JPH05203622A - 毛管電気泳動及び毛管クロマトグラフィーのための複数点検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 毛管電気泳動及び毛管クロマトグラフィーに
関する。 【構成】 （ａ）単一の検出器により、前記毛管の長さ
にそって離れて間隔を開けられた多くの検出点で時間の
関数として前記分離媒体による光吸収性の変動を検出
し；（ｂ）前記個々の検出点で、このようにして検出さ
れた光吸収性の変動のピーク、及び前記すべての検出点
で実質的に同じである、前記ピークが生じる順序を同定
し；（ｃ）前記順序での個々のピークのために、前記検
出点に達するために前記ピークにより取られる時間によ
り割り算された前記検出点に前記ピークにより移動され
た距離をすべての前記検出点の間で平均を取り；そして
（ｄ）前記順序での個々のピークのために、前記順序に
おける同じ位置でのピークにより定義される面積を前記
すべての検出点の間で平均を取ることを含んで成る、毛
管における分離媒体を通して電気泳動分離を受ける溶質
の移動性及び相対量の代表的な値を決定するための方法
に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、毛管電気泳動及び毛管クロマト
グラフィーの分野及び特に、オンライン検出の方法に関
する。

【０００２】

【発明の背景】毛管電気泳動及び毛管クロマトグラフィ
ーは、生化学的混合物についての分離方法としての多く
の明確な利点を提供する。これは、ひじょうに小さなサ
ンプルの高速度での分離の実施を可能にする。毛管電気
泳動に特別に付与するもう１つの利点は、毛管の狭い内
腔により、熱が毛管から外部に散逸される急速な速度で
ある。これは、高速度及び高効率での分離を提供する、
電気泳動を駆動する高電圧の使用を可能にする。それら
の利点のそれぞれは、生物学的対象物、特にペプチド、
タンパク質及び核酸の混合物のサンプルの毛管による分
析を有用なものにする。

【０００３】毛管分離における分離された溶質を検出す
るための最も好都合な方法は、オンライン検出である。
オンライン検出が提供するいくつかの利点の１つは、単
一の連続した電気泳動分離の間、多くのクロマトグラム
及びエレクトロフェログラムトレースを得る能力であ
る。これを達成する最も通常の方法は、分離を進行しな
がら、毛管を数回、スキャンすることによってである。
これは、オペレーターの分離への従事、１回よりもむし
ろ数回の測定に基づく溶質の移動性及びピーク領域の決
定及び最少の広がりを伴って最大のピーク分離を有する
クロマトグラム及びエレクトロフェログラムの選択を可
能にする。

【０００４】スキャンによる１つの困難性は、移動する
検出器又は移動する毛管のいづれかのための必要性及び
検出器及び毛管の相対位置と観察されるピークとの正確
な相互関係の必要性である。もう１つの困難性は、粉砕
された石英から製造され、そしてベースライン変動を生
成するかも知れない内径及び壁の厚さの変動を最少にす
るために内側及び外側の両側をみがかれた毛管の使用の
必要性である。第３番目の困難性は、スキャンが行われ
るであろう毛管の全長さにそって、検出ビーム、たとえ
ば紫外線（ＵＶ光）に対して透過性である毛管の内部の
媒体及び毛管の両者のための必要性である。多くの場
合、被膜が、毛管をより柔軟にし、そしてこわれにくく
する目的のために毛管の外壁に適用される。これらの被
膜の多くは、ＵＶ光に対して不透過性であり、そして従
って、スキャンを可能にしない。

【０００５】お互いから固定された距離で固定される２
つの検出器の使用は、Ｂeckers, Ｊ．Ｌ．，なと．，
“Ｕse of a Ｄouble −Ｄetector Ｓystem forthe Ｍ
easurement of Ｍobilities in Ｚone Ｅbctrophuresi
s,“Ｊ．Ｃhromatog. ４５２：５９１〜６００（１９８
８）に開示される。しかしながら、そのようなシステム
は十分に満足のいくものではない。２つの検出器システ
ムのための装置の費用は、全体としてシステムの費用の
主成分である２つの検出器の費用を包含する。また、２
つの検出器はめったに同じ感度を有さず、そして感度の
差異は、特定の溶質のために異なったピーク領域をもた
らすであろう。さらに、２つの検出器の使用は、いかに
検出器がお互いに対して配置されるかに対して制限を付
与し、すなわちそれらが繊維光学物を利用しない場合、
それらがいかに接近して配置されるに対する制限が存在
する。これらの及び他の問題は、本発明により解決され
る。

