JPH05202098A - 乳質原料から生理活性物質の製造法 - Google Patents

乳質原料から生理活性物質の製造法

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JPH05202098A
JPH05202098A JP4036915A JP3691592A JPH05202098A JP H05202098 A JPH05202098 A JP H05202098A JP 4036915 A JP4036915 A JP 4036915A JP 3691592 A JP3691592 A JP 3691592A JP H05202098 A JPH05202098 A JP H05202098A
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cation exchanger
aqueous solution
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Toshiaki Uchida
俊昭 内田
Kaoru Sato
薫 佐藤
Isahiro Kawasaki
功博 川崎
Shunichi Dosemari
俊一 堂迫
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ラクトパーオキシダーゼ、分泌性コンポーネ
ント、ラクトフェリンを含む乳質原料を陽イオン交換体
と接触させることによりこれらの成分を陽イオン交換体
に吸着させた後、イオン強度及びpHの相違する水溶液ま
たは緩衝液で順次これらの成分を分離溶出させてラクト
パーオキシダーゼ、分泌性コンポネント及びラクトフェ
リンを製造する方法。 【効果】 簡単な操作で純度が高いラクトパーオキシダ
ーゼ、分泌性コンポネント及びラクトフェリンを収率よ
く得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳質原料から生理活性
物質を分離精製する方法に関する。オキシダーゼ（以
下、ＬＰＯと略記する）、分泌性コンポネント（以下、
ＳＣと略記する）、ラクトフェリン（以下、ＬＦと略記
する）のいずれか少なくとも一つを含む乳質原料をイオ
ン交換クロマトグラフ処理し、ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを分
離して製造する方法に関する。本発明の方法によって得
られるＬＰＯ、ＳＣ及びＬＦは、多様な生理活性を有す
るので、医薬、化粧品、飲食品、飼料等の分野で利用さ
れる。
【０００２】
【従来の技術】ＬＰＯ、ＳＣ及びＬＦは、乳等の外分泌
液中に存在する糖蛋白質である。ＬＰＯは、過酸化物除
去に大きな役割を果たすと共に、抗菌活性についても知
られている。ＳＣは、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡ
と略記する）と結合し、分泌型ＩｇＡ（以下、ＳＩｇＡ
と略記する）を形成する。このＳＩｇＡは、乳児にとっ
て最も重要な感染防御因子であって、消化器官内でプロ
テアーゼ等によって簡単には分解されず、外来抗原に対
する凝集作用等、局所感染防御に関与している。このよ
うなＳＩｇＡのプロテアーゼ耐性は、ＳＣによって付与
されていることが知られている。ＬＦは、静菌作用、リ
ンパ球の増殖効果、鉄の吸収促進効果、白血球の分化調
整作用、過酸化脂質の生成防止効果、抗ウイルス作用
等、種々の生理機能を持つことが知られている。したが
って、ＬＰＯ、ＳＣ及びＬＦの生理作用が生体内でも有
効であれば、医薬、化粧品、飲食品、飼料等の素材とし
て大いに利用することができる。
【０００３】ＬＰＯとＬＦを取得する方法としては、ア
ルギン酸ゲルを用いてＬＦ及びＬＰＯを同一画分中に得
る方法（特開昭61−246198）、カルボキシル基またはス
ルホン基を導入したデキストランを被覆したシリカ粒子
を用い、塩濃度勾配によってＬＰＯとＬＦを溶出する方
法（特開平１−86839)、強陽イオン交換体に吸着したＬ
ＰＯとＬＦをpH 6.5で塩濃度を変化させることによって
選択的に溶出させる方法（特表平３−502921）等が知ら
れている。さらにＬＦとＬＰＯを選択的に溶出する方法
としては、乳またはホエーを陽イオン交換樹脂と接触さ
せ、イオン強度0.2〜0.7 、pH５以下の水溶液または緩
衝液でＬＰＯを溶出させた後、イオン強度 0.5以上、pH
５以上の水溶液または緩衝液でＬＦを溶出する方法（特
開平３−109400）が知られているが、ＳＣの溶出につい
ては言及されていない。
【０００４】一方、ＳＣを取得する方法としては、本発
