JPH035539B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は増感ルミネセンスまたはルミノメトリ
ー検定方法、特に免疫検定方法、ならびにこの検
定方法を容易にするために設計された診断用キツ
トに関する。 免疫検定は臨床検査室において最も広く使用さ
れる分析技術の一つである。現在免疫検定の大部
分には標識として放射性同位元素特に1¹²⁵が使用
される。しかし放射性同位元素にはいくつかの大
きな欠点がある。第一に、この標識方法には高度
に放射性な、したがつて危険のおそれのある薬剤
が使用される。第二に放射性標識された物質の貯
蔵寿命は、放射性同位元素が本質的に絶えず崩壊
するためばかりでなく放射性標識されたタンパク
質がしばしば不安定であるために、短い。第三
に、感度良く迅速に検出可能な反応剤を得るに十
分なだけタンパク質を標識することがしばしば困
難である。第四に放射性標識物質の処分が不便で
ある。 これらの欠点のため、放射性標識に代る、実用
性のある方法の探究が盛んに行われてきた。ある
物質が標識として適当であるためには少なくとも
次の三要件を満すことが必要である。： (a) 配位子例えば抗原または抗体と結合した場合
非常に少量で、かつ迅速に検出できなければな
らない。 (b) その測定に影響を与えることなくこれを配位
子例えば抗原または抗体と結合することが可能
でなければならない。 (c) 一旦結合した場合、配位子の性質に大きな変
化を与えてはならない。 代りの標識として最も有望なものの一つは、ル
ミネセンス発光を起す反応にそれ自体で関与し得
る物質であるが、もしくは、適当な処理によつて
ルミネセンス反応に関与し得る化合物を生ずる物
質である。ルミネセンス反応（すなわちルミネセ
ンス発光を起す化学反応）は一般に放射された光
を検出、測定しこれによつて標識された材料の定
量を行うに十分な持続時間を有する。一方ルミネ
センスの測定は迅速に行ない得る操作であつて、
放射能の測定に通常数分間を要するのに対し数秒
で完了することができる。 ルミネセンスはこれまで次の三つの主要なルミ
ネセンス免疫検定系において使用されてきた： (a) 有機ルミネセンス免疫検定。この検定では、
ルミネセンス反応に直接関与する（すなわち励
起状態に転化され次に光子を放出して非励起状
態に復帰する）化学ルミネセンス性または生物
ルミネセンス性化合物が、配位子例えばタンパ
ク質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、核
酸、中間代謝物、抗原および（または）抗体を
標識するのに使用されてきた。適当な化合物の
例としてルミノールおよびイソルミノールが挙
げられる。 (b) ルミネセンス触媒または補助因子免疫検定。
この検定ではルミネセンス反応の触媒または補
助因子が標識として使用されてきた。適当な触
媒の例としてペルオキシダーゼが挙げられる。 (c) 酵素結合免疫検定。この検定においては適当
な基質に対する酵素標識の作用によつて生じた
生成物の測定にルミネセンス反応が使用されて
きた。この種の免疫検定の例としては、酵素／
抗体反応剤とグルコースとを反応させて過酸化
水素を生成させ、次にこれにルミノールを管理
された条件下で添加してルミネセンス反応を開
始させることにより生成過酸化水素量を測定す
る方法による、抗体結合グルコースオキシダー
ゼの定量がある。 以上の免疫検定の感度は一部、標識または標識
からの生成物の検出の下限によつて決定される。
ルミネセンス免疫検定の場合検定系の感度は一部
は、ルミネセンス反応において標識された材料単
位当り放射される光の量によつて定まる。本発明
の目的の一つは、標識された材料または標識から
の生成物を本発明の改良されたルミネセンス反応
によつて定量することによつて達成される、高め
られた感度を有するルミネセンス免疫検定方法を
提供することである。 本発明の改良されたルミネセンス反応は免疫検
定標識またはその生成物の測定に特に有用である
が、この用途のみに限られるものではない。すな
わち本発明のさらに一つの目的は、本発明の改良
されたルミネセンス反応を検定操作に取入れるこ
とによつて達成される、高められた感度を有する
ルミネセンス検定方法（免疫検定方法その他）を
提供することである。 免疫検定ではないが、本発明のルミネセンス反
応を組み入れ得る検定として次の例が挙げられ
る。 (a) 不溶性ペルオキシダーゼ−エラスチン試料か
らのペルオキシダーゼ放出に基くエラスターゼ
検定。 (b) 共固定化したグルコースオキシダーゼとペル
オキシダーゼとに基くグルコース検定。 (c) ペルオキシダーゼ、２，３−ジヒドロ−１，
４−フタラジンジオン化合物、または酸化剤例
えば過酸化水素の検定（これらの標識でも、標
識からの生成物でもない場合）。 従つて本発明の最も広い観点によれば、ペルオ
キシダーゼと酸化剤と化学ルミネセンス性２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物と
の間の化学ルミネセンス反応を、式 〔式中、 (i) ＡおよびＢは水素原子であり、そしてＲはハ
ロゲン原子、フエニル基、

【式】（ここで、Ｙは−CH₂ −または−Ｏ−であり、そしてＶは水素原子で
あるか、あるいはＹは−Ｏ−、−Ｓ−または−
Ｓ−Ｓ−であり、そしてＶはヒドロキシル基で
ある）、

【式】（ここで、Ｗ は水素原子またはカルボキシル基である）、

【式】基−CH＝ CH−Ｚ（ここで、Ｚはカルボキシル基または
２，４−ジニトロフエニル基である）、基−
CH₂CH₂COOC₂H₅またはC₁−C₆アルキル基で
あるか、 (ii) Ａは水素原子であり、Ｂはハロゲン原子また
はC₁−C₆アルキル基であり、そしてＲはハロ
ゲン原子であるか、 (iii) Ａはハロゲン原子であり、Ｂは水素原子であ
り、そしてＲはハロゲン原子またはフエニル基
であるか、あるいは (iv) Ａは水素原子またはハロゲン原子であり、Ｒ
とＢとは一緒に式

【式】 （式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子で
ある） で表わされるナフタリン核構成鎖を表わし、こ
れにより式(1)で表わされる化合物は式 で表わされるベータナフトールとなり、 上記(i)〜(iv)の各場合においてハロゲン原子と
は塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味
する〕 で表わされるフエノール性化合物の存在下で行
うことを特徴とするルミネセンスまたはルミノ
メトリー検定方法を提供する。 検定方法は好ましくは免疫検定方法である。 本発明は公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン化合物／酸化剤／ペルオキシダー