【０００６】

【発明の要約】毛管でのクロマトグラフィー又は電気泳
動分離の連続的段階を示す複数クロマトグラム及びエレ
クトロフェログラムが、複数の検出器の必要性を伴わな
いで及び毛管の縦のスキャンを伴わないで得られる方法
が開発された。この方法によれば、時間の関数としての
光吸収性の変動が、毛管の長さにそって離れて間隔を開
けられた多くの位置で、単一の検出器により検出され
る。これは２つの手段の１つで達成される。

【０００７】第１に、毛管中の検出窓は検出器の検出ビ
ームと整合され、ここで前記窓は、毛管の長さにそって
ある間隔で配置されるいくつかの検出窓の１つである。
すべての溶質ピークが検出窓を通過し、そして従って、
検出器により検出された後すぐに、毛管は、溶質の移動
の方向とは反対の方向に動かされ、次の検出と検出器の
ビームとが整合される。これは、すべての検出窓が検出
器のビームに配置され、そして個々の窓の位置で毛管を
通過する溶質ピークが検出されるまで、十分な回数くり
返される。

【０００８】第２に、毛管は、前記に記載されるシステ
ムにおけるように、その長さにそってある間隔で配置さ
れる多くの検出窓を含む。毛管はそれらの検出窓間でル
ープされるが、しかしながら、個々の隣接する対の検出
窓は少なくとも１つのループにより分離される。そのル
ープは、検出窓が、単一の検出器のビームの路内に落ち
いるようにお互い十分に隣接してすべて位置するように
配置される。ループはすべて同じ方向に存在し、これに
よって溶質は、それぞれの時間で同じ方向にビームを通
過し、又はループは方向が交互に変えられ、それによっ
て溶質は、１つのループから次のループに交互にビーム
を通過し、又はループは両者の組合せであり得る。いづ
れの場合でも、連続した検出がすべての検出窓を通過す
るすべてのピークを記録し、そしてピークが検出される
順序は、いづれか特定のピークが検出される検出窓を同
定する手段として作用する。

【０００９】いづれの方法においても、サンプル混合物
の個々の成分のための平均ピーク領域が、種々のクロマ
トグラム又はエレクトロフェログラム間の対応するピー
クの領域を単純に平均を取ることによって得られ、そし
て個々の成分の移動性は、毛管の注入端から個々の窓へ
の距離ｖｓ．ピークが窓において検出される時間のプロ
ットすることによって、高い程度の精度に決定され得
る。本発明の他の特徴及び利点は、次の記載から明らか
になるであろう。

【００１０】

【発明の特定の記載及び好ましい態様】本発明に使用さ
れる毛管は、いづれの材料からでも製造され得、ここで
電気泳動及びクロマトグラフィーは、その材料自体から
の妨害を伴わないで行われ得、そして検出窓が導入され
得、又は短いセグメントが、毛管の長さにそって特定の
距離で、検出窓として企画され得る。検出窓は、検出ビ
ームの通過を可能にし、そして従って、分離される溶質
の性質に依存するであろう。使用されるビームのタイプ
及び検出システムに従って選択され又は適合されるであ
ろういづれかの組成物又は構造体のものであろう。ＵＶ
光の吸収に基づく検出システムが、最も通常であり、そ
して生物学的混合物、たとえば小さなペプチド、タンパ
ク質及び核酸の毛管電気泳動への使用のために特に便利
である。従って、そのようなシステムのための検出窓
は、ＵＶ光に対して透過性であろう。

【００１１】そのようなシステムについてのＵＶ光透過
性は検出窓のみに必要とされるので、本発明は、石英以
外の毛管を用いて実施される。検出窓間の毛管のセグメ
ントは、実際、不活性であり、そして分離に妨害を与え
ないいづれかの材料のものである。これは、たとえば、
ガラス、及び他のシリカ含有材料、プラスチック、及び
金属、たとえばステンレス鋼を包含する。構成するのに
最も容易で且つ最少の費用である毛管は、完全な毛管が
同じ材料から構成されるものであろう。特に便利な例
は、融合シリカである。