明者らは、乳またはホエーを陽イオン交換樹脂と接触さ
せ、イオン強度 0.005〜0.25、pH６〜９の塩溶液で溶出
する方法（特願平３−49162)を出願した。しかし、この
方法によると得られるＳＣ含有量の高い画分が得られる
が、ＳＣの単離という面からみるとＳＣの純度が低く、
乳またはホエーのpHを６〜９、電気伝導度を５mS／cm以
下に調整しても70％程度の純度しか得られない。さらに
純度を上げるためには、一旦ＬＦ及び／またはＬＰＯを
除去した残液を回収し、再度イオン交換クロマトグラフ
処理を行わなければならない。また、ＳＣとＬＦを個々
に分画する方法として、ＤＥＡＥ−セルロース及びＣＭ
−セルロースを用いた二段階精製方法（榎本ら、『消化
器と免疫』、第16巻、 146〜150 頁、1986年発行）が知
られている。しかし、このような再クロマトグラフ処理
を工業的に行うと、工程が複雑となり、作業性を低下さ
せるという問題があった。しかもこれらの方法は、乳質
原料中に存在する生理活性物質のＬＰＯ、ＳＣ及びＬＦ
の３者を同時に分離精製しようとするものではなかっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、叙上の状況
に鑑みなされたものであって、ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中
いずれかを少なくとも一つ以上含む乳質原料を、陽イオ
ン交換体と接触させることによって、ＬＰＯ、ＳＣ、Ｌ
Ｆを吸着させた後、個々に溶出させることにより、効率
的、かつ工業的規模でＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを製造する方
法を提供することを課題とする。
【０００６】
【発明を解決するための手段】本発明者らは、従来技術
のところで示したように、効率的、かつ高純度でＬＰＯ
及びＬＦを回収する方法（特開平３−109400）を提案し
たが、この際に回収されるＬＦ画分を詳細に解析したと
ころ、ＬＦのみならずＳＣが混入していることが判明し
た。これは、ＬＦもＳＣも分子量が約 80KDaの糖蛋白質
であって、その物理化学的性質がよく似ているため、電
気泳動的に両者を識別することが困難であったことによ
る。
【０００７】そこで本発明者らは、ＬＦとＳＣを含む画
分から両者を分画する方法について鋭意検討を行ったと
ころ、(1) ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中いずれかを少なくと
も一つ以上含む乳質原料を陽イオン交換体と接触させ、
(2) イオン強度 0.2以下、pH５以下の水溶液または緩衝
液で陽イオン交換体を洗浄し、(3) 陽イオン交換体を洗
浄した後、イオン強度 0.2〜0.5 、pH５以下の水溶液ま
たは緩衝液でＬＰＯを選択的に溶出し、(4) ＬＰＯを溶
出した後、イオン強度 0.1〜0.5 、pH５を越える水溶液
または緩衝液でＳＣを選択的に溶出し、(5) ＳＣを溶出
した後、イオン強度 0.5を越え、pH５を越える水溶液ま
たは緩衝液でＬＦを選択的に溶出することによってＬＰ
Ｏ、ＳＣ及びＬＦを分離できることを見出し、本発明を
なすに至った。
【０００８】本発明で用いることのできる乳質原料とし
ては、ヒト、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ等の哺乳類由来
の乳及びホエーを挙げることができる。好ましくは、熱
処理条件の緩やかなものを用いる。また、脱脂粉乳、全
脂粉乳、ホエー粉、ホエー蛋白を75％以上含むＷＰＣ粉
（ホエー蛋白質濃縮物）、あるいはホエー蛋白質を90％
以上含むＷＰＩ粉（ホエー蛋白質分離物）を水または緩
衝液に還元したものでもよい。さらに、等電点沈澱によ
ってカゼインを除去したり、レンネットによってカゼイ
ンカードを排除した上清、あるいはチーズ製造時に排出
されるチーズホエーも利用することができる。これらの
乳質原料は、予めクラリファイヤー、マイクロフィルト
レーション、濾過等の操作によって沈澱物を除去してお
くことが望ましい。このようにすると、蛋白質のイオン
交換体への吸着効率を高め、さらに純度を高めることが
できる。本発明における乳質原料は、ラクトパーオキシ
ダーゼ、分泌性コンポーネント、ラクトフェリンの中い
ずれかを少なくとも一つ含むものが用いられる。
【０００９】組成物中のＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを高収率で
得るためには、陽イオン交換体と接触させる乳質原料の
pHが５〜９のものが望ましい。乳のpHが５より低い場合
