JPH0520439B2

JPH0520439B2 -

Info

Publication number: JPH0520439B2
Application number: JP59061290A
Authority: JP
Inventors: Doromaaru Adorian; Eguzeruteie Misheru; Roran Kuroodo; Rui Teiyo Jan; Tarudei Misheru
Original assignee: ANSUCHI MERYUU; ROONU PUURAN RUSHERUSHU
Current assignee: ANSUCHI MERYUU; ROONU PUURAN RUSHERUSHU
Priority date: 1983-04-01
Filing date: 1984-03-30
Publication date: 1993-03-19
Also published as: IE840802L; IE57598B1; CA1203478A; AR242115A1; ATE32304T1; MX7676E; DK164741C; EP0121468A3; NO841266L; NO166230B; DK164741B; DK174484A; JPS6023320A; EP0121468B1; IN160634B; AU2626484A; AU565104B2; US4675384A; DE3469132D1; ES8501635A1

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野本発明は血漿蛋白のクロマトグラフイーによる
分画方法に関する。詳しくは、本発明はイオン交
換体を使用し高純度のアルブミンを得る血漿の分
画方法に関する。発明の背景血漿の主要成分であるアルブミンと免疫グロブ
リンを分離するために使用される工業的規模の最
も普及している方法は、アルコール水溶液を使用
して蛋白を選択的に沈澱することを原理とするコ
ーン（Cohn）の方法である。沈澱による方法は
選択性が完全ではなく蛋白が部分的に変性するの
で、操作に長時間を要し、人手と資本の面で高価
となり、無菌かつ非発熱性の製品を得ることはと
くに困難である。イオン交換材料の導入とともに、固定床カラム
を使用した連続法により蛋白の混合物から個々の
蛋白を分離するための新しい技術が提案されてい
る。これらの方法はより経済的であり、純度のよ
り高い蛋白をより高い収量で得ることを可能にす
る。しかしながら、バイオ産業におけるそれらの
方法の大規模な開発は一定の不都合があるためま
だ制限されている。多糖類イオン交換体と接触させて血漿からアル
ブミンを単離する方法が仏国特許出願第23272526
号明細書、米国特許第4228154号明細書および同
第4136094号明細書に記載されている。これらの
方法は不純物とくにリポ蛋白、場合によつてはγ
−グロブリンの大部分を除去するための複雑な予
備処理を含んでいたり、98％を超える純度を得る
ために分子篩によるアルブミンの最終的精製を必
要としたりする。これらの補完的処理は工業化が
困難であり不経済である。また生産性も低く、絶
えず増大する世界的な蛋白の需要により必要性の
高い血漿の大量処理には適していない。多糖類とは逆に無機担体は優れた物理化学的性
質を持ち高い過量を可能にするが、吸着部位が
非特異的であり、PHと使用可能なイオン強度に応
じて、蛋白収量の損失を招くことがあり得る。無機のイオン交換担体を使用したクロマトグラ
フイーによる蛋白の分離方法はとくに仏国特許第
2321932号、同第2359634号および同第2464967号
明細書に記載されている。上記のイオン交換体が
関与していると、血漿の分画の場合、治療用途に
要求される純度の程度としては収率が不十分にな
ることがあり、分画すべき血漿の如何によらず高
純度のアルブミンを得ることができない。発明の目的本発明の主要な目的は、最初に血漿から夾雑物
を除去する以外は補完的処理をすることなく、大
量の血漿を処理し、高収率で高純度の蛋白を単離
することのできる方法を提供することである。さらに詳しくは、本発明の目的は、血漿からそ
の由来にかかわらず治療用途のアルブミンを大規
模に抽出する方法を提供することである。本発明の説明最も一般的にいえば、本発明の方法は陰イオン
および陽イオンイオン交換体を使用して血漿を分