【００１２】融合シリカ毛管は一般的に、耐破壊性を増
強するために毛管の外面上を被覆するポリイミドにより
供給される。ポリイミド被膜はＵＶ光に対して透過性で
ないので、検出窓は、読み取りを達成するために検出ビ
ームの十分な通過を可能にするのに十分に広い暴露され
た融合シリカ表面の狭いバンドを残して、その被膜を除
去することによって形成され得る。約０．１mm又はそれ
以下の内径の毛管においては、バンドは、約０．０１mm
〜約１．０mmの幅であり得る。被膜の除去は、従来の手
段により達成され得、その例として、加熱されたプーロ
ブ、たとえば帯電線による酸化を挙げることができる。
そのような被膜を有する融合シリカ管は、Ｐolymicro
Ｔechnologies Ｉnc., Ｐhoenix, Ａrizona, Ｕ．Ｓ．
Ｐ．から入手できる。

【００１３】毛管の内壁表面の処理が、吸着性及び電気
泳動の場合、電気浸透を抑制するために所望される場
合、検出ビームを妨害しない処理剤が使用され得る。こ
のタイプの処理剤は、吸着性及び電気浸透の抑制に使用
するために当業者の間で知られている種々の材料から選
択され得、そして一般的に、低分子量の化合物又はポリ
マーの単層であり得、その例として、線状ポリアクリル
アミド、デキストウン及びメチルセルロースを挙げるこ
とができる。処理剤は、毛管を製造する当業界において
良く知られている従来の方法により付着され得る。しか
しながら、処理剤の使用は任意であり；本発明は、内部
的に被覆されていない毛管並びに内部的に被覆されてい
る毛管に拡張する。

【００１４】単一の毛管に使用される検出窓の数は、臨
界ではなく、そして広く異なる。その数は少なくとも２
であり、そしてほとんどの用途のためには、６よりも多
くないであろう。３〜５個の検出窓を有する毛管が好ま
しい。多くの場合、検出窓の数は、毛管の長さ及び下記
に説明されるように、次に達する前、すべての溶質の１
つの窓の通過を可能にするために十分に離れて窓の間隔
を開ける必要性により制限されるであろう。

【００１５】検出窓の配置、数及びその間の空間は、臨
界ではなく、そして広く異なる。しかしながら、最も便
利で且つ最も容易に解釈される結果は、溶質ピークが別
々の非オーバーラップグループ、すなわちクロマトグラ
ム又はエレクトロフェログラムに検出される場合に得ら
れ、ここで個々のそのようなグレープは、単一の検出窓
に対応する。従って、好ましくは、検出窓は、１つの検
出器からの連続した検出器トレースがオーバーラップし
ないで連続的にすべてのクロマトグラム又はエレクトロ
フェログラムを示すように十分に離れて間隔を開けられ
るであろう。実際、オーバーラップが最後の２又は３個
のクロマトグラム又はエレクトロフェログラム間に生じ
る場合、それらが検出されるピーク及び順序は、オーバ
ーラップピーク順序の先に、少なくとも１つの及び好ま
しくは２つの非オーバーラップピーク順序が存在する場
合、同一であり得る。次に、それらの初期の非オーバー
ラップピーク順序から決定される相対的保持時間は、後
のピーク順序を分類し、そしてその対応するピークを同
定するために使用され得る。

【００１６】検出窓は、等しい間隔で又は連続的に上昇
する間隔で配置され得、ここでその選択は溶質間の移動
性の範囲に依存する。いづれか１つの検出窓へのすべて
の溶質の通過を必要とする時間が、１つの検出窓から次
の検出窓への一定の溶質の移動のために必要とされる時
間に比べて短い溶質混合物のために、検出窓は好ましく
は、お互いから等しい間隔で空間を開けられている。ピ
ークの広がりが、そのピークが毛管の一端から他端に移
動するにつれて、ひじょうに高まる溶質混合物のために
は、検出窓間の空間は好ましくは、移動の方向に上昇
し、その結果、個々の連続的な検出窓が、ピークの広が
りが次の窓に達する前、ピークの広がりのたえず上昇す
る幅を調節することができる。

【００１７】毛管（検出窓の領域における）及び検出器
のようなシステムの要素に対して温度調節を付与するこ
とによって、個々検出窓と通過する溶質を検出するため
に使用される記録計のベースラインにおける変動又はド
リフトの発生を最少にすることができる。これは、サー
モスタット又は同等の温度調節装置と共に使用される、
当業者に良く知られている循環クーラント、ファン、ヒ
ートジャケット又はマントル又は他の類似する装置の使
用により容易に達成される。これは、光ビーム、検出窓
及び光二極管の相対位置における少々の変動を回避する
であろう。