は、カゼインの沈澱が生じて好ましくない。また、ホエ
ーのpHが６より低い場合は、例えは、β−ラクトグロブ
リン、α−ラクトアルブミン、血清アルブミン、免疫グ
ロブリン等、ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦ以外の夾雑物も陽イオ
ン交換体に吸着するので、結果的にＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦ
の回収量と純度が低下する。乳またはホエーのpHが９よ
り高い場合は、陽イオン交換体に吸着するＬＰＯ、Ｓ
Ｃ、ＬＦの量が低下する。
【００１０】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中いずれかを少なく
とも一つを含む乳質原料は、特に脱塩処理を行ってイオ
ン強度を調整しなくてもＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを選択的に
溶出させることが可能であるが、電気伝導度を５mS／cm
以下になるまで脱塩すると、特にＳＣの陽イオン交換体
に対する吸着量を高くすることができる。
【００１１】本発明でＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの吸着に用い
る陽イオン交換体としては、架橋型の多糖類やセルロー
ス、あるいはアクリルアミド樹脂にカルボキシル基、ス
ルホン基、リン酸基等を導入したもの、または樹脂と交
換基の間に何らかのスペーサーを導入したもの等があ
り、具体的にはカルボキシメチル基を導入したＣＭ−セ
ルロファインＣ-500（生化学工業（株）製）、スルホン
基を導入したスルホン化キトパール（富士紡績（株）
製）、スルホプロピル基を導入したＳＰ−トヨパール 5
50Ｃ（東ソー（株）製）、Ｓ−セファロース ファース
ト フロー（ファルマシア社製）、リン酸基を導入した
ホスホセルロース（ファルマシア社製）等を例示するこ
とができる。ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中いずれかを少なく
とも一つ含む乳質原料を陽イオン交換体に接触させる方
法としては、タンク内で両者を接触させる方法、陽イオ
ン交換体を充填したカラムに通液する方法、あるいは回
転型カラム反応器を用いる方法（特開平2-138295）等が
ある。特に、大量調製する際には回転型カラム反応器を
用いると効率的である。
【００１２】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中いずれかを少なく
とも一つ含む乳質原料と陽イオン交換体を接触させる温
度は特に限定されないが、通常は、４℃以上60℃未満の
範囲で行う。４℃未満の温度では、乳質原料の凍結、粘
度上昇、脂肪分離等が生じる。60℃以上の温度では、Ｌ
ＰＯ、ＳＣ、ＬＦが変性する可能性がある。なお、15℃
以上の温度では微生物の繁殖が著しいので、大量処理を
行う場合は温度15℃未満で処理することが望ましい。
【００１３】また、乳質原料と陽イオン交換体とは、乳
質原料１kgに対して陽イオン交換体を１〜100 ｇの目安
で混合し、15分間〜15時間程度撹拌して処理を行うこと
もできる。
【００１４】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの溶出は、以下のよう
に行う。まず、イオン強度が 0.2以下でpHが５以下の水
溶液または緩衝液で該陽イオン交換体を洗浄し、陽イオ
ン交換体の間に詰まっている不純物を除去する。この
際、イオン強度が 0.2及びpHが５を越えると陽イオン交
換体に吸着しているＬＰＯが溶出してくる恐れがあるの
で、イオン強度が0.05〜0.15及びpHが 2.5〜4.5 で処理
を行うことが好ましい。この洗浄処理に先立って、イオ
ン強度が 0.1以下でpHが５を越える水溶液または緩衝液
でＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを吸着した陽イオン交換体を予備
洗浄してもよい。この洗浄には、水または温湯を用いて
もよい。この予備洗浄を十分行っておくと、その後の洗
浄に使用するイオン強度が 0.2以下でpHが５以下の水溶
液または緩衝液の液量を減少させることができるので、
製造コストを考慮すると有利である。これらの洗浄に用
いる水溶液または緩衝液は特に限定されるものではな
く、イオン強度が 0.2以下でpHが５以下のものであれば
よい。具体的には、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の有