ゼ系にある種の容易に入手し得るフエノール類ま
たはナフトール類を添加するとルミネセンス反応
の感度が顕著に高められるとの驚くべき発見に基
くものである。 本明細書において「増感」なる語は本発明のル
ミネセンス反応の全光放射および（または）本発
明のルミネセンス反応の信号／バツクグラウンド
比が、増感剤の不在における２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物／酸化剤／ペル
オキシダーゼ系で得られるものより大きいことを
意味する。このように「増感」されたルミネセン
ス反応を取入れた検定方法のみが本発明の範囲に
属する。 これらのフエノール類またはナフトール類の添
加による増感がペルオキシダーゼを使用する反応
に対して特異的であることが本発明の系の特に有
利な点である。 本発明の化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオン（DPD）化合物は、
化学ルミネセンス反応において励起状態に転化さ
れ、次で光を放射して非励起状態に復帰すること
のできるいかなるDPD化合物でもよい。 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジンジオン化合物としては一般式 （式中、R¹は置換されていないかまたは置換
されているアミノ基であつてR²，R³およびR⁴は
各各水素原子、置換されていないかまたは置換さ
れているC₁−C₆アルキル基、置換されていない
かまたは置換されているC₁−C₆アルケニル基、
ヒドロキシル基、C₁−C₆アルコキシ基、カルボ
キシル基または置換されていないかまたは置換さ
れているアミノ基であるか、またはR²は置換さ
れていないかまたは置換されているアミノ基であ
つてR¹，R³およびR⁴は各各水素原子、置換され
ていないかまたは置換されているC₁−C₆アルキ
ル基、置換されていないかまたは置換されている
C₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−C₆
アルコキシ基、カルボキシル基または置換されて
いないかまたは置換されているアミノ基である
か、またはR¹とR²とは共同してベンゾ基の置換
されていないかまたは置換されているアミノ誘導
体であつてR³およびR⁴は各各水素原子、置換さ
れていないかまたは置換されているC₁−C₆アル
キル基、置換されていないかまたは置換されてい
るC₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−
C₆アルコキシ基、カルボキシル基または置換さ
れていないかまたは置換されているアミノ基であ
る） で表わされるものが好ましい。 本発明に使用するための特に好ましいフタラジ
ンジオン化合物はルミノールおよびイソルミノー
ルである。 本明細書において、置換されているアミノ基に
はアミド基を含む。 本発明のルミネセンス検定方法における化学ル
ミネセンス性DPD化合物の形態は対象とする検
定方法の種類によつて異る。フタラジンジオン化
合物を標識として使用する検定方法例えば有機ル
ミネセンス免疫検定方法の場合には化学ルミネセ
ンス性DPD化合物は、そのアミノ基が配位子例
えばタンパク質、ホルモン、ハプテン、ステロイ
ド、核酸、中間代謝物、抗原または抗体と結合し
た、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ンの置換されたアミノ誘導体である。アミノ基は
配位子と直接結合していても架橋肢を介して結合
していてもよい。適当な架橋肢は、例えば英国特
許第2008247A号明細書および米国特許第4104029
号明細書における論議から明かな如く当業者にと
つて周知である。好ましい架橋肢としては例えば
ヘミスクシナートか、ヘミグルタラートか、ヘミ
マレアートか、カルボキシメチルか、グルクロニ
ドか、メルカプトアセタートかカルボキシメチル
誘導体か、から誘導されるものがある。アミノ基
は公知の任意の方法によつて配位子に結合するこ
とができ、かかる方法のいくつかも英国特許第
2008247A号明細書および米国特許第4104029号明
細書に論じられている。好ましい結合方法の例と
しては混合された無水物、カルボジイミド、およ
び（または）活性エステルを使用する方法があ
る。 フタラジンジオン化合物を標識として使用する
これらの検定用として適当な化学ルミネセンス性
DPD化合物は、アミノ基が配位子と結合してい
る２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
の任意の置換されたアミノ誘導体であつてよい
が、好ましい物質は５−アミノ−２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノール）お
よび６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン（イソルミノール）でいずれの場
合もそのアミノ基が配位子特に抗体と結合したも
のである。 フタラジンジオン化合物を標識として使用する
以外の検定の場合には、化学ルミネセンス性
DPD化合物は配位子と結合していない、２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、
特に上に挙げた好ましい型のものである。この場
合化学ルミネセンス性DPD化合物は溶液内で遊
離しているか、マトリツクス上に固定されている
ことができる。特に好ましい材料はルミノールお
よびイソルミノールである。 化学ルミネセンス性DPD化合物、酸化剤およ
びペルオキシダーゼ間のルミネーセンス反応を増
強する一般式(1)で表わされる任意のフエノール類
またはナフトール類を本検定に使用することがで
きる。しかし、特に化学ルミネセンス性DPD化
合物がルミノールまたはイソルミノールである場
合、次の増感剤が特に高度の増感作用を呈するこ
とが見いだされた。増感剤は４−クロロフエノー
ル、４−ブロモフエノール、４−ヨードフエノー
ル、４−ブロモ−２−クロロフエノール、２，４
−ジクロロフエノール、３，４−ジクロロフエノ
ール、４−メチルフエノール、４−第三ブチルフ
エノール、３−（４−ヒドロキシフエニル）プロ
ピオン酸エチル、４−ベンジルフエノール、４−
（2′，4′−ジニトリロスチリル）フエノール、４
−ヒドロキシケイヒ酸、４−フエニルフエノー
ル、２−クロロ−４−フエニルフエノール、４−
（4′−ヒドロキシフエニル）ベンゾフエノン、４
−（フエニルアゾ）フエノール、４−（2′−カルボ
キシフエニルアゾ）フエノール、４−フエノキシ
フエノール、４−（4′−ヒドロキシフエノキシ）
フエノール、４−ヒドロキシフエニルスルフイ