【００１８】長さ及び内径の両者に関する毛管の大きさ
は、臨界ではなく、そして本発明の広範囲の毛管サイズ
のもの、たとえばマイクロ毛管（microcapillaries）に
拡張する。一般的に、毛管は内径約５〜約３００μの範
囲のものであり、そして約２０〜約１００μのものが好
ましい。毛管の長さは、一般的に約１００mm〜約３００
０mmの範囲であり、そして約３００mm〜約１０００mmの
ものが好ましい。

【００１９】電気泳動分離に関しては、使用される電圧
は、約５００Ｖ〜約３０，０００Ｖの範囲であり、好ま
しくは約１，０００Ｖ〜約１０，０００Ｖである。分離
媒体は同様に、本発明において臨界ではなく、そして行
われる分離タイプに依存して、液体、ゲル又は顆粒（た
とえばビーズ）のいづれかでもあり得る。分離媒体は、
検出ビームの通過を可能にするものであり得、そして、
従って、検出窓、及び検出窓間の毛管のセグメントを通
して連続的であり得る。他方、分離媒体は、ビーム通過
を可能にしないものであり得、そして従って、ビームが
通過する検出窓でギャップを含むことができる。これ
は、クロマトグラフィー分離において、特に顆粒が分離
媒体として使用される場合に、最もしばしば生じるであ
ろう。電気泳動分離においては、従来の液体緩衝溶液が
最も通常、使用されるが、しかし特定の試験のための最
適な選択は、分離される溶質の性質に依存するであろ
う。

【００２０】一般的に、クロマトグラフィー又は電気泳
動分離は、毛管分離に有用であり又は適合できることが
知られている材料及び方法により、従来の技法に従って
行われ得る。これは、分離の前、毛管中にサンプルを導
入し、分離を行い、温度調節を維持し、オンライン検出
を行い、そして結果を処理し、又は解釈する方法に拡張
する。

【００２１】上記のように、検出は好ましくは、ＵＶ光
吸収性に基づかれているが、しかし、再び、毛管を通し
てのいづれのタイプのオンライン検出でも使用され得
る。光の吸収は便利さ及び単純性のために好ましいが、
しかし吸収度が測定される波長は広範囲にわたって変化
する。再び、最適な波長の選択は、分離媒体に関する溶
質の吸収性に依存するであろう。毛管クロマトグラフィ
ー又は電気泳動システムのために通常使用されるタイプ
の従来の検出装置が使用され得る。

【００２２】分離媒体の直径（すなわち毛管の内径）に
関する検出ビームの大きさ（ビーム断面の面積）は、多
くの場合、検出されるシグナルのベースウインで観察さ
れるドリフトの程度に影響を及ぼすであろう。検出器、
たとえば光二極管が使用される場合、その光二極管又は
光ビームに関する毛管の位置の小さな変化又は変動が、
検出の感度に対して有意な効果を有する。この効果は、
光二極管及び光ビームは温度の変化に基づいてそれらの
位置を変えるので、サーモスタットを用いての温度調節
により最少化され又は排除され得る。その効果はまた、
毛管の、すなわち毛管の縦軸に横断する方法においてよ
り大きな寸法の内径よりも大きい光ビームを用いること
によって最少化され又は排除され得る。従って、本発明
の好ましい態様においては、検出ビームの縦寸法は、毛
管の内径の約１．１倍〜約３．０倍、好ましくは約１．
３倍〜約１．８倍であろう。

【００２３】次に図面に関し、図１，２及び３は、本発
明の手段を例示する上記に言及される態様の代表的な図
面である。これらの図面は、単に本発明を例示するもの
である。図１においては、線状毛管１２を有する電気泳
動システム１１が図示されている。そのシステムの成分
は、毛管に、電極溜め１３，１４、電極１５，１６、電
力源１７、ＵＶ光源１８、光二極管検出器１９、インテ
グレーター２０及び記録計２１である。この例における
毛管１２は融合シリカであり、そして毛管の外面は斜線
により図に示されるポリイミド２２により被覆される。
ポリイミド被膜は断続的であり、ＵＶ光に対して透過性
であり、そして検出窓として作用する４つの短い非被覆
セグメント２３，２４，２５，２６を残す。溶質の移動
は矢印２７の方向に生じる。図面に示される配置におい
ては、システム成分は第１検出窓２３での溶質の検出の
ために配置される。すべての溶質がその窓を通過した後
すぐに、毛管１２は、第２検出窓２４が光源及び第二極
管と整合されるまで、ＵＶ光源１８及び光二極管検出器
１９に対する矢印２８の方向に移動する。第２検出窓を
通過するすべてのピークが記録された後すぐに、毛管１
２は再び同じ方向に移動し、光源及び検出器との整合し
て連続的に第３及び第４窓に移る。毛管の移動は、設定
態様で又は予定数のピークが検出されたことを示す記録
計からのシグナルに従って、手動的に又は従来の適切な
駆動機構により達成され得る。