機酸緩衝液、あるいはグリシン緩衝液、ジメチルグルタ
ル酸緩衝液等を例示することができる。リン酸緩衝液も
使用可能であるが、pHが５以下では緩衝能が低下する。
【００１５】次に、該陽イオン交換体に吸着しているＬ
ＰＯ、ＳＣ、ＬＦを選択的に分離して溶出させる。本発
明では特定のイオン強度とpHを持つ洗浄液で洗浄を行っ
た後、さらに溶出液として特定のイオン強度とpHを持つ
水溶液または緩衝液を用いるので、一度のクロマトグラ
フ処理によってＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを効率よく分離し、
溶出することができる。一方、ＬＰＯ、ＳＣおよびＬＦ
を同時に含む画分を得る場合にはpH５を越え、イオン強
度0.5 を越える水溶液又は緩衝液で溶出することで得る
ことができる。
【００１６】陽イオン交換体に吸着しているＬＰＯを溶
出させるには、イオン強度が 0.2〜0.5 でpHが５以下、
好ましくは、イオン強度が 0.2〜0.4 でpHが３〜５の水
溶液または緩衝液を用いる。イオン強度が 0.2以下で
は、ＬＰＯが溶出できないか、溶出しても極めて少量で
ある。イオン強度が 0.5以上になるとpHが５以下であっ
ても同時にＳＣ、ＬＦが溶出するため、ＬＰＯの純度が
低下し、さらには、ＳＣ、ＬＦの回収量も低下する。一
方、pHが５以上になるとイオン強度が0.2 以下であって
も少量のＳＣ、ＬＦが同時に溶出するので、ＬＰＯの純
度が低下する。ここで用いる水溶液または緩衝液も特に
限定されるものではなく、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液
等の有機酸緩衝液、あるいはグリシン緩衝液、ジメチル
グルタル酸緩衝液等を用いることができ、イオン強度を
高めるためには食塩等を添加すればよい。このようにし
て得られたＬＰＯの純度は50％以上であり、通常の処理
でも純度80％以上のＬＰＯを容易に得ることができる。
又、pH５を越え、イオン強度 0.1〜0.5 の水溶液又は緩
衝液で溶出すると、主としてＬＰＯとＳＣの両者を含む
画分が得られる。
【００１７】ＬＰＯを溶出した後、陽イオン交換体に吸
着しているＳＣを溶出させるには、イオン強度が 0.1〜
0.5 、好ましくは 0.3〜0.5 で、pHが５を越え、好まし
くは６〜８の水溶液または緩衝液を用いる。pHが５以下
では、ＳＣとＬＦを分別回収することが難しく、ＳＣの
純度を低下させる。また、イオン強度が 0.5を越える
と、ＬＦの混入が多く、ＳＣの純度を低下させる。ここ
で用いる水溶液または緩衝液も特に限定されるものでは
なく、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝
液、酢酸緩衝液等を例示することができる。このように
すると純度80％以上のＳＣを容易に得ることができる。
又、pH５を越え、イオン強度 0.5を越える水溶液又は緩
衝液で溶出するとＳＣとＬＦを同時に含む画分を得るこ
とができる。
【００１８】ＬＰＯ及びＳＣを溶出した後、陽イオン交
換体に吸着しているＬＦを溶出させるには、イオン強度
が 0.5を越え、好ましくは 0.7〜2.0 で、pHが５を越
え、好ましくは６〜８の水溶液または緩衝液を用いる。
イオン強度が 0.5以下ではＬＦの溶出量が少なく、ま
た、pHが５以下でもＬＦの溶出量が少ない。ここで用い
る水溶液または緩衝液も特に限定されるものではなく、
水に食塩を溶解してイオン強度を 0.5を越えるように調
整した水溶液やクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、マレイン
酸緩衝液等の有機酸緩衝液、あるいはリン酸緩衝液、イ
ミダゾール緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩
衝液、トリス緩衝液等を例示することができる。このよ
うにして得られたＬＦの純度は70％以上であり、通常の
処理でも純度80％以上のＬＦを容易に得ることができ
る。
【００１９】また、ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦ溶出用の水溶液
または緩衝液を通液する前に、イオン強度 0.1未満で溶
出液と同一pHに調整した水溶液または緩衝液を通液する
ことができる。この操作は煩雑になるが、陽イオン交換
体に残存している塩類を洗い流すことができると同時に
陽イオン交換体のpHを目的のpHに平衡化する効果があ
る。
【００２０】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの吸着及び溶出に用い