ド、４−ヒドロキシフエニルジスルフイド、２−
ナフトール、１−ブロモ−２−ナフトール、６−
ブロモ−２−ナフトールおよび１，６−ジブロモ
−２−ナフトールである。これら増感剤のうち、
４−ヨードフエノール、４−フエニルフエノール
および２−クロロ−４−フエニルフエノールは特
に有効であり、４−ヨードフエノールは最も有効
である。 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物特にルミノールのルミネセンス反応の触媒
となる任意のペルオキシダーゼ（供与体と定義さ
れる。過酸化水素、インタナシヨナルユニオンオ
ブビオケミストリーによるオキシドレダクターゼ
（EC No.1.11.1.7）が本発明のルミネセンス検定
方法に使用し得る。例として植物ペルオシダーゼ
が挙げられる。しかし好ましい酵素に西洋わさび
ペルオキシダーゼ（EC No.1.11.1.7）である。 本発明のルミネセンス検定方法におけるペルオ
キシダーゼの形態は対象とする検定方法の種類に
よつて異る。ペルオキシダーゼを標識として使用
する検定方法特に免疫検定方法の場合は、ペルオ
キシダーゼは配位子例えばタンパク質、ホルモ
ン、ハプテン、ステロイド、核酸、中間代謝物、
抗原または抗体と結合される。一般にペルオキシ
ダーゼは架橋肢を介して配位子に結合される。適
当な架橋肢および結合操作は化学ルミネセンス性
DPD化合物について上記したものと同じである。 ペルオキシダーゼを標識として使用する以外の
検定方法の場合は、酵素は溶液中においてもマト
リツクスに固測化されたときも、配位子と結合し
ない遊離の形態にある。 ルミネセンス反応において２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物特にルミノール
またはイソルミノールと反応してDPD化合物の
励起を起させ発光させる任意の酸化剤を本発明の
ルミネセンス反応に使用することができる。特に
好ましい酸化剤は過ホウ酸イオンおよび過酸化水
素である。 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物、またはペルオキシダーゼを配位子に対す
る標識として使用する検定方法、特に免疫検定方
法においては、既知量の酸化剤を通常その給源か
ら反応混合物に添加する。しかし他のある検定方
法の場合には酸化剤（通常過酸化水素）の存在量
は未知である。この第二の型の検定方法において
は標識は、基質から酸化剤への転化に関与する物
質、しばしば酵素例えばグルコースオキシダーゼ
である。かくしてこの場合には本発明のルミネセ
ンス反応は、標識された配位子をルミネセンス反
応混合物中の酸化剤濃度の測定によつて定量する
のに使用される。 本発明のルミネセンス検定方法からの光の放射
は第一にペルオキシダーゼ、酸化剤、増感剤およ
び化学ルミネセンス性DPD化合物の選択に左右
されるが、また二次的因子例えば温度、PH、反応
剤濃度、混合速度および測光方法によつても決定
される。本系の感度を最大とするためには、これ
ら二次的因子を調節して、再現性のある測定の容
易な方法によつて信号対バツクグラウンド比がで
きるだけ大きい状態で最大の発光が得られるよう
にしなければならない。 条件の選定は一般に、酵素すなわちペルオキシ
ダーゼの触媒活性、反応の動力学、使用する装
置、信号対バツクグラウンド比および必要な感度
等の間の妥協によつて行なわれる。 本発明者らは、最適の結果を得るためには本発
明のルミネセンス反応を温度範囲10−50℃、PH範
囲６−10、最も普通には７−９の穏和な条件下で
行なうべきであることを見いだした。本発明の方
法に対する適当な緩衝性物質はリン酸塩、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミノ
−２−メチル−１，３−プロパンジオール、酢酸
塩、炭酸塩およびホウ酸塩である。 一般にルミネセンス反応混合物中の反応剤の濃
度は測定すべき材料以外は一定に保たれる。可変
因子は例えば標識からの生成物、酸化剤または未
結合ペルオキシダーゼ、および標識された配位子
の濃度である。 次の反応剤濃度は本発明のルミネセンス反応に
使用するのに特に適当である： ペルオキシダーゼ 0.1μｇ−5000mg／リツトル 酸化剤 10μmol−300mmol／リツトル 化学ルミネセンス性DPD化合物
0.5μmol−200mmol／リツトル 増感剤 1μmol−100mmol／リツトル 本発明のルミネセンス反応を行なうには四つの
主要反応剤のうちのいくつか（ただし少くとも一
つを除く）を試料管に入れる。次に、欠けていた
主要反応剤を管に添加してルミネセンス反応を開
始させる。放射された光は標準的測定装置例えば
光電子増倍管によつて定量され、それからの信号
は記録計、オツシロスコープまたはスカラーに送
られ表示または記録される。またある場合には光
は肉眼で観察または写真乾板上に記録される。し
かし好ましくは光は英国特許第2025609A号明細
書に記載されている型のルミノメーターによつて
定量される。 本発明のルミネセンス検定方法は三種の主要な
免疫検定方法に使用することができ、そのそれぞ
れの顕著な特徴は配位子に結合される標識の種類
である。標識は次の通りである： (a) ２，３−ジヒドロ−１，４−ナフタリジンジ
オン化合物のアミノまたは置換されたアミノ誘
導体でアミノ基が配位子に結合しているもの、 (b) ペルオキシダーゼ酵素、および (c) 基質の、本ルミネセンス反応によつて定量し
得る材料（一般に過酸化水素またはペルオキシ
ダーゼ）への転化に関与する前記(a)，(b)以外の
物質、一般に酵素例えばグルコースオキシダー
ゼ。 上記の免疫検定方法においては、検定すべき物
質の標識づけ、またはかかる物質の抗体の標識づ
けが可能である。使用する標識の型に応じ検定方
法は不均一系でも均一系でもよい。前者の場合は
複雑な流体例えば血清の分析が可能であるが、後
者の場合には予備的抽出または精製工程が必要な
ことがある。 代表的な不均一系または均一系ルミネセンス免
疫検定方法の概要を以下に述べる： １ 不均一系ルミネセンス免疫検定 この型の免疫検定方法においては検定すべき物
質をその抗体と反応させる。次に遊離の抗体と結
合した抗体とを分離する。反応は、抗体か、検定
すべき物質か、または遊離のもしくは結合した部
分と分離後反応し得る別の分子かを標識すること
によつて定量される。 ２ 競争的不均一系ルミネセンス免疫検定 この場合には検定すべき未知量の物質を、標識
と既知の限定された量のその抗体とを結合させた
既知量の該物質と混合する。標識された物質とさ
れていない物質との間で抗体に対する競争的反応
が起る。抗体と標識されていない物質との、およ
び抗体と標識された物質との錯体を遊離の標識さ
