JPH051995A - 金属ポルフインを用いる新規測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 不安定な試薬の使用による弊害がなく、測定
時間、労力および試料を節約できる高感度な特異的結合
測定法の提供。 【構成】 触媒とそれに結合する要素との複合体を検出
して、１種以上の結合反応により試料中の分析対象の存
在を測定する特異的結合測定法において、該検出を、
a．酸化剤の不存在下、金属ポルフィン触媒複合体を化
学発光性物質と高pＨで反応させ、b．該触媒複合体の濃
度に比例する化学発光を測定する、ことにより行うこと
を特徴とする特異的結合測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、金属ポルフィンのよう
な感光性物質を用いる新規定量法に関する。さらに詳し
くは、本発明は、一般に水溶性の分析対象を金属ポルフ
ィンを用いて定量する分野に関し、特に、診断法に用い
る化学発光検出法ならびに触媒に関する。

【０００２】

【従来の技術および課題】化学的方法に基づく測定法
は、液体媒体中に極めて低い濃度で出現する、医学、環
境および産業にとって重要な各種物質を検出定量するの
に非常に有用であるが、分析対象物質自体が強い蛍光や
化学発光を示す場合を除き、低濃度の直接検出は困難で
ある。したがって、被検物質の存在は、一般に検出段階
で、結合要素に接続されたシグナル発生分子(通常、触
媒)を用いて間接的に測定される。この検出段階の前
に、別の化学反応(通常、抗体もしくは核酸の結合反応
が含まれる)が行われる。結合要素は、抗体もしくは被
検物質のような測定中の他の分子に対して高い結合親和
性を有することにより特徴づけられる。検出のための複
合体(conjugate)をつくるのに用いられる触媒としては
酵素が使用されることが最も多い。酵素検出反応は、酵
素を一定時間特定の条件(pＨ、塩濃度、温度、基質、緩
衝液の組成など)でインキュベーションした後、酵素反
応生成物を測定することにより特徴づけられる。酵素は
本来不安定なために、酵素触媒を組込んだ測定法は、貯
蔵寿命が短い傾向があるので、酵素触媒を使わない、よ
り特異的な検出反応が要望されている。

【０００３】一方、測定法の感度は非常に重要であり、
その検出段階における検出限界は、その測定法の感度を
限定することが多いが、化学発光検出システムは、最高
の感度を提供するので好ましい方法である。化学発光反
応では、通常、化学発光性化合物(光を発生しうる化合
物)が酸化されて、光電子を生成し、この光電子が非常
に高感度な計測器でカウントされる。最も普通の化学発
光システムは、ヘム触媒もしくはヘム含有タンパク質で
触媒されるルミノールの過酸化水素による酸化反応を利
用する。種々の触媒を用いる種々の酸化システムの研究
から、過酸化水素を用いるミクロペルオキシダーゼの系
が最高の検出感度を示すことが見出されている[シュレ
ーダーおよびイーガー、アナリティカル・ケミストリー
(Ｓchroeder and Ｙeager, Ａnal．Ｃhem.)、５０
巻、１１１４〜１１２０頁、１９７８年]。ヘムを含有
するタンパク質であるセイヨウワサビペルオキシダーゼ
はルミノールの過酸化水素による酸化反応に広い用途が
見出されている。

【０００４】これらの方法は全て、過酸化水素、または
その尿素付加体もしくは亜塩素酸塩のような強酸化剤
を、高濃度(０.１mＭ〜１０mＭ)で反応混合物に添加す
る必要がある。しかし、これらの薬剤は、不安定で、貯
蔵、使用および処置に不便である。さらに、これらの方
法には反応溶液中に存在する他の物質(例えばタンパク
質)の酸化反応および化学発光性物質の酸化反応を触媒
する鉄のような他の物質による酸化反応からくる高いバ
ックグラウンドを生ずる問題がある。したがって、検出
反応溶液に、高濃度で強酸化剤を添加することに依存し
ないシステムの開発が望まれている。