た陽イオン交換体は、イオン強度が0.25より高い水溶液
または緩衝液で洗浄した後、水で十分洗浄することによ
り、再度利用することが可能となる。
【００２１】本発明の工程の概念を表１に示す。
【表１】
【００２２】得られたＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦは、必要に応
じて、濃縮、脱塩、乾燥を行う。濃縮は、真空濃縮法、
限外濾過法、逆浸透圧濾過法等を用いて行うことができ
る。脱塩は、限外濾過膜、透析膜、電気透析膜、あるい
はイオン交換樹脂、ゲル濾過用ゲル等を用いて行うこと
ができる。乾燥は、凍結乾燥法や噴霧乾燥法等を用いて
行うことができる。
【００２３】このようにして製造した溶液あるいは乾燥
させたＬＰＯ、ＳＣ中には免疫グロブリンＧが不純物と
して存在する。これらの蛋白質をさらに高度に精製する
ためには、プロティンＧやプロティンＡなどを固定化し
た免疫グロブリンＧアフィニティー担体を用いたクロマ
トグラフが有効である。この方法を用いると少なくとも
純度90％以上のＬＰＯ、ＳＣを得ることができる。
【００２４】以下に実施例を示して本発明を具体的に説
明する。
【実施例１】チーズホエー 600kgを分画分子量20,000の
限外濾過膜を用いて２mS／cmになるまで脱塩した。こう
して得られたチーズホエー（pH 6.4）中には、ＬＰＯ22
ｇ、ＳＣ17ｇ、ＬＦ48ｇがそれぞれ含まれていた。この
チーズホエーとＳＰ−トヨパール 550Ｃ（東ソー（株）
製）６kgをタンク内で接触させ、６時間混合撹拌するこ
とによってＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを陽イオン交換体に吸着
させた後、上清をデカンテーションで除去し、充填層型
カラム（直径20cm×高さ29cm）に充填した。
【００２５】カラムを水で十分洗浄し、５mMクエン酸緩
衝液(pH 5.0)で平衡化した後、0.08M 塩化ナトリウムを
含む５mMクエン酸緩衝液（pH 5.0）で洗浄した。ＬＰＯ
の溶出は 0.3M 塩化ナトリウムを含む５mMクエン酸緩衝
液（pH 5.0）で行った。ＳＣの溶出は、ＬＰＯを溶出し
た後のカラムを0.01M 塩化ナトリウムを含む10mMクエン
酸緩衝液（pH 6.5）で平衡化した後、0.4M塩化ナトリウ
ム水溶液で行った。ＬＦの溶出は、１M 塩化ナトリウム
水溶液で行った。
【００２６】溶出したＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦは、それぞ
れ、分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮、脱塩
した後、凍結乾燥を行い、純度87％のＬＰＯ18ｇ、純度
90％のＳＣ15.3ｇ、純度92％のＬＦ35ｇを得た。なお、
純度の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。
【００２７】
【実施例２】チーズホエー200kg に対し、Ｓ−セファロ
ース ファーストフロー (ファルマシア社製) 2kg をタ
ンク内で接触させ、15時間混合攪拌することによってＬ
ＰＯ、ＳＣ、ＬＦを陽イオン交換体に吸着させた。上清
をデカンテーションで除去したのち、陽イオン交換体を
充填層カラム（直径20cm×高さ29cm) に充填した。
【００２８】カラムを水で十分洗浄し、10mMクエン酸緩
衝液 (pH 4.0) で平衡化した後、0.15M 塩化ナトリウム
を含む10mMクエン酸緩衝液 (pH 4.0) で洗浄した。ＬＰ
Ｏの溶出は0.4M塩化ナトリウムを含む10mMクエン酸緩衝
液 (pH 4.0) で行った。ＳＣの溶出は、ＬＰＯを溶出し
た後のカラムを10mMクエン酸緩衝液 (pH 6.5) で平衡化
した後、0.4M塩化ナトリウム水溶液で行った。ＬＦの溶
出は、１M 塩化ナトリウム水溶液で行った。
【００２９】溶出したＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦは、それぞ
れ、分画分子量 10,000 の限外濾過膜を用いて濃縮、脱
塩した後、凍結乾燥を行い、純度90％のＬＰＯ12ｇ、純
度85％のＳＣ 8ｇ、純度95％のＬＦ17ｇを得た。
【００３０】
【実施例３】スルホン化キトパール（富士紡績（株）
製）1.5Lを充填した回転型カラム反応器（東京理化器械
（株）製）に、生脱脂乳 400kg（pH 6.8）を 200 L／h
の流速で３時間循環通液した。この回転型カラム反応器
内を40℃の温水で十分に洗浄した後、0.07M 塩化カリウ