れた物質および標識されていない物質から分離す
る。 抗体と結合した標識された物質の量は検定すべ
き溶液中の標識されていない物質の量に関係す
る。これらの量は抗体に結合した標識の量を測定
するか、残存する遊離の標識された物質の量を測
定することにより定量することができる。ペルオ
キシダーゼが標識であり抗体が固相すなわちガラ
ス試験管の壁に結合しているこの型の検定方法の
例は英国特許第2044927A号明細書に記されてい
る。 ３ “２位置”不均一系ルミネセンス免疫検定 この型の免疫検定方法においては検定すべき物
質を先ず標識されていないその抗体に結合し次に
その抗体を固相支持体たとえばプラスチツクに結
合する。（抗体と物質との）錯体は次に、標識さ
れた抗体によつて処理する。得られた固体錯体中
の標識された抗体の分析は、次に固体錯体を溶液
から分離し、次で分離された固体錯体中に存在す
る標識の量、または溶液中に溶解している残存の
標識された抗体中に存在する標識の量を測定する
ことによつて行なわれる。 この型の免疫検定方法の別の態様においては、
検定すべき物質を標識された抗体、および標識さ
れていない、固体に担持した抗体に逐次結合する
か、または標識された抗体と標識されていない抗
体との両方に一段階で結合する。 ４ 均一系ルミネセンス免疫検定 この方法は標識が、２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジンジオン化合物のアミノまたは置換さ
れたアミノ誘導体である免疫検定方法に適用でき
る。これは対象である遊離の標識された物質（ま
たはその抗体）から放射される光の強度または波
長が対象である結合された標識された物質（また
はその抗体）から放射される光と異ることに基い
ている。 一例として、（プロゲステロン−イソルミノー
ル誘導）複合体、ヘム触媒および過酸化水素の反
応により放射される光の強度は同じ反応を抗プロ
ゲステロンIgGの存在で行なうときの強度より低
いことが見いだされた。 すなわちこの検定方法においては未知のプロゲ
ステロン試料を先ず既知量の抗プロゲステロン
IgGと共にインキユベートした。平衡到達後既知
量のプロゲステロン−イソイルミノール誘導複合
体を添加し、次に既知量のヘムおよび過酸化水素
を加えた。放射された光を測定し、これにより未
知試料中に存在するプロゲステロンの量を標準曲
線から求めた。（未知試料中のプロゲステロンの
量が多い程平衡において残存する遊離IgGが少く
ルミネセンス反応の光の収率が低い）。 このようにして、プロゲステロンの定量を分離
工程の必要なしに達成することができる。 上記免疫検定方法のすべてにおいて、定量、検
出および探索の工程に本発明のルミネセンス反応
を適用し得る。 上記免疫検定方法に使用する抗体は市場から購
入しまたは既知の免疫学的手法によつて調製する
ことができる。抗体は抗体（複数）の複雑な混合
物の形態であつても、または一つ以上のモノクロ
ーナルな抗体であつてもよい。一般に抗体の所要
容積は僅かであり、抗体はその活性に対して適当
なPH、イオン強度および温度条件に保たれる。 本発明のルミネセンス反応を利用する免疫検定
方法には以下に列挙する物質が有利に使用し得る
がこれに限られるものではない：タンパク質、例
えばインシユリン、アルフアフエトタンパク質お
よびフエリチン、ホルモン例えば成長ホルモン、
上皮小体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成
ホルモン、甲状肢刺激ホルモン、向副腎皮質性ホ
ルモン、グルカゴン、プロラクチン、およびカル
シトニン、ハプテン／ステロイド例えばエストリ
オール、プロゲステロンおよびコルチゾル、医薬
例えばジゴキシン、抗原例えば細胞表面抗原およ
び発がん抗原、および抗体例えばおたふくかぜビ
ルス抗原、ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）、ウサギ
IgG、ヒツジIgG、モルモツトIgG、ロバIgGおよ
びヒト免疫グロブリンＥおよびＭ。 本発明のルミネセンス検定方法はまた上記の免
疫検定方法以外の検定方法にも使用することがで
きる。例として次のものを挙げることができる： １ 不溶性ペルオキシダーゼエラスチン試料から
のペルオキシダーゼ放出に基くエラスターゼの
検定。 この検定方法においては、固体のエラスチン−
ペルオキシダーゼ複合体を種々の量のエラスター
ゼと共にインキユベートする。所定時間後未反応
の複合体を遠心分離によつて除去し、上澄液につ
いて結合していないペルオキシダーゼを検定す
る。 上澄液中に存在する不結合ペルオキシダーゼの
量は被験試料中のエラスターゼの活性と関係して
いる。 ２ 合成ペプチド基質からのイソルミノール放出
に基くプロテイナーゼ検定。 この検定方法においては、固定化された合成ポ
リペプチド基質であるアフイゲル（Affigel）10
−Ala−Ala−Ala−Phe−イソルミノールを種々
の量のプロテイナーゼによつて処理する。所定時
間後未反応基質を遠心分離によつて除去し、上澄
液についてイソルミノールを検定する。上澄液中
に存在するイソルミノールの量は被験試料中のプ
ロテイナーゼ活性に関係している。 ３ 共固定化したグルコースオキシダーゼとペル
オキシダーゼに基くグルコースの検定。 この検定方法においてはグルコースオキシダー
ゼとペルオキシダーゼとを支持体例えばセフアロ
ース（登録商標）またはプラスチツク管上に共固
定化する。これにルミノールおよび増感剤の溶液
を加える。最後にグルコースの溶液を加え、光の
放射を記録する。光の放射は溶液中のグルコース
量と直接に関係している。 本発明の検定方法の主用途は臨床検査室または
外科である。かかる検査室および（または）外科
においては所定の検定操作に使用すべき材料を検
定キツトの形で入手するのが通常である。 従つて本発明はまた (a) ペルオキシダーゼ (b) 一般式(1)で表わされ、式中においてＲ，Ａお
よびＢは先に定義した通りである増感剤、およ
び (c) 化学ルミネセンス性の２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物 を含有して成る、本発明の高められたルミネセン
スまたはルミノメトリー検定用の検定キツトを提
供する。 検定キツトはまた酸化剤を含んでもよいが、多
くの場合は酸化剤は別個に提供されるか、または
検定すべき物質である。 好ましくは、ペルオキシダーゼ、酸化剤、増感
剤、および化学ルミネセンス性DPD化合物はそ
れぞれ、先に本発明の検定に使用するに好ましい
ものとして列挙した物質である。本検定キツトの
特に好ましい一態様においては、ペルオキシダー
ゼと化学ルミネセンス性DPD化合物とのうち少
くとも一つは検定すべき物質の抗体に結合され