画することから成り、血漿の溶液を、イオン交換
体もしくは非イオン交換体製の少なくとも一種の
部分的に疎水性の支持体とイオン交換体製の少な
くとも一種の親水性支持体とに接触させることを
特徴としている。部分的に疎水性の支持体は、親水基を有すると
ともに、親油基を有する溶質と複合体を形成し得
る疎水基を有する支持体を意味する。これらの支
持体は一般的に疎水性の重合体すなわち炭素数３
以上の直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の
アルキル基あるいは飽和または不飽和の環状基を
有する重合体から成る。これに対して、親水性支
持体は疎水基をもたない支持体であり、表面の部
位がもつぱら親水性である。さらに詳しくいえば、本発明の特徴は、部分的
に脱塩した血漿の水溶液を順次少なくとも一種の
陰イオン交換体と少なくとも一種の陽イオン交換
体に接触させ、これらのイオン交換体としてイオ
ン交換能が2m.eq／ｇ未満であり、粒径4μm〜５
mm、孔径500〜2500Å、比表面積５〜150m²／ｇの
多孔性無機質支持体を、少なくとも一の交換体用
にアミノ基もしくは第四アンモニウム塩基を含有
または担持する網状化重合体の薄膜を15mg／m²未
満の厚さに被覆したもの、および他方のイオン交
換体用にカルボン酸基を担持する網状化ポリビニ
ルラクタムの薄膜を15mg／m²未満の厚さに被覆し
たものを使用することにある。上記イオン交換体の基体となる無機質支持体は
アルミナとシリカが代表的な例である。使用する
交換体の支持体は、上記の限定の範囲内であれ
ば、同じ性質のものでも異なる性質のものでも使
用でき、また同じ特性のものでも異なる特性のも
のでも使用できる。使用する無機質支持体は、孔径600〜1500Å、
比表面積20〜50m²／ｇおよび粒径50μm〜１mmの
ものが好ましい。陰イオン交換樹脂は下記の官能基を含有または
担持する網状重合体から形成される。すなわち、
次式の第一，第二もしくは第三アミン基または第
四アンモニウム塩基：−NH₂，−NHR，−Ｎ(R)₂，
−N⁽⁺⁾(R)₈X^(-)（式中、Ｒは、同一または相異なつ
て、炭素数１〜４のアルキル基もしくはヒドロキ
シアルキル基を表わし、Ｘは、例えば塩化物、硫
酸塩、硝酸塩、燐酸塩、クエン酸塩のような無機
もしくは有機陰イオンを表わす。第三アミン基、第四アンモニウム塩基は、支持
体の全表面を被覆しイオン交換体を形成している
網状重合体の鎖の一部となつているか、あるいは
この重合体に固定されており、イオン交換体の交
換能は2meq／ｇ以下、好ましくは0.15〜
1.2meq／ｇ、さらに好ましくは0.15〜0.70meq／
ｇである。支持体の表面を被覆する網状重合体はそれ自体
公知の製品であり、触媒としてのポリアミンを使
用すると網状化するエポキシ化合物；ポリアミン
との重縮合により網状化するホルムアルデヒド；
重合開始剤または紫外線の存在下でモノアルキレ
ングリコールもしくはポリアルキレングリコール
のジアクリル酸エステルまたはジメタクリル酸エ
ステル、ジビニニルベンゼン、ビニルトリアルコ
キシシラン、ビニルトリハロゲノシラン、ビス−
メチレンアクリルアミドのような多官能単量体と
反応して網状化するビニルピリジン、スチレンお
よびそれらの誘導体などのビニル単量体のような
単量体から得られる。網状重合体が分子鎖中に官能基をもたない場合
には重合体を修飾する必要がある。これは特にス
チレンとその誘導体、アクリル酸アルキルとメタ
クリル酸アルキル、ならびにアクリロニトリルを
ベースとする網状重合体の場合である。重合体の
この修飾はあらゆる公知方法により行われる。支持体上のこれらの陰イオン交換樹脂とその製
造法は仏国特許公開公報第2321932号および同第
2464967号に記載されているので参照することが
できる。陽イオン交換体に関しては、多孔性無機質支持
体に官能基−COOHを担持する網状ポリビニル
ラクタム薄膜を被覆する。支持体を被覆するビニルラクタム共重合体はそ
れ自体公知の製品であり、式（）の単量体（式中、ＲはＨまたは低級アルキル基を表わ
し、ｘは２〜５の整数を表わす。）の単量体と式
（）（式中、R₁はＨまたはCH₃を表わし、R₂はC₁
−C₃₀の直鎖もしくは分枝状の二価のアルキレン
基、フエニレン基、シクロアルキレン基、―（
CH₂）_o−Ｏ―（CH₂）_n――、―（CH₂）_o――CO―（CH₂
