物を四度目のアスピレーションで取出し、そ
して各溜めを少なくとも３回水性緩衝塩で洗う。プレー
トを６時間風乾し、次いでそれらの溜めを鋏で切り離
し、そして放射能を通例のカウンターで数える。１２５
Ｉに対しては１分間のカウントが合理的正確度に対して
通常充分である。
し５回洗い、次いで約１０，０００ｃｐｍ（１分間のカ
ウント数）の１２５Ｉ−均質ＢＧＰを適宜担蛋白質中で
希釈したものを（例えば水性緩衝塩中の０．１％卵黄ア
ルブミン）各溜めに加え全量で約２００マイクロリッタ
ーにする。一晩おく間に放射線標示蛋白質をなお抗原に
対して利用できる抗体上の結合部位と平衡させる。各溜
め中の内容物を四度目のアスピレーションで取出し、そ
して各溜めを少なくとも３回水性緩衝塩で洗う。プレー
トを６時間風乾し、次いでそれらの溜めを鋏で切り離
し、そして放射能を通例のカウンターで数える。１２５
Ｉに対しては１分間のカウントが合理的正確度に対して
通常充分である。
【００４６】以下の実施例はさらに本発明の生成物を説
明する。下記の実施例においては糖蛋白質はＢＧＰ、Ｈ
ＧＰまたはＳＧＰの何れでもよい。
明する。下記の実施例においては糖蛋白質はＢＧＰ、Ｈ
ＧＰまたはＳＧＰの何れでもよい。
【００４７】実施例１ 血液からヘモグロビンを含まない肉基質の製造 新鮮な血液をと殺時の羊および馬から抗凝固剤シトラー
ト−デキストロース溶液中で静脈穿刺によって集めた。
血液は約２４時間４℃に保ちそして約２５００ＲＰＭで
約２０分間遠心分離してペレット赤血球にした。上澄お
よび中間細胞層を除去した。赤血球を冷たい０．１２Ｍ
ＮａＣｌ、０．０５燐酸ナトリウム緩衝液の約ｐＨ７．
４の同量のもので３回洗った。各洗滌段階において、細
胞は緩衝液中に懸濁させ、次いで約２５００ＲＰＭにお
いて約２０分間遠心分離した。遠心分離後、懸濁剤およ
び残留軟膜をアスピレートした。この手順を三回繰り返
しその結果軟膜除去のために赤血球の全容量は２５％損
失した。
ト−デキストロース溶液中で静脈穿刺によって集めた。
血液は約２４時間４℃に保ちそして約２５００ＲＰＭで
約２０分間遠心分離してペレット赤血球にした。上澄お
よび中間細胞層を除去した。赤血球を冷たい０．１２Ｍ
ＮａＣｌ、０．０５燐酸ナトリウム緩衝液の約ｐＨ７．
４の同量のもので３回洗った。各洗滌段階において、細
胞は緩衝液中に懸濁させ、次いで約２５００ＲＰＭにお
いて約２０分間遠心分離した。遠心分離後、懸濁剤およ
び残留軟膜をアスピレートした。この手順を三回繰り返
しその結果軟膜除去のために赤血球の全容量は２５％損
失した。
【００４８】実施例２ 均質糖蛋白質の単離および精製 洗った赤血球を９容量の０．００５Ｍ燐酸ナトリウムに
約８．０のｐＨでとかした。細胞膜は１３，０００×ｇ
で４５分間４℃において遠心分離してペレット化した。
上澄を吸収して捨てた。細胞膜層は次いで赤色ペレット
から傾瀉した。上記の手順を細胞がクリーム白になるま
でくり返した。細胞膜は還流下でアセトン、無水アルコ
ールおよび７５％エタノールによって逐次抽出した。７
５％エタノール抽出液を少量になるまで真空蒸溜によっ
て濃縮し、透析しそして凍結乾燥した。これは粗抽出物
でこれを一連の段階でさらに精製した。７５％エタノー
ル抽出物をエタノールから沈澱させ、次いで０．０２Ｍ
くえん酸ナトリウムにｐＨ４．１でとかしそして同一緩
衝液で平衡化し溶出させたフォスフォセルロースカラム
に入れた。カラム流出液はシアリン酸、ヘキソースおよ
び２８０ナノメーターにおいて光学密度を監視した。シ
アリン酸は空になるときに現われそして透析した。水中
の２ｍｇ／ｍｌの濃度で糖蛋白質を３０分間０℃で５容
量のジエチルエーテル：エタノール（４：１ｖ／ｖ）と
共に混合した。水性相を凍結乾燥しそして再度ジエチル
エーテル：エタノールで抽した。１０ｍｇ／ｍｌの水
中の濃度で糖蛋白質を９容量のクロロホルム：メタノー
ル（２：１ｖ／ｖ）によって３０分間２３℃において抽
出しそして２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。水
性層を凍結乾燥しそして０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
で１％のＥｍｕｌｐｈｏｇｅｎｅ ＢＣ−７２０（ＧＡ
Ｆ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）を含む緩衝液にとかし