る。 必要に応じ検定キツトにはまた、検定すべき物
質の既知量をそれぞれ含有する一種以上の標準溶
液および（または）一種以上の好ましい緩衝液が
含まれていてもよい。検定キツトはまた、検定の
実施に際し放射された光の測定に使用する装置と
共用するのに適当な反応容器を含むのが便利であ
る。また反応剤を十分に混合するのに使用するた
めの混合装置も検定キツトに含むことができる。 以下本発明の検定方法および検定キツトについ
て説明するがこれは単に例示のためであつて本発
明はこれに限定されるものではない。 材料および方法 反応剤 西洋わさびペルオキシダーゼ〔HRP：純度指
数（Reinheit Zahl）（403nmでの光学濃度に対す
る250nmでの光学濃度の比、RZ）約1.0〕は
Hughes and Hughes社（Romford，Essex）か
ら入手し、2.6cm×4.0cmの〓Ultrogel AcA 34〓
カラム（LKBインストルメンツ社、South
Croydon，Surrey）を使用するゲル過によつ
て精製した。カラムはNaCl0.15mol／を含む
0.015mol／リン酸塩緩衝液（PH7.2）を使用し
て溶離した。得られた精製ペルオキシダーゼの
RZは約3.0であつた。 アルフアフエトタンパク質（AFP）、ウサギ抗
ヒトAFP（コード100−008）およびウサギ抗ヒト
AFP／HRP複合体はMercia Brocades社Dako
Products（Brocades House，Pyrford，West
Byfleet，Weybridge，Surrey）から入手した。 チロキシン（T₄）、ウサギ抗T₄被覆管および
T₄／HRP複合体はBoehringer社（Lewes，
Sussex，英国）から入手した。 風疹ビルス（ヒト）被覆ビーズおよび抗ヒト
IgG（ヤギ）／HRP複合体はAffott研究所、診断
事業部（Brighton Hill Parade，Basingstoke，
Hampshire）から入手した。 抗IgE（ヤギ）被覆管および抗IgE（ウサギ）ペ
ルオキシダーゼ複合体はBehringwerke社
（Marburg）から入手した。 ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン）およびイソルミノー
ル（６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン）はSigma Chemical社（Fancy
Road，Poole，Dorset、英国）から入手した。
ルミノールのモノナトリウム塩は既に報告されて
いる方法（Hamら、Anal.Lett.，1979、12、
535）によつて調製した。 ７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカ
ルボン酸ヒドラジド（式(2)において、R¹とR²と
は共同してジメチルアミノで置換されたベンゾ基
を表わし、R³＝R⁴＝Ｈである化合物）は
Boehringer社（Mannheim）から入手した。 Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソル
ミノールはフインランドのLKBから入手した。 フエノール類およびナフトール類は、２−クロ
ロフエノールおよび２，４，６−トリクロロフエ
ノール〔Fluka社、Chemische Fabrik（CH9470、
Buchs、スイス）から入手〕、２−ナフトール
〔BDH Chemicals社、（Atherstone、
Warwickshire）から入手〕および４−ヒドロキ
シフエニルスルフイド〔Fluorochem社
（Glossop，Derbyshire）から入手〕を除きすべ
てAldrich Chemical社から入手した。 エラスチン、エラスターゼ、およびグルコース
オキシダーゼはSigma Chemical社（Dorset）か
ら入手した。 分析装置 化学ルミネセンス反応は10mm×10mmで容積４ml
のプラスチツク製使い捨てキユベツト（W.
Sarstedt社、Leicester LE31UQ、英国）中で行
なつた。放射光は既に報告されているルミノメー
ター（Carterら、英国特許第2025609A号明細書
参照）に、数個のキユベツトを光電子増倍管の光
電陰極の前に正確にかつ再現性良く順次位置でき
るよう改変を加えて定量した。 結果は高速電位差測定式チヤート記録計
〔PM8202型、Philipo社（Eindhoven、オラン
ダ）、全目盛ふれ時間0.25秒以下〕上に表示した。 例 １ ルミノールおよび４−ヨードフエノールを使用
するペルオキシダーゼのルミネセンス検定 ナトリウムルミノール（50mg）および過酸化水
素（62μ、30％ｗ／ｖ）をトリス緩衝液（0.1モ
ル濃度、PH8.5）200mlに加える。溶液は使用の数
時間前に調製し、ルミネセンス反応を開始させる
のに使用した。10μの４−ヨードフエノールの
ジメチルスルホキシド溶液（4.54mmol／リツト
ル）をキユベツトの一隅に入れ、ウサギ抗AFP
−HRP複合体（1000倍希釈）10μを別の隅に入
れた。ルミノール／H₂O₂反応剤（0.9ml）を注入
して反応を開始させた。放射光を測定した結果を
第１表に示す。信号／バツクグラウンド比の改善
も測定し、結果を第２表に示す。 例 ２−３ ４−ヨードフエノール溶液の添加量をそれぞれ
20μおよび90μに増加した以外は例１と同様
に操作した。放射光を測定した結果を第１表に示
す。信号／バツクグラウンド比の改善も測定し、
結果を第２表に示す。 例 ４−８ ４−ヨードフエノールの代りに次の増感剤を使
用した以外は例１と同様に操作した： ４−ブロモフエノール ４−クロロフエノール ４−ブロモ−２−クロロフエノール ２，４−ジクロロフエノール ３，４−ジクロロフエノール 結果を第１表および第２表に示す。 例 ９−13 増感剤溶液の添加量を90μに増加した以外は
例４−８と同様に操作した。結果を第１表および
第２表に示す。 例 14−16 ４−ヨードフエノールの代りに次の増感剤を使
用した以外は例１と同様に操作した： ４−ヒドロキシケイヒ酸 ２−ナフトール ６−ブロモ−２−ナフトール 結果を第１表および第２表に示す 例 17−20 ４−ヨードフエノール10μの代りに次の増感
剤5μを使用した以外は例１と同様に操作し
た： ４−フエニルフエノール １，６−ジブロモ−２−ナフトール １−ブロモ−２−ナフトール ２−クロロ−４−フエニルフエノール 結果を第１表および第２表に示す。 例 21−25 ４−ヨードフエノール10μの代りに次の増感
剤5μを使用した以外は例１と同様に操作し
た： ４−ヒドロキシフエニルスルフイド ４−ヒドロキシフエニルジスルフイド ４−（2′，4′−ジニトロスチリル）フエノール ４−（4′−ヒドロキシフエニル）ベンゾフエノ