）_n――、
―（CH₂）_o――COO―（CH₂）_n――、（CH₂）_o−SO₂―（
CH₂
）_n――、―（CH₂）_o――NR₄―（CH₂）_n――、または（
CH₂
）_o――CO−NR₄―（CH₂）_n――（ここに、R₄はＨもし
くはC₁−C₃のアルキル基を表わし、ｎおよびｍ
は０〜12の整数を表わす。）を介して不飽和炭素
原子に結合し得る−COOH基を表わす。）の不飽
和カルボン酸単量体との共重合により得られる。式（）の単量体の例としてはＮ−ビニルピロ
リドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム、Ｎ−ビニル
−β−プロピオノラクタム、α−メチルビニルプ
ロピオノラクタムなどが挙げられる。Ｎ−ビニル
ピロリドンを使用するのが好ましい。式（）のカルボン酸の例としてはアクリル
酸、メタクリル酸、４−ペンテン酸、ビニルベン
ゼンカルボン酸、６−アクリルアミドヘキサン酸
などが挙げられる。これらの単量体は当業界において公知の多官能
性網状化剤、例えばジエチレングリコールもしく
はジブタン−１，４−ジオールのジアクリル酸エ
ステルまたはジメタクリル酸エステルのようなポ
リオールのジアクリル酸エステル、およびトリア
リルイソシアヌレートのようなトリアジンのビニ
ルもしくはアリル誘導体などを使用して網状化で
きる。網状化剤としては次式 CH₂＝CH−SiX₃ （）（式中、各Ｘは、同一または相異なつて、低級
アルコキシ、アセトキシもしくはフエノキシまた
はハロゲン原子の加水分解性残基を表わす。）の
シラン型単量体を使用することもできる。使用し
易いシラン誘導体の例はビニルトリメトキシシラ
ン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリアセ
トキシシラン、ビニルトリクロロシラン、ビニル
トリス（β−メトキシエトキシ）シランなどであ
る。好ましくは、無機質支持体の共重合体による被
覆は支持体の存在下で単量体を現場重合すること
により達成される。ビニルラクタム、網状化剤お
よびビニルカルボン酸、場合によつてさらに重合
開始剤を溶媒に溶解し、得られた溶液を支持体に
含浸させてから溶媒を蒸発させ、単量体を加熱や
紫外線照射のようなそれ自体公知の任意の方法に
より網状化する。溶媒としては、最終的に蒸発さ
せるのが容易になるように沸点ができるだけ低い
単量体の溶媒製品がすべて使用できる。例えば、
塩化メチレン、クロロフロロメタン（フルゲン）、
エチルエーテル、アセトン、酢酸エチルなどが使
用できる。一般に、単量体の使用量は多孔性支持体の表面
に１〜15mg／m²、好ましくは１〜６mg／m²の薄膜
が得られるように選ばれる。単量体の割合により
重合体薄膜上に割当てられる官能基の量が決定さ
れる。支持体の表面に割当てられた官能基の量が
0.05〜2meq／ｇ支持体となるような量のビニル
カルボン酸を使用するのが好ましい。網状化剤の
量は単量体の総重量に対して１〜60重量％の範囲
で変えられる。さらに検討の結果、血漿からの蛋白の分離およ
び非常に高純度のアルブミンの収得が別の支持体
を使用したクロマトグラフイーにより、イオン交
換体もしくは非イオン交換体製の少なくとも一種
の部分的に疎水性の支持体とイオン交換体製の少
なくとも一種の親水性支持体を順次使用する条件
下で達成し得ることが見出された。この場合は、一般的には、支持体は無機質でも
有機質でもよく、天然物でも合成物でもよい。大
大規模生産のためには、もちろん無機酸化物をベ
ースとする支持体が好ましい。親水性支持体はイオン交換基を有する重合体マ
トリツクスまたは親水性重合体薄膜を被覆した無
機酸化物で構成できる。親水性天然物支持体の例
は、網状化デキストラン、アガロース、網状化ア
ガロース、セルロース、網状化セルロースのよう
な多糖類をベースとする重合体マトリツクスであ
る。公知の合成親水性支持体はアクリルアミドとそ
の親水性誘導体のような単量体の重合により得ら
れる。親水性支持体の別の群は表面を天然もしくは合
成親水性重合体で被覆した多孔性無機酸化物に代
表されれる。多孔性無機酸化物はシリカ、アルミ
ナ、マグネシア、酸化チタンまたはそれらの天然
または合成誘導体たとえばガラス、ケイ酸塩、ゼ
オライト、カオリンなどでもよい。無機質支持体
は粒径が4μm〜５mm、好ましくは50μm〜１mm、