そして０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０
で平衡させたＷｈａｔｍａｎ ＤＥ−５２セルロース
カラム中に入れた。カラムは０．０→０．５Ｍ ＮａＣ
ｌに漸増する緩衝液で溶出した。精製した糖蛋白質は単
一ピークとして溶出されそして透析しそして凍結乾燥し
た。
約８．０のｐＨでとかした。細胞膜は１３，０００×ｇ
で４５分間４℃において遠心分離してペレット化した。
上澄を吸収して捨てた。細胞膜層は次いで赤色ペレット
から傾瀉した。上記の手順を細胞がクリーム白になるま
でくり返した。細胞膜は還流下でアセトン、無水アルコ
ールおよび７５％エタノールによって逐次抽出した。７
５％エタノール抽出液を少量になるまで真空蒸溜によっ
て濃縮し、透析しそして凍結乾燥した。これは粗抽出物
でこれを一連の段階でさらに精製した。７５％エタノー
ル抽出物をエタノールから沈澱させ、次いで０．０２Ｍ
くえん酸ナトリウムにｐＨ４．１でとかしそして同一緩
衝液で平衡化し溶出させたフォスフォセルロースカラム
に入れた。カラム流出液はシアリン酸、ヘキソースおよ
び２８０ナノメーターにおいて光学密度を監視した。シ
アリン酸は空になるときに現われそして透析した。水中
の２ｍｇ／ｍｌの濃度で糖蛋白質を３０分間０℃で５容
量のジエチルエーテル：エタノール（４：１ｖ／ｖ）と
共に混合した。水性相を凍結乾燥しそして再度ジエチル
エーテル：エタノールで抽した。１０ｍｇ／ｍｌの水
中の濃度で糖蛋白質を９容量のクロロホルム：メタノー
ル（２：１ｖ／ｖ）によって３０分間２３℃において抽
出しそして２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。水
性層を凍結乾燥しそして０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
で１％のＥｍｕｌｐｈｏｇｅｎｅ ＢＣ−７２０（ＧＡ
Ｆ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）を含む緩衝液にとかし
そして０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０
で平衡させたＷｈａｔｍａｎ ＤＥ−５２セルロース
カラム中に入れた。カラムは０．０→０．５Ｍ ＮａＣ
ｌに漸増する緩衝液で溶出した。精製した糖蛋白質は単
一ピークとして溶出されそして透析しそして凍結乾燥し
た。
【００４９】実施例３ 赤血球糖蛋白質−ラテックス ビーズ試薬 実施例２のようにして単離した精製赤血球糖蛋白質を
０．４５５ミクロン平均直径のカルボキシル−変性均質
ラテックス粒子（Ｄｏｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の
水中０．２５％懸濁物とカプルさせた。混合物をｐＨを
５±１に保ちながら２２−２５℃においてかきまぜた。
次いで新たに最少量の水にとかした１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒド
ロクロリトドを加えて最終濃度を０．１Ｍとした。ｐＨ
を５．５に１時間保ち、そして混合物を２２−２５℃で
１８時間かきまぜた。粒子は０．１Ｍグリシン、０．１
５ＭＮａＣｌ、７ｍＭＣａＣｌ２（ＧＢＳ）を含む緩衝
液でｐＨ４．０においてそして次にｐＨ８．０で交互に
洗いそして２回蒸溜水で洗った。各洗浄の間に粒子は１
７，０００×ｇで２０分間遠心分離した。糖蛋白質ラテ
ックス ビーズ試薬は次いでＧＢＳ中１％濃度にｐＨ
８．３にうすめそして４℃で貯えた。使用前に試薬は
０．２５％にＧＢＳでうすめた。
０．４５５ミクロン平均直径のカルボキシル−変性均質
ラテックス粒子（Ｄｏｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の
水中０．２５％懸濁物とカプルさせた。混合物をｐＨを
５±１に保ちながら２２−２５℃においてかきまぜた。
次いで新たに最少量の水にとかした１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒド
ロクロリトドを加えて最終濃度を０．１Ｍとした。ｐＨ
を５．５に１時間保ち、そして混合物を２２−２５℃で