ムを含む５mM酢酸緩衝液(pH 4.0)で洗浄した。ＬＰＯの
溶出は、塩酸でpHを 4.0に調整した 0.2M 塩化カリウム
水溶液で行った。ＳＣの溶出は、ＬＰＯを溶出した回転
型カラム反応器内を水で十分洗浄し、さらに0.01M トリ
ス塩酸緩衝液（pH 7.5）で洗浄した後、 0.3M 塩化カリ
ウム水溶液で行った。ＬＦの溶出は、0.75M 塩化カリウ
ムを含む重炭酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)で行った。
【００３１】溶出したＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦは、それぞ
れ、分画分子量50,000の限外濾過膜を用いて1.5Lとなる
まで濃縮し、電気透析膜を用いて電気伝導度が 0.2mS／
cmとなるまで脱塩した後、凍結乾燥を行い、純度85％の
ＬＰＯ19.7ｇ、純度88％のＳＣ13.8ｇ、純度94％のＬＦ
39ｇを得た。なお、純度の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥで行
った。
【００３２】
【実施例４】ＷＰＣ15ｇを 250MLの水に溶解し、pHを
7.5に調整した後、ＣＭ−セルロファイン（生化学工業
（株）製）10ｇを充填したカラム（直径 1.5cm×高さ12
cm）に３ML／min の流速で通液した。
【００３３】カラムを0.005Mリン酸緩衝液（pH 7.5）で
十分洗浄し、さらに0.05M 塩化ナトリウムを含む 0.005
M クエン酸緩衝液（pH 4.5）で洗浄した。ＬＰＯの溶出
は、0.25M 塩化ナトリウムを含む 0.005M クエン酸緩衝
液（pH 4.5）で行った。ＳＣの溶出は0.15M 塩化ナトリ
ウムを含む0.01M リン酸緩衝液（pH 7.0）で行った。Ｌ
Ｆの溶出は、 0.7M 塩化ナトリウムを含む0.01M リン酸
緩衝液（pH 7.0）で行った。
【００３４】溶出したＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦは、それぞ
れ、脱塩用のイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ−３
（オルガノ（株）製）を用いて電気伝導度 0.5mS／cmと
なるまで脱塩した後、濃縮し、凍結乾燥を行い、純度91
％のＬＰＯ 5mg、純度96％のＳＣ２mg、純度94％のＬＦ
８mgを得た。なお、純度の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥで行
った。
【００３５】
【発明の効果】本発明の方法によってＬＰＯ、ＳＣ、Ｌ
Ｆを分離採取すると、従来法に見られるように再度クロ
マトグラフ処理を行ってＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを分離、精
製する必要がなく、工程を簡略化することができる。す
なわち、本発明によれば、一回のクロマトグラフ処理に
よって、純度80％以上のＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを回収する
ことができる。さらに、限外濾過工程を付すことによっ
て、僅かに含まれる低分子の不純物を除去することがで
き、最終的には、純度85％以上のＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを
得ることができる。このように工程が簡略化できるこ
と、純度が高いこと、また、回収率が高いことから、生
産コストを安価にすることが可能となるばかりでなく、
感染予防用の食品や医薬品、貧血予防の食品や医薬品、
あるいは治療剤として利用することが可能である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳質原料から生理活性
物質を分離精製する方法に関する。ラクトパーオキシダ
ーゼ（以下、ＬＰＯと略記する）、分泌性コンポネント
（以下、ＳＣと略記する）、ラクトフェリン（以下、Ｌ
Ｆと略記する）のいずれか少なくとも一つを含む乳質原
料をイオン交換クロマトグラフ処理し、ＬＰＯ、ＳＣ、
ＬＦを分離して製造する方法に関する。本発明の方法に
よって得られるＬＰＯ、ＳＣ及びＬＦは、多様な生理活
性を有するので、医薬、化粧品、飲食品、飼料等の分野
で利用される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】組成物中のＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを高収率で