【０００５】近年、化学発光法の研究は、高エネルギー
の酸化剤の添加を必要としない化学反応に焦点があてら
れている。一つの方法は、熱を用いて化学発光検出シグ
ナルを発生させる方法である[ハンメレンら、ピュアー
・アプライド・ケミストリー(Ｈummelen et al., Ｐure
Ａppl.Ｃhemistry)、５９巻、６３９〜６４４頁、１９
８７年]。他の方法は、高エネルギーを有するが安定な
ジオキセタンを、すでに含有する化学発光酵素基質を開
発する方法である[ブロンステインら、ジャーナル・オブ
・バイオルミネッセンス・アンド・ケミルミネッセンス
(Ｂronstein etal., Ｊ．Ｂiolum．Ｃhemilum.)、４
巻、９９〜１１１頁、１９８９年]。これらジオキセタ
ンの標識の安定性と高い感度は、当該技術分野の大きな
改良であるが、酵素標識を使う不利はそのままであり、
その検出反応は、通常、最高の感度を得るには、長時間
(１０分以上)を要する。最も多く市販されている化学発
光システムは、過酸化水素と作用してルミノールを酸化
する鉄ポルフィリンタンパク質錯体を用いるが、過酸化
水素以外の化合物が、鉄ポルフィリンタンパク質と直接
作用し、触媒作用に必要な、活性な酸化中間体を産生す
ることができるということが以前より知られている[ジ
ョージ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｇeorge, Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.)、２０１巻、４１３〜
４２６頁、１９５３年)。また２価の状態の鉄で、酸化
剤を添加せずに、ルミノール化学発光させることに成功
している[ザイツおよびヘルクレス、アナリティカル・
ケミストリー(Ｓeitz and Ｈercules, Ａnal, Ｃhe
m.)、４４巻、２１４３〜２１４９頁、１９７２年]。し
かし、このシステムでは、検出限界が劣り(１００p
Ｍ)、その鉄は、酸素とルミノールとが反応する前に、
酸素により酸化されないように安定化されなければなら
ない。またこのシステムは、抗体もしくはＤＮＡの測定
には適用できない。なぜならば、鉄をタンパク質もしく
は核酸に結合させて、鉄を化学発光検出法用の触媒とし
て利用可能にする実用的方法が困難であるからである。

【０００６】また、前記のタンパク質内に錯体化された
鉄ポルフィリン(ミクロペルオキシダーゼもしくはセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼとして)は、抗体の標識と
して用いられ、化学発光で検出されるが、化学発光シス
テムを作動させるには過酸化水素を添加しなければなら
ない。ポルフィン中の鉄を、マンガンと置換して過酸化
水素の測定に成功している[サイトウら、アナリティカ
ル・サイエンス (Ｓaito et al., Ａnal．Ｓci.)、３
巻、１７１〜１７４頁、１９８７年]が、鉄タンパク質
化合物であるペルオキシダーゼの方が、該マンガンポル
フィン化合物よりも活性に優れている。マンガンポルフ
ィンも、過酸化水素を用いた系でカタラーゼもしくはペ
ルオキシダーゼ活性を有することが分かっているが、天
然の鉄タンパク質化合物(例えばセイヨウワサビペルオ
キシダーゼ)と比べて改善された活性を示していない[サ
イトウら、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・ブレティン(Ｓaito et al., Ｃhem．Ｐharm．Ｂul
l.)、３４巻、２８８５〜２８８９頁、１９８６年、お
よび同、３５巻、８６９〜８７２頁、１９８７年]。し
たがって、金属ポルフィンで触媒された反応の分野の研
究がいくつかあるが、製造された化合物は天然の鉄ポル
フィリン化合物よりも触媒としての活性が小さく、いず
れの場合も過酸化水素が反応の基質として使用されてい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、高pＨのルミ
ノール溶液中における感光性色素についての研究に由来
するものである。このシステムにおいて、例えば感光性
色素は受光して一重項酸素を作り、つぎに、この一重項
酸素がルミノールから化学発光を発生させる。本発明者
らは、驚くべきことに、いくつかのマンガンポルフィン
類が、光の不存在下かつ高エネルギーの酸化剤の不存在
下にルミノールの化学発光反応を非常に効率的に触媒す
ることを見出した。さらに研究を行った結果、金属がポ
ルフィンのリングに必要であり、マンガンが鉄よりも著
しく優れた働きをし、ポルフィンのフェニル環の電子求
引性基が、過酸化水素不存在下で化学発光反応をさらに
改善することを見出した。また、さらに研究を行った結
果、この活性が、添加剤として両親媒性物質、例えばあ
る種の界面活性剤や有機酸によって１００倍以上に強化
されることを見出した。これは、多分、これらの添加剤
が、ポルフィンリングと相互に反応して、マンガンと、
酸素もしくはルミノールまたは両者との反応を促進する
ことによると考えられる。

【０００８】かくして、本発明の主な目的は、診断法に
おける検出段階に用いる反応を単純化することである。
この目的は、ルミノールから化学発光を発生させるため
に、高エネルギー化合物を必要でなくすことによって達
成する。例えば、水酸化ナトリウムとルミノールを水中
に存在させることだけが、金属ポルフィンの化学発光検
出法に必要となる。したがって、本発明は、例えば、過
酸化水素もしくは他の酸化剤を混合するか、加熱もしく
は光照射を行ってエネルギーの酸化剤を発生させること
を必要とする従来技術の方法と比べて、大きく単純化す
ることができる。好ましい態様において、例えば、マン
ガン−メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィン
で標識した抗体をアッセイ系に用い、抗原抗体反応の結
果結合したマンガンポルフィン標識抗体をpＨ１２.７で
過剰量のルミノールと共にインキュベートし、ルミノー
ルが発生した光を、反応が開始されてから１〜２分間積
算する。