１８時間かきまぜた。粒子は０．１Ｍグリシン、０．１
５ＭＮａＣｌ、７ｍＭＣａＣｌ２（ＧＢＳ）を含む緩衝
液でｐＨ４．０においてそして次にｐＨ８．０で交互に
洗いそして２回蒸溜水で洗った。各洗浄の間に粒子は１
７，０００×ｇで２０分間遠心分離した。糖蛋白質ラテ
ックス ビーズ試薬は次いでＧＢＳ中１％濃度にｐＨ
８．３にうすめそして４℃で貯えた。使用前に試薬は
０．２５％にＧＢＳでうすめた。
【００５０】実施例４ 糖蛋白ラテックス カプル ビーズによるラテックス
スライド試験 実施例３の糖蛋白質−ラテックス ビーズ試薬を血清学
的リング スライド、７．９×１２．１ｃｍ（Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で行ったラテック
ス試験に使用した。血清の試験区域の二重希釈をＧＢＳ
（ｐＨ８．３）中で行った。次に各血清希釈液１滴をス
ライド状のセラミックリング内で糖蛋白ラテックス ビ
ーズ試薬１滴に加える。このスライドをトーマス クリ
ニカルローテイターで２２〜２５℃で５分間１５００Ｒ
ＰＭで回転する。凝集を顕微鏡検査によって測定する。
滴定の終末は対照のラテックス懸濁液に比較して目に見
えるクランプを与える血清の最大希釈と考えた。
スライド試験 実施例３の糖蛋白質−ラテックス ビーズ試薬を血清学
的リング スライド、７．９×１２．１ｃｍ（Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で行ったラテック
ス試験に使用した。血清の試験区域の二重希釈をＧＢＳ
（ｐＨ８．３）中で行った。次に各血清希釈液１滴をス
ライド状のセラミックリング内で糖蛋白ラテックス ビ
ーズ試薬１滴に加える。このスライドをトーマス クリ
ニカルローテイターで２２〜２５℃で５分間１５００Ｒ
ＰＭで回転する。凝集を顕微鏡検査によって測定する。
滴定の終末は対照のラテックス懸濁液に比較して目に見
えるクランプを与える血清の最大希釈と考えた。
【００５１】例５ １２５Ｉで標識した精製糖蛋白 例２からの精製糖蛋白１００ミクログラムを１２５Ｉ
１００マイクロキューリーで標識する。０．４マイクロ
グラムの１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ，６ａ−
ジフェニルグリコールウリル（ＩＩａ）（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉ１１）を
含有するメチレン クロリド溶液２０マイクロリッター
部を試験管にいれ、試験管を３７℃の浴で回転させてメ
チレンクロリドを蒸発させると底部にＩＩの薄いフィル
ムが形成する。もう一つの試験管にｐＨ８．２ボレート
−サラインバッファー中で精製糖蛋白１００マイクログ
ラム、ヨウ化カリウム０．１１マイクログラムおよび
１２５Ｉ １００マイクロキューリーを加える。この混
合物の最終容量をボレート−サラインバッファで１００
μｌに調整する。試験管を０〜２℃にした後、糖蛋白溶
液をＩＩａを含む試験に移して反応を開始する。０〜２
℃でおだやかに攪拌しながら５分間反応を進める。残留
グリコールウリルからこの混合物をデカントして反応を
止める。ヨウ素化の効率を測定するため５マイクロリッ
ターの反応混合物を１０マイクロリッターのボレート−
サライン中で０．１ｍｇの牛血清アルブミンと混合さ
せ、次いで１ｍｌ冷１０％トリクロル酢酸と混合する。
３０分間０〜２°に放置した後この混合物を遠心分離す
る。ペレットを１ｍｌの新しい１０％トリクロル酢酸と
混合し、この混合物を再び遠心分離する。次に蛋白沈殿
物を１ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウムに溶かす。この
標識された蛋白をセファデックスＧ−５０カラムクロマ
トグラフィーにより遊離のヨウ素と分ける。比放射能は
１マイクログラム糖蛋白当たり１マイクロキューリーで
ある。
１００マイクロキューリーで標識する。０．４マイクロ
グラムの１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ，６ａ−
ジフェニルグリコールウリル（ＩＩａ）（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉ１１）を
含有するメチレン クロリド溶液２０マイクロリッター