得るためには、陽イオン交換体と接触させる乳質原料の
ｐＨが４〜９のものが望ましい。カゼインを含有する乳
のｐＨが５より低い場合は、カゼインの沈澱が生じて好
ましくない。また、ホエーのｐＨが４より低い場合は、
例えは、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミ
ン、血清アルブミン、免疫グロブリン等、ＬＰＯ、Ｓ
Ｃ、ＬＦ以外の夾雑物も陽イオン交換体に吸着するの
で、結果的にＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの回収量と純度が低下
する。さらに、ＬＰＯの活性はｐＨ５以下で低下するの
で好ましくない。乳またはホエーのｐＨが９より高い場
合は、陽イオン交換体に吸着するＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの
量が低下する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの中いずれかを少なく
とも一つを含む乳質原料は、特に脱塩処理を行ってイオ
ン強度を調整しなくてもＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを吸着させ
ることが可能であるが、電気伝導度を５ｍＳ／ｃｍ以下
になるまで脱塩すると、特にＳＣの陽イオン交換体に対
する吸着量を高くすることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】また、乳質原料と陽イオン交換体とは、乳
質原料１ｋｇに対して陽イオン交換体を０．２〜１００
ｇの目安で混合し、１５分間〜１５時間程度撹拌して処
理を行うこともできる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】ＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦの溶出は、以下のよう
に行う。まず、イオン強度が０．２以下でｐＨが５以下
の水溶液または緩衝液で該陽イオン交換体を洗浄し、陽
イオン交換体の間に詰まっている不純物を除去する。こ
の際、イオン強度が０．２及びｐＨが５を越えると陽イ
オン交換体に吸着しているＬＰＯが溶出してくる恐れが
あるので、イオン強度が０．０５〜０．１５及びｐＨが
４〜５で処理を行うことが好ましい。この洗浄処理に先
立って、イオン強度が０．１以下でｐＨが５を越える水
溶液または緩衝液でＬＰＯ、ＳＣ、ＬＦを吸着した陽イ
オン交換体を予備洗浄してもよい。この洗浄には、水ま
たは温湯を用いてもよい。この予備洗浄を十分行ってお
くと、その後の洗浄に使用するイオン強度が０．２以下
でｐＨが５以下の水溶液または緩衝液の液量を減少させ
ることができるので、製造コストを考慮すると有利であ
る。これらの洗浄に用いる水溶液または緩衝液は特に限
定されるものではなく、イオン強度が０．２以下でｐＨ
が５以下のものであればよい。具体的には、酢酸緩衝
液、クエン酸緩衝液等の有機酸緩衝液、あるいはグリシ
ン緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液等を例示すること
ができる。リン酸緩衝液も使用可能であるが、ｐＨが５
以下では緩衝能が低下する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】陽イオン交換体に吸着しているＬＰＯを溶
出させるには、イオン強度が０．２〜０．５でｐＨが５
以下、好ましくは、イオン強度が０．２〜０．４でｐＨ
が３〜５の水溶液または緩衝液を用いる。イオン強度が
０．２以下では、ＬＰＯが溶出できないか、溶出しても
極めて少量である。イオン強度が０．５以上になるとｐ
Ｈが５以下であっても同時にＳＣ、ＬＦが溶出するた
め、ＬＰＯの純度が低下し、さらには、ＳＣ、ＬＦの回
収量も低下する。一方、ｐＨが５以上になるとイオン強
度が０．２以下であっても少量のＳＣ、ＬＦが同時に溶
出するので、ＬＰＯの純度が低下する。ここで用いる水
溶液または緩衝液も特に限定されるものではなく、酢酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等の有機酸緩衝液、あるいはグ
リシン緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液等を用いるこ
とができ、イオン強度を高めるためには食塩等を添加す
ればよい。このようにして得られたＬＰＯの純度は最低
でも５０％以上であり、通常は純度８０％以上のＬＰＯ