【０００９】本発明の他の目的は、免疫測定に要する試
薬の安定性を改良することである。これは２つの方法で
達成され、不安定で高エネルギーの酸化剤もしくは酸化
剤前駆体の必要性が除かれる。また、本発明の方法は、
一般に用いられている酵素をより安定な金属ポルフィン
と取換えることができる。好ましい具体例では、ただ一
種類の検出反応溶液を予め作製し、測定時まで長期間貯
蔵できる。本発明のさらに他の目的は、固相を用いる免
疫測定システム(例えば、ＥＬＩＳＡ法)において、標識
された触媒が、非特異的に(偶発的に)結合するのを減少
させることである。多くの測定法では、感度はこのよう
な非特異的結合によって制限され、非特異的結合を減少
させることによって、直接感度を改善することができ
る。この感度の改善は、分子量が大きく固相に結合しや
すい酵素触媒(分子量:４０,０００〜２００,０００)の
代わりに、固相と結合する機会が少ない小さなポルフィ
ン触媒(分子量:１０００)を用いることによって可能に
なる。

【００１０】本発明のさらに他の目的は、測定法に用い
る装置の複雑さと価格を低下させることである。これ
は、使用前に２種以上の別個の溶液を混合する必要がな
く、長寿命の化学発光の光シグナルを発する化学反応を
提供することによって達成される。従来の方法の多く
は、検出段階の直前に２種以上の不安定な溶液を混合す
る必要がある。場合により、この混合を光電子検出器の
光学セルで行わねばならない。本発明では、１５分以上
もの長時間持続する光シグナルを発するので、この必要
がなくなる。長寿命の光シグナルをつくることによる本
発明は、化学発光反応開始後、種々の時間にわたって光
の測定を行うことができる。本発明のさらに他の目的
は、化学発光反応によって生成する光の量を増大させる
ことである。このことは、使用する光検出装置をより単
純にすることができ、かつ、測定値を得るのに必要な時
間が短くなるので有利である。前記の光の量の増大は、
化学発光反応溶液にある種の添加剤を含有させて、光の
化学発光による生成を１００倍以上も促進させることに
よって達成される。

【００１１】本発明のさらに他の目的は、２つの同時測
定を簡便に行うことができる方法を提供することであ
る。これは、金属ポルフィンからの化学発光反応と、光
励起による感光性色素からの化学発光反応とを併立させ
ることによって達成される。金属ポルフィンで触媒され
た化学発光は、感光性色素の存在下で測定することがで
き、感光性色素は金属ポルフィンの存在下で測定するこ
とができる。このことから、同じアッセイ段階で２つの
別個の標識した抗体を使用して各々別個に検出すること
ができる。したがって、同時アッセイ法は、アッセイに
要する時間と労力と試料の使用量を節約するように組立
てることができる。

【００１２】すなわち、本発明は、(１)触媒とそれに結
合する要素との複合体を検出して、１種以上の結合反応
により、試料中の分析対象の存在を測定する特異的結合
測定法において、該検出を、a．酸化剤の不存在下、金
属ポルフィン触媒を化学発光薬剤と高pＨで反応させ、
b．該触媒複合体の濃度に比例する化学発光を測定す
る、ことにより行うことを特徴とする特異的結合測定
法、(２)触媒とそれに結合する要素との複合体を検出し
て、１種以上の結合反応により、試料中の分析対象の存
在を測定する特異的結合測定方法において、該検出を、
a．酸化剤の不存在下、金属ポルフィン触媒複合体を化
学発光性物質と高pＨで反応させ、b．金属ポルフィン触
媒の反応を両親媒性物質で促進し、c．該触媒複合体の
濃度に比例する化学発光を測定する、ことにより行うこ
とを特徴とする特異的結合測定法、(３)触媒とそれに結
合する要素との２種の複合体を検出して、１種以上の結
合反応により、試料中の２つの分析対象を測定する特異
的結合測定法において、該検出を、a．酸化剤の不存在
下、感光性色素触媒複合体および金属ポルフィン触媒複
合体を、同じ反応混合物中、高pＨで化学発光性物質と
反応させ、b．光の不存在下、金属ポルフィン触媒複合
体の濃度に比例する、金属ポリフィン触媒から発する化
学発光を測定し、c．光照射の間もしくは後に生成する
感光性触媒複合体の濃度に比例する、感光性色素からの
化学発光を測定する、ことにより行うことを特徴とする
特異的結合測定法、(４)a．金属ポルフィンとそれに結
合する要素との複合体を収容する第１容器と、b．高pＨ
で、かつ、酸化剤を添加していない化学発光性物質を収
容する第２容器と、からなることを特徴とする特異的結
合測定用キット。(５)a．金属ポルフィンとそれに結合
する要素との複合体を収容する第１容器と、b．高pＨで
化学発光性物質と両親媒性物質とが入り、酸化剤が添加
されていない第２容器と、からなることを特徴とする特
異的結合測定用キット、を提供するものである。