部を試験管にいれ、試験管を３７℃の浴で回転させてメ
チレンクロリドを蒸発させると底部にＩＩの薄いフィル
ムが形成する。もう一つの試験管にｐＨ８．２ボレート
−サラインバッファー中で精製糖蛋白１００マイクログ
ラム、ヨウ化カリウム０．１１マイクログラムおよび
１２５Ｉ １００マイクロキューリーを加える。この混
合物の最終容量をボレート−サラインバッファで１００
μｌに調整する。試験管を０〜２℃にした後、糖蛋白溶
液をＩＩａを含む試験に移して反応を開始する。０〜２
℃でおだやかに攪拌しながら５分間反応を進める。残留
グリコールウリルからこの混合物をデカントして反応を
止める。ヨウ素化の効率を測定するため５マイクロリッ
ターの反応混合物を１０マイクロリッターのボレート−
サライン中で０．１ｍｇの牛血清アルブミンと混合さ
せ、次いで１ｍｌ冷１０％トリクロル酢酸と混合する。
３０分間０〜２°に放置した後この混合物を遠心分離す
る。ペレットを１ｍｌの新しい１０％トリクロル酢酸と
混合し、この混合物を再び遠心分離する。次に蛋白沈殿
物を１ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウムに溶かす。この
標識された蛋白をセファデックスＧ−５０カラムクロマ
トグラフィーにより遊離のヨウ素と分ける。比放射能は
１マイクログラム糖蛋白当たり１マイクロキューリーで
ある。
【００５２】例６ 糖蛋白放射免疫検定 この固層サンドイッチタイプ免疫検定は、例２の均一な
糖蛋白を用いる。ポリスチレンミクロタイプ−プレート
（Ｖ−ｂｏｔｔｏｍ，Ｃｏｏｋｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のウエルをホスフェート
２００マイクロリッターのホスフェートバッファー サ
ライン（ＰＢＳ）中精製糖蛋白２マイクログラムでイン
キュベートすることにより精製糖蛋白で被覆する。この
プレートを湿った部屋の中で２２〜２５℃で一夜インキ
ュベートする。ウエルをアスピレーションによって空に
しＰＢＳ中で３回洗浄する。次にこのウエルにＰＢＳ中
の０．１％ゼラチンを満たし、コルテイス ラボラトリ
ーズ ミクロミキサーで１時間２２〜２５℃でインキュ
ベートする。次にアスピレーションによりウエルを空に
しＰＢＳ中で３回洗浄する。各ウエルに２００マイクロ
リッターの適当に希釈した血清を加える。プレートを湿
った部屋の中で２２〜２５℃で一夜インキュベートす
る。ウエルを空にして２リットルのＰＢＳ中で攪拌しな
がら洗浄する。ＰＢＳ中で攪拌しながら洗浄する。ＰＢ
Ｓ中０．０５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）中で適当に
希釈した１２５Ｉ−標式赤血球糖蛋白を２００マイクロ
リッターの容量で各ウエルに加える。プレートを一夜イ
ンキュベートする。各ウエルの内容物をアスピレート
し、ＰＢＳで３回洗浄する。プレートを風乾する。各ウ
エルをはさみで切断し、放射能をガンマー シンチレー
ション カウンター中で測定する。
糖蛋白を用いる。ポリスチレンミクロタイプ−プレート
（Ｖ−ｂｏｔｔｏｍ，Ｃｏｏｋｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のウエルをホスフェート
２００マイクロリッターのホスフェートバッファー サ
ライン（ＰＢＳ）中精製糖蛋白２マイクログラムでイン
キュベートすることにより精製糖蛋白で被覆する。この
プレートを湿った部屋の中で２２〜２５℃で一夜インキ
ュベートする。ウエルをアスピレーションによって空に
しＰＢＳ中で３回洗浄する。次にこのウエルにＰＢＳ中
の０．１％ゼラチンを満たし、コルテイス ラボラトリ
ーズ ミクロミキサーで１時間２２〜２５℃でインキュ
ベートする。次にアスピレーションによりウエルを空に
しＰＢＳ中で３回洗浄する。各ウエルに２００マイクロ
リッターの適当に希釈した血清を加える。プレートを湿
った部屋の中で２２〜２５℃で一夜インキュベートす
る。ウエルを空にして２リットルのＰＢＳ中で攪拌しな
がら洗浄する。ＰＢＳ中で攪拌しながら洗浄する。ＰＢ
Ｓ中０．０５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）中で適当に
希釈した１２５Ｉ−標式赤血球糖蛋白を２００マイクロ
