JPH0735397B2 - 哺乳類の糖蛋白質 - Google Patents
哺乳類の糖蛋白質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は牛、馬および羊のような哺乳類からの精製した
赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好抗体の検出に
対する免疫検査におけるこれら製剤の使用およびロゼツ
テ リンパ球（rosettinglymphocytes）の算出に対する
安定な標準化しうる試薬の製造におけるこれらの糖蛋白
質類の有用性に関する。
赤血球細胞膜糖蛋白質、感染性単核症異好抗体の検出に
対する免疫検査におけるこれら製剤の使用およびロゼツ
テ リンパ球（rosettinglymphocytes）の算出に対する
安定な標準化しうる試薬の製造におけるこれらの糖蛋白
質類の有用性に関する。
免疫学的診断における試みまたは感染性単核症の経路監
視がこれまで全赤血球画分の使用を重要視してきた。赤
血球は多くの異つた細胞膜蛋白質を含むことが知られて
おり、それらはそれぞれ一つまたは一つ以上の異なる抗
体と反応性である〔Marchesi,V.T.,H.Furthmayr and M.
Tomita,Ann.Rev.Biochem.45,657698（1976）〕、全赤血
球、または粗赤血球画分は、多くのIM（感染性単核症）
とは無関係のものを含めて、広く異なる特性を有する抗
体によつて凝集反応を起すであろうから、正の誤りが問
題であつた。正の誤りの回避は有効かつ信頼しうる臨床
診断に対しては明らかに重要である。本発明は、その望
ましい形において、牛の均質な糖蛋白質を含み、それら
の総てはそれらが均質であるためにIM抗体に対して大き
な特異性と敏感性を有する。
視がこれまで全赤血球画分の使用を重要視してきた。赤
血球は多くの異つた細胞膜蛋白質を含むことが知られて
おり、それらはそれぞれ一つまたは一つ以上の異なる抗
体と反応性である〔Marchesi,V.T.,H.Furthmayr and M.
Tomita,Ann.Rev.Biochem.45,657698（1976）〕、全赤血
球、または粗赤血球画分は、多くのIM（感染性単核症）
とは無関係のものを含めて、広く異なる特性を有する抗
体によつて凝集反応を起すであろうから、正の誤りが問
題であつた。正の誤りの回避は有効かつ信頼しうる臨床
診断に対しては明らかに重要である。本発明は、その望
ましい形において、牛の均質な糖蛋白質を含み、それら
の総てはそれらが均質であるためにIM抗体に対して大き
な特異性と敏感性を有する。
感染性単核症の免疫学的診断は1932年にPaulおよびBunn
elによつてAmer.Ｊ.Med,Sci.183,90−104（1932）中に
始めて報告された。彼等は羊のような種からの赤い血液
細胞または赤血球は活性感染性単核症を有する患者から
の血清中に含まれるIM異好（heterophile）抗体によつ
て凝集反応を起すことができることを教えた。これらの
異好抗体を検出するための多くの試験が引続き展開され
た、例えば次のものを参照のこと：米国特許第3,426,12
3号および第3,708,572号。
elによつてAmer.Ｊ.Med,Sci.183,90−104（1932）中に
始めて報告された。彼等は羊のような種からの赤い血液
細胞または赤血球は活性感染性単核症を有する患者から
の血清中に含まれるIM異好（heterophile）抗体によつ
て凝集反応を起すことができることを教えた。これらの
異好抗体を検出するための多くの試験が引続き展開され
た、例えば次のものを参照のこと：米国特許第3,426,12
3号および第3,708,572号。
そのうちに患者の血清のモルモツトの腎臓による予備培
養はいわゆるフオルスマン（Forssman）抗体を吸収しま
たは析出したと報告され、偏在する抗体は異好抗体の検
出を妨げた〔Davidson,I＆P.H.Walker,Amer.Ｊ.Clin.Pa
thol.5,455−65（1935）〕。モルモツト腎臓によるIMの
吸収または予備培養は凝集反応試験の特異性を増したが
凝集反応が開始する前に吸収段階を必要とした（参照、
例えば、米国特許第3,959,456および3,864,467各号）。
養はいわゆるフオルスマン（Forssman）抗体を吸収しま
たは析出したと報告され、偏在する抗体は異好抗体の検
出を妨げた〔Davidson,I＆P.H.Walker,Amer.Ｊ.Clin.Pa
thol.5,455−65（1935）〕。モルモツト腎臓によるIMの
吸収または予備培養は凝集反応試験の特異性を増したが
凝集反応が開始する前に吸収段階を必要とした（参照、
例えば、米国特許第3,959,456および3,864,467各号）。
Stuart等およびBeerは馬の糖蛋白質が感染性単核症を持
つ患者の区域に見出された異好抗体と反応したことを報
告した。Proc.Soc.Exp.Biol.34:212,215（1936）および
J.Clin.Invest.15:591−599を参照のこと。
つ患者の区域に見出された異好抗体と反応したことを報
告した。Proc.Soc.Exp.Biol.34:212,215（1936）および
J.Clin.Invest.15:591−599を参照のこと。
牛の赤血球もIM異好抗体の検出に独特のものであること
が判明した。この種の赤色血液細胞についての初期の仕
事において、BaileyおよびRaffel〔J.Clin.Invest.14,2
28−244（1935）〕は野生の牛の赤血球はIM抗体を含む
血清によつて凝集反応を起さないが、これらの赤血球は
異染色性抗体を吸収しそして補体の存在において溶解す
ることを見出した。この牛の赤血球溶血素試験は、モル
モツト腎臓による予備吸収段階が利用された場合でさ
え、馬または羊の赤血球を使用する凝集反応試験よりも
異好抗体に対してはより独特なものであると後に報告さ
れた。〔Evans,A.S.等，Ｊ.Infect.Dis.132,546−554
（1975）〕。エバンス（Evans）等は牛の赤血球は免疫
学的因子を含みこれはやぎ、羊または馬のようなその他
の種からの赤血球中に存在する免疫学的因子よりも特異
的に異孔抗体に結合することを示唆した。
が判明した。この種の赤色血液細胞についての初期の仕
事において、BaileyおよびRaffel〔J.Clin.Invest.14,2
28−244（1935）〕は野生の牛の赤血球はIM抗体を含む
血清によつて凝集反応を起さないが、これらの赤血球は
異染色性抗体を吸収しそして補体の存在において溶解す
ることを見出した。この牛の赤血球溶血素試験は、モル
モツト腎臓による予備吸収段階が利用された場合でさ
え、馬または羊の赤血球を使用する凝集反応試験よりも
異好抗体に対してはより独特なものであると後に報告さ
れた。〔Evans,A.S.等，Ｊ.Infect.Dis.132,546−554
（1975）〕。エバンス（Evans）等は牛の赤血球は免疫
学的因子を含みこれはやぎ、羊または馬のようなその他
の種からの赤血球中に存在する免疫学的因子よりも特異
的に異孔抗体に結合することを示唆した。
哺乳類赤血球とIM異好抗体との免疫学的反応性に対する
これらの観察は単離しそして精製した哺乳類赤血球から
の糖蛋白質を使用する免疫試験による感染性単核症の免
疫化学的診断に対する基礎を与えた。
これらの観察は単離しそして精製した哺乳類赤血球から
の糖蛋白質を使用する免疫試験による感染性単核症の免
疫化学的診断に対する基礎を与えた。
部分的精製の一方法は羊からの材料を使用して熱フエノ
ール抽出段階を用いる〔Callihan,H.J.,Int.Archs,Alle
ray Appl,Immun.51:696−708（1976）〕。この方法はも
しも肉基質がヘモグロビンを含む場合には変性のために
熱フエノールによる抽出はヘモグロビンの実質的除去を
妨げるであろうという問題に悩む。本発明は牛、羊また
は馬の肉基質をヘモグロビンを含まないように分離する
方法を含み、そして次いで生成肉基質を熱エタノール抽
出に当てる。その結果生じる糖蛋白質生成物は純粋であ
りそしてIM異好抗体と高い反応性を有する。
ール抽出段階を用いる〔Callihan,H.J.,Int.Archs,Alle
ray Appl,Immun.51:696−708（1976）〕。この方法はも
しも肉基質がヘモグロビンを含む場合には変性のために
熱フエノールによる抽出はヘモグロビンの実質的除去を
妨げるであろうという問題に悩む。本発明は牛、羊また
は馬の肉基質をヘモグロビンを含まないように分離する
方法を含み、そして次いで生成肉基質を熱エタノール抽
出に当てる。その結果生じる糖蛋白質生成物は純粋であ
りそしてIM異好抗体と高い反応性を有する。
糖蛋白質画分はクロロホルム メタノール抽出によつて
馬から分離された。これらの画分はある種の血液群抗原
と密接に関連した。〔Guertler,K.G.,Schmid,D.O.,Yebo
u,D.A.およびCleve,H.,Blood Grps.Biochem.Gents.9:41
−45（1978）〕。しかし、得られた生成物はIMまたはそ
の他とPaul−Bummel陽性抗体との反応性は何等試験をし
なかつた。報告されたデータを検討したところ単離され
た糖蛋白質は不純であり従つて放射線免疫試験ほど敏感
なものとして試験に使うには不適当であつた。
馬から分離された。これらの画分はある種の血液群抗原
と密接に関連した。〔Guertler,K.G.,Schmid,D.O.,Yebo
u,D.A.およびCleve,H.,Blood Grps.Biochem.Gents.9:41
−45（1978）〕。しかし、得られた生成物はIMまたはそ
の他とPaul−Bummel陽性抗体との反応性は何等試験をし
なかつた。報告されたデータを検討したところ単離され
た糖蛋白質は不純であり従つて放射線免疫試験ほど敏感
なものとして試験に使うには不適当であつた。
その他の研究者も種々の哺乳類の種から糖蛋白質を単離
しそして「精製された」糖蛋白質を得たと報告した。例
えばハマグチおよびCleveは人間、牛、豚、馬および羊
の赤血球からクロロホルム−メタノール抽出によつて糖
蛋白質を単離する方法を報告した。しかし単離された抽
出物は本発明の精製した糖蛋白質と比べると粗製品であ
つた。ハマグチ製造の血清学的活性は本発明のものの10
00倍も低かつた。〔なおFujita,S.,Cleve,H.,Biochim.B
iophys,Acta406:206−213（1975）;Grant,D.C.,Martin,
W.G.およびAnastassiadis,P.A.,Ｊ.Biol.Chem.242（1
7）:3912−3918（1967）； Hamazaki,H.,Hotta,K.,Konishi,J.,Comp.Bio−Chem.Phy
siol55B:37−44（1976）〕を参照のこと。
しそして「精製された」糖蛋白質を得たと報告した。例
えばハマグチおよびCleveは人間、牛、豚、馬および羊
の赤血球からクロロホルム−メタノール抽出によつて糖
蛋白質を単離する方法を報告した。しかし単離された抽
出物は本発明の精製した糖蛋白質と比べると粗製品であ
つた。ハマグチ製造の血清学的活性は本発明のものの10
00倍も低かつた。〔なおFujita,S.,Cleve,H.,Biochim.B
iophys,Acta406:206−213（1975）;Grant,D.C.,Martin,
W.G.およびAnastassiadis,P.A.,Ｊ.Biol.Chem.242（1
7）:3912−3918（1967）； Hamazaki,H.,Hotta,K.,Konishi,J.,Comp.Bio−Chem.Phy
siol55B:37−44（1976）〕を参照のこと。
1971年には早くも現発明者と協力者達〔Fletcher,M.A.,
およびWoolfolk,B.J.,Ｊ.Immunol.107:842−853（197
1）〕は75％エタノールによる牛の赤血球の部分的精製
は粗糖蛋白質抽出物を生じこれは異好抗体と高い反応性
を示した。反応性は血球凝集阻害物質、定量的沈澱およ
び寒天ゲル拡散を測定する三試験方法のそれぞれの結果
に基づいた。
およびWoolfolk,B.J.,Ｊ.Immunol.107:842−853（197
1）〕は75％エタノールによる牛の赤血球の部分的精製
は粗糖蛋白質抽出物を生じこれは異好抗体と高い反応性
を示した。反応性は血球凝集阻害物質、定量的沈澱およ
び寒天ゲル拡散を測定する三試験方法のそれぞれの結果
に基づいた。
IMに対するいくつかの診断的試験が報告されそれらは牛
の赤血球抗原に基きそしてそれらは牛の赤血球中の反応
性特質の最純形態として粗抽出物を使用する。例えば米
国特許第3,826,821;3,840,655;3,959,456および4,228,1
48各号を参照のこと。
の赤血球抗原に基きそしてそれらは牛の赤血球中の反応
性特質の最純形態として粗抽出物を使用する。例えば米
国特許第3,826,821;3,840,655;3,959,456および4,228,1
48各号を参照のこと。
出願人は牛の赤血球膜糖蛋白質を本質的に均質な形に精
製した。この牛の糖蛋白質の均一性は種種の方法で示さ
れ、それにはドデシル硫酸ナトリウムの存在におけるポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動法を含む。IM検出に対
するこの牛の糖蛋白質の精製した形のものは血球凝集阻
害防止試験において1971年にFletcher等によつて記述さ
れた牛の赤血球の粗抽出物によつて得た結果と比べて感
度において少なくとも10倍の増加を生じた。部分的に精
製した形におけるこの糖蛋白質によつて得られた結果は
1980年３月27日に現発生者および協力者によつてLevey
B.A.等Ｊ.Clin.Microbio.11,256−262（1980）に報告さ
れた。
製した。この牛の糖蛋白質の均一性は種種の方法で示さ
れ、それにはドデシル硫酸ナトリウムの存在におけるポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動法を含む。IM検出に対
するこの牛の糖蛋白質の精製した形のものは血球凝集阻
害防止試験において1971年にFletcher等によつて記述さ
れた牛の赤血球の粗抽出物によつて得た結果と比べて感