【００１３】本発明で用いる触媒は、例えば中心核に金
属原子を有するフェニルポルフィン類である。金属原子
としては鉄およびマンガンが好ましく、マンガンが特に
好ましい。すなわち、マンガンで製造した触媒の方が鉄
で製造した触媒よりも活性が高いからである。アルミニ
ウム、亜鉛もしくは鉛のような他の金属は、得られる触
媒の作用が非常に弱いかまたは作用がないので、あまり
好ましくない。フェニルポルフィン類におけるフェニル
環は、そのパラ位置が、カルボキシル基もしくはスルホ
ン基のような電子求引性残基で置換されているものが好
ましい。抗体、ＤＮＡのような結合要素と結合させるに
は、カルボキシル基が導入された金属ポルフィンを使用
することが好ましい。なぜならば、このカルボキシル残
基を、結合要素たるタンパク質もしくは核酸中の他の残
基に結合させることができる多くの化学的方法があるか
らである。アビジンもしくは抗体のようなタンパク質に
結合させるには、スクシンイミドのような活性誘導体を
作ることが最も望ましく、スクシンイミドは、ポルフィ
ン触媒をタンパク質のアミノ基に簡単に結合させること
ができる。

【００１４】触媒は、このように結合要素である他の分
子に結合させた場合、「複合体(conjugate)」と称され
る。検出段階で、この複合体は、化学発光性物質として
用いるケミルミフォア(Ｃhemilumiphore)と緩衝液(水溶
液)中でインキュベートすることによって定量すること
ができる。このケミルミフォアは、塩基性pＨ下で触媒
と反応すると光を発生する分子である。ルミノールは最
も好ましいケミルミフォアであるが、ルミノール誘導体
（例、イソルミノール）、ルシゲニンもしくはベンゾピ
レン等のような他のケミルミフォアも使用できる。ま
た、この他の化学発光性物質も利用できることは申すま
でもない。ルミノールは、少なくとも０.００２mＭ、好
ましくは０.０１mＭ〜２mＭの濃度で使用される。最高
の検出感度を得るには、ルミノールをアルカリ性溶液か
ら再結晶し、プラスチックの容器中に貯蔵する。pＨ維
持のための緩衝液の組成は、特に重要なものではない
が、単純な、水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。金属
ポルフィン触媒と化学発光性物質との反応はpＨ１１以
上で、好ましくは１２〜１３.５で行う。反応温度も特
に重要ではないが、１５〜３５℃の温度が好ましい。

【００１５】高い光出力が望ましい場合には、両親媒性
物質を希釈することによって得られるエンハンサーを使
用することが好ましい。例えば以下の界面活性剤が、光
出力を増大するために検出溶液に添加するのに好ましい
ものである。すなわちツイーン(Ｔween)２０、ツイーン
４０、ツイーン６０、ツイーン８０、ツイーン８５であ
る。ツイーン２０は、これによる促進効果が最高なので
最も好ましい。ソルビタンモノラウレート、ソルビタン
モノオレエートおよびトリトンＸ−１００のような他の
界面活性剤も有利であるが、これらを使用した場合、光
レベルの促進効果は、比較的低い。界面活性剤による促
進効果を利用すると、最適の反応条件がわずかに変化す
る場合がある。界面活性剤の存在下では、ルミノールの
濃度は高い方が好ましく、０.２〜２mＭの濃度が特に好
ましい。

【００１６】この他のエンハンサーとしては、例えば有
機酸が挙げられる。有機酸としては炭素数約１０以上が
望ましく、とくに不飽和の脂肪酸が有利に用いられる。
なかでもリノール酸やリノレン酸が効果的である。濃度
は約０.０１％〜約１％の範囲で用いられるが、とくに
０.０５〜０.２％が望ましい。金属ポルフィンで触媒さ
れる化学発光反応に適切な条件は、感光性色素で触媒さ
れる化学発光反応にも適切である。感光性色素系では、
メチレンブルーのような色素は、光電子を吸収して励起
され、溶解している酸素分子から一重項酸素を生成す
る。一重項酸素は、ルミノールと反応して光を発する。
また、励起された色素が直接ルミノールと反応して光を
発する。金属ポルフィンと感光性色素の同時測定を行う
には、エンハンサーが存在しない場合の金属ポルフィン
について前記したのと同じ条件と、検定中の金属ポルフ
ィンが生成する最高光強度の５％以上の光強度を生成す
る感光性色素を用いることが好ましい。光がなければ感
光性色素から化学発光は起らないので、金属ポルフィン
化学発光検出法は高濃度の感光性色素が存在しても適合
しうる。本発明の測定法による化学発光の測定、定量自
体は公知方法により行うことができる。