リッターの容量で各ウエルに加える。プレートを一夜イ
ンキュベートする。各ウエルの内容物をアスピレート
し、ＰＢＳで３回洗浄する。プレートを風乾する。各ウ
エルをはさみで切断し、放射能をガンマー シンチレー
ション カウンター中で測定する。
【００５３】例７ Ｅ−ロゼット（Ｒｏｓｅｔｔｅ）阻止検定 ヒトリンパ球を末梢ペパリン化静脈血のサンプルから単
離する。リンパ球をグラジエント遠心分離によって単離
する。このリンパ球単離はＲＰＭＩメジウム、上記のリ
ンパ球分離メジウム（ＬＳＭ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ）で１：２に希釈した血液を層化することに
より行なう。試験管を約４００×ｇで約４５分間遠心分
離する。単核細胞をインターフェースから集め洗浄し、
計数する。種々の量の糖蛋白を末梢血液リンパ球と約２
０℃で約３０分間インキュベートする。次に洗浄した羊
の赤血球を赤血球：末梢血液リンパ球が４０：１になる
ように加える。この混合物を約２０℃で約５分間約２０
０×ｇで遠心分離し、ロゼットを計数する前に約４０℃
で一夜インキュベートする。１個のリンパ球に付着した
３個またはそれ以上の赤血球を１ロゼットと見做した。
本発明はその特定の具体例について記述されたが、さら
に種々の態様が考えられる。本願は一般に本発明の種々
の応用、用途もしくは適用を含むものと理解されるべき
である。
離する。リンパ球をグラジエント遠心分離によって単離
する。このリンパ球単離はＲＰＭＩメジウム、上記のリ
ンパ球分離メジウム（ＬＳＭ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ）で１：２に希釈した血液を層化することに
より行なう。試験管を約４００×ｇで約４５分間遠心分
離する。単核細胞をインターフェースから集め洗浄し、
計数する。種々の量の糖蛋白を末梢血液リンパ球と約２
０℃で約３０分間インキュベートする。次に洗浄した羊
の赤血球を赤血球：末梢血液リンパ球が４０：１になる
ように加える。この混合物を約２０℃で約５分間約２０
０×ｇで遠心分離し、ロゼットを計数する前に約４０℃
で一夜インキュベートする。１個のリンパ球に付着した
３個またはそれ以上の赤血球を１ロゼットと見做した。
本発明はその特定の具体例について記述されたが、さら
に種々の態様が考えられる。本願は一般に本発明の種々
の応用、用途もしくは適用を含むものと理解されるべき
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 7055−2Ｊ 33/543 Ｂ 7906−2Ｊ 33/68
Claims (16)
- 【請求項１】 馬の糖蛋白質のアミノ酸組成が８．１モ
ル％のアスパラギン酸、１０．６モル％のトレオニン、
１０．８モル％のセリン、９．４モル％のグルタミン
酸、１２．３モル％のプロリン、９．２モル％のグリシ
ン、１１．３モル％のアラニン、４．４モル％のバリ
ン、０．８モル％のメチオニン、３．５モル％のイソロ
イシン、８．２モル％のロイシン、１．１モル％のチロ
シン、２．９モル％のフェニルアラニン、１．２モル％
のヒスチジン、１．３モル％のリジンおよび４．８％の
アルギニンであり、そして羊の糖蛋白質のアミノ酸組成
が５．６モル％のアスパラギン酸、８．１モル％のトレ
オニン、１２．９モル％のセリン、１３．０モル％のグ
ルタミン酸、１１．６モル％のプロリン、７．７モル％
のグリシン、９．６モル％のアラニン、６．２モル％の
バリン、０．５モル％のメチオニン、４．６モル％のイ
ソロイシン、８．３モル％のロイシン、１．６モル％の
チロシン、１．２モル％のフェニルアラニン、１．６モ
ル％のヒスチジン、３．２モル％のリジン、４．０モル
％のアルギニン、および０．３モル％のトリプトフアン
である馬および羊の赤血球糖蛋白質から成る群から選ば
れる哺乳類の糖蛋白質。 - 【請求項２】 アミノ酸組成が８．１モル％のアスパラ
ギン酸、１０．６モル％のトレオニン、１０．８モル％
のセリン、９．４モル％のグルタミン酸、１２．３モル
％のプロリン、９．２モル％のグリシン、１１．３モル
％のアラニン、４．４モル％のバリン、０．８モル％の
メチオニン、３．５モル％のイソロイシン、８．２モル
％のロイシン、１．１モル％のチロシン、２．９モル％
のフェニルアラニン、１．２モル％のヒスチジン、１．