度において少なくとも10倍の増加を生じた。部分的に精
製した形におけるこの糖蛋白質によつて得られた結果は
1980年３月27日に現発生者および協力者によつてLevey
B.A.等Ｊ.Clin.Microbio.11,256−262（1980）に報告さ
れた。
現在の発明は牛、馬および羊の赤血球からの糖蛋白質の
単離を含みこの糖蛋白質はIMと反応するがフオルスマン
抗体とは反応しない。二つの形態の牛の糖蛋白が記載さ
れ、一つは約10％の錯体糖脂質を含む部分的に精製した
形でありそしてもう一つは本質的に均質な形である。こ
の発明の馬および羊の糖蛋白質は本質的に均質である。
IM活性はある種のシアログリコプロテインと関連しそし
てノイラミニダーゼ処理によつて完全にだめになる。こ
の発明の糖蛋白質はポール−ブンネル（Paul−Bunnel）
抗体との反応に信頼のできる抗原的要素を保持する。こ
の特性はIMに対するある種の血清学的診断試験の発展を
可能にしたがこれはこれまで完全な赤血球および複雑な
時間を消費する吸収方法が必要であつた。例えば、レイ
ビイ（Levey）等、上記を参照。
単離を含みこの糖蛋白質はIMと反応するがフオルスマン
抗体とは反応しない。二つの形態の牛の糖蛋白が記載さ
れ、一つは約10％の錯体糖脂質を含む部分的に精製した
形でありそしてもう一つは本質的に均質な形である。こ
の発明の馬および羊の糖蛋白質は本質的に均質である。
IM活性はある種のシアログリコプロテインと関連しそし
てノイラミニダーゼ処理によつて完全にだめになる。こ
の発明の糖蛋白質はポール−ブンネル（Paul−Bunnel）
抗体との反応に信頼のできる抗原的要素を保持する。こ
の特性はIMに対するある種の血清学的診断試験の発展を
可能にしたがこれはこれまで完全な赤血球および複雑な
時間を消費する吸収方法が必要であつた。例えば、レイ
ビイ（Levey）等、上記を参照。
ここに単離された馬および羊の糖蛋白質の付加的受容者
特性は末梢血液リンパ細胞と相互反応して試験管内で
「Ｅロゼツテ（rosettes）」を形成する能力である。
「Ｅロゼツテ」は末梢血液リンパ細胞でこれに三または
それ以上の羊の赤血球が付着するようになる。ロゼット
形成は人間のＴリンパ細胞および胸腺細胞に対する受容
された標識である。この発明においてはロゼット形成能
力のある受容体が馬および羊の赤血球糖蛋白質から単離
された。従つて、精製した馬および羊の試薬はロゼット
形成リンパ細胞の算出に対する標準化しうる試薬の製造
に有用であろう。
特性は末梢血液リンパ細胞と相互反応して試験管内で
「Ｅロゼツテ（rosettes）」を形成する能力である。
「Ｅロゼツテ」は末梢血液リンパ細胞でこれに三または
それ以上の羊の赤血球が付着するようになる。ロゼット
形成は人間のＴリンパ細胞および胸腺細胞に対する受容
された標識である。この発明においてはロゼット形成能
力のある受容体が馬および羊の赤血球糖蛋白質から単離
された。従つて、精製した馬および羊の試薬はロゼット
形成リンパ細胞の算出に対する標準化しうる試薬の製造
に有用であろう。
本発明の均質な糖蛋白質および敏感な免疫試験の発展に
対してそれらが提供する機会は、先行技術の試験方法に
よつて見出された異好抗体から認められるようにエプス
タイン−バー（Epstein−Barr）ビールスそれ自身に対
する抗体の検出および定量の急速かつ有用な手段を可能
にするであろう。そのような実際的試験に対する要求
は、例えば最近のBrit.Med.Ｊ．280,1153−1154（198
0）中の論説中で認められた。
対してそれらが提供する機会は、先行技術の試験方法に
よつて見出された異好抗体から認められるようにエプス
タイン−バー（Epstein−Barr）ビールスそれ自身に対
する抗体の検出および定量の急速かつ有用な手段を可能
にするであろう。そのような実際的試験に対する要求
は、例えば最近のBrit.Med.Ｊ．280,1153−1154（198
0）中の論説中で認められた。
本発明は牛の赤血球から牛の糖蛋白質（BGP）の二つの
形を得るためのおよび馬の赤血球から本質的に均一な形
の馬糖蛋白質（HGP）を得るための、および羊の赤血球
から本質的に均質な形の羊の糖蛋白質を得るための新規
な精製手順を提供し、それらはそれぞれ人の感染性単核
症の異孔抗体の存在に対する試験において抗原として作
用する。
形を得るためのおよび馬の赤血球から本質的に均一な形
の馬糖蛋白質（HGP）を得るための、および羊の赤血球
から本質的に均質な形の羊の糖蛋白質を得るための新規
な精製手順を提供し、それらはそれぞれ人の感染性単核
症の異孔抗体の存在に対する試験において抗原として作
用する。
その部分的に精製した形においてBGPは約10重量％まで
の錯体糖脂質を含む。それはクマシーブルーまたは過沃
素酸を含むシツフ試薬で着色した場合ドデシル硫酸ナト
リウムのような希釈洗剤中の燐酸塩一緩衝のポリアクリ
ルアミド ゲル上でpH7.0におけるゲル電気泳動に際し
単一バンドを与える。
の錯体糖脂質を含む。それはクマシーブルーまたは過沃
素酸を含むシツフ試薬で着色した場合ドデシル硫酸ナト
リウムのような希釈洗剤中の燐酸塩一緩衝のポリアクリ
ルアミド ゲル上でpH7.0におけるゲル電気泳動に際し
単一バンドを与える。
その好ましい最も精製した、または均質な形において本
発明のBGPは本質的に錯体糖脂質を含まない。本発明の
均質BGPはクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツ
フ試薬で着色した場合ドデシル硫酸ナトリウムのような
希釈洗剤中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルアミド上でpH
7.0におけるゲル電気泳動に際し実質的に単一バンドを
形成する。
発明のBGPは本質的に錯体糖脂質を含まない。本発明の
均質BGPはクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツ
フ試薬で着色した場合ドデシル硫酸ナトリウムのような
希釈洗剤中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルアミド上でpH
7.0におけるゲル電気泳動に際し実質的に単一バンドを
形成する。
本発明の均質BGPはまた、pH4.0より小さい等電点を有
し、等電点電気泳動でアノードゲルに至る。
し、等電点電気泳動でアノードゲルに至る。
部分的に精製したそして均質なBGPのアミノ酸組成は100
モルのBGPについてのモル数で、アスパラギン酸約7.2、
トレオニン約8.0、セリン約7.2、グルタミン酸約16.5、
プロリン約12.9、グルシン約8.9、アラニン約5.6、バリ
ン約5.4、メチオニン約1.2、イソロイシン約6.4、ロイ
シン約9.2、チロシン約0.9、フエニルアラニン約2.8、
ヒスチジン約1.3、リシン約1.8およびアルギニン約4.8
である。見本源として使用した個々の牛間の差異に主と
して基づく少々の変化が、もちろん、観察されるであろ
うことはこの技術に熟練した普通の熟練を有する人々に
は容易に理解できるであろう。
モルのBGPについてのモル数で、アスパラギン酸約7.2、
トレオニン約8.0、セリン約7.2、グルタミン酸約16.5、
プロリン約12.9、グルシン約8.9、アラニン約5.6、バリ
ン約5.4、メチオニン約1.2、イソロイシン約6.4、ロイ
シン約9.2、チロシン約0.9、フエニルアラニン約2.8、
ヒスチジン約1.3、リシン約1.8およびアルギニン約4.8
である。見本源として使用した個々の牛間の差異に主と
して基づく少々の変化が、もちろん、観察されるであろ
うことはこの技術に熟練した普通の熟練を有する人々に
は容易に理解できるであろう。
精製した馬の糖蛋白質のアミン酸組成は100モルのHGPに
つきモル数で次の通りである：アスパラギン酸約8.1、
トレオニン約10.6、セリン約10.8、グルタミン酸約9.
4、プロリン約12.3、グリシン約9.2、アラニン約11.3、
バリン約4.4、メチオニン約0.8、イソロイシン約3.5、
ロイシン約8.2、チロシン約1.1、フエニルアラニン約2.
9、ヒスチジン約1.2、リシン約1.3、およびアルギニン
約4.8。トレオニンの組成は加水分解に際し約５％の損
失に対し修正しそしてセリンのそれは加水分解に際して
の約10％の損失に対し修正した。
つきモル数で次の通りである：アスパラギン酸約8.1、
トレオニン約10.6、セリン約10.8、グルタミン酸約9.
4、プロリン約12.3、グリシン約9.2、アラニン約11.3、
バリン約4.4、メチオニン約0.8、イソロイシン約3.5、
ロイシン約8.2、チロシン約1.1、フエニルアラニン約2.
9、ヒスチジン約1.2、リシン約1.3、およびアルギニン
約4.8。トレオニンの組成は加水分解に際し約５％の損
失に対し修正しそしてセリンのそれは加水分解に際して
の約10％の損失に対し修正した。
精製した羊の糖蛋白質のアミノ酸組成は100モルのSGPに
つきモル数で次のようである：アスパラギン酸約5.6、
トレオニン約8.1、セリン約12.9、グルタミン酸約13.
0、プロリン約11.6、グリシン約7.7、アラニン約9.6、
バリン約6.2、メチオニン約0.5、イソロイシン約4.6、
ロイシン約8.3、チロシン約1.6、フエニルアラニン約1.
2、ヒスチジン約1.6、リシン約3.2、アルギニン約4.0お
よびトリプトフアン約0.3。
つきモル数で次のようである：アスパラギン酸約5.6、
トレオニン約8.1、セリン約12.9、グルタミン酸約13.
0、プロリン約11.6、グリシン約7.7、アラニン約9.6、
バリン約6.2、メチオニン約0.5、イソロイシン約4.6、
ロイシン約8.3、チロシン約1.6、フエニルアラニン約1.
2、ヒスチジン約1.6、リシン約3.2、アルギニン約4.0お
よびトリプトフアン約0.3。
カルボヒドラートは均質な牛の糖蛋白質の約25重量％、
均質な馬の糖蛋白質の約55重量％そして均質な羊の糖蛋
白質の約57重量％になる。蛋白質は実質的に各糖蛋白質
における差になる。
均質な馬の糖蛋白質の約55重量％そして均質な羊の糖蛋
白質の約57重量％になる。蛋白質は実質的に各糖蛋白質
における差になる。
本発明の均質な高度に純粋な赤血球糖蛋白質は安定な標
準化しうる試薬を与えこれは室温において生物学的活性
の損失なしでいつまでも保たれる。これらの糖蛋白質は
不活性支持体に付着させそして放射性付箋のような付箋
を標示し、そして放射線免疫試験のような免疫試験に、
ポール−ブンネル抗体の検出に対しそしてリンパ細胞の
ある種の小住民（subpopulataions）の検出に使われ
る。
準化しうる試薬を与えこれは室温において生物学的活性
の損失なしでいつまでも保たれる。これらの糖蛋白質は
不活性支持体に付着させそして放射性付箋のような付箋
を標示し、そして放射線免疫試験のような免疫試験に、
ポール−ブンネル抗体の検出に対しそしてリンパ細胞の
ある種の小住民（subpopulataions）の検出に使われ
る。
本発明の特別の実施態様は羊および馬の赤血球の単離さ
れた糖蛋白質と受容体特性を含みこれはこの受容体が人
のＴリンパ細胞と相互作用する能力であり、そしてこの
ようにしてロゼツテの形成を妨げる。ロゼツテ リンパ
細胞の生成および算出は新鮮な羊の血液の入手しやすさ
を要求しこれは出荷および貯蔵に対する特別な取扱いを
必要とする。その上、新鮮な羊の血液は４℃で貯蔵する
場合でさえ限られた貯蔵寿命である。
れた糖蛋白質と受容体特性を含みこれはこの受容体が人
のＴリンパ細胞と相互作用する能力であり、そしてこの
ようにしてロゼツテの形成を妨げる。ロゼツテ リンパ
細胞の生成および算出は新鮮な羊の血液の入手しやすさ
を要求しこれは出荷および貯蔵に対する特別な取扱いを
必要とする。その上、新鮮な羊の血液は４℃で貯蔵する
場合でさえ限られた貯蔵寿命である。
ここに記載する生成物は感染性単核症の検出における診
断試薬として有用な精製した糖蛋白質である。この発明
によつて達成される製品純度はこれまで他のIM診断用製
剤では不可能であつた水準の抗原的敏感性および特殊性
を提供する。ここに記載する抗原は牛、羊または馬の赤
血球から複雑な一連の段階において単離しそして精製さ
れ、それはとりわけ、エタノール沈澱、ホスホセルロー
ス クロマトグラフイー、脂質溶剤抽出およびジエチル
アミノエチル（DEAE）クロマトグラフイーを含み。
牛、羊または馬の何れを問わず各種に対しては実質的に
同一精製を行つたことは理解されであろう。
断試薬として有用な精製した糖蛋白質である。この発明
によつて達成される製品純度はこれまで他のIM診断用製
剤では不可能であつた水準の抗原的敏感性および特殊性
を提供する。ここに記載する抗原は牛、羊または馬の赤
血球から複雑な一連の段階において単離しそして精製さ
れ、それはとりわけ、エタノール沈澱、ホスホセルロー
ス クロマトグラフイー、脂質溶剤抽出およびジエチル
アミノエチル（DEAE）クロマトグラフイーを含み。
牛、羊または馬の何れを問わず各種に対しては実質的に
同一精製を行つたことは理解されであろう。
次々と、牛、馬または羊からヘモグロビン蛋白質が赤色
細胞膜からまず除去され、これを次いで逐次的有機溶剤
処理によつて抽出しこれは75％エタノール抽出物を含む
粗GPを生じる。これらの前段階は始めに出願人および協
力者によつて1971年に記載した；前掲のフレツチヤー
（Fletcher）等を参照のこと。
細胞膜からまず除去され、これを次いで逐次的有機溶剤
処理によつて抽出しこれは75％エタノール抽出物を含む
粗GPを生じる。これらの前段階は始めに出願人および協
力者によつて1971年に記載した；前掲のフレツチヤー
（Fletcher）等を参照のこと。
本発明に従えば、75％エタノールで得た抽出物をさらに
カチオン交換カラム上でクロマトグラフによつて処理し
次いで一連の少なくとも二つの異なる脂質溶剤によつて
抽出して生成物を生じるがこれは均質糖蛋白質に混つた
約10重量％までの錯体糖脂質を含む。生成物はpH7.0に
おいてゲル電気泳動試験で単一バンドを示しそこでは生
成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツフ試
薬によつて着色され、そしてゲルは希釈洗剤溶液、例え
ば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩衝のポリ