【００１７】本発明の定量法によれば、例えば、液体中
に極めて低濃度で存在する医学的、環境的、工業的に重
要な様々な物質を測定することができる。とりわけ臨床
診断に利用できる物質が挙げられ、例えば体液中に含ま
れるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリン
Ｍ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリン
Ｅ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン(フィブリ
ンおよびそれらの分解産物)、α−フェトプロテイン、
Ｃ反応性タンパク、β₂−ミクログロブリン、ミオグロ
ビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリン
などのタンパク、ホルモン、投与薬剤などが挙げられ
る。上述の体液としては、全血、血清、血漿など血液、
尿、脊髄液や組織からの抽出液などが挙げられる。測定
のための試薬として、金属ポルフィン類、例えばカルボ
キシル基が導入されたマンガンポルフィンをハプテン、
抗原もしくはそれらに対する抗体、さらにＲＮＡやＤＮ
Ａと化学的に結合させ、金属ポルフィン標識体を調製す
ることができる。

【００１８】金属ポルフィン標識体を用いる測定キット
の一例として、サンドイッチ法によるキットを以下に挙
げる。 (１) 担体上に保持された抗体 (２) 金属ポルフィン・第２抗体複合体 (３) 被測定物質の標準品 (４) 上記(２)〜(３)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液(該試薬および該被検試料の希釈に用いるこ
とができる緩衝剤であればいずれでもよいが、その一例
としてはpＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝
液が挙げられる。) (５) インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液(該担体の洗浄に用いることができる緩衝液であれば
いずれでもよいが、その一例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。) (６) 金属ポルフィン活性測定に必要な試薬。その一例
としてアルカリ性溶媒に溶解されたルミノールが挙げら
れる。 上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。被測定物質の標準品もしくは被検液約１０〜２
００マイクロリットルに試薬(４)を加えて希釈し、一定
量の試薬(１)、次いで試薬(２)を１０〜３００マイクロ
リットルを加えた後、約０〜４０℃で反応させる。約１
０分〜２４時間反応後、試薬(５)で洗浄し担体上に結合
している金属ポルフィンの触媒活性を測定する。すなわ
ち、試薬(６)約１０〜３０００マイクロリットルを加え
て、化学発光測定装置で一定時間反応液中の化学発光量
を測定する。

【００１９】また、本発明の測定用キットは前記の複合
体および化学発光性物質をそれぞれ別個の容器に収容し
た粉末、顆粒状あるいは液状等の剤形のもので、化学発
光性物質は所望により所定の濃度の前記両親媒性物質と
混合してもよい。また、緩衝剤を組合せてもよい。容器
としては、特に限定するものではなく、ガラス、プラス
チック、金属のものが用いられ、それぞれの試薬は溶
解、分散、混合、乾燥、顆粒化、凍結乾燥などの公知の
方法で製造できる。

【００２０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これらに限定されるものではない。 実施例１ マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン
の標準曲線 マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン
[米国、ユタ州、ローガン、ポルフィリン・ブロダクツ
(Ｐorphyrin Ｐroducts)社]を１mＭ ＮaＯＨに溶解
し、０.０１mＭルミノールと０.２Ｍ ＮaＯＨを含有す
る溶液で各種濃度に希釈した。１ミリリットルの試料を
試験管にとり、光電子計数ルミノメーターに入れた。ル
ミノメーターに挿入して５０秒から６０秒の間の光電子
を計数した。結果を図１に示す。この実験から得た検出
限界は(０レベルから識別できる確率が９５％の最低濃
度)、０.９pgのマンガン−メソテトラ−４−スルホフェ
ニルポルフィンであった。

【００２１】実施例２ マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン
発光作用のツイーン２０による増強 マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン
を１mＭ ＮaＯＨに溶解した。得られた溶液を、ツイー
ン２０[米国、ミズーリ州、セントルイス、シグマ・ケミ
カル・カンパニー(Ｓigma chemical company)社]を０
％、０.００２５％、０.００５％、０.０１％および０.
０３％含有する、０.１ＭＮaＯＨ、１mＭルミノールの
溶液１ミリリットルで、１００pg／ミリリットルと０pg
／ミリリットルに希釈した。この試料１ミリリットルを
試験管にとり、各試料をルミノメーターに挿入後、６０
〜６２秒間の光電子を計数した。結果を図２に示す。

【００２２】実施例３ 各種ポルフィリン誘導体の発光作用の比較 マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィ
ン、鉄−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン、
マンガン−メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフ
ィン、メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィ
ン、メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン、マン
ガン−プロトポルフィリン、亜鉛−プロトポルフィリン、
スズ−プロトポルフィリン、アルミニウム−フタロシア
ニンテトラスルホネートおよびクロリンＥ６(chlorin
Ｅ６)(米国、ユタ州、ローガン、ポルフィリン・プロダ
クツ社)ならびにミクロペルオキシダーゼ、銅クロルフ
ィリンおよびヘマチン(米国ミズーリ州、セントルイス、
シグマ・ケミカルカンパニー社)を各々、０.５mＭルミノ
ールと０.１Ｍ ＮaＯＨおよび０.０１％ツイーン２０
を含有する液で、１００pg／ミリリットルと１ng／ミリ
リットルの濃度に希釈した。各試料を、光電子計数化学
発光メータに挿入後、６０〜６２秒間、光を測定した。
この実験から得た結果を表１に要約する。結果は、各化
合物で触媒された発光を、マンガン−メソテトラ−４−
スルホフェニルポルフィンで触媒された発光に対する比
率で示す。