孔径が250〜3000Å、好ましくは600〜1500Å、比
表面積が５〜150m²／ｇ、好ましくは20〜50m²／
ｇである。支持体の表面を被覆する重合体は上記のような
天然の多糖類重合体でもよく、それらは網状化剤
の存在下でビニル単量体の重合により得られるそ
れ自体公知の水不溶性親水性重合体でもよい。こ
れらの親水性重合体の代表例は、２−ヒドロキシ
エチル、ヒドロキシルプロピル、ヒドロキシエト
キシエチルのアクリル酸エステルもしくはメタク
リル酸エステルの単独重合体または共重合体のよ
うなヒドロキシアルキルもしくはヒドロキシ（低
級アルコキシ）アルキルのアクリル酸エステルま
たはメタクリル酸エステルの重合体；例えば酢酸
ビニルの単独重合体または共重合体の部分加水分
解物のようなカルボン酸ビニルエステル重合体の
部分加水分解物；アクリルアミド重合体；Ｎ−ビ
ニルラクタムの単独重合体および共重合体のよう
なヘテロ環ビニル化合物の重合体などである。多
糖類重合体で被覆した無機酸化物は仏国特許第
2319399号明細書に記載されている。同様に、部分的に疎水性の支持体は天然もしく
は合成重合体マトリツクスならびに部分的に疎水
性の重合体の薄膜で被覆した上記のような無機酸
化物で構成することもできる。多糖類重合体は炭
素数３以上の直鎖もしくは分枝状アルキル基また
はアルケニル基；フエニル、トリル、キシリルの
ようなアリール基またはアルキルアリール基；シ
クロヘキシルのようなシクロアルキル基またはシ
クロアルケニル基のような基の不動化により部分
的に疎水性にすることができる。合成重合体はス
チレンとその誘導体のような芳香族ビニル単量体
を単独でまたは芳香族ビニル単量体同志および／
または例えば（C₁−C₅）アルキルのアクリル酸
エステルもしくはメタクリル酸エステル、アクリ
ロニトリル、ブタジエンのような共重合性単量体
と混合して懸濁重合することにより得られる、モ
ノアルキレングリコールもしくはポリアルキレン
グリコールのジアクリル酸エステルまたはジメタ
クリル酸エステル、ジビニルベンゼン、ビニルト
リアルコキシシラン、ビニルトリハロゲノシラ
ン、ビス−メチレンアクリルアミドのような多官
能性単量体を重合開始剤または紫外線の存在下で
使用することにより網状化できる。本発明の方法において使用するのが好ましい疎
水性支持体は少なくとも部分的に疎水性の重合体
薄膜で被覆した無機酸化物（親水性支持体に対し
て上記のように定義されたようなもの）から成
る。被覆に使用する重合体は例えば長鎖の脂肪族
アミンのような疎水基を不動化した多糖類重合体
（この型の支持体は仏国特許第2403098号明細書ま
たは米国特許第4308254号明細書に記載の方法に
より調製できる。）、あるいは触媒としてポリアミ
ンを使用すると網状化するエポキシ化合物；ポリ
アミンとの重縮合により網状化するホルムアルデ
ヒド；重合開始剤または紫外線の存在下でモノア
ルキレングリコールもしくはポリアルキレングリ
コールのジアクリル酸エステルまたはジメタクリ
ル酸エステル、ジビニルベンゼン、ビニルトリア
ルコキシシラン、ビニルトリハロゲノシラン、ビ
ス−メチレンアクリルアミドのような多官能単量
体と反応して網状化するビニルピリジン、スチレ
ンおよびその誘導体などのビニル単量体のような
単量体を出発原料として得られる合成重合体であ
つてもよい。イオン交換基は親水性もしくは疎水性重合体上
に化学修飾により固定するか、あるいは酸型もし
くは塩基型のイオン化し得るかまたは化学反応に
より最終的に修飾されてイオン交換基を導入し易
い官能基を担持するビニル単量体を使用して単独
重合または共重合により重合体分子鎖中に導入す
ることもできる。共重合性単量体の例としては次式の化合物が挙
げられる。（式中、R₁はＨまたはCH₃を表わし、R₂はフ
エニル基もしくはナフチル基のようなアリール
基；−Ｃ≡Ｎ、−CONH₂、−CH₂OH、−COOR₃
（ここに、R₃はＨまたはC₁−C₆アルキル）、

【式】−OH、−NH₂、−ハロゲン、−SO₃H、−PO（OH）₂のような反応性官能基
Ｙ；またはC₁−C₃₀の直鎖もしくは分枝状の二価
のアルキレン基、フエニレン基、シクロアルキレ
ン基、―（CH₂）_o――Ｏ―（CH₂）_n――、―（CH₂）_o―
―CO―（
CH₂）_n――、―（CH₂）_o――COO―（CH₂）_n――、―（C
H₂）_o――