３モル％のリジンおよび４．８モル％のアルギニンであ
る馬の糖蛋白質である特許請求の範囲第（１）項に記載
の糖蛋白質。 - 【請求項３】 アミノ酸組成が５．６モル％のアスパラ
ギン酸、８．１モル％のトレオニン、１２．９モル％の
セリン、１３．０モル％のグルタミン酸、１１．６モル
％のプロリン、７．７モル％のグリシン、９．６モル％
のアラニン、６．２モル％のバリン、０．５モル％のメ
チオニン、４．６モル％のイソロイシン、８．３モル％
のロイシン、１．６モル％のチロシン、１．２モル％の
フェニルアラニン、１．６モル％のヒスチジン、３．２
モル％のリジン、４．０モル％のアルギニン、および
０．３モル％のトリプトフアンである羊の糖蛋白質であ
る特許請求の範囲第（１）項に記載の糖蛋白質。 - 【請求項４】 １分子につき２８％のＮ−グリコリノイ
ラミン酸、１分子につき１１％のガラクトース、１分子
につき１４％のＮ−アセチル−ガラクトースアミン、１
分子につき１％のＮ−アセチルグルコースアミンおよび
１分子につき１％のマンノースの組成で、５５％の炭水
化物残余物を含むシアロ糖蛋白質である特許請求の範囲
第（２）項に記載の糖蛋白質。 - 【請求項５】 １分子につき１６．７％のシアル酸、１
分子につき９％のガラクトース、１分子につき１３．７
％のＮ−アセチルガラクトースアミン、１分子につき１
４．４％のＮ−アセチルグルコースアミンおよび１分子
につき１．７％のマンノースの組成で、５６．６％の炭
水化物残余物を含むシアロ糖蛋白質である特許請求の範
囲第（３）項に記載の糖蛋白質。 - 【請求項６】 （ａ）赤血球由来の乾燥した、磨砕した
ヘモグロビンを含まない間質を無水アセトン中に均一に
懸濁させ； （ｂ）１時間から６時間還流させ、濾過しそして残渣を
乾かし； （ｃ）１００％の無水エタノール中に前記の乾燥した残
渣を懸濁させ； （ｄ）１時間から６時間還流させ、濾過しそして残渣を
乾かし； （ｅ）（ｄ）工程からの乾燥残渣を５０％から８０％ま
での濃度の水性エタノール中に懸濁させそして（ｂ）工
程を反復し； （ｆ）（ｅ）工程からの残差を水に溶かしそして９０％
の水性エタノールを加え、続いて氷上で結晶化が起こる
までインキュベートし、遠心分離しそして固体層を低ｐ
Ｈ、低イオン濃度の緩衝液に対して透析し； （ｇ）（ｆ）工程からの固体をクロマトグラフ カラム
上でカチオン交換樹脂に通し； （ｈ）シアル酸含有分画をカラムから集めそしてこれを
乾かし； （ｉ）（ｈ）工程からの集めた分画を既知の脂質溶剤に
よって抽出して処理し、遠心分離し、水性層を集めそし
てこれを乾かし； （ｊ）別の脂質溶剤を使用して（ｉ）工程の生成物につ
いて（ｉ）工程を反復し、そして （ｋ）特許請求の範囲第（１）、（２）または（３）項
に記載の生成物を凍結乾燥した形で採取する；工程から
なる特許請求の範囲第（１）、（２）または（３）項の
何れか一つの項に記載の糖蛋白質を製造する方法。 - 【請求項７】 カチオン交換樹脂がホスホセルロースで
ある特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。 - 【請求項８】 （ｉ）工程の脂質溶剤が４：１と１：１
の間の容量比のジエチル エーテルおよびエタノールで
ある特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。 - 【請求項９】 （ｊ）工程の脂質溶剤が２：１の容量比
のクロロホルムおよびメタノールである特許請求の範囲
第（６）項に記載の方法。 - 【請求項１０】 （ｅ）工程の溶剤が７５％水性エタノ
ールである特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。 - 【請求項１１】 （ａ）特許請求の範囲第（１）、
（２）または（３）項の何れか一つの項に記載の糖蛋白
質を１％の中性洗浄剤を含む低イオン濃度の緩衝液に溶
かし； （ｂ）この溶液をアニオン交換クロマトグラフカラムに
かけ； （ｃ）低イオン濃度緩衝液で充分洗い； （ｄ）高塩濃度の水性緩衝液によってカラムを溶離し、
そして （ｅ）（ｄ）工程の生成物を水に対して透析しそして特
許請求の範囲第（４）または（５）項に記載の生成物を
凍結乾燥した形で採取する；工程からなる特許請求の範
囲第（４）または（５）項の何れか一つの項に記載の糖