アクリルアミドである。
カチオン交換カラム上でクロマトグラフによつて処理し
次いで一連の少なくとも二つの異なる脂質溶剤によつて
抽出して生成物を生じるがこれは均質糖蛋白質に混つた
約10重量％までの錯体糖脂質を含む。生成物はpH7.0に
おいてゲル電気泳動試験で単一バンドを示しそこでは生
成物はクマシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツフ試
薬によつて着色され、そしてゲルは希釈洗剤溶液、例え
ば１％ドデシル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩衝のポリ
アクリルアミドである。
本発明に従つて行われる最終シリーズの段階において、
錯体糖脂質は生成物をアニオン交換カラム上で結合しそ
して高塩緩衝液で溶出することによつて実質的に完全に
除去する。この生成物はpH7.0においてゲル電気泳動に
おいて実質的た単一バンドを示し、そこでは生成物はク
マシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツフ試薬によつ
て着色し、そしてゲルは薄い洗浄溶液、例えば１％ドデ
シル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルア
ミドである。
錯体糖脂質は生成物をアニオン交換カラム上で結合しそ
して高塩緩衝液で溶出することによつて実質的に完全に
除去する。この生成物はpH7.0においてゲル電気泳動に
おいて実質的た単一バンドを示し、そこでは生成物はク
マシー ブルーまたは過沃素酸を含むシツフ試薬によつ
て着色し、そしてゲルは薄い洗浄溶液、例えば１％ドデ
シル硫酸ナトリウム中の燐酸塩−緩衝のポリアクリルア
ミドである。
本発明の均質な糖蛋白質は本質的に糖脂質を含まないこ
とが判明した。均質BGPはおよそ25％のカルボヒドラー
トを含むのに対し、均質HGPはおよそ55％のカルボヒド
ラートを含み、そして均質SGPはおよそ57％のカルボヒ
ドラートを含む。各糖蛋白質の残りは実質的に蛋白質で
ある。
とが判明した。均質BGPはおよそ25％のカルボヒドラー
トを含むのに対し、均質HGPはおよそ55％のカルボヒド
ラートを含み、そして均質SGPはおよそ57％のカルボヒ
ドラートを含む。各糖蛋白質の残りは実質的に蛋白質で
ある。
この一連の段階で除去した糖脂質は人の感染性単核症の
特徴である抗体に対して本質的に非反応性であることも
また判明した。それの除去は実際上の免疫検査法の達成
に対しては特に重要である、しかし、これらの方法にお
いて、標示（放射性同位体、フルオロゲン、クロモゲ
ン、発光物質またはその他の型の標示の何れであつて
も）は全く特殊な免疫化学反応体に結合することを当然
としなければならない。不注意な標示は、たとえ存在す
る総ての他の物質に対して不活性であつても、この前提
は無効にしそして無効であるかまたは信頼できる分析を
不可能とする結果に導く。それ以上に標示した汚染物質
は、たとえ検査される免疫化学的本質と非反応性である
としても、試験試料中の他の成分と充分反応性であろう
しそれによつて得られる読みの大きさに寄与し、それに
よつて試験を混乱させそして誤つた情報を与える原因な
る。従つて錯体糖脂質はそのような免疫試験において使
用すべきBGPから本質的に完全に除去することが診断に
対する成功的免疫試験の発展および人のIMの監視に対し
て不可欠のことである。
特徴である抗体に対して本質的に非反応性であることも
また判明した。それの除去は実際上の免疫検査法の達成
に対しては特に重要である、しかし、これらの方法にお
いて、標示（放射性同位体、フルオロゲン、クロモゲ
ン、発光物質またはその他の型の標示の何れであつて
も）は全く特殊な免疫化学反応体に結合することを当然
としなければならない。不注意な標示は、たとえ存在す
る総ての他の物質に対して不活性であつても、この前提
は無効にしそして無効であるかまたは信頼できる分析を
不可能とする結果に導く。それ以上に標示した汚染物質
は、たとえ検査される免疫化学的本質と非反応性である
としても、試験試料中の他の成分と充分反応性であろう
しそれによつて得られる読みの大きさに寄与し、それに
よつて試験を混乱させそして誤つた情報を与える原因な
る。従つて錯体糖脂質はそのような免疫試験において使
用すべきBGPから本質的に完全に除去することが診断に
対する成功的免疫試験の発展および人のIMの監視に対し
て不可欠のことである。
本発明の部分的に精製したBGPは燐酸塩−緩衝のSDS−変
成ポリアクリルアミド ゲル上でpH7.0における電気泳
動試験において単一バンドを示すばかりでなく、またそ
の組成は1971年に出願人と協力者によつて記述した粗製
の牛の抗原製剤の組成と著しく異なる。下記の表は粗製
および部分的精製製品中に存在する構成糖類のモル比を
比較する： 第II表は本発明の部分的に精製したBGPのカルボヒドラ
ート組成を示し、なお約10％の錯体糖脂質を含む、蛋白
質のミリグラムにつきミクロモルで： 第II表中の値は、シアリン酸の値を除いて、まず糖を10
0℃で３時間3NHCl中で加水分解した後に通例のガス−液
クロマトグラフイーによつて得た。シアリン酸に対する
値は通例のようにアルカリ性−エールリツヒ（Ehrlic
h）試験によつて測定しそしてＮ−グリコリル ノイラ
ミン酸として計算した。第II表はLevey,B.A.等，Ｊ.Cli
n.Microbio.11,256（1981）中に報告された。
成ポリアクリルアミド ゲル上でpH7.0における電気泳
動試験において単一バンドを示すばかりでなく、またそ
の組成は1971年に出願人と協力者によつて記述した粗製
の牛の抗原製剤の組成と著しく異なる。下記の表は粗製
および部分的精製製品中に存在する構成糖類のモル比を
比較する： 第II表は本発明の部分的に精製したBGPのカルボヒドラ
ート組成を示し、なお約10％の錯体糖脂質を含む、蛋白
質のミリグラムにつきミクロモルで： 第II表中の値は、シアリン酸の値を除いて、まず糖を10
0℃で３時間3NHCl中で加水分解した後に通例のガス−液
クロマトグラフイーによつて得た。シアリン酸に対する
値は通例のようにアルカリ性−エールリツヒ（Ehrlic
h）試験によつて測定しそしてＮ−グリコリル ノイラ
ミン酸として計算した。第II表はLevey,B.A.等，Ｊ.Cli
n.Microbio.11,256（1981）中に報告された。
第II a表は異なつた牛の個体からとつた別の試料につい
て得られた本発明の均質BGPのカルボヒドラート組成を
示したそれから第１およびII表の数値を得た。
て得られた本発明の均質BGPのカルボヒドラート組成を
示したそれから第１およびII表の数値を得た。
第II a表中の値は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸および
ポリペプチド含量に対するものを除いて、100℃におい
て約３時間3NHCl中でまず糖を加水分解した後に通例の
ガス−液クロマトグラフイーによつて得た。Ｎ−グリコ
リルノイラミン酸に対する値は通例のようにアルカリ性
−エーリツヒ試験によつて測定した。
ポリペプチド含量に対するものを除いて、100℃におい
て約３時間3NHCl中でまず糖を加水分解した後に通例の
ガス−液クロマトグラフイーによつて得た。Ｎ−グリコ
リルノイラミン酸に対する値は通例のようにアルカリ性
−エーリツヒ試験によつて測定した。
均質の牛の糖蛋白質はおよそ75重量％の蛋白質と25重量
％のカルボヒドラートを有する。これらのような測定に
おける少量の変動はあつた。一つの変化は第ＩおよびII
表間に使用した試料、および第II aおよびII b表間に使
用した試料であつた。特に第ＩおよびII表に使つた試料
は蛋白質の重量％はおよそ77％に等しくそしてカルボヒ
ドラートの重量％はおよそ23％に等しかつたのに対し第
II aおよびII b表に使つた試料は蛋白質の重量％はおよ
そ73％そしてカルボヒドラートの重量％はおよそ27％に
等しかつた。生物学技術に熟練した人々には容易に理解
できるように、個人間のそのような差は小さなものであ
りそして個々の源泉の試料からに予期される。
％のカルボヒドラートを有する。これらのような測定に
おける少量の変動はあつた。一つの変化は第ＩおよびII
表間に使用した試料、および第II aおよびII b表間に使
用した試料であつた。特に第ＩおよびII表に使つた試料
は蛋白質の重量％はおよそ77％に等しくそしてカルボヒ
ドラートの重量％はおよそ23％に等しかつたのに対し第
II aおよびII b表に使つた試料は蛋白質の重量％はおよ
そ73％そしてカルボヒドラートの重量％はおよそ27％に
等しかつた。生物学技術に熟練した人々には容易に理解
できるように、個人間のそのような差は小さなものであ
りそして個々の源泉の試料からに予期される。
蛋白質の重量％はアミノ酸分析に供したアミノ酸のモル
数から概算したのであるから、観察された重量％の差は
また、もちろん、各試料に対して使用した異なるアミノ
酸分析器およびアミノ酸分析器に使用した異なる緩衝剤
系に依るものである。
数から概算したのであるから、観察された重量％の差は
また、もちろん、各試料に対して使用した異なるアミノ
酸分析器およびアミノ酸分析器に使用した異なる緩衝剤
系に依るものである。
第II b表は部分的に精製したBGP中および均質BGP中に存
在する構成糖類のモル比を比較する。
在する構成糖類のモル比を比較する。
本発明の均質BGPはＮ−アセチルグルコースアミン対Ｎ
−グリコリルノイラミン酸の実質的に高いモル比を有す
るが、これは部分的に精製したBGPからの錯体糖脂質の
除去が著しくカルボヒドラートの組成を変えたことを示
すことに注意する。この比較は異なる牛の個体から得た
異なる二つの試料を使用して行つたこと、そして生きも
の間の個々の差は或る程度常に得られる数値に影響する
ことが心にとめるべきである。
−グリコリルノイラミン酸の実質的に高いモル比を有す
るが、これは部分的に精製したBGPからの錯体糖脂質の
除去が著しくカルボヒドラートの組成を変えたことを示
すことに注意する。この比較は異なる牛の個体から得た
異なる二つの試料を使用して行つたこと、そして生きも
の間の個々の差は或る程度常に得られる数値に影響する
ことが心にとめるべきである。
第II cおよびII d表はそれぞれ均質な馬の糖蛋白質（HG
P）と均質な羊の糖蛋白質のカルボヒドラート組成を与
える。
P）と均質な羊の糖蛋白質のカルボヒドラート組成を与
える。
第II cおよびII d表のカルボヒドラート組成は第II a表
に対して用いた方法によつて測定した。
に対して用いた方法によつて測定した。
第III表は本発明の部分的に精製したBGPと1971年に出願
人と協力者によつて報告された粗BGPの比較をアミノ酸
組成について存在する全BGPの100モルに対するモル数で
行つた。これらの値は試料を6NHCl中で110℃において封
入し真空にした管中で24時間加水分解し、そのようにし
て得た生成物をクロマトグラフで処理しそしてDurran50
0自動アミノ酸分析器によつて分析した。加水分解に基
づく損失に対しては補正は行わなかつた。
人と協力者によつて報告された粗BGPの比較をアミノ酸
組成について存在する全BGPの100モルに対するモル数で
行つた。これらの値は試料を6NHCl中で110℃において封
入し真空にした管中で24時間加水分解し、そのようにし
て得た生成物をクロマトグラフで処理しそしてDurran50
0自動アミノ酸分析器によつて分析した。加水分解に基
づく損失に対しては補正は行わなかつた。
本発明の均質BGPは本発明の部分的精製BGPと本質的に同
一アミノ酸組成を有し、異なる動物からの試料において
個々の変化が許されることが理解されるであろう。二つ
の形態は主として前者を生産するために後者から錯体糖
脂質を実質的に完全に除去したところが主として異な
る。従つて、第III表を与えた異なる牛の個体からの試
料について測定した均質BGPが次の第IV中に与えられる
アミノ酸組成を有することが判つた。
一アミノ酸組成を有し、異なる動物からの試料において
個々の変化が許されることが理解されるであろう。二つ
の形態は主として前者を生産するために後者から錯体糖
脂質を実質的に完全に除去したところが主として異な
る。従つて、第III表を与えた異なる牛の個体からの試
料について測定した均質BGPが次の第IV中に与えられる
アミノ酸組成を有することが判つた。
第IV表は本発明の各均質糖蛋白質のアミノ酸組成を存在
するアミノ酸と100モルに対するモル数で与える。
するアミノ酸と100モルに対するモル数で与える。
個々のアミノ酸は6NHCl中で110℃で封入し脱気した中で
24時間加水分解した後JOEL5AHアミノ酸分析器で測定し
た。Ｎ−未端アミノ酸分析はダンシル法によつて行い、
PCA−Thr−Pro−Cly−Pro−Pro−Asx−を有した。〔Gra
y,W.R.Methods Enzymol.25,333（1972）〕。また、Ｎ−
末端構造は核磁気共鳴分析法および質量分析法によっ
て、下記の構造を示した： （式中、PCAはピロリジンカルボキシリックアミノ酸を
表わし、Thrはトレオニンを表わし、Proはプロリンを表
わし、Glyはグリシンを表わし、Asxはアスパラギンを表
わし、NeuNGcはＮ−グリコリル−ノイラミン酸を表わ
し、GALNacはＮ−アセチル−ガラクトサミンを表わし、
そしてGALはガラクツロン酸を表わす）。
24時間加水分解した後JOEL5AHアミノ酸分析器で測定し
た。Ｎ−未端アミノ酸分析はダンシル法によつて行い、
PCA−Thr−Pro−Cly−Pro−Pro−Asx−を有した。〔Gra
y,W.R.Methods Enzymol.25,333（1972）〕。また、Ｎ−
末端構造は核磁気共鳴分析法および質量分析法によっ
て、下記の構造を示した： （式中、PCAはピロリジンカルボキシリックアミノ酸を
表わし、Thrはトレオニンを表わし、Proはプロリンを表
わし、Glyはグリシンを表わし、Asxはアスパラギンを表
わし、NeuNGcはＮ−グリコリル−ノイラミン酸を表わ
し、GALNacはＮ−アセチル−ガラクトサミンを表わし、
そしてGALはガラクツロン酸を表わす）。
DNS−アミノ酸はWoods,K.R.等（Biochem.Biophys.Acta.