【００２３】表１ 各種ポルフィリン誘導体の化学発光触媒作用の比較 試験化合物 相対活量 マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン １ 鉄−メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン 0.53 マンガン−メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィン 0.77 メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィン ０ メソテトラ−４−スルホフェニルポルフィン ０ マンガン−プロトポルフィリン 0.23 亜鉛−プロトポルフィリン ０ スズ−プロトポルフィリン ０ アルミニウム−フタロシアニンテトラスルホネート ０ クロリンＥ６ ０ ミクロペルオキシダーゼ（ヘム含有） ０ 銅クロルフィリン ０ ヘマチン（ヘム含有） 0.06

【００２４】実施例４ エンドセリン(Ｅndothelin)のイムノアッセイ法による
測定へのマンガン−メソテトラ−４−カルボキシフェニ
ルポルフィンの利用 白色プラスチック製のマイクロタイタープレート[米
国、バージニア州、シャンティイー、ＤＹＮＡＴＥＣＨ
ＭicroＦＬＵＯＲ、ダイナテック・ラボラトリース・
インコーポレーテッド(Ｄynatech Ｌaboratories Ｉn
c.)]の各ウエルに、５０μg／ミリリットルのモノクロ
ーナル抗エンドセリン抗体を含有する０.１Ｍ炭酸緩衝
液(pＨ９.５)０.１ミリリットルを入れて、室温で３時
間処理した。この抗体の製造法はスズキら、ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッズ(Ｓuzuki et al.,
Ｊ．Ｉmmun．Ｍethods)、１１８巻、２４５−２５０頁、１
９８９年に記載されている。該ウエルをリン酸緩衝溶液
で３回すすぎ、ついで、２５％のブロック・エース[雪
印乳業(株)]を含有するリン酸緩衝溶液０.３ミリリット
ルを各ウエルに添加した。このようにして調製されたプ
レートは使用するまで６℃で保管した。

【００２５】エンドセリン−１(ペプチド研究所)を、１
％ＢＳＡで希釈し、最終的に、アッセイ用緩衝液(１０
％ブロックエース、０.４ＭＮaＣl、１mＭエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム、２０mＭリン酸ナトリウム p
Ｈ７.０)で１００倍に希釈した。つぎに、エンドセリン
含有アッセイ用緩衝液の０.２ミリリットルずつ(０pg／
ミリリットル、２０pg／ミリリットル、５０pg／ミリリ
ットル、１００pg／ミリリットルおよび２００pg／ミリ
リットル、いずれも３重複)を、前記調製したマイクロ
タイタープレートの各ウエルに加え、１６時間インキュ
ベートした。各ウエルをリン酸緩衝溶液で３回洗浄し
た。ポリクロナール抗エンドセリン抗体・マンガン−メ
ソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィン複合体の
１:２５倍希釈液を含有する複合体インキュベーション
緩衝液[１０％ブロックエース、０.５％ＢＳＡ、０.４
Ｍ ＮaＣl、１mＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
を含有する２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.０)]
１００マイクロリットルを各ウエルに添加した。

【００２６】前記抗体複合体はつぎのとおり製造した。
５マイクロモルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含有
する１００マイクロリットル乾燥ジメチルホルムアミド
(ＤＭＦ)を、７.５マイクロモルのジシクロヘキシルカ
ルボジイミドおよび５マイクロモルのマンガン−メソテ
トラ−４−カルボキシフェニルポルフィン含有の１００
マイクロリットル乾燥ＤＭＦと混合し、一夜暗所に４℃
で反応させた。５mgの抗エンドセリン抗体を含有する１
ミリリットルの０.０５Ｍリン酸緩衝液pＨ８を、先に調
製したスクシンイミドエステル溶液の４０マイクロリッ
トルと混合し、一夜暗所に４℃で反応させた。０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.５で平衡化したウルトラ
ゲル(Ｕltragel)ＡＣＡ３４樹脂のカラム(１.５cm×４
５cm)を通過させて、複合体を分離した。前記滴定板を
４℃で１６時間培養した。反応後のマイクロタイタープ
レートを、冷リン酸緩衝溶液で３回洗浄しエンドセリン
に反応した抗体複合体の活性を測定した。抗体複合体を
検出する段階では、１.０mＭルミノール(アルカリ溶液
から精製)、０.０７Ｍ ＮaＯＨ、０.０３Ｍグリシンお
よび０.１％ツイーン２０含有溶液１００マイクロリッ
トルを、マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し
た。各ウエルからの発光を、ＭＬ１０００型マイクロタ
イタープレート用化学発光測定計(米国、バージニア
州、シャンティイー、ダイナテック社)で計測した。図
３には、前記の方法で作成したエンドセリン標準曲線を
示す。エンドセリンの濃度を増大すると検出段階で生成
する光が直線的に増大した。