ン ４−（4′−ヒドロキシフエノキシ）フエノール 信号／バツクグラウンド比の改善を測定し、結
果を第３表に示す。 例 26−29 ４−ヨードフエノール10μの代りに次の増感
剤20μを使用した以外は例１と同様に操作し
た： ４−（フエニルアゾ）フエノール ４−（2′−カルボキシフエニルアゾ）フエノー
ル ４−ベンジルフエノール ３−（４−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸
エチル 信号／バツクグラウンド比の改善を測定した結
果を第３表に示す。 比較例 ルミネセンス反応混合物に増感剤を添加しなか
つた以外は例１と同様に操作した。結果を第１表
および第２表に示す。

【表】 定

【表】

【表】 エノール

【表】 プロピオン酸エ
チル
例 30−33 ４−ヨードフエノールの代りに他の種々のフエ
ノール類およびナフトール類（10μ、DMSO中
１mg／ml溶液）を使用した以外は例１と同様に操
作した。放射光量を増感剤なしのルミネセンス反
応のものと比較した。フエノールまたはナフトー
ル類の存在において放射光量がその不在の場合よ
りも大きければルミネセンス反応は増強されたも
のとした。 結果を第４表に示す。

【表】 例 34 ルミノールの代りにＮ−（６−アミノヘキシル）
−Ｎ−エチルイソルミノールを使用した以外は例
１と同様に操作した。 例 35 ルミノールの代りにイソルミノールを使用した
以外は例１と同様に操作した。 例 36 ルミノールの代りに７−ジメチルアミノナフタ
レン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド（９−ジ
メチルアミノ−２，３−ジヒドロベンゾ〔ｆ〕フ
タリジン−１，４−ジオン）を使用し、フタラジ
ンジオン化合物／H₂O₂を使用前１：10に希釈し
た以外は例１と同様に操作した。 例 37 過酸化水素の代りに過ホウ酸ナトリウムを使用
した以外は例１と同様に操作した。 例 38 アルフアフエトタンパク質（AFP）の検定 (a) 抗AFPによるポリスチレンビーズの被覆 (1) 500mlの広口ガラスびんにグリシン／NaOH
緩衝液（0.1mol／、PH8.8）125mlおよび
BSA0.25ｇを添加した。次に溶液を20℃でロー
ラーミキサー上で２時間混合した。終了後びん
（およびふた）をグリシン緩衝液（50ml×３回）
ですすいで未結合アルブミンを除き、最後に流
し出して水を切つた。 (2) ポリスチレンビーズ1000個をリプソール
（Lipsol、登録商標、１％、500ml）で30分間洗
浄した。蒸留水で洗浄後ビーズをグリシン緩衝
液200mlと共にブフナーフラスコに入れ脱ガス
した。 (3) グリシン緩衝液400mlを予め被覆したガラス
瓶に移し、ウサギ抗ヒトAFP1.5mlを加えた。
溶液をよく混合した後脱ガスしたビーズを添加
した。全体をローラーミキサー上で６時間、20
℃で混合した。 (4) ６時間後グリシン緩衝液−抗体溶液を傾瀉
し、ビーズを400mlのPBS（リン酸塩
0.015mol／、NaCl0.15mol／、PH7.2）で
２回洗浄した。第２回のPBS洗液を傾瀉して
除いたのち、BSAのPBS（400ml）溶液（0.5
％）を添加した。全体を再びローラーミキサー
上で20℃で混合した。30分後PBS−アルブミ
ン溶液を取りTween20（登録商標、0.01％）を
含有する酢酸塩緩衝液（0.1mol／、PH4.2、
400ml）を添加した。10分間混合を行つたのち
酢酸塩緩衝液をTween0.05％を含有するPBS
緩衝液（400ml×２）で置換えた。最後にPBS
を傾瀉して除き、ビーズを紙上で20℃で30分
間乾燥した。ビーズはねじぶたをしたびんに４
℃で貯蔵した。 (b) (1) PBS中の十分な抗体被覆ビース〔前記
(a)工程〕を15−30分間脱ガスした。 (2) AFPを含有する試料50μをPBS／BSA／
Tween（リン酸塩0.015mol／、
NaCl0.15mol／、BSA0.2％、Tween20 0.05
％、PH7.2）0.95mlと共にキユベツトに加えた。
溶液を37℃に温めたのちビーズと共に１時間イ
ンキユベートした。 (3) 次に溶液を傾瀉して除き、ビーズをPBS／
Tweenで洗浄した（200mlで15秒間、次に200
mlで５分間）。 (4) 次にビーズをウサギ抗ヒトAFP／HRP複合
体１：1000希釈液0.9mlと１時間インキユベー
トした。（複合体はPBS／SBA／Tweenに希釈
し、ビーズへの添加前に37℃に温めた）。 (c) (1) 溶液を再び傾瀉して除き、ビースを脱イ
オン蒸留水で２回洗浄した。水を傾瀉により除
いたのちビーズを注意深くキユベツトに移した
（キユベツト当り１個）。 (2) 各キユーベツトの隅にはまた、10μの４−
ヨードフエノールのトリス緩衝液（0.1mol／
、PH8.0）溶液（１mg／ml）を入れた。ルミ
ノール／H₂O₂溶液〔ナトリウムルミノール
（50mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、トリス
（0.1mol／、PH8.0、200ml）〕0.9mlを注入し
てルミネセンス反応を開始させた。30秒後の光
放射を測定し、あらかじめ調製した標準曲線と
比較してAFP濃度を求めた。 例 39 T₄の検定 T₄を競争的酵素結合免疫吸着検定を使用して
検定した。標識されていないT₄とT₄／HRP複合
体とを含有する試料混合物を、限定された量の抗
T₄（ウサギ）で被覆した管とインキユベートし
た。 平衡到達後未結合の材料を管から洗い去り、
10μの４−ヨードフエノールのトリス緩衝液
（0.1mol／、PH8.0）溶液（１mg／ml）を各管に
入れた。ルミノール／H₂O₂溶液〔ナトリウムル
ミノール（50mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、
トリス（0.1mol／、PH8.0、200ml）〕0.9mlを注
入してルミネセンス反応を開始させた。30秒後の
光放射を測定し、あらかじめ調製した標準曲線と
比較してT₄濃度を求めた。 例 40 抗風疹IgGの検定 抗風疹IgGを含有する試験試料を風疹ビルス
（ヒト）被覆ビーズとトリス緩衝液中でインキユ
ベートした。洗浄して未反応成分を除いたのち、
ビーズを抗ヒトIgG（山羊）／HRP複合体と、再
びトリス緩衝液中でインキユベートした。 溶液を傾瀉し、ビーズは脱イオン蒸留水で洗浄
した。洗浄したビーズを水から分離したのちキユ
ベツトに移した（キユベツト当り１個）。 各キユベツトの隅にはまた、10μのヨードフ
エノールのトリス緩衝液（0.1mol／、PH8.0）
溶液（１mg／ml）を入れた。ルミノール／H₂O₂
溶液〔ナトリウムルミノール（50mg）、H₂O₂（62μ