を容易に得ることができる。又、ｐＨ５を越え、イオン
強度０．１〜０．５の水溶液又は緩衝液で溶出すると、
主としてＬＰＯとＳＣの両者を含む画分が得られる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】ＬＰＯ及びＳＣを溶出した後、陽イオン交
換体に吸着しているＬＦを溶出させるには、イオン強度
が０．５を越え、好ましくは０．７〜２．０で、ｐＨが
５を越え、好ましくは６〜８の水溶液または緩衝液を用
いる。イオン強度が０．５以下ではＬＦの溶出量が少な
く、また、ｐＨが５以下でもＬＦの溶出量が少ない。こ
こで用いる水溶液または緩衝液も特に限定されるもので
はなく、水に食塩を溶解してイオン強度を０．５を越え
るように調整した水溶液やクエン酸緩衝液、酢酸緩衝
液、マレイン酸緩衝液等の有機酸緩衝液、あるいはリン
酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝
液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等を例示することがで
きる。このようにして得られたＬＦの純度は最低でも７
０％以上であり、通常は純度８０％以上のＬＦを容易に
得ることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】
【実施例３】スルホン化キトパール（富士紡績（株）
製）１．５Ｌを充填した回転型カラム反応器（東京理化
器械（株）製）に、生脱脂乳４００ｋｇ（ｐＨ６．８）
を２００Ｌ／ｈの流速で３時間循環通液した。この回転
型カラム反応器を樹脂と共に４０℃の温水で十分に洗浄
した後、０．０７Ｍ塩化カリウムを含む５ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．０）で洗浄した。ＬＰＯの溶出は、塩酸で
ｐＨを４．０に調整した０．２Ｍ塩化カリウム水溶液で
行った。ＳＣの溶出は、ＬＰＯを溶出した回転型カラム
反応器を樹脂と共に水で十分洗浄し、さらに０．０１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、０．３
Ｍ塩化カリウム水溶液で行った。ＬＦの溶出は、０．７
５Ｍ塩化カリウムを含む重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）で行った。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/14 ＡＢＹ ＡＤＤ 8314−4Ｃ ＡＤＹ 37/50 ＡＤＺ 8314−4Ｃ 39/395 Ｙ 8413−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 3/20 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 9/08 7823−4Ｂ

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 乳質原料を陽イオン交換体と接触させ、
    ラクトパーオキシダーゼ、分泌性コンポネント、ラクト
    フェリンを連続的に溶出、分離、精製する工程におい
    て、(1) 該乳質原料を陽イオン交換体と接触させ、(2)
    イオン強度 0.2以下、pH５以下の水溶液または緩衝液で
    陽イオン交換体を洗浄し、(3) 陽イオン交換体を洗浄し
    た後、イオン強度 0.2〜0.5 、pH５以下の水溶液または
    緩衝液でラクトパーオキシダーゼを選択的に溶出し、
    (4) ラクトパーオキシダーゼを溶出した後、イオン強度
    0.1〜0.5 、pH５を越える水溶液または緩衝液で分泌性
    コンポネントを選択的に溶出し、(5) 分泌性コンポネン
    トを溶出した後、イオン強度 0.5を越え、pH５を越える
    水溶液または緩衝液でラクトフェリンを選択的に溶出す
    ることを特徴とするラクトパーオキシダーゼ、分泌性コ
    ンポネント及びラクトフェリンを分離して製造する方
    法。
  2. 【請求項２】 乳質原料の電気伝導度が５mS／cm以下で
    ある請求項１記載のラクトパーオキシダーゼ、分泌性コ
    ンポネント及びラクトフェリンの製造方法。
JP4036915A 1992-01-29 1992-01-29 乳質原料から生理活性物質の製造法 Pending JPH05202098A (ja)

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