【００２４】図２は、固定して維持されるループ毛管４
２を有する電気泳動システム４１を示す。毛管は前のよ
うに融合シリカから製造され、そして外面はポリイミド
により被覆され、但し、３個の検出窓４３，４４，４５
を除く。すべての３個の窓は、いづれかのシステム成分
の移動がすべての３個の窓からの読取りを得るために必
要でないように、ＵＶ光源４６及び光二極管検出器４７
と整合される。検出窓を含む管のセグメントは、束で、
又は平らな配置で配列され得、そして平らな配置は、ビ
ームがすべての窓を同時に通過するように検出ビームを
横切って存在し、又はそれは、ビームが連続的に窓を通
過するように検出ビームに平行して存在することができ
る。システムのすべての残る部分は、図１のシステムの
対応する部分と同一である。電気泳動の間、溶質の移動
の方向は、矢印４８により示される。

【００２５】ベースラインのドリフト及び変動を回避す
るための温度調節は、温度調節ユニット及びサーモスタ
ットのシステムにより達成される。これらは、図２にお
いて斜線４９で示される。

【００２６】本発明はまた、いくつかのサンプル成分が
他に対してひじょうにゆっくりと移動するサンプルの電
気泳動分離にある利点を提供する。従来の実施において
は、このタイプの分離は一般的に、２種の実験を必要と
し、１つはより移動性の成分のために適切なゆっくりし
た移動速度を促進する条件下で行われ、そして他の、低
い移動性の成分のために適切な早い移動速度を促進する
条件下で行われる。しかしながら、本発明の適用によれ
ば、２つの検出窓が使用され、１つは毛管のインジュク
ター端に隣接し、そして他はそのインジェクター端から
比較的遠い。そのような配置により、検出されるべきす
べての成分のために必要とされる時間の長さは相当に短
くされる。なぜならば、より早い移動成分の検出は、こ
れらの成分がインジェクター端から最も離れて検出窓を
通過する場合のみ記録されるからであり、そしてより遅
く移動する成分の検出は、それらがインジェクター端に
最も近い検出窓を通過する場合に記録されるであろうか
らである。本発明のこの態様においては、十分なエレク
トロフェログラムを記録することは、いづれの検出窓の
ためにも必要ではない。

【００２７】図３は、電気泳動システムよりもむしろク
ロマトグラフィーシステムを示す。このシステムは、図
２のシステムの形態と同一であるが、但しこのシステム
における毛管５１は、クロマトグラフィー分離媒体、た
とえばゲル又は充填層により満たされている。示される
このシステムは、従来のクロマトグラフィーポンプ５２
により毛管を通して送り出される液体キャリヤーを使用
するシステムである。システムは別な方法で実施され、
そして図２のために記載されるのと同じ態様で操作され
る。

【００２８】図１の形態に相当するクロマトグラフィー
システムは同様にして構成され得、そして類似する態様
で操作される。いづれの場合においても、特定タイプの
クロマトグラフィーは広く異なる。例として、吸着クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー及び分配クロマトグラフィーを
挙げることができる。次の例は例示目的であって、本発
明を制限するものではない。

【００２９】

【実施例】例１ 長さ５４０mm、内径０．０７５mmであり、そして非ＵＶ
透過性ポリイミドにより被覆された外面を有する直線の
融合シリカ管を、毛管として使用した。毛管の長さにそ
って４つの位置でのポリイミド被膜の部分を、電気的に
加熱されたタングステンワイヤにより焼き取った。これ
は、その中にサンプルが導入される予定である。毛管の
端から、それぞれ１２cm、１７cm、２７cm及び３７cmの
位置で、毛管中にＵＶ−透過窓を創造した。これらの窓
の個々は約２mmの長さであった。ＵＶ透過窓を含む、完
全な長さの管の内部を、線状ポリアクリルアミドの単層
により被覆し、吸着及び電気浸透を排除した。この被膜
の有効性は、移動速度の変化が、毛管がｐＨ１１で貯蔵
される時間の間、４週間にわたって生じないことを観察
することによって確かめられた。