SO₂―（CH₂）_n――、―（CH₂）_o――NR₄―（CH₂）_n――
、―（
CH₂）_o――CO−NR₄―（CH₂）_n――（ここにR₄はＨまた
はC₁−C₃アルキル基を表わし、ｎおよびｍは０
〜12の整数を表わす。）を介して不飽和炭素原子
に結合された前記と同じ意味をもつ官能基Ｙを表
わす。共重合性単量体の例としては（メタ）アクリル
酸、４−ペンテン酸、ビニルベンゼンスルホン
酸、ビニルベンゼンカルボン酸、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、メタ
クリロニトリル、アリルアルコール、アリルアミ
ン、１，２−ジメチル−４−ペンテニルアミン、
２，３−エポキシプロピルのアクリル酸エステル
およびメタクリル酸エステル；Ｎ−メチロールア
クリルアミド、６−アクリルアミドヘキサン酸、
スチレンなどが挙げられる。官能共重合体を得る
ための反応性ビニル単量体の選択は用途によつて
のみ制限され、その選択は官能基によつて行なわ
れる。例えば陽イオン基または陰イオン基を担持
する単量体を選び支持体をそのままイオン交換樹
脂として使用できる。それ自体イオン交換基をもたない単量体の場合
は任意の公知技術に従い化学反応によりその化学
反応が共重合体の安定性に適合する範囲で最終的
にこれを修飾することが可能である。任意の従来技術に従い共重合体に存在する反応
性基Ｙを最終的に修飾して新しい官能基Y′を得
ることも可能である。この修飾は、例えば、第一
アミンを第三アミンもしくは第四アンモニウム塩
に転換してイオン交換支持体を得るか、あるいは
場合によつてアルキル化により第四アンモニウム
塩に転換することのあるジアミンの−COOH基
の反応により陽イオン交換体を陰イオン交換体に
転換することによつて行なうことができる。天然もしくは合成重合体による無機質支持体の
被覆は吹付けまたは含浸のような任意の公知の方
法により得られる。被覆する重合体が合成重合体
のときは支持体を上記の一種以上の単量体と場合
によつて重合開始剤を溶媒に溶解した溶液で含浸
し、次いでこの溶媒を蒸発させ、公知の方法に従
い単量体を網状化することにより得るのが好適で
ある。溶媒としては単量体と重合開始剤の溶媒で
あればどんな製品でも使用できるが、最終的蒸発
を容易にするためにできるだけ低い沸点のものが
好ましい。このような溶媒の例としては塩化メチ
レン、エチルエーテル、ベンゼン、アセトン、酢
酸エチル、クロロフロロメタン（フルゲン）など
が挙げられる。一般に、単量体または重合体の使用量は、支持
体の表面に１〜15mg／m²、好ましくは１〜６mg／
m²の厚さの重合体の薄膜が得られるように選ばれ
る。支持体の表面に割当てられる官能基の量は0.01
〜2meq／ｇ支持体が好適である。支持体をもつ
ぱらイオン交換体として使用するときは、その量
は好ましくは0.05〜2meq／ｇ支持体である。陰イオン交換基はジエチルアミノエチル基や次
式 −N⁽⁺⁾−(R)₃X^(-) （式中、Ｒは、同一または相異なつて、アルキ
ル基またはヒドロキシアルキル基を表わし、Ｘ
は、例えば塩化物、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、ク
エン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、蟻酸塩などのよう
な無機もしくは有機陰イオンを表わす。）で表わ
される第四アミノアルキル基のような芳香族アミ
ノ基または脂肪族アミノ基により構成することが
できる。陽イオン交換基はスルホン酸塩基、硫酸塩基、
ホスホノ基、カルボキシ基もしくはフエノール性
水酸基、好ましくはカルボキシメチル基またはス
ルホアルキル基である。商業的に入手し易い親水性イオン交換支持体と
してはセフアデツクスおよびセフアロースという
商品名でフアルマシア・フアイン・ケミカルス社
から発売されている公知の化合物、特にDEAEセ
フアデツクス（ジエチルアミノエチルデキストラ
ン）、QAEセフアデツクス（第四アンモニウム塩
化ジエチルアミノエチルデキストラン）、DEAE
セフアロース（ジエチルアミノエチルアガロー
ス）、CMセフアデツクス（カルボキシメチルデ
キストラン）、SPセフアデツクス（スルホプロピ
ルデキストラン）、CMセフアロース（カルボキ
シメチルアガロース）ならびにDEAEトリスアク
リルＭおよびCMトリスアクリルＭという商