【００２７】実施例５ ＥＬＩＳＡ法によるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）測
定におけるＭｎ−メソテトラ−４−カルボキシフェニル
ポルフィンの使用 前記実施例４と同様にして、抗α−フェトプロテイン抗
体［Ａ−４４型、東京標準血清（東京）］感作白色マイ
クロタイタープレートウェルを調製した。α−フェトプ
ロテイン［米国、カリフォルニア州、トレイ・パインズ
（TorreyPines）、スクッリプス・ラボラトリーズ（Scr
ipps Laboratories）］を２５％ブロック・エース含有
ＰＢＳで希釈し、使用直前にインキュベーション緩衝液
（１０％ブロック・エース、０.５％ ＢＳＡ、０.３５
％アルギン酸ナトリウム含有ＰＢＳ）で最終１００倍希
釈した。プレートの各ウェルに、０、５、１２.５、３
７.５または１２５ｎｇ／ミリリットルのα−フェトプ
ロテインを含む１９５マイクロリットルのインキュベー
ション緩衝液を加えた。ついで、５マイクロリットルの
２μｇ／ミリリットルのマンガン−メソテトラ−４−カ
ルボキシフェニルポルフィン抗体複合体を各ウェルに加
えた。複合体の調製は以下のように行った。マンガン−
メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィン３ｍｇ
をジメチルホルムアミド ２.１ミリリットルに溶解し
た。この溶液に、２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）
１.０５ミリリットルにＮ−ヒドロキシスクシンイミド
４ｍｇおよび２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.０） １.
０５ミリリットルに水溶性カルボジイミド ６.３ｍｇを
それぞれ溶かした溶液を加えた。室温で１時間インキュ
ベート後、１.５ｍｇの抗α−フェトプロテイン［Ａ２
９５、東京標準血清（東京）］を含有する２５ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６.０）４.２ミリリットルを加えた。こ
れを６℃で一夜インキュベートした。ついで、誘導され
た複合体を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）の存在
下、セファデックスＧ−５０を用いるゲル濾過により、
低分子化合物から分離した。６℃にて振盪しながら４５
分間インキュベートした後、該プレートをＰＢＳで２回
洗浄した。０.１Ｍ ＮａＯＨ、１ｍＭ ルミノールおよ
び０.１％リノレン酸含有溶液を加え（各ウェルに１０
０マイクロリットル）、前記実施例４と同様にしてマイ
クロタイタープレート用化学測定計で化学発光を測定し
た。図４は、この方法で作成したα−フェトプロテイン
の標準曲線を示す。検出限界（平均バックグラウンド値
の２倍に等しいシグナルを生ずる被検物質の量）は１.
５ｎｇ／ミリリットルと算出された。この方法では、１
５％までの血漿濃度を使用することができ、典型的な成
人の血漿中ＡＦＰ濃度は１０ｎｇ／ミリリットル以下で
あることが判明した。

【００２８】実施例６ ２種触媒を用いる化学発光法による同時測定法 この実施例では、１つのアッセイ容量中に２種の異なる
化学発光触媒系を共存させ別々の測定を行うことを示
す。一方の触媒であるメチレンブルーがルミノールと反
応して化学発光を発する。第２の触媒は、マンガン−メ
ソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィンである。
両触媒を、１mＭルミノールと５０mＭ ＮaＯＨを含有
する２０％のエタノールと８０％の水の溶液に溶解し
た。メチレンブルーを、１０ng／ミリリットルマンガン
−メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィンの存
在下、１ng／ミリリットル、０.５ng／ミリリットル、
０.２５ng／ミリリットル、０.１ng／ミリリットルおよ
び０ng／ミリリットルになるように希釈した。色素触媒
を励起する５mＷ ６７０nmのレーザーダイオードと、６
７０nmの光が光電子増倍管に入るのを防止するため４３
５nmより長波長光をカットオフ(cut off)するフィルタ
ーとを備えた光電子計数化学発光メータで、上記の化学
発光を測定した。１ミリリットルずつの溶液を１２mm試
験管に取り、各試験管を化学発光メータに挿入後、光電
子を３０〜６０秒間計数した。バックグラウンド暗部の
計数値を測定値から差引いた。得られた結果を図５に示
す。次の実験では、マンガン−メソテトラ−４−カルボ
キシフェニルポルフィンを、１ng／ミリリットルのメチ
レンブルーを含有する同じ緩衝液で、１０ng／ミリリッ
トル、５ng／ミリリットル、２.５ng／ミリリットル、
１ng／ミリリットル、０.５ng／ミリリットルおよび０n
g／ミリリットルの濃度になるように希釈した。化学発
光を、レーザー光をオフにし、バックグラウンドを差引
かないこと以外、上記の方法と同じ方法で測定した。こ
れらの結果を図６に示す。図５と図６は、両者の触媒
が、同じ反応混合物から独立に定量できることを示して
いる。