【００３０】融合シリカ毛管はＶ−溝に固定され、その
結果、毛管は光吸収検出器のビームに対して固定された
位置で存在し、但しそれはまた、縦方向に動かされ得
る。Ｖ−溝は流れにより冷却された。Ｖ−溝におけるス
リット（横の開口）は、検出器ビームと整合され、スリ
ットは毛管の外径にほぼ等しい高さ及び０．１５mmの幅
のものである（検出器ビームの路を横切って、毛管の縦
方向に）。検出は、２６０nmの波長で管上溶質検出のた
めに改良されたＬＫＢ／Ｐharmacia（Ｕppsala,Ｓweden
）ＨＰＬ（２１４１の変動波長モニターにより達成さ
れた。そのエレクトロフェログラムは、Ｒadiometer,
Ｃopenhagen, ＤenmarkからのＲＥＣ６１Ｓervograph
記録計により記録された。

【００３１】入ＤＮＡの電気泳動分離を、毛管で行っ
た。毛管内の分離媒体は、ＴＢＥ緩衝液（０．０９Ｍの
トリス、０．０９Ｍの硼酸及び０．００２Ｍのエチレン
ジアミン四酢酸）、ｐＨ８．２であった。入ＤＮＡを、
２０００Ｖで３０秒間、電気泳動手段により毛管中に注
入し、そして注入した後すぐに、電気泳動分離を行うた
めに同じ電圧にゆだねた。これらの操作条件及びＵＶ透
明性窓の配置は、サンプル中の入ＤＮＡを示すピーク
が、次の窓に達する前、１つの窓を通過するこれまでの
決定に基づいて選択された。

【００３２】分離の記録は、Ｖ−溝開口部と整合される
毛管の第１ＵＶ−透過窓により開始され、これは毛管の
注入端から１２cmの所に配置される窓である。すべての
ピークが検出器を通過する場合、毛管は、Ｖ−溝開口部
と整合して第２ＵＶ−透過窓を配置するためにＶ−溝に
おいて後方に動かされる。これは、個々の４個のＵＶ−
透過窓を通過するすべてのピークが検出され、統合さ
れ、そして記録されるまでくり返された。

【００３３】記録計トレースの部分が図４に示され、こ
れは、ピークの順序及び同一性が単一のエレクトロフェ
ログラムが示すよりも一層複雑であることを示す。

【００３４】例２ 長さ５８０mm、内径０．０５mmであり、そして非ＵＶ透
過性ポリイミドにより被覆された外面を有する直線の融
合シリカ管を、毛管として使用した。ポリイミド被膜の
部分を、例１に記載される態様で焼き取った。これは、
毛管の端から、それぞれ４cm、１４cm、及び４４cmの位
置で、ＵＶ−透過窓を創造した。これらの窓の個々は約
２mmの長さであった。ＵＶ透過窓を含む、完全な長さの
管の内部を、線状ポリアクリルアミドの単層により被覆
した。

【００３５】２つのループを毛管に形成し、１つは第１
及び第２ＵＶ−透過窓間に存在し、そしてもう１つは第
２及び第３ＵＶ−透過窓間に存在し、その結果、その窓
を含む毛管の部分は、図２に示される配置でＶ−溝に平
行して配置され、そして窓は並行に配置された。ループ
はファンにより冷却され、そしてＶ−溝は流れにより冷
却された。Ｖ−溝は例１のＶ−溝のスリットに類似する
スリットを含み、但し、その高さは毛管の３個のセグメ
ントの外径の合計よりもわずかに大きかった。スリット
の幅は前記のように０．１５mmであった。

【００３６】同じ検出器が、Ｓpectra Ｐhysics ＳＰ
4270 Ｉntegrator と共に使用され、そして検出は２０
０nmで行われた。検出器ビームは、すべての３個のＵＶ
−透過窓を同時に通過した。

【００３７】電気泳動分離を、Ｂio−Ｒad Ｌaborator
ies, Ｉnc. Ｈercules, Ｃalifornia,Ｕ．Ｓ．Ａ．か
ら得られたペプチドの次の標準混合物を用いて行った
（溶離の順序）： １．ブラジキニン ２．アンギオテンシン ３．αメラニン細胞刺激ホルモン ４．甲状腺刺激ホルモン ５．黄体形成ホルモン放出ホルモン ６．〔２−５〕ロイシンエンケファリン ７．ボンベシン ８．メチオニンエンケファリン ９．オキシトシン