133,369（1967）〕によつて記述されたようにTLCによつ
て固定した。牛および羊の糖蛋白質のアミノ酸分析に対
しては、トリプトフアンは100℃で20時間4Nメタン−ス
ルホン酸中で加水分解した後に測定した。BGPに対する
シスタイン値は加水分解前に均質BGPをジアスターゼで
アルキル化して測定した。部分的精製BGP（第III表）と
均質BGP（第IV）間のアミノ酸組成の観察される差違は
重大ではなくそして、なかんずく、巨大糖蛋白質の存在
によるHCl加水分解の延引、BGPの各形態を分析するのに
使用した異なるアミノ酸分析器、および各形態のBGPを
つくるのに使用した牛の個々のよく知られた差違による
ものである。部分精製BGPのアミノ酸組成は実質的に均
質BGPのそれと同じであることが理解されるであろう。
133,369（1967）〕によつて記述されたようにTLCによつ
て固定した。牛および羊の糖蛋白質のアミノ酸分析に対
しては、トリプトフアンは100℃で20時間4Nメタン−ス
ルホン酸中で加水分解した後に測定した。BGPに対する
シスタイン値は加水分解前に均質BGPをジアスターゼで
アルキル化して測定した。部分的精製BGP（第III表）と
均質BGP（第IV）間のアミノ酸組成の観察される差違は
重大ではなくそして、なかんずく、巨大糖蛋白質の存在
によるHCl加水分解の延引、BGPの各形態を分析するのに
使用した異なるアミノ酸分析器、および各形態のBGPを
つくるのに使用した牛の個々のよく知られた差違による
ものである。部分精製BGPのアミノ酸組成は実質的に均
質BGPのそれと同じであることが理解されるであろう。
本発明の均質BGPは変性溶媒中で測定して34,000ダルト
ンの分子量を有する。
ンの分子量を有する。
本発明の特別の実施態様は測定されるべき抗源またはそ
の結合される相手には付箋を付けることを要求する。放
射性同位体付箋は、例えば、125I、131I、3Hまたは
14C、がまたはその他の容易にそして便利に使用できる
ものが好ましい。蛋白質のトリトリウム付箋は、例え
ば、この目的に対してしばしば用いられる周知の試薬で
ある〔3H〕−無水酸てよつて行うことができる。アイソ
トープ125Iは最も望まし。それはその高い比放射能のた
めおよびその比較的長い半減期のためである。
の結合される相手には付箋を付けることを要求する。放
射性同位体付箋は、例えば、125I、131I、3Hまたは
14C、がまたはその他の容易にそして便利に使用できる
ものが好ましい。蛋白質のトリトリウム付箋は、例え
ば、この目的に対してしばしば用いられる周知の試薬で
ある〔3H〕−無水酸てよつて行うことができる。アイソ
トープ125Iは最も望まし。それはその高い比放射能のた
めおよびその比較的長い半減期のためである。
抗体または蛋白質性抗原はこの技術で知られている種々
の方法の一つ、例えばラクトペルオキシダーゼ、クロル
アミン−Ｔ〔Hunter,W,M等Nature194,405（1962）〕、
イオドーゲン〔Fraker,P.J.等Biochem.Biophys.Res,Com
m.80,849（1978）〕、またはBolton−Hunter試薬〔Bolt
on,A.E等Bio−Chem.Ｊ．133,529（1973）〕によつて約5
0ミクロci/ミクログラム蛋白質の比放射能に対し125Iで
標子することができる。標示した蛋白質は未反応遊離
125Iからゲル濾過によつて分けることができる。
の方法の一つ、例えばラクトペルオキシダーゼ、クロル
アミン−Ｔ〔Hunter,W,M等Nature194,405（1962）〕、
イオドーゲン〔Fraker,P.J.等Biochem.Biophys.Res,Com
m.80,849（1978）〕、またはBolton−Hunter試薬〔Bolt
on,A.E等Bio−Chem.Ｊ．133,529（1973）〕によつて約5
0ミクロci/ミクログラム蛋白質の比放射能に対し125Iで
標子することができる。標示した蛋白質は未反応遊離
125Iからゲル濾過によつて分けることができる。
チロシンを含む蛋白質を放射性標示する好ましい方法は
クロラミン−Ｔである。これは放射性付箋によつて蛋白
質を標示する最もしばしば用いる方法である。別法とし
て、チロシン残渣は始めに蛋白質をNaIと反応させ、次
いでトリトリウムガスによつて接触水添することにより
２段階法でトリトリウムによつて標示することができ
る。リシンまたはアルギニンの遊離アミノ基の側鎖は3H
−無水酢酸またはボルトン−ハンター試薬によつて標示
することができる。
クロラミン−Ｔである。これは放射性付箋によつて蛋白
質を標示する最もしばしば用いる方法である。別法とし
て、チロシン残渣は始めに蛋白質をNaIと反応させ、次
いでトリトリウムガスによつて接触水添することにより
２段階法でトリトリウムによつて標示することができ
る。リシンまたはアルギニンの遊離アミノ基の側鎖は3H
−無水酢酸またはボルトン−ハンター試薬によつて標示
することができる。
放射性付箋の代りに多くの種類の他の付箋を使うことが
できる。付箋をつけるその他の方法にはフルオロゲン、
クロモフオア、酵素または発光性付箋を含む。例えば、
馬のラデイシュ ペルオキシダーゼまたはベーターガラ
クトシダーゼはKennedy,J.H.等Clinica Chimica Acta7
0,1（1976）中で検討される多くの方法によつて蛋白質
性抗原にカプルすることができる。フルオレツセン イ
ソチオシアナートは蛋白質に結合できる周知のフルオゲ
ニツク基である〔Ackroyd,J.F.ed.Immunological Metho
ds,Blackwells Oxford（1964）155−174頁。
できる。付箋をつけるその他の方法にはフルオロゲン、
クロモフオア、酵素または発光性付箋を含む。例えば、
馬のラデイシュ ペルオキシダーゼまたはベーターガラ
クトシダーゼはKennedy,J.H.等Clinica Chimica Acta7
0,1（1976）中で検討される多くの方法によつて蛋白質
性抗原にカプルすることができる。フルオレツセン イ
ソチオシアナートは蛋白質に結合できる周知のフルオゲ
ニツク基である〔Ackroyd,J.F.ed.Immunological Metho
ds,Blackwells Oxford（1964）155−174頁。
A.牛、馬または羊の赤血球から粗抗源の製造 Fletcher等，Ｊ.Imm.107,842（1971）中に一般的に記載
されるようにして肉基質、例えば細胞膜の抽出によつて
ヘモグロビンを含まない肉基質を単離する。さらに特
に、新たに殺した牛からの新鮮な血液に凝固を防ぐため
に抗凝固剤を加える。ヘパリンおよびエチレンジアミン
四酢酸を避けるほかはほとんど通例の抗凝固剤は使うこ
とができる。望ましい抗凝固剤には酸性化シトラート−
デキストロース、オキザラートおよびAlsieverを含む。
血液は普通の冷蔵温度で約24時間まで貯蔵できる。次い
で普通の等張緩衝剤の何れかによつて細胞膜を無傷に保
つpHにおいて、即ち約5.0から約9.0、好ましくは約6.0
から約8.0まで例えば燐酸塩−緩衝の塩水のpH約7.4また
はトリス−緩衝塩水のpH約7.4において充分に洗う。も
しも血液試料を洗浄前に約24時よりも認めうる程長い時
間放置すると、試料は細菌または白色血液細胞からのリ
ソソマル（lysosomal）酵素によつて汚染されるであろ
う。各洗滌段階で細胞は緩衝液中に懸濁させ次いで遠心
分離する。遠分離後上澄および軟膜はアスピレーターで
除く。これらの洗浄−遠心分離−アスピレーション段階
に軟膜が完全に除去されそして上澄が完全に明澄で着色
がなくなるまで続ける。実質的に総ての軟膜を除去する
ことはそれが加水分解性酵素源だから重要である。洗浄
段階中に赤血球の全体積のおよそ1/4がなくなる。
されるようにして肉基質、例えば細胞膜の抽出によつて
ヘモグロビンを含まない肉基質を単離する。さらに特
に、新たに殺した牛からの新鮮な血液に凝固を防ぐため
に抗凝固剤を加える。ヘパリンおよびエチレンジアミン
四酢酸を避けるほかはほとんど通例の抗凝固剤は使うこ
とができる。望ましい抗凝固剤には酸性化シトラート−
デキストロース、オキザラートおよびAlsieverを含む。
血液は普通の冷蔵温度で約24時間まで貯蔵できる。次い
で普通の等張緩衝剤の何れかによつて細胞膜を無傷に保
つpHにおいて、即ち約5.0から約9.0、好ましくは約6.0
から約8.0まで例えば燐酸塩−緩衝の塩水のpH約7.4また
はトリス−緩衝塩水のpH約7.4において充分に洗う。も
しも血液試料を洗浄前に約24時よりも認めうる程長い時
間放置すると、試料は細菌または白色血液細胞からのリ
ソソマル（lysosomal）酵素によつて汚染されるであろ
う。各洗滌段階で細胞は緩衝液中に懸濁させ次いで遠心
分離する。遠分離後上澄および軟膜はアスピレーターで
除く。これらの洗浄−遠心分離−アスピレーション段階
に軟膜が完全に除去されそして上澄が完全に明澄で着色
がなくなるまで続ける。実質的に総ての軟膜を除去する
ことはそれが加水分解性酵素源だから重要である。洗浄
段階中に赤血球の全体積のおよそ1/4がなくなる。
洗浄しそして包装した血液は次いでアルカリ性pH、即ち
約8.0以上の低張性緩衝液中に溶かす。溶解する緩衝液
はヘモグロビンの変性および変性したヘモグロビンが細
胞膜に望ましくない結合をするのを防ぐためアルカリ性
でなければならない。細胞肉基質または細胞膜は約13,0
00×ｇにおいて１時間約４℃から約15℃まで程度の温に
おいて遠心分離によつて一緒に包装する。上澄はアスピ
レートして捨て、その際ゆるく包まれた細胞膜層は赤色
ペレツトから斜瀉される。このアルカリ性洗浄に続く冷
遠心分離および分離段階は斜瀉した細胞膜層がクリーム
白、即ち目に見えるヘモグロビン汚染がなくなるまで繰
り返す。精製した肉基質は次の段階実施のため例えば凍
結−乾燥によつて乾かさねばならない。
約8.0以上の低張性緩衝液中に溶かす。溶解する緩衝液
はヘモグロビンの変性および変性したヘモグロビンが細
胞膜に望ましくない結合をするのを防ぐためアルカリ性
でなければならない。細胞肉基質または細胞膜は約13,0
00×ｇにおいて１時間約４℃から約15℃まで程度の温に
おいて遠心分離によつて一緒に包装する。上澄はアスピ
レートして捨て、その際ゆるく包まれた細胞膜層は赤色
ペレツトから斜瀉される。このアルカリ性洗浄に続く冷
遠心分離および分離段階は斜瀉した細胞膜層がクリーム
白、即ち目に見えるヘモグロビン汚染がなくなるまで繰
り返す。精製した肉基質は次の段階実施のため例えば凍
結−乾燥によつて乾かさねばならない。
遠心分離に対する別法はRosenberry,T.L.等Ｊ.Biochem.