、30％ｗ／ｖ）、トリス（0.1mol／、PH8.0、
200ml）〕0.9mlを注入してルミネセンス反応を開
始させた。30秒後の光放射を測定し、あらかじめ
調製した標準曲線と比較して抗風疹IgG濃度を求
めた。 例 41 IgEの検定 ヒトIgEを含有する試料を抗IgE（ヤギ）被覆管
に添加し20℃で２時間インキユベートした。終了
後管を洗浄して未反応成分を除き、既知量の抗
IgE（ウサギ）ペルオキシダーゼ複合体を管に加
え、20℃でさらに２時間インキユベートした。 次に過剰の酵素と複合した抗体を洗い去り結合
酵素活性を次のようにして測定した： 各管の隅に10μの４−ヨードフエノールのトリ
ス緩衝液（0.1mol／、PH8.0）溶液（１mg／ml）
を入れた。ルミノール／H₂O₂〔ルミノール（50
mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、トリス
（0.1mol／、PH8.0、200ml）〕0.9mlを注入して
ルミネセンス反応を開始させた。30秒後の光放射
を測定し、あらかじめ調製した標準曲線と比較し
てIgE濃度を求めた。 例 42 エラスターゼの検定 西洋わさびペルオキシダーゼをG.C.Saunders
らの方法（Anal.Biochem.1982、126、122）によ
り粉末エラスチンと複合させた。エラスチンペル
オキシダーゼ懸濁液１mlを洗浄し、CaCl₂
（2mmol／）を含む0.01mol／トリス緩衝液
（PH９）２ml中で平衡させた。複合体を遠心分離
して上澄液を廃棄した。種々の量（０−100ng／
ml）のエラスターゼのトリス−CaCl₂緩衝液溶液
を加え、エラスチン−HRPと共に37℃でインキ
ユベートした。60分後未反応のエラスチン−
HRPを遠心分離により除去し、上澄液のアリコ
ートを移して再遠心分離した。上澄液200μを
とつてキユベツトに入れ、ルミノール／H₂O₂／
４−ヨードフエノール溶液〔ナトリウムルミノー
ル（50mg）、H₂O₂（62μ、30％ｗ／ｖ）、４−ヨ
ードフエノール（２ml、DMSO中１mg／ml）、ト
リス緩衝液（0.1mol／、PH8.0）200ml中〕0.9
mlを添加して光放射を開始させた。30秒後の光放
射を測定した。 例 43 共固定化したグルコースオキシダーゼとペルオ
キシダーゼによるグルコース検定 グルコースオキシダーゼ（５mg、Sigma社）お
よび西洋わさびペルオキシダーゼ（５mg、Sigma
社）をFordおよびDelucaの方法（Anal.
Biochem.，1981、110、43）により、臭化シアン
で活性化したセフアロース上に共固定化した。固
定化した酵素はリン酸塩緩衝液（0.1mol／、
PH7.0）中に懸濁した。固定化酵素懸濁液（100
mg／、50μ）を、キユベツトに入れたルミノ
ール水溶液（25mg／100ml）１mlと４−ヨードフ
エノール（DMSO中１mg／ml）50μに添加し
た。次にグルコース含有の水性溶液試料10μを
加え、キユベツト内容物を混合し、光放射を記録
した。ピークの光放射はグルコース50−
500mmolの間で直線的であつた。別の方法とし
て、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ
をプラスチツク支持体上に固定化することもでき
る（例えばLeonら、Clin.Chem.，1977、23、
1556参照）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼと酸化剤と化学ルミネセン
   ス性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
   ン化合物との化学ルミネセンス反応を、式 ［式中、 (i) ＡおよびＢは水素原子であり、そしてＲはハ
   ロゲン原子、フエニル基、
   【式】（ここで、Ｙは−CH₂ −または−Ｏ−であり、そしてＶは水素原子で
   あるか、あるいはＹは−Ｏ−、−Ｓ−または−
   Ｓ−Ｓ−であり、そしてＶはヒドロキシル基で
   ある）、【式】（ここで、Ｗ は水素原子またはカルボキシル基である）、
   【式】基−CH＝ CH−Ｚ（ここで、Ｚはカルボキシル基または
   ２，４−ジニトロフエニル基である）、基−
   CH₂CH₂COOC₂H₅またはC₁−C₆アルキル基で
   あるか、 (ii) Ａは水素原子であり、Ｂはハロゲン原子また
   はC₁−C₆アルキル基であり、そしてＲはハロ
   ゲン原子であるか、 (iii) Ａはハロゲン原子であり、Ｂは水素原子であ
   り、そしてＲはハロゲン原子またはフエニル基
   であるか、あるいは (iv) Ａは水素原子またはハロゲン原子であり、Ｒ
   とＢとは一緒に式【式】 （式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子で
   ある） で表わされるナフタリン核構成鎖を表わし、こ
   れにより式(1)で表わされる化合物は式 で表わされるベータナフトールとなり、そして 上記(i)〜(iv)の各場合においてハロゲン原子と
   は塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味
   する］ で表わされるフエノール性化合物の存在下で行
   うことを特徴とする、ルミネセンスまたはルミ
   ノメトリー検定方法。 ２ 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−１，
   ４−フタラジンジオン化合物として一般式 （式中、R¹は置換されていないかまたは置換
   されているアミノ基であつてR²，R³およびR⁴は
   各各水素原子、置換されていないかまたは置換さ
   れているC₁−C₆アルキル基、置換されていない
   かまたは置換されているC₁−C₆アルケニル基、
   ヒドロキシル基、C₁−C₆アルコキシ基、カルボ
   キシル基または置換されていないかまたは置換さ
   れているアミノ基であるか、またはR²は置換さ
   れていないかまたは置換されているアミノ基であ
   つてR¹，R³およびR⁴は各各水素原子、置換され
   ていないかまたは置換されているC₁−C₆アルキ
   ル基、置換されていないかまたは置換されている
   C₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−C₆
   アルコキシ基、カルボキシル基または置換されて
   いないかまたは置換されているアミノ基である
   か、またはR¹とR²とは共同してベンゾ基の置換
   されていないかまたは置換されているアミノ誘導
   体であつてR³およびR⁴は各各水素原子、置換さ