【００３８】毛管に使用される分離媒体は、０．１μの
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５であった。サンプル
注入は、８０００Ｖで１０秒間、電気泳動的に達成さ
れ、そして実施電圧はまた８０００Ｖでもあった。

【００３９】記録計トレースが図５に示され、そして溶
離順序の３回の反復は同一であった。第１の反復は、ト
レースに文字“Ａ”により示され、そして４．０cmの位
置で窓を通過する溶質に対する検出器応答を示し；第２
の反復は、“Ｂ”により示され、そして１４．０cmの位
置で窓を通過する溶質に対する検出器応答を示し；そし
て第３の反復は“Ｃ”により示され、そして４４．０cm
の位置で窓を通過する溶質に対する検出器応答を示す。
成分数は、第３の反復において個々のピーク上に示され
る。それらの個々の反復における溶離順序において、ブ
ラジオニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、〔２−
５〕ロイシンエンケファリン及びオキシトシンは、標準
混合物の既知の溶離挙動に基づいて、それぞれピーク
１，５，６及び９と同一である。

【００４０】統合されたピーク領域が下記表１に列挙さ
れる。検出器ＵＶビームの断面に対する光強度の変動及
び他の要因、たとえば１つの窓から他の窓への毛管の直
径における変動を補うために、ピーク領域を、ブラジオ
ニンに対して標準化した。

【００４１】

【表１】

【００４２】図６においては、cmでの移動距離（すなわ
ち、毛管の注入端からの窓の距離）が、個々のピークが
検出器で現れる点で、時間（秒）に対してプロットされ
た。図における黒丸は、ブラジキニンを示し；Ｘは黄体
形成ホルモン放出ホルモンを示し；白丸はロイシンエン
ケファリンを示し；そして三角はオキシトシンを示す。
それらの点は直線になり、それは移動値（電圧／cmでの
電場の強さにより割り算されたcm／秒での移動速度）が
高い精度で容易に決定されることを示す。これらの値
は、下記表２に列挙される。

【００４３】

【表２】

【００４４】前述のものは例示目的である。本明細書に
記載される操作条件、材料、工程段階及び他のパラメー
ターが、本発明の範囲内でさらに変性又は置換され得る
ことは、当業者に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】これは、本発明の電気泳動システムの１つの例
の図である。