Biophys.Meth.４,39（1981）中に人の血液から細胞膜の
調製に記載されたようにPellicon上での濾過である。
Biophys.Meth.４,39（1981）中に人の血液から細胞膜の
調製に記載されたようにPellicon上での濾過である。
その後、約1gの肉基質を好ましくは約200mlのアセトン
と共に乳鉢と乳棒によつて磨砕して牛、馬または羊の赤
血球からの凍結乾燥したヘモグロピンを含まない肉基質
のアセトン中の均等懸濁をつくる。アセトンは無水で新
しく開いた瓶からとらねばならぬ。1gの肉基質当りのア
セトンの容量は約100mlの少量からの実質的に200mlより
多い量まで変化してよい。懸濁物は普通約３時間還流さ
せることができるが、時間は約１ないし６時間に変化す
るであろう。懸濁物がなお温かい間にアセトンを濾して
残渣を集める；そうしなければ濾器上に若干の望ましく
ないアセトン可溶の中性脂質が沈澱する。残渣は好まし
くは温アセトンによつて充分洗いそいて風乾する。
と共に乳鉢と乳棒によつて磨砕して牛、馬または羊の赤
血球からの凍結乾燥したヘモグロピンを含まない肉基質
のアセトン中の均等懸濁をつくる。アセトンは無水で新
しく開いた瓶からとらねばならぬ。1gの肉基質当りのア
セトンの容量は約100mlの少量からの実質的に200mlより
多い量まで変化してよい。懸濁物は普通約３時間還流さ
せることができるが、時間は約１ないし６時間に変化す
るであろう。懸濁物がなお温かい間にアセトンを濾して
残渣を集める；そうしなければ濾器上に若干の望ましく
ないアセトン可溶の中性脂質が沈澱する。残渣は好まし
くは温アセトンによつて充分洗いそいて風乾する。
アセトン抽出残渣について同一還流手順を繰り返し、こ
のときには無水アセトンを100％エタノールで置き換え
る。100％エタノールによる抽出は総てではないがいく
らかの糖脂質を除去する。エタノール抽出液を明け、そ
して残渣は乾かす。アセトンおよびエタノール抽出残渣
は再び還流させるが、好ましくは約75％水性エタノール
により、しかし約50％と約80％の間の水性エタノールの
溶液を使うことができる。上澄液を濾し分けて傍にお
く。次いで等量の水性エタノールで残渣を洗う。洗つた
残渣は捨てる。抽出液および総ての洗浄液は合体し、濃
縮し透析して塩を除きそして普通のやり方で凍結乾燥さ
せる。別法として、水性エタノール抽出液およびその洗
滌液は合体し、濃縮し、水に対して透析しそして普通の
冷凍温度での貯蔵してよい。
のときには無水アセトンを100％エタノールで置き換え
る。100％エタノールによる抽出は総てではないがいく
らかの糖脂質を除去する。エタノール抽出液を明け、そ
して残渣は乾かす。アセトンおよびエタノール抽出残渣
は再び還流させるが、好ましくは約75％水性エタノール
により、しかし約50％と約80％の間の水性エタノールの
溶液を使うことができる。上澄液を濾し分けて傍にお
く。次いで等量の水性エタノールで残渣を洗う。洗つた
残渣は捨てる。抽出液および総ての洗浄液は合体し、濃
縮し透析して塩を除きそして普通のやり方で凍結乾燥さ
せる。別法として、水性エタノール抽出液およびその洗
滌液は合体し、濃縮し、水に対して透析しそして普通の
冷凍温度での貯蔵してよい。
B.牛、馬または羊の糖蛋白質を均質物に精製 Ａ段階からの凍結乾燥したエタノール抽出物を水に再び
溶かしそして約90％の水性エタノールで再沈澱させる。
少なくとも２時間氷の上に置きそして塩、例えば酢酸ナ
トリウムまたはその他の普通の塩の結晶３−４個を加え
ると沈澱の開始を助ける。典型的には白色の嵩張つた沈
澱が現われる。この沈澱は遠心分離しそして上澄液は除
去して捨てる。沈澱は次いで通例の低イオン濃度でそし
てカチオン系交換カラムを通過させてつくつた低pHの緩
衝液に対して透析する。
溶かしそして約90％の水性エタノールで再沈澱させる。
少なくとも２時間氷の上に置きそして塩、例えば酢酸ナ
トリウムまたはその他の普通の塩の結晶３−４個を加え
ると沈澱の開始を助ける。典型的には白色の嵩張つた沈
澱が現われる。この沈澱は遠心分離しそして上澄液は除
去して捨てる。沈澱は次いで通例の低イオン濃度でそし
てカチオン系交換カラムを通過させてつくつた低pHの緩
衝液に対して透析する。
カチオン系交換樹脂上のクロマトグラフイーは約４から
約６までのpH、例えば糖蛋白質が異好抗体と反応性にな
る等電焦点の上で行うのが最良である。この段階に好適
な樹脂にはホスホセルロース、カルボキシメチル セル
ロースおよび蛋白質の精製に普通使われる弱酸性アクリ
ル樹脂の何れをも含む。樹脂が低イオン濃度、低pH緩衝
液で予め平衡化した後に透析した蛋白質試料をカラムに
通す。中性および塩基性汚染物質はカラムによつて結合
されそして捨てられる。シアリン酸を含みそしてカラム
に結合しないこれらの画分を集める。これらは水に対し
て透析することができもしも望むなら凍結乾燥させる。
約６までのpH、例えば糖蛋白質が異好抗体と反応性にな
る等電焦点の上で行うのが最良である。この段階に好適
な樹脂にはホスホセルロース、カルボキシメチル セル
ロースおよび蛋白質の精製に普通使われる弱酸性アクリ
ル樹脂の何れをも含む。樹脂が低イオン濃度、低pH緩衝
液で予め平衡化した後に透析した蛋白質試料をカラムに
通す。中性および塩基性汚染物質はカラムによつて結合
されそして捨てられる。シアリン酸を含みそしてカラム
に結合しないこれらの画分を集める。これらは水に対し
て透析することができもしも望むなら凍結乾燥させる。
集めた画分、しかし好ましくは必らずしも凍結乾燥させ
なかつたものを次に処理する。もしも凍結乾燥させまた
は乾かしたときは画分はまず水にとかし、約５容量のエ
ーテル：エタノール（容量対容量比で約4:1ないし約1:
1）を次に加えそして混合物を遠心分離しそして沈降さ
せる。二相が現れ、一相は水相そして一相はジエチル
エーテルを含む。水性相を除きそして凍結乾燥させて残
留エーテルおよび水を除く。
なかつたものを次に処理する。もしも凍結乾燥させまた
は乾かしたときは画分はまず水にとかし、約５容量のエ
ーテル：エタノール（容量対容量比で約4:1ないし約1:
1）を次に加えそして混合物を遠心分離しそして沈降さ
せる。二相が現れ、一相は水相そして一相はジエチル
エーテルを含む。水性相を除きそして凍結乾燥させて残
留エーテルおよび水を除く。
ジエチル エーテルと異なる別の抽出を次いで通例の化
学の技法に従つて行う。この手順において、第一抽出段
階からの凍結乾燥した抽出物を水に溶かしそしてクロロ
ホルム／メタノールの約2:1v/vと比の約９容量中で再抽
出する。混合物は再び遠心分離しそして水性相と有機相
に分ける。分離した水性相をとり出して凍結乾燥する。
もしも凍結乾燥した物質が牛から出発したものであれば
それは本発明の部分的精製BGPである。
学の技法に従つて行う。この手順において、第一抽出段
階からの凍結乾燥した抽出物を水に溶かしそしてクロロ
ホルム／メタノールの約2:1v/vと比の約９容量中で再抽
出する。混合物は再び遠心分離しそして水性相と有機相
に分ける。分離した水性相をとり出して凍結乾燥する。
もしも凍結乾燥した物質が牛から出発したものであれば
それは本発明の部分的精製BGPである。
なお残存する主として錯体糖脂質を含む汚染物を除去す
るために、次いで凍結乾燥した糖蛋白質をEmulphogenま
たはTriton−Ｘ−100のような約１％の中性洗剤を含む
低イオン濃度の緩衝液に溶かす。この洗剤は錯体糖脂質
の溶解を助ける。低イオン濃度緩衝液で予め平衡化させ
たアニオン交換カラムにこの溶液を通す。種々の好適な
アニオン交換樹脂が購入でき、それらにはDE−52セルロ
ース、DEAE BIO−GEL ＡおよびCellex Dを含む。カラ
ムは低イオン濃度水性緩衝液によつて遂に溶出された画
分の光学的密度が緩衝液単独からなるブランク溶液水
準、普通は280ナノメーターにおいて0.1単位よりも少な
い、に戻るまで洗浄する。次いでカラムを高塩分濃度、
即ち0.3モル濃度以上のNaCl、酢酸ナトリウム、KCl、等
のような通常の塩を含む水性緩衝液で溶出する。高濃度
の塩は糖蛋白質とカチオン系樹脂間の静電的相互反応と
競合し、それによつて物質の単一ピークがプールされ
る。物質はH2Oに対して透析し、凍結乾燥しそして使用
のために保存する。
るために、次いで凍結乾燥した糖蛋白質をEmulphogenま
たはTriton−Ｘ−100のような約１％の中性洗剤を含む
低イオン濃度の緩衝液に溶かす。この洗剤は錯体糖脂質
の溶解を助ける。低イオン濃度緩衝液で予め平衡化させ
たアニオン交換カラムにこの溶液を通す。種々の好適な
アニオン交換樹脂が購入でき、それらにはDE−52セルロ
ース、DEAE BIO−GEL ＡおよびCellex Dを含む。カラ
ムは低イオン濃度水性緩衝液によつて遂に溶出された画
分の光学的密度が緩衝液単独からなるブランク溶液水
準、普通は280ナノメーターにおいて0.1単位よりも少な
い、に戻るまで洗浄する。次いでカラムを高塩分濃度、
即ち0.3モル濃度以上のNaCl、酢酸ナトリウム、KCl、等
のような通常の塩を含む水性緩衝液で溶出する。高濃度
の塩は糖蛋白質とカチオン系樹脂間の静電的相互反応と
競合し、それによつて物質の単一ピークがプールされ
る。物質はH2Oに対して透析し、凍結乾燥しそして使用
のために保存する。
SDSのような洗済中の、前にアニオン交換カラム上でク
ロマトグラフ処理をし、透析した凍結乾燥した物質のポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動、クマシー ブルー染
料または過沃素酸シツフ試薬で着色した後に本質的に一
つのバンドを生じる。洗剤中のポリアクリルアミド ゲ
ル電気泳動は蛋白質試料と均質性を確かめるためおよび
分子量を推定するための周知の技法である。例えば次を
参照のこと;Fletcher,M.A.等Biochem.Biophys,Acta.27
8,163（1972）。
ロマトグラフ処理をし、透析した凍結乾燥した物質のポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動、クマシー ブルー染
料または過沃素酸シツフ試薬で着色した後に本質的に一
つのバンドを生じる。洗剤中のポリアクリルアミド ゲ
ル電気泳動は蛋白質試料と均質性を確かめるためおよび
分子量を推定するための周知の技法である。例えば次を
参照のこと;Fletcher,M.A.等Biochem.Biophys,Acta.27
8,163（1972）。
C.本発明の精製した糖蛋白質の使用 出願人が行つた実験において、本発明の糖蛋白質製品は
感染性単核症の患者からの血清による羊の赤血球の凝集
反応の強い防止剤であつた。受容者の特性は糖蛋白質の
ノイラミニダーゼによる前処理によつて終つた。
感染性単核症の患者からの血清による羊の赤血球の凝集
反応の強い防止剤であつた。受容者の特性は糖蛋白質の
ノイラミニダーゼによる前処理によつて終つた。
ここに記述するいずれの免疫的試験も、またはその明ら
かな変更も本発明の糖蛋白質の精製した形態に適用でき
る、その形態には部分的に精製したBGP、本質的に均質
なBGP、本質的に均質なHGP、および本質的に均質なSGP
を含む。
かな変更も本発明の糖蛋白質の精製した形態に適用でき
る、その形態には部分的に精製したBGP、本質的に均質
なBGP、本質的に均質なHGP、および本質的に均質なSGP
を含む。
本発明の何れの糖蛋白質生成物も人の伝染性単核症の診
断および／または監視のためのラテツクス ビーヅ試験
に使用できる。
断および／または監視のためのラテツクス ビーヅ試験
に使用できる。
1.ラテツクス ビーズ試験 本発明の何れの精製した糖蛋白質の担体粒子への化学的
結合も種々の方法で達成できる。ポリスチレン、ポリ
（メチルメタクリレート）のような合成ポリマーで成る
粒子または何れの合成ラツテクスもそれらが長期の貯蔵
間に高い安定性があるために微小細胞よりも好ましい。
一般にビーズまたは粒子は一つまたは一つ以上の第一ア
ミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはヒドロキシ
ル基のような遊離官能基を有すべきである。蛋白質を合
成ポリマーから成る担体粒子へのカプリングの種々の方
法は、なかでも米国特許第4,046,723;3,882,224;3,857,
931;3,639,558各号を含む文献中に検討されている。ラ
テツクス ビーズを本発明の糖蛋白質にカプリングする
好ましい方法において、糖蛋白質を約0.25％（水中）の
カルボキシル−変性、均質ラテツクス粒子に添加する。
混合物は少なくとも約30分かきまぜる。pHは約４ないし
約６の間に保つ。次いで、例えば１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒドロク
ロリドのような置換アルボジイミドと最少量の水に新た
につくつた溶液を加える。このカルボジイミドはその最
終濃度が約0.1M程度になるような量で加える。７より下
のpHを少なくとも１時間保ち、次いで混合物を一晩また
はそれ以上かきまぜる。粒子は交互に低pH（約４）の水
性緩衝液次いで高pH（約８）の水性緩衝液で洗い、そし
て最後に２回蒸溜水で洗う。本発明のカプルした糖蛋白
質を含むビーズは次いで高い水性pH緩衝液（約８）中に
約１％の濃度で貯蔵する。
結合も種々の方法で達成できる。ポリスチレン、ポリ
（メチルメタクリレート）のような合成ポリマーで成る
粒子または何れの合成ラツテクスもそれらが長期の貯蔵
間に高い安定性があるために微小細胞よりも好ましい。
一般にビーズまたは粒子は一つまたは一つ以上の第一ア
ミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはヒドロキシ
ル基のような遊離官能基を有すべきである。蛋白質を合
成ポリマーから成る担体粒子へのカプリングの種々の方
法は、なかでも米国特許第4,046,723;3,882,224;3,857,
931;3,639,558各号を含む文献中に検討されている。ラ
テツクス ビーズを本発明の糖蛋白質にカプリングする
好ましい方法において、糖蛋白質を約0.25％（水中）の
カルボキシル−変性、均質ラテツクス粒子に添加する。
混合物は少なくとも約30分かきまぜる。pHは約４ないし
約６の間に保つ。次いで、例えば１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ヒドロク
ロリドのような置換アルボジイミドと最少量の水に新た
につくつた溶液を加える。このカルボジイミドはその最
終濃度が約0.1M程度になるような量で加える。７より下
のpHを少なくとも１時間保ち、次いで混合物を一晩また
はそれ以上かきまぜる。粒子は交互に低pH（約４）の水
性緩衝液次いで高pH（約８）の水性緩衝液で洗い、そし
て最後に２回蒸溜水で洗う。本発明のカプルした糖蛋白
質を含むビーズは次いで高い水性pH緩衝液（約８）中に
約１％の濃度で貯蔵する。
感染性単核症の試験を行うために、糖蛋白質ラテツクス
ビーズを約0.25％（w/v）程度の濃度に緩衝液中で希
釈する。認めうる程の低い濃度の試薬は容易に目視でき
る凝集し、一方認めうる高濃度は蛋白質結合担体粒子の
浪費を来らせる。緩衝液中の順次的希釈を試験抗血清ま
たは血清のような生物学的液体で行う。そのような希釈
液の１滴を血清学的環スライド中の溜めのセラミツク環
内の糖蛋白質ラテツクス ビーズ試薬の１滴に加える。
スライドを短かく回転させて抗血清または血清とラテツ
クス試薬を混合し、そして凝集反応を目視によつて測定
する。滴定の終点は可視凝集を与える血清の最高希釈
（即ち最も薄い濃度）として決定する。凝集反応試験に
対してはその他の容器を使うことができる、例えば、Co
oke Engi−neering Co.からのＵ−形状の溜めを有する
ポリスチレン ミクロ滴定板があるが、そのような溜め
の中で凝集反応を読むことはより困難である。
ビーズを約0.25％（w/v）程度の濃度に緩衝液中で希
釈する。認めうる程の低い濃度の試薬は容易に目視でき