   れていないかまたは置換されているC₁−C₆アル
   キル基、置換されていないかまたは置換されてい
   るC₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−
   C₆アルコキシ基、カルボキシル基または置換さ
   れていないかまたは置換されているアミノ基であ
   る） で表わされるものを使う前項１に記載の検定方
   法。 ３ 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−１，
   ４−フタラジンジオン化合物としてルミノールま
   たはイソルミノールを使う前項２に記載の検定方
   法。 ４ ペルオキシダーゼとして西洋わさび
   （horseradish）ペルオキシダーゼを使う前項１〜
   ３のいずれかに記載の検定方法。 ５ 酸化剤として過酸化水素または過ホウ酸イオ
   ンを使う前項１〜４のいずれかに記載の検定方
   法。 ６ ペルオキシダーゼが遊離の形または配位子に
   結合した形で存在し、ペルオキシダーゼの存在ま
   たは量を化学ルミネセンスの検出または測定から
   それぞれ推定する前項１〜５のいずれかに記載の
   検定方法。 ７ フエノール性化合物として４−ヨードフエノ
   ール、４−フエニルフエノールまたは２−クロロ
   −４−フエニルフエノールを使う前項１〜６のい
   ずれかに記載の検定方法。 ８ ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
   ン化合物としてルミノールまたはイソルミノール
   を使い、ペルオキシダーゼとして配位子に結合し
   た形で存在する西洋わさびペルオキシダーゼを使
   い、西洋わさびペルオキシダーゼの存在または量
   を化学ルミネセンスの検出または測定からそれぞ
   れ推定し、酸化剤として過酸化水素を使い、そし
   てフエノール性化合物として４−ヨードフエノー
   ルを使う前項１に記載の検定方法。 ９ 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−１，
   ４−フタラジンジオン化合物、 ペルオキシダーゼ、および式 ［式中、 (i) ＡおよびＢは水素原子であり、そしてＲはハ
   ロゲン原子、フエニル基、
   【式】（ここで、Ｙは−CH₂ −または−Ｏ−であり、そしてＶは水素原子で
   あるか、あるいはＹは−Ｏ−、−Ｓ−または−
   Ｓ−Ｓ−であり、そしてＶはヒドロキシル基で
   ある）、【式】（ここで、Ｗ は水素原子またはカルボキシル基である）、
   【式】基−CH＝ CH−Ｚ（ここで、Ｚはカルボキシル基または
   ２，４−ジニトロフエニル基である）、基−
   CH₂CH₂COOC₂H₅またはC₁−C₆アルキル基で
   あるか、 (ii) Ａは水素原子であり、Ｂはハロゲン原子また
   はC₁−C₆アルキル基であり、そしてＲはハロ
   ゲン原子であるか、 (iii) Ａはハロゲン原子であり、Ｂは水素原子であ
   り、そしてＲはハロゲン原子またはフエニル基
   であるか、あるいは (iv) Ａは水素原子またはハロゲン原子であり、Ｒ
   とＢとは一緒に式【式】 （式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子で
   ある） で表わされるナフタリン核構成鎖を表わし、こ
   れにより式(1)で表わされる化合物は式 で表わされるベータナフトールとなり、そして 上記(i)〜(iv)の各場合においてハロゲン原子と
   は塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味
   する］ で表わされるフエノール性化合物 の各成分を別別の容器に含んで成る、ルミネセ
   ンスまたはルミノメトリー検定に使用するため
   のキツト。 １０ 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−
   １，４−フタラジンジオン化合物として一般式 （式中、R¹は置換されていないかまたは置換
   されているアミノ基であつてR²，R³およびR⁴は
   各各水素原子、置換されていないかまたは置換さ
   れているC₁−C₆アルキル基、置換されていない
   かまたは置換されているC₁−C₆アルケニル基、
   ヒドロキシル基、C₁−C₆アルコキシ基、カルボ
   キシル基または置換されていないかまたは置換さ
   れているアミノ基であるか、またはR²は置換さ
   れていないかまたは置換されているアミノ基であ
   つてR¹，R³およびR⁴は各各水素原子、置換され
   ていないかまたは置換されているC₁−C₆アルキ
   ル基、置換されていないかまたは置換されている
   C₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−C₆
   アルコキシ基、カルボキシル基または置換されて
   いないかまたは置換されているアミノ基である
   か、またはR¹とR²とは共同してベンゾ基の置換
   されていないかまたは置換されているアミノ誘導
   体であつてR³およびR⁴は各各水素原子、置換さ
   れていないかまたは置換されているC₁−C₆アル
   キル基、置換されていないかまたは置換されてい
   るC₁−C₆アルケニル基、ヒドロキシル基、C₁−
   C₆アルコキシ基、カルボキシル基または置換さ
   れていないかまたは置換されているアミノ基であ
   る） で表わされるものを使う前項９に記載のキツト。 １１ 化学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−
   １，４−フタラジンジオン化合物としてルミノー
   ルまたはイソルミノールを使う前項１０に記載の
   キツト。 １２ ペルオキシダーゼとして西洋わさびペルオ
   キシダーゼを使う前項９〜１１のいずれかに記載
   のキツト。 １３ ペルオキシダーゼが遊離の形または配位子
   に結合した形で存在する前項９〜１２のいずれか
   に記載のキツト。 １４ フエノール性化合物として４−ヨードフエ
   ノール、４−フエニルフエノールまたは２−クロ
   ロ−４−フエニルフエノールを使う前項９〜１３
   のいずれかに記載のキツト。 １５ ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
   オン化合物としてルミノールまたはイソルミノー
   ルを使い、ペルオキシダーゼとして配位子に結合
   した形で存在する西洋わさびペルオキシダーゼを
   使いそしてフエノール性化合物として４−ヨード
   フエノールを使う前項９に記載のキツト。