【図２】これは、本発明の電気泳動システムの第２の例
の図である。

【図３】これは、本発明のクロマトグラフィーシステム
の例の図である。

【図４】これは、図１のシステムを利用しての実験操作
の間に取られる、ストリップチャート記録計からのトレ
ースである。

【図５】これは、図２のシステムを利用しての実験操作
の間に取られる、ストリップチャート記録計からのトレ
ースである。

【図６】これは、図５のトレースから取られる４種のペ
プチドに関する、移動距離ｖｓ．時間のプロットであ
る。

【符号の説明】

１２…線状毛管 １３，１４…電極溜め １５，１６…電極 １７…電力源 １８…ＵＶ光源 １９…光二極管検出器 ２０…インテグレーター ２１…記録計 ２２…ポリイミド ２３，２４，２５，２６…非被覆セグメント ２７…溶質の移動方向 ４２…ループ毛管 ４３，４４，４５…検出窓 ４６…ＵＶ光源 ４７…光二極管検出器 ４８…溶質の移動方向 ５１…毛管 ５２…クロマトグラフィーポンプ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛管における分離媒体を通して電気泳動
   分離を受ける溶質の移動性及び相対量の代表的な値を決
   定するための方法であって： （ａ）単一の検出器により、前記毛管の長さにそって離
   れて間隔を開けられた多くの検出点で時間の関数として
   前記分離媒体による光吸収性の変動を検出し； （ｂ）前記個々の検出点で、このようにして検出された
   光吸収性の変動のピーク、及び前記すべての検出点で実
   質的に同じである、前記ピークが生じる順序を同定し； （ｃ）前記順序での個々のピークのために、前記検出点
   に達するために前記ピークにより取られる時間により割
   り算された前記検出点に前記ピークにより移動された距
   離をすべての前記検出点の間で平均を取り；そして （ｄ）前記順序での個々のピークのために、前記順序に
   おける同じ位置でのピークより定義される面積を前記す
   べての検出点の間で平均を取ることを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 毛管に保持される分離媒体において行わ
   れる、クロマトグラフィー及び電気泳動分離から成る群
   から選択された分離方法により、溶質の連続的分離の連
   続段階を示す多くの溶質ピークパターンを、前記溶質が
   前記毛管において移動の方向に移動するにつれて得るた
   めの方法であって： （ａ）光吸収性検出器により前記毛管における第１の位
   置を整合し、そして前記第１の位置での時間の関数とし
   て前記分離媒体により光吸収性の変動を検出することに
   よって第１溶質ピークパターンを得； （ｂ）前記移動の方向に前記毛管の長さにそってさらに
   第２位置と共に整合するように前記検出器に関する前記
   毛管を置換し、そして前記第２位置での時間の関数とし
   て光吸収性の変動を検出することによって第２溶質ピー
   クパターンを得；そして （ｃ）前記多くの溶質ピークパターンを達成するために
   十分に多くの位置で段階（ｂ）をくり返すことを含んで
   成る方法。
3. 【請求項３】 前記分離方法が電気泳動であり、前記溶
   離ピークパターンがエレクトロフェログラムであり、そ
   して前記方法が： （ｄ）前記個々のエレクトロフェログラムのために、そ
   こでのピーク及び前記ピークが生じる順序を同定し、こ
   こで前記順序は個々の前記エレクトロフェログラムにお
   いて実質的に同じであり； （ｅ）前記順序での個々のピークのために、前記エレク
   トロフェログラムが得られる位置に達するために前記ピ
   ークにより取られる時間により割り算された前記位置に
   前記ピークにより移動された距離をすべての前記エレク
   トロフェログラムの間で平均を取り；そして （ｆ）前記順序での個々のピークのために、前記順序に
   おける同じ位置でのピークにより定義される面積を前記
   すべてのエレクトロフェログラムの間で平均を取ること
   をさらに含んで成る請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記毛管が融合シリカの長さであり、こ
   の外面の、実質的に連続的な態様でポリイミドにより被
   覆され、但し、段階（ａ）及び（ｂ）において前記光吸
   光性検出器と整合する個々の前記位置で不連続である請
   求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 前記毛管の内面が、線状ポリアクリルア
   ミド、デキストラン及びメチルセルロースから成る群か
   ら選択された物質により被覆される請求項４記載の方
   法。
6. 【請求項６】 クロマトグラフィー及び電気泳動分離か
   ら成る群から選択された分離方法により、溶質の連続的
   分離の連続段階を示す多くの溶質ピークパターンを得る
   ための方法であって： （ａ）毛管に保持される分離媒体において前記分離工程
   を保進する条件に前記溶質をゆだね、ここで前記毛管
   は、お互いに十分に接近して検出点として定義される前
   記毛管の長さにそって多くの位置を配置するために少な
   くとも１度ループ化され、そして個々の対の検出点が前
   記毛管の少なくとも１つのループにより分離され；そし
   て （ｂ）前記分離媒体を通して前記検出点以上への前記溶
   質の移動により引き起こされる、時間の関数としての前
   記分離媒体により前記検出ビームからの光の吸収の変動
   を検出することを含んで成る方法。
7. 【請求項７】 前記分離方法が電気泳動であり、前記溶
   離ピークパターンがエレクトロフェログラムであり、そ
   して前記方法が： （ｃ）そのようにして検出された変動のピークを同定
   し、そして前記ピークをエレクトロフェログラムにグル
   ープ分けし、ここで１つは個々の検出点に対応し； （ｄ）前記ピークが個々の前記エレクトロフェログラム
   において生じる順序を同定し、ここで前記順序は個々の
   前記エレクトロフェログラムにおいて実質的に同じであ
   り； （ｅ）前記順序での個々のピークのために、前記エレク
   トロフェログラムが得られる位置に達するために前記ピ
   ークにより取られる時間により割り算された前記位置に
   前記ピークにより移動された距離をすべての前記エレク
   トロフェログラムの間で平均を取り；そして （ｆ）前記順序での個々のピークのために、前記順序に
   おける同じ位置でのピークにより定義される面積を前記
   すべてのエレクトロフェログラムの間で平均を取ること
   をさらに含んで成る請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記毛管が融合シリカの長さであり、こ
   の外面の、実質的に連続的な態様でポリイミドにより被
   覆され、但し、個々の前記検出位置での不連続性を除く
   請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記毛管の内面が、線状ポリアクリルア
   ミド、デキストラン及びメチルセルロースから成る群か
   ら選択された物質により被覆される請求項８記載の方
   法。