る凝集し、一方認めうる高濃度は蛋白質結合担体粒子の
浪費を来らせる。緩衝液中の順次的希釈を試験抗血清ま
たは血清のような生物学的液体で行う。そのような希釈
液の１滴を血清学的環スライド中の溜めのセラミツク環
内の糖蛋白質ラテツクス ビーズ試薬の１滴に加える。
スライドを短かく回転させて抗血清または血清とラテツ
クス試薬を混合し、そして凝集反応を目視によつて測定
する。滴定の終点は可視凝集を与える血清の最高希釈
（即ち最も薄い濃度）として決定する。凝集反応試験に
対してはその他の容器を使うことができる、例えば、Co
oke Engi−neering Co.からのＵ−形状の溜めを有する
ポリスチレン ミクロ滴定板があるが、そのような溜め
の中で凝集反応を読むことはより困難である。
2.本発明の均質糖蛋白質を使用する免疫試験 放射線免疫試験を含めて多くの型の免疫試験がこの技術
では知られておりそして本発明の均質糖蛋白質の検出お
よび／または定量に使うことができる。免疫試験は、例
えば125I、131I、3Hまたは14C、または何等かその他の
容易にそして便利に使うことができるその他の放射性同
位体のような放射能を有する付箋を抗原に対して用いる
ことができる。抗原に付箋をつけるその他の方法にはフ
ルオロゲン、クロモフオア、酵素または発光付箋の結合
を含む。遊離の（即ち結合していない）抗原から抗体−
抗原錯体を分離する多数の方法が知られておりそれには
抗体の沈澱（二重抗体）が含まれる。その他の既知の技
法中には個体支持マトリクスがあり、固相試験としても
知られ、そこでは抗原−抗体の対の一成分を固定するた
めにガラス、シリカまたはプラスチツクのビーズまたは
単一のプラスチツク インサートを使用する。
では知られておりそして本発明の均質糖蛋白質の検出お
よび／または定量に使うことができる。免疫試験は、例
えば125I、131I、3Hまたは14C、または何等かその他の
容易にそして便利に使うことができるその他の放射性同
位体のような放射能を有する付箋を抗原に対して用いる
ことができる。抗原に付箋をつけるその他の方法にはフ
ルオロゲン、クロモフオア、酵素または発光付箋の結合
を含む。遊離の（即ち結合していない）抗原から抗体−
抗原錯体を分離する多数の方法が知られておりそれには
抗体の沈澱（二重抗体）が含まれる。その他の既知の技
法中には個体支持マトリクスがあり、固相試験としても
知られ、そこでは抗原−抗体の対の一成分を固定するた
めにガラス、シリカまたはプラスチツクのビーズまたは
単一のプラスチツク インサートを使用する。
本発明の均質糖蛋白質に付箋をつける好ましい方法は
125Iによるもの、即ち放射性標示でこれはミクログラム
の蛋白質につき検出しうる崩壊速度の事項で測定して極
めて高い特質的活性を有する標示した抗原を生じること
ができる。
125Iによるもの、即ち放射性標示でこれはミクログラム
の蛋白質につき検出しうる崩壊速度の事項で測定して極
めて高い特質的活性を有する標示した抗原を生じること
ができる。
糖蛋白質は125Iによつて約１マイクロキユーリー／マイ
クログラムの特殊な活性に、この技術で知られた種々の
方法の一つによつて標示することができ、その方法は例
えばラクトペルオキシドース、クロルアミン−Ｔ標示、
またはIodogen〔Fraker,P.J.＆J.C.Speck,Biochem.Bio
−phys.Res.Commun.80,849（1978）〕である。標示した
蛋白は未反応遊離125Iからゲル濾過によつて分離するこ
とができる。125 I−標示均質糖蛋白質、例えば125I−BGPをベースと
する好ましい免疫試験は競争的放射線免疫試験である。
競争的放射線免疫試験の原理は標示抗原が非標示抗原と
血清中の抗体の同一結合部分で争うことである。例えば
次を参照のこと:Kabat,E（1976）Structural Concepts
in Immunology and Immunochemistry Holt,Richard Win
ston。抗体−抗原錯体の遊離抗原からの分離は結合した
抗原の量の測定を可能にする。この周知の検査は多くの
変化があり、例えば、何れの非標示抗原が標示抗原に対
し最大の類似性を有するかを測定するために種々の非標
示抗原を試験する。他の変化は標準化した放射線標示の
および非標示の抗原を、多数の試験血清の多数の希釈物
のそれぞれからの試料に対して、何れかの血清中の特殊
な抗体の滴定量を得る目的で標準化量を試験する。これ
は試験抗血清によつて結合した放射性抗原の相対的量を
測定しそしてこの量を試験抗血清として同一希釈の対照
抗血清によつて結合した量とを比較して行われる。
クログラムの特殊な活性に、この技術で知られた種々の
方法の一つによつて標示することができ、その方法は例
えばラクトペルオキシドース、クロルアミン−Ｔ標示、
またはIodogen〔Fraker,P.J.＆J.C.Speck,Biochem.Bio
−phys.Res.Commun.80,849（1978）〕である。標示した
蛋白は未反応遊離125Iからゲル濾過によつて分離するこ
とができる。125 I−標示均質糖蛋白質、例えば125I−BGPをベースと
する好ましい免疫試験は競争的放射線免疫試験である。
競争的放射線免疫試験の原理は標示抗原が非標示抗原と
血清中の抗体の同一結合部分で争うことである。例えば
次を参照のこと:Kabat,E（1976）Structural Concepts
in Immunology and Immunochemistry Holt,Richard Win
ston。抗体−抗原錯体の遊離抗原からの分離は結合した
抗原の量の測定を可能にする。この周知の検査は多くの
変化があり、例えば、何れの非標示抗原が標示抗原に対
し最大の類似性を有するかを測定するために種々の非標
示抗原を試験する。他の変化は標準化した放射線標示の
および非標示の抗原を、多数の試験血清の多数の希釈物
のそれぞれからの試料に対して、何れかの血清中の特殊
な抗体の滴定量を得る目的で標準化量を試験する。これ
は試験抗血清によつて結合した放射性抗原の相対的量を
測定しそしてこの量を試験抗血清として同一希釈の対照
抗血清によつて結合した量とを比較して行われる。
本発明の範囲に入る変化はまたフルオロゲン、クロマト
フォア、発光物質または酵素のような糖蛋白質に対する
非−放射性付箋を使用する競争的放射線免疫検査を含
む。
フォア、発光物質または酵素のような糖蛋白質に対する
非−放射性付箋を使用する競争的放射線免疫検査を含
む。
遊離抗原から抗体−抗原錯体を分離するための多くの方
法がこの技術では知られている。例えば本発明の均質BG
Pに利用しうる一つの方法は固相、サンドイツチ型免疫
試験である。この方法では、好ましくは容易に鋏で切る
ことができそして円底溜めを有する物質でつくつたマイ
クロ滴定板を各溜の中に約２マイクログラムの均質BGP
を約200マイクロ立の水性緩衝塩溶液と共に一晩おいて
被覆した。最も好適にはこの段階は乾燥を防ぐために湿
つた部屋で行う。
法がこの技術では知られている。例えば本発明の均質BG
Pに利用しうる一つの方法は固相、サンドイツチ型免疫
試験である。この方法では、好ましくは容易に鋏で切る
ことができそして円底溜めを有する物質でつくつたマイ
クロ滴定板を各溜の中に約２マイクログラムの均質BGP
を約200マイクロ立の水性緩衝塩溶液と共に一晩おいて
被覆した。最も好適にはこの段階は乾燥を防ぐために湿
つた部屋で行う。
次いで溜めをアスピレーターで空になし、少なくとも１
回水性緩衝塩で洗いそして水性緩衝塩中の蛋白質担体の
溶液で充たす。蛋白質担体は溜めの内部、または固相の
始めの段階で添加した精製したBGPによつて結合しなか
つた何れの部位もブロツクする。溜めを被覆するために
使用する蛋白質担体の典型的溶液は、例えば約0.05％か
ら約0.2％までの範囲の濃度範囲のゼラチン、やぎの血
清アルブミン、免の血清アルブム、または卵黄アルブミ
ンである。この試験においては牛の血清アルブミンは蛋
白質担体として使用すべきではないなぜなればそれは均
質性牛の糖蛋白質への特殊の結合を妨げるかもしれない
からである。板は担体溶液を少なくとも１時間置き溜め
の均一な被覆を得るために静かにかきまぜまたは混合す
る。
回水性緩衝塩で洗いそして水性緩衝塩中の蛋白質担体の
溶液で充たす。蛋白質担体は溜めの内部、または固相の
始めの段階で添加した精製したBGPによつて結合しなか
つた何れの部位もブロツクする。溜めを被覆するために
使用する蛋白質担体の典型的溶液は、例えば約0.05％か
ら約0.2％までの範囲の濃度範囲のゼラチン、やぎの血
清アルブミン、免の血清アルブム、または卵黄アルブミ
ンである。この試験においては牛の血清アルブミンは蛋
白質担体として使用すべきではないなぜなればそれは均
質性牛の糖蛋白質への特殊の結合を妨げるかもしれない
からである。板は担体溶液を少なくとも１時間置き溜め
の均一な被覆を得るために静かにかきまぜまたは混合す
る。
溜めはアスピレーシヨンによつて再び空になし水性緩衝
塩によつて２−５回、好ましくは３回洗い、次いで約20
0マイクロリツターの適当に希釈した血清試料を各溜め
に加える。この段階は抗原を特殊の抗体に結合する。板
は抗体抗原と平衡させるために例えば室温で一晩、好ま
しくは湿つた部屋の中で乾燥を妨ぎながら置く。
塩によつて２−５回、好ましくは３回洗い、次いで約20
0マイクロリツターの適当に希釈した血清試料を各溜め
に加える。この段階は抗原を特殊の抗体に結合する。板
は抗体抗原と平衡させるために例えば室温で一晩、好ま
しくは湿つた部屋の中で乾燥を妨ぎながら置く。
溜めは三度目のアスピレーシヨンで空になし５回洗い、
次いで約10,000cpm（１分間のカウント数）の125I−均
質BGPを適宜担蛋白質中で希釈したものを（例えば水性
緩衝塩中の0.1％卵黄アルブミン）各溜めに加え全量で
約200マイクロリツターにする。一晩おく間に放射線標
示蛋白質をなす抗原に対して利用できる抗体上の結合部
位と平衡させる。
次いで約10,000cpm（１分間のカウント数）の125I−均
質BGPを適宜担蛋白質中で希釈したものを（例えば水性
緩衝塩中の0.1％卵黄アルブミン）各溜めに加え全量で
約200マイクロリツターにする。一晩おく間に放射線標
示蛋白質をなす抗原に対して利用できる抗体上の結合部
位と平衡させる。
各溜め中の内容物を四度目のアスピレーシヨンで取出
し、そして各溜めを少なくとも３回水性緩衝塩で洗う。
プレートを６時間風乾し、次いでそれらの溜めを鋏で切
り離し、そして放射能を通例のカウンターで数える。
125Iに対しては１分間のカウントが合理的正確度に対し
て通常充分である。
し、そして各溜めを少なくとも３回水性緩衝塩で洗う。
プレートを６時間風乾し、次いでそれらの溜めを鋏で切
り離し、そして放射能を通例のカウンターで数える。
125Iに対しては１分間のカウントが合理的正確度に対し
て通常充分である。
以下の実施例はさらに本発明の生成物を説明する。下記
の実施例においては糖蛋白質はBGP、HGPまたはSGPの何
れでもよい。
の実施例においては糖蛋白質はBGP、HGPまたはSGPの何
れでもよい。
実施例１ 血液からヘモグロビンを含まないストローマの製造 新鮮な血液をと殺時の羊および馬から抗凝固剤シトラー
ト−デキストロース溶液中で静脈穿刺によつて集めた。
血液は約24時間４℃に保ちそして約2500RPMで約20分間
遠心分離してペレツト赤血球にした。上澄および中間細
胞層を除去した。赤血球を冷たい0.12MNacl、0.05燐酸
ナトリウム緩衝液の約pH7.4の同量のもので３回洗つ
た。
ト−デキストロース溶液中で静脈穿刺によつて集めた。
血液は約24時間４℃に保ちそして約2500RPMで約20分間
遠心分離してペレツト赤血球にした。上澄および中間細
胞層を除去した。赤血球を冷たい0.12MNacl、0.05燐酸
ナトリウム緩衝液の約pH7.4の同量のもので３回洗つ
た。
各洗浄段階において、細胞は緩衝液中に懸濁させ、次い
で約2500RPMにおいて約20分間遠心分離した。遠心分離
後、懸濁剤および残留軟膜をアスピレートした。この手
順を三回繰り返しその結果軟膜除去のために赤血球の全
容量は25％損失した。
で約2500RPMにおいて約20分間遠心分離した。遠心分離
後、懸濁剤および残留軟膜をアスピレートした。この手
順を三回繰り返しその結果軟膜除去のために赤血球の全
容量は25％損失した。
実施例２ 均質糖蛋白質の単離および精製 洗つた赤血球を９容量の0.005M燐酸ナトリウムに約8.0
のpHでとかした。細胞膜は13,000×ｇで45分間４℃にお
いて遠心分離してペレツト化した。上澄を吸収して捨て
た。細胞膜層は次いで赤色ペレツトから傾瀉した。上記
の手順を細胞がクリーム白になるまでくり返した。細胞
膜は還流下でアセトン、無水アルコールおよび75％エタ
ノールによつて逐次抽出した。75％エタノール抽出液を
少量になるまで真空蒸溜によつて濃縮し、透析しそして
凍結乾燥した。これは粗抽出物でこれを一連の段階でさ
らに精製した。75％エタノール抽出物をエタノールから
沈澱させ次いで0.02Mくえん酸ナトリウムにpH4.1でとか
しそして同一緩衝液で平衡化し溶出させたフオスフオセ
ルロース カラムに入れた。カラル流出液はシアリン
酸、ヘキソースおよび280ナトメーターにおいて光学密
度を監視した。シアリン酸は空になるときに現われそし
て透析した。水中の2mg/mlの濃度で糖蛋白質を30分間０
℃で５容量のジエチルエーテル：エタノール（4:1v/v）
と共に混合した。水性相を凍結乾燥しそして再度ジエチ
ル エーテル：エタノールで抽した。10mg/mlの水中の
濃度で糖蛋白質を９容量のクロロホルム：メタノール
（2:1v/v）によつて30分間23℃において抽出しそちて20
00RPMで30分間遠心分離した。水性層を凍結乾燥しそし
て0.05M Tris−HClで１％のEmulphogeneBC−720（GAF,N
eW York,N.Y）を含む緩衝液にとかしそして0.5M Tris−
HCl緩衝液でpH8.0で平衡させたWhatman DE−52セルロー
ス カラム中に入れた。カラムは0.0→0.5M NaClに漸増
する緩衝液で溶出した。精製した糖蛋白質は単一ピーク
として溶出されそして透析しそして凍結乾燥した。
のpHでとかした。細胞膜は13,000×ｇで45分間４℃にお
いて遠心分離してペレツト化した。上澄を吸収して捨て
た。細胞膜層は次いで赤色ペレツトから傾瀉した。上記
の手順を細胞がクリーム白になるまでくり返した。細胞
膜は還流下でアセトン、無水アルコールおよび75％エタ
ノールによつて逐次抽出した。75％エタノール抽出液を
少量になるまで真空蒸溜によつて濃縮し、透析しそして
凍結乾燥した。これは粗抽出物でこれを一連の段階でさ
らに精製した。75％エタノール抽出物をエタノールから
沈澱させ次いで0.02Mくえん酸ナトリウムにpH4.1でとか
しそして同一緩衝液で平衡化し溶出させたフオスフオセ
ルロース カラムに入れた。カラル流出液はシアリン
酸、ヘキソースおよび280ナトメーターにおいて光学密
度を監視した。シアリン酸は空になるときに現われそし
て透析した。水中の2mg/mlの濃度で糖蛋白質を30分間０
℃で５容量のジエチルエーテル：エタノール（4:1v/v）
と共に混合した。水性相を凍結乾燥しそして再度ジエチ
ル エーテル：エタノールで抽した。10mg/mlの水中の
濃度で糖蛋白質を９容量のクロロホルム：メタノール
（2:1v/v）によつて30分間23℃において抽出しそちて20
00RPMで30分間遠心分離した。水性層を凍結乾燥しそし
て0.05M Tris−HClで１％のEmulphogeneBC−720（GAF,N
eW York,N.Y）を含む緩衝液にとかしそして0.5M Tris−
HCl緩衝液でpH8.0で平衡させたWhatman DE−52セルロー
ス カラム中に入れた。カラムは0.0→0.5M NaClに漸増
する緩衝液で溶出した。精製した糖蛋白質は単一ピーク
として溶出されそして透析しそして凍結乾燥した。
実施例３ 赤血球糖蛋白質−ラテツクス ビーズ試薬 実施例２のようにして単離した糖製赤血球糖蛋白質を0.