【００２９】実施例７ 両親媒性物質による化学発光増強作用 本実施例においては、アルカリ条件でルミノール、マン
ガンポルフィンの溶液に両親媒性物質を添加することで
化学発光が増強されることを示したものである。試験管
中に０.１Ｎ ＮaＯＨ水溶液で溶解された０.５mＭルミ
ノール１ミリリットルを分注した。次に化学発光増強作
用テスト化合物の１０％水溶液１０マイクロリットルを
加えて混合し、１分間の化学発光量を計測した(Ｂ)。さ
らに、１０mＭ ＮaＯＨ水溶液に溶解したマンガン−メ
ソテトラ−４−スルホフェニルポルフィンの１００ng／
ミリリットル溶液１０マイクロリットルを加えて混合
し、１分間の化学発光量を測定した(Ｓ)。コントロール
としてはテスト化合物水溶液の代わりに蒸留水を用い
た。テスト化合物の化学発光増強作用の強さは次式で算
出した。

【数１】 本実験の結果を表２に示す。

【００３０】表２ 化学発光増強作用の比較

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、単純化した反応によ
り、感度よく特異的結合が測定でき、不安定な試薬の使
用による不便さが解消でき、検定時間と労力と試料の使
用量を節約した測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 マンガン−メソテトラ−４−スルホフェニル
ポルフィンの濃度の増大の光出力に対する影響を示すグ
ラフ。

【図２】 マンガン−ポルフィリンの化学発光触媒作用
のツイーン２０による増強を示すグラフ。

【図３】 抗エンドセリン抗体とマンガン−メソテトラ
−４−カルボキシフェニルポルフィンとの複合体を用い
て得たイムノアッセイ法におけるエンドセリンの標準曲
線。

【図４】 抗α−フェトプロテイン抗体とマンガン−メ
ソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィンとの複合
体を用いて得たイムノアッセイ法におけるα−フェトプ
ロテインの標準曲線。

【図５】 マンガン−メソテトラ−４−カルボキシフェ
ニルポルフィンの存在下でのメチレンブルー色素触媒の
標準曲線。

【図６】 メチレンブルー色素触媒の存在下でのマンガ
ン−メソテトラ−４−カルボキシフェニルポルフィンの
標準曲線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｚ 7055−2Ｊ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 触媒とそれに結合する要素との複合体を
   検出して、１種以上の結合反応により試料中の分析対象
   の存在を測定する特異的結合測定法において、該検出
   を、a．酸化剤の不存在下、金属ポルフィン触媒複合体
   を化学発光性物質と高pＨで反応させ、b．該触媒複合体
   の濃度に比例する化学発光を測定する、ことにより行う
   ことを特徴とする特異的結合測定法。
2. 【請求項２】 触媒とそれに結合する要素との複合体を
   検出して、１種以上の結合反応により試料中の分析対象
   の存在を測定する特異的結合測定方法において、該検出
   を、a．酸化剤の不存在下、金属ポルフィン触媒複合体
   を化学発光性物質と高pＨで反応させ、b．金属ポルフィ
   ン触媒の反応を両親媒性物質で促進し、c．該触媒複合
   体の濃度に比例する化学発光を測定する、ことにより行
   うことを特徴とする特異的結合測定法。
3. 【請求項３】 触媒とそれに結合する要素との２種の複
   合体を検出して、１種以上の結合反応により試料中の２
   つの分析対象を測定する特異的結合測定法において、該
   検出を、a．酸化剤の不存在下、感光性色素触媒複合体
   および金属ポルフィン触媒複合体を、同じ反応混合物
   中、高pＨで化学発光性物質と反応させ、b．光の不存在
   下、金属ポルフィン触媒複合体の濃度に比例する、金属
   ポルフィン触媒から発する化学発光を測定し、c．光照
   射の間もしくは後に生成する感光性触媒複合体の濃度に
   比例する、感光性色素からの化学発光を測定する、こと
   により行うことを特徴とする特異的結合測定法。
4. 【請求項４】 a．金属ポルフィンとそれに結合する要
   素との複合体を収容する第１容器と、b．高pＨで、か
   つ、酸化剤を添加していない化学発光性物質を収容する
   第２容器と、からなることを特徴とする特異的結合測定
   用キット。
5. 【請求項５】 a．金属ポルフィンとそれに結合する要
   素との複合体を収容する第１容器と、b．高pＨで化学発
   光性物質と両親媒性物質とが入り、酸化剤が添加されて
   いない第２容器と、からなることを特徴とする特異的結
   合測定用キット。