蛋白質を製造する方法。 - 【請求項１２】 （ａ）ラテックスまたは合成樹脂の微
細粒子に特許請求の範囲第（１）、（２）、（３）、
（４）または（５）項の何れか一つの項に記載の糖蛋白
質を付加し； （ｂ）この（ａ）工程からの粒子によって平らな表面を
被覆し； （ｃ）感染性単核症が潜伏する疑いのある患者からの生
物学的試験液体の希釈試料を加え、平らな表面を回転さ
せ； （ｄ）試料の凝集反応の程度を観察し；そして （ｅ）（ｄ）工程の結果を、既知量の感染性単核症異好
性抗体を含む標準品を（ａ）か（ｄ）まで列挙した手順
の（ｃ）工程の試料と置き換えた場合に観察される擬集
の程度と比較する；工程からなる感染性単核症を診断す
る方法。 - 【請求項１３】 放射性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｏ
ｇｅｎ）、発色団、酵素、発光物質および免疫検定法で
使用するその他の既知の標識から成る群から選ばれる標
識を含む特許請求の範囲第（１）、（２）、（３）、
（４）または（５）項に記載の糖蛋白質。 - 【請求項１４】 標示が１２５Ｉである特許請求の範囲
第（１３）項に記載の標示をつけた糖蛋白質。 - 【請求項１５】 試験液体試料中に存在する人の感染性
単核症の異好性抗体の量を測定する放射線免疫検査方法
において、前記の抗体に対する抗原が、特許請求の範囲
第（１４）項に記載の標識した糖蛋白質である方法。 - 【請求項１６】 放射線免疫検査がサンドイッチ型であ
る特許請求の範囲第（１５）項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24793481A | 1981-03-26 | 1981-03-26 | |
| US06/343,235 US4525459A (en) | 1982-01-27 | 1982-01-27 | New purified glycoproteins and use in diagnosing infectious mononucleosis |
| US343235 | 1982-03-09 | ||
| US356348 | 1982-03-09 | ||
| US06/356,348 US4460694A (en) | 1981-03-26 | 1982-03-09 | Bovine glycoproteins and use in diagnosing infectious mononucleosis |
| US247934 | 1994-05-24 |
Related Parent Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP57048786A Division JPH0735397B2 (ja) | 1981-03-26 | 1982-03-26 | 哺乳類の糖蛋白質 |
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|---|---|
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Family
ID=27400082
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57048786A Expired - Lifetime JPH0735397B2 (ja) | 1981-03-26 | 1982-03-26 | 哺乳類の糖蛋白質 |
| JP21671391A Pending JPH05194599A (ja) | 1981-03-26 | 1991-03-04 | 哺乳類の糖蛋白質 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57048786A Expired - Lifetime JPH0735397B2 (ja) | 1981-03-26 | 1982-03-26 | 哺乳類の糖蛋白質 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JPH0735397B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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