455ミクロン平均直径のカルボキシル−変性均質ラテツ
クス粒子（Dow Diagnostics）の水中0.25％懸濁物とカ
プルさせた。混合物をpHを５±１に保ちながら22−25℃
においてかきまぜた。次いで新たに最少量の水にとかし
た１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド−ヒドロクロリトドを加えて最終濃度を0.
1Mとした。pHを5.5に１時間保ち、そして混合物を22−2
5℃で18時間かきまぜた。粒子は0.1Mグリシン、0.15M N
aCl、7mM CaCl2（GBS）を含む緩衝液でpH4.0においてそ
して次にpH8.0で交互に洗いそして２回蒸溜水で洗つ
た。各洗浄の間に粒子は17,000×ｇで20分間遠心分離し
た。糖蛋白質ラテツクスビーズ試薬は次いでGBS中１％
濃度にpH8.3にうすめそして４℃で貯えた。使用前に試
薬は0.25％にGBSでうすめた。
455ミクロン平均直径のカルボキシル−変性均質ラテツ
クス粒子（Dow Diagnostics）の水中0.25％懸濁物とカ
プルさせた。混合物をpHを５±１に保ちながら22−25℃
においてかきまぜた。次いで新たに最少量の水にとかし
た１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド−ヒドロクロリトドを加えて最終濃度を0.
1Mとした。pHを5.5に１時間保ち、そして混合物を22−2
5℃で18時間かきまぜた。粒子は0.1Mグリシン、0.15M N
aCl、7mM CaCl2（GBS）を含む緩衝液でpH4.0においてそ
して次にpH8.0で交互に洗いそして２回蒸溜水で洗つ
た。各洗浄の間に粒子は17,000×ｇで20分間遠心分離し
た。糖蛋白質ラテツクスビーズ試薬は次いでGBS中１％
濃度にpH8.3にうすめそして４℃で貯えた。使用前に試
薬は0.25％にGBSでうすめた。
実施例４ 糖蛋白ラテツクス カプル ビーズちよるラテツクス
スライド試験 実施例３−糖蛋白質−ラテツクス ビーズ試薬を血清学
的リング スライド、7.9×12.1cm（Scientific Produc
ts）上で行つたラテツクス試験に使用した。血清の試験
区域の二重希釈をGBS（pH8.3）中で行つた。次に各血清
希釈液１滴をスライド状のセラミツクリング内で糖蛋白
ラツテクス ビーズ試薬１滴に加える。このスライドを
トーマス クリニカル ローテイターで22〜25℃で５分
間1500RPMで回転する。凝集を顕微鏡検査によつて測定
する。滴定の終末は対照のラテツクス懸濁液に比較して
目に見えるクランプを与える血清の最大希釈と考えた。
スライド試験 実施例３−糖蛋白質−ラテツクス ビーズ試薬を血清学
的リング スライド、7.9×12.1cm（Scientific Produc
ts）上で行つたラテツクス試験に使用した。血清の試験
区域の二重希釈をGBS（pH8.3）中で行つた。次に各血清
希釈液１滴をスライド状のセラミツクリング内で糖蛋白
ラツテクス ビーズ試薬１滴に加える。このスライドを
トーマス クリニカル ローテイターで22〜25℃で５分
間1500RPMで回転する。凝集を顕微鏡検査によつて測定
する。滴定の終末は対照のラテツクス懸濁液に比較して
目に見えるクランプを与える血清の最大希釈と考えた。
例５125 Iで標識した精製糖蛋白 例２からの精製糖蛋白100ミクログラムを125I100マイク
ロキューリーで標識する。0.4マイクログラムの1,3,4,6
−テトラクロロ−3a,6a−ジフエニルグリコールウリル
（II a）（Pierce Chemical社、Rockford I11）を含有
するメチレン クロリド溶液20マイクロリツター部を試
験管にいれ、試験管を37℃の浴で回転させてメチレン
クロリドを蒸発させると底部にIIの薄いフイルムが形成
する。もう一つの試験管にpH8.2ボレート−サラインバ
ツフアー中で精製糖蛋白質100マイクログラム、ヨウ化
カリウム0.11マイクログラムおよび125I100マイクロキ
ユーリーを加える。この混合物の最終容量をボレート−
サラインバツフアで100μに調整する。試験管は０〜
２℃にした後、糖蛋白溶液をII aを含む試験に移して反
応を開始する。０〜２℃でおだやかに撹拌しながら５分
間反応を進める。残留グリコールウリルからこの混合物
をデカントして反応を止める。ヨウ素化の効率を測定す
るため５マイクロリツターの反応混合物を10マイクロリ
ツターのボレート−サライン中で0.1mgの牛血清アルブ
ミンと混合させ、次いで1ml冷10％トリクロル酢酸と混
合する。30分間０〜２゜に放置した後この混合物を遠心
分離する。ペレツトを1mlの新しい10％トリクロル酢酸
と混合し、この混合物を再び遠心分離する。次に蛋白沈
殿物を1mlの0.1M水酸化ナトリウムに溶かす。この標識
された蛋白をセフアデツクスＧ−50カラムクロマトグラ
フイーにより遊離のヨウ素と分ける。比放射能は１マイ
クログラム糖蛋白当たり１マイクロキユーリーである。
ロキューリーで標識する。0.4マイクログラムの1,3,4,6
−テトラクロロ−3a,6a−ジフエニルグリコールウリル
（II a）（Pierce Chemical社、Rockford I11）を含有
するメチレン クロリド溶液20マイクロリツター部を試
験管にいれ、試験管を37℃の浴で回転させてメチレン
クロリドを蒸発させると底部にIIの薄いフイルムが形成
する。もう一つの試験管にpH8.2ボレート−サラインバ
ツフアー中で精製糖蛋白質100マイクログラム、ヨウ化
カリウム0.11マイクログラムおよび125I100マイクロキ
ユーリーを加える。この混合物の最終容量をボレート−
サラインバツフアで100μに調整する。試験管は０〜
２℃にした後、糖蛋白溶液をII aを含む試験に移して反
応を開始する。０〜２℃でおだやかに撹拌しながら５分
間反応を進める。残留グリコールウリルからこの混合物
をデカントして反応を止める。ヨウ素化の効率を測定す
るため５マイクロリツターの反応混合物を10マイクロリ
ツターのボレート−サライン中で0.1mgの牛血清アルブ
ミンと混合させ、次いで1ml冷10％トリクロル酢酸と混
合する。30分間０〜２゜に放置した後この混合物を遠心
分離する。ペレツトを1mlの新しい10％トリクロル酢酸
と混合し、この混合物を再び遠心分離する。次に蛋白沈
殿物を1mlの0.1M水酸化ナトリウムに溶かす。この標識
された蛋白をセフアデツクスＧ−50カラムクロマトグラ
フイーにより遊離のヨウ素と分ける。比放射能は１マイ
クログラム糖蛋白当たり１マイクロキユーリーである。
例６ 糖蛋白放射免疫検定 この固着サンドイツチタイプ免疫検定は、例２の均一な
糖蛋白を用いる。ポリスチレンミクロタイタープレート
（Ｖ−bottom,Cooke Engineering Co.,U.S.A.）のウエ
ルをホスフエート200マイクロリツターのホスフエート
バツフアー サライン（PBS）中精製糖蛋白２マイクロ
グラムでインキユベートすることにより精製糖蛋白で被
覆する。このプレートを湿つた部屋の中で22〜25℃で一
夜インキュベートする。ウエルをアスピレーシヨンによ
つて空にしPBS中で３回洗浄する。次にこのウエルにPBS
中の0.1％ゼラチンを満たし、コルテイス ラボラトリ
ーズ ミクロミキサーで１時間22〜25℃でインキユベー
トする。次にアスピレーシヨンによりウエルを空にしPB
S中で３回洗浄する。各ウエルに200マイクロリツターの
適当に希釈した血清を加える。プレートを湿つた部屋の
中で22−25℃で一夜インキユベートする。ウエルを空に
して２のPBS中で撹拌しながら洗浄する。PBST中0.05
％牛血清アルブミン（BSA）中で適当に希釈した125I−
標式赤血球糖蛋白を200マイクロリツターの容量で各ウ
エルに加える。プレートを一夜インキユベートする。各
ウエルの内容物をアスピレートし、PBSで３回洗浄す
る。プレートが風乾する。各ウエルをはさみで切断し、
放射能をガンマー シンチレーシヨン カウンター中で
測定する。
糖蛋白を用いる。ポリスチレンミクロタイタープレート
（Ｖ−bottom,Cooke Engineering Co.,U.S.A.）のウエ
ルをホスフエート200マイクロリツターのホスフエート
バツフアー サライン（PBS）中精製糖蛋白２マイクロ
グラムでインキユベートすることにより精製糖蛋白で被
覆する。このプレートを湿つた部屋の中で22〜25℃で一
夜インキュベートする。ウエルをアスピレーシヨンによ
つて空にしPBS中で３回洗浄する。次にこのウエルにPBS
中の0.1％ゼラチンを満たし、コルテイス ラボラトリ
ーズ ミクロミキサーで１時間22〜25℃でインキユベー
トする。次にアスピレーシヨンによりウエルを空にしPB
S中で３回洗浄する。各ウエルに200マイクロリツターの
適当に希釈した血清を加える。プレートを湿つた部屋の
中で22−25℃で一夜インキユベートする。ウエルを空に
して２のPBS中で撹拌しながら洗浄する。PBST中0.05
％牛血清アルブミン（BSA）中で適当に希釈した125I−
標式赤血球糖蛋白を200マイクロリツターの容量で各ウ
エルに加える。プレートを一夜インキユベートする。各
ウエルの内容物をアスピレートし、PBSで３回洗浄す
る。プレートが風乾する。各ウエルをはさみで切断し、
放射能をガンマー シンチレーシヨン カウンター中で
測定する。
例７ Ｅ−ロゼツト（Rosette）阻止検定 ヒトリンパ球を末梢ペパリン化静脈血のサンプルから単
離する。リンパ球をグラジエント遠心分離によつて単離
する。このリンパ球単離はRPMIメジウム、上記のリンパ
球分離メジウム（LSM,Litton Bionetics）で1:2に希釈
した血液を層化することにより行なう。試験管を約400
×ｇで約45分間遠心分離する。単核細胞をインターフエ
ースから集め洗浄し、計数する。種々の量の糖蛋白を末
梢血液リンパ球と約20℃で約30分間インキユベートす
る。次に洗浄した羊の赤血球を赤血球：末梢血液リンパ
球が40:1になるように加える。この混合物を約20℃で約
５分間約200×ｇで遠心分離し、ロゼツトを計数する前
に約40℃で一夜インキユベートする。１個のリンパ球に
付着した３個またはそれ以上の赤血球を１ロゼツトと見
做した。
離する。リンパ球をグラジエント遠心分離によつて単離
する。このリンパ球単離はRPMIメジウム、上記のリンパ
球分離メジウム（LSM,Litton Bionetics）で1:2に希釈
した血液を層化することにより行なう。試験管を約400
×ｇで約45分間遠心分離する。単核細胞をインターフエ
ースから集め洗浄し、計数する。種々の量の糖蛋白を末
梢血液リンパ球と約20℃で約30分間インキユベートす
る。次に洗浄した羊の赤血球を赤血球：末梢血液リンパ
球が40:1になるように加える。この混合物を約20℃で約
５分間約200×ｇで遠心分離し、ロゼツトを計数する前
に約40℃で一夜インキユベートする。１個のリンパ球に
付着した３個またはそれ以上の赤血球を１ロゼツトと見
做した。
例８ 牛から集めた新鮮な血液を用いて例１〜７を繰返し、同
様の結果を得た。
様の結果を得た。
本発明はその特定の具体例について記述されたが、さら
に種々と態様が考えられる。本願は一般に本発明の種々
の応用、用途もしくは適用を含むものと理解されるべき
である。
に種々と態様が考えられる。本願は一般に本発明の種々
の応用、用途もしくは適用を含むものと理解されるべき
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｉｎｔ． Ａｒｃｈｓ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎ． ｖｏｌ．51 Ｎｏ．６ Ｐ．696−708（1976) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ ｖｏｌ．117 Ｎｏ．３ Ｐ．722 −729（1976) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ. 11 Ｎｏ．３ Ｐ．256−262（1980) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ. 14 Ｎｏ．１ Ｐ．51−58（1977) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ ｖｏｌ．107 Ｎｏ．３ Ｐ．842 −853（1971) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ. 251 Ｎｏ．11 Ｐ．3500−3510（1976) Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ｖｏｌ．603 Ｎｏ．１ Ｐ．185−197（1980) Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ｖｏｌ．33 Ｎｏ. ３ Ｐ．150−163（1977) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｐｒａｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖ ｏｌ．６ Ｎｏ．２ Ｐ．275−290 （1977) Ｋｏｒｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｖｏ ｌ．10 Ｎｏ．４ Ｐ．259−277（1977)
Claims (7)
- 【請求項１】アミノ酸組成が0.5モル％の1/2シスチン、
6.2モル％のアスパラギン酸、8.8モル％のトレオニン、
7.5モル％のセリン、16.4モル％のグルタミン酸、13.9
モル％のプロリン、9.9モル％のグリシン、5.0モル％の
アラニン、5.0モル％のバリン、1.8モル％のメチオニ
ン、5.3モル％のイソロイシン、7.7モル％のロイシン、
0.5モル％のチロシン、3.0モル％のフェニルアラニン、
1.1モル％のヒスチジン、2.6モル％のリジン、4.8モル
％のアルギニンおよび0.2モル％のトリプトファンであ
り；糖脂質を含まず;N−グリコリルノイラミン酸、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグルコースアミン、Ｎ−アセチ
ルガラクトースアミンおよびマンノースを1:1.50:1.08:
0.54:0.09のモル比で含む23−27重量％の炭水化物含量
を有し；さらに73−77重量％の蛋白質含量およびクマシ
ーブルーまたは過ヨウ素酸変性シッフ試薬で着色した場
合にポリアクリルアミド ゲル電気泳動で単一バンドを
示し、分子量は34,000ダルトンであり、Ｎ末端アミノ酸
配列PCA−Thr−Pro−Gly−Pro−Pro−Asx−を有し、次
式で示されるＮ末端構造を有し、 （式中、PCAはピロリジンカルボキシリックアミノ酸を
表わし、Thrはトレオニンを表わし、Proはプロリンを表
わし、Glyはグリシンを表わし、Asxはアスパラギンを表
わし、NeuNGcはＮ−グリコリルノイラミン酸を表わし、
GALNacはＮ−アセチルガラクトースアミンを表わし、そ
してGALはガラクツロン酸を表わす）、そしてpH4.0より
小さい等電点を有し、等電点電気泳動でアノードゲルに
至ることを特徴とする牛赤血球由来の均質な牛の糖蛋白
質。 - 【請求項２】アミノ酸組成が0.5モル％の1/2シスチン、
6.2モル％のアスパラギン酸、8.8モル％のトレオニン、
7.5モル％のセリン、16.4モル％のグルタミン酸、13.9
モル％のプロリン、9.9モル％のグリシン、5.0モル％の
アラニン、5.0モル％のバリン、1.8モル％のメチオニ
ン、5.3モル％のイソロイシン、7.7モル％のロイシン、
0.5モル％のチロシン、3.0モル％のフェニルアラニン、
1.1モル％のヒスチジン、2.6モル％のリジン、4.8モル
％のアルギニンおよび0.2モル％のトリプトファンであ
り；糖脂質を含まず;N−グリコリルノイラミン酸、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグリコースアミン、Ｎ−アセチ
ルガラクトースアミンおよびマンノースを1:1.50:1.08:
0.54:0.09のモル比で含む23−27重量％の炭水化物含量
を有し；さらに73−77重量％の蛋白質含量およびクマシ
ーブルーまたは過ヨウ素酸変性シッフ試薬で着色した場
合にポリアクリルアミド ゲル電気泳動で単一バンドを
示し、分子量は34,000ダルトンであり、Ｎ末端アミノ酸
配列PCA−Thr−Pro−Gly−Pro−Pro−Asx−を有し、次
式で示されるＮ末端構造を有し、 （式中、PCAはピロリジンカルボキシリックアミノ酸を
表わし、Thrはトレオニンを表わし、Proはプロリンを表
わし、Glyはグリシンを表わし、Asxはアスパラギンを表
わし、NeuNGcはＮ−グリコリルノイラミン酸を表わし、
GALNacはＮ−アセチルガラクトースアミンを表わし、そ
してGALはガラクツロン酸を表わす）、そしてpH4.0より
小さい等電点を有し、等電点電気泳動でアノードゲルに
至ることを特徴とする牛赤血球由来の均質な牛の糖蛋白
質の製造方法であって、 （ａ）牛の赤血球由来の乾燥し、磨砕したヘモグロビン
を含まない間質を無水アセトン中に均一に懸濁させ； （ｂ）１時間から６時間まで還流させ、濾過し、そして
残渣を乾かし； （ｃ）前記の乾燥した残渣を100％の無水エタノール中
に懸濁させ； （ｄ）１時間から６時間還流させ、濾過し、そして残渣
を乾かし； （ｅ）（ｄ）工程からの乾燥残渣を50％から80％までの
濃度の水性エタノール中に懸濁させ、そして（ｂ）工程
を反復し； （ｆ）（ｅ）工程からの残渣を水に溶かしそして90％の
水性エタノールを加え、続いて氷の上で結晶化が起こる
までインキュベートし、遠心分離しそして固体層を低p
H、低イオン濃度の緩衝液に対して透析し； （ｇ）（ｆ）工程からと固体をクロマトグラフ カラム
上でカチオン交換樹脂に通し； （ｈ）シアル酸含量分画をカラムから集めそしてこれを
乾かし； （ｉ）（ｈ）工程からの集めた分画を既知の脂質溶剤に
よって抽出処理し、遠心分離し、水性層を集めそしてこ
れを乾かし； （ｊ）別の脂質溶剤を使用して（ｉ）工程の生成物につ
いて（ｉ）工程を反復し、そして凍結乾燥し； （Ｋ）（ｊ）工程の生成物を１％の中性洗浄剤を含む低
イオン濃度の緩衝液に溶かし； （ｌ）この溶液をアニオン交換クロマトグラフカラムに
かけ； （ｍ）低イオン濃度緩衝液で充分に洗い； （ｎ）高塩濃度の水性緩衝液によってカラムを溶離し、
そして （ｏ）（ｎ）工程の生成物を水に対して透析しそして得
られた生成物を凍結乾燥した形で採取する； 工程からなる製造方法。 - 【請求項３】カチオン交換樹脂がホスホセルロースであ
る特許請求の範囲第（２）項に記載の方法。 - 【請求項４】（ｉ）工程の脂質溶剤が4:1と1:1との間の
容量比のジエチルエーテルおよびエタノールである特許
請求の範囲第（２）項に記載の方法。 - 【請求項５】（ｊ）工程の脂質溶剤が2:1と容量比のク
ロロホルムおよびメタノールである特許請求の範囲第
（２）項に記載の方法。 - 【請求項６】（ｅ）工程の溶剤が75％水性エタノールで
ある特許請求の範囲第（２）項に記載の方法。 - 【請求項７】アミノ酸組成が0.5モル％の1/2シスチン、
6.2モル％のアスパラギン酸、8.8モルのトレオニン、7.
5モル％のセリン、16.4モル％のグルタミン酸、13.9モ
ル％のプロリン、9.9モル％のグリシン、5.0モル％のア
ラニン、5.0モル％のバリン、1.8モル％のメチオニン、
5.3モル％のイソロイシン、7.7モル％のロイシン、0.5
モル％のチロシン、3.0モル％のフェニルアラニン、1.1
モル％のヒスチジン、2.6モル％のリジン、4.8モル％の
アルギニンおよび0.2モル％のトリプトファンであり；
糖脂質を含まず;N−グリコリルノイラミン酸、ガラクト
ース、Ｎ−アセチルグリコースアミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトースアミンおよびマンノースを1:1.50:1.08:0.5
4:0.09のモル比で含む23−27重量％の炭水化物含量を有
し；さらに73−77重量％の蛋白質含量およびクマシーブ
ルーまたは過ヨウ素酸変性シッフ試薬で着色した場合に
ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で単一バンドを示
し、分子量は34,000ダルトンであり、Ｎ末端アミノ酸配
列PCA−Thr−Pro−Gly−Pro−Pro−Asx−を有し、次式
で示されるＮ末端構造を有し、 （式中、PCAはピロリジンカルボキシリックアミノ酸を
表わし、Thrはトレオニンを表わし、Proはプロリンを表
わし、Glyはグリシンを表わし、Asxはアスパラギンを表
わし、NeuNGcはＮ−グリコリルノイラミン酸を表わし、
GALNacはＮ−アセチルガラクトースアミンを表わし、そ
してGALはガラクツロン酸を表わす）、そしてpH4.0より
小さい等電点を有し、等電点電気泳動でアノードゲルに
至ることを特徴とする牛赤血球由来の均質な牛の糖蛋白
質を使用する感染性単核症抗体の検出方法であって、 （ａ） ラテックスまたは合成樹脂の微細粒子に上記糖
蛋白質を付加し； （ｂ） この（ａ）工程からの粒子によって平らな表面
を被覆し； （ｃ） 感染性単核症が潜伏する疑いのある患者からの
生物学的試験液体の希釈試料を加え、平らな表面を回転
させ； （ｄ） 試料の凝集反応の程度を観察し；そして （ｅ） （ｄ）工程の結果を、既知量の感染性単核症異
好性抗体を含む標準品を（ａ）から（ｄ）まで列挙した
手順の（ｃ）工程の試料と置き換えた場合に観察される
凝集と程度と比較する； 工程からなる方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24793481A | 1981-03-26 | 1981-03-26 | |
| US06/343,235 US4525459A (en) | 1982-01-27 | 1982-01-27 | New purified glycoproteins and use in diagnosing infectious mononucleosis |
| US343235 | 1982-03-09 | ||
| US356348 | 1982-03-09 | ||
| US06/356,348 US4460694A (en) | 1981-03-26 | 1982-03-09 | Bovine glycoproteins and use in diagnosing infectious mononucleosis |
| US247934 | 1994-05-24 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21671391A Division JPH05194599A (ja) | 1981-03-26 | 1991-03-04 | 哺乳類の糖蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57206694A JPS57206694A (en) | 1982-12-18 |
| JPH0735397B2 true JPH0735397B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=27400082
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57048786A Expired - Lifetime JPH0735397B2 (ja) | 1981-03-26 | 1982-03-26 | 哺乳類の糖蛋白質 |
| JP21671391A Pending JPH05194599A (ja) | 1981-03-26 | 1991-03-04 | 哺乳類の糖蛋白質 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21671391A Pending JPH05194599A (ja) | 1981-03-26 | 1991-03-04 | 哺乳類の糖蛋白質 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0061912B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0735397B2 (ja) |
| CA (1) | CA1198051A (ja) |
| DE (1) | DE3277412D1 (ja) |
| MX (1) | MX7187E (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69122280T2 (de) * | 1990-03-01 | 1997-04-24 | Hewlett Packard Co | Minimierung von Eluatbandbreiten in der Flüssigchromatographie |
-
1982
- 1982-03-23 CA CA000399058A patent/CA1198051A/en not_active Expired
- 1982-03-26 JP JP57048786A patent/JPH0735397B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-03-26 EP EP82301605A patent/EP0061912B1/en not_active Expired
- 1982-03-26 DE DE8282301605T patent/DE3277412D1/de not_active Expired
- 1982-03-26 MX MX1000082U patent/MX7187E/es unknown
-
1991
- 1991-03-04 JP JP21671391A patent/JPH05194599A/ja active Pending
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａｖｏｌ．６０３Ｎｏ．１Ｐ．１８５−１９７（１９８０） |
| Ｉｎｔ．ＡｒｃｈｓＡｌｌｅｒｇｙａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．ｖｏｌ．５１Ｎｏ．６Ｐ．６９６−７０８（１９７６） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｖｏｌ．２５１Ｎｏ．１１Ｐ．３５００−３５１０（１９７６） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｖｏｌ．１１Ｎｏ．３Ｐ．２５６−２６２（１９８０） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｖｏｌ．１４Ｎｏ．１Ｐ．５１−５８（１９７７） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｖｏｌ．１０７Ｎｏ．３Ｐ．８４２−８５３（１９７１） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｖｏｌ．１１７Ｎｏ．３Ｐ．７２２−７２９（１９７６） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅｖｏｌ．６Ｎｏ．２Ｐ．２７５−２９０（１９７７） |
| ＫｏｒｅａｎＢｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１０Ｎｏ．４Ｐ．２５９−２７７（１９７７） |
| ＶｏｘＳａｎｇｖｏｌ．３３Ｎｏ．３Ｐ．１５０−１６３（１９７７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX7187E (es) | 1987-12-23 |
| EP0061912B1 (en) | 1987-09-30 |
| EP0061912A2 (en) | 1982-10-06 |
| JPS57206694A (en) | 1982-12-18 |
| EP0061912A3 (en) | 1983-04-20 |
| JPH05194599A (ja) | 1993-08-03 |
| DE3277412D1 (en) | 1987-11-05 |
| CA1198051A (en) | 1985-12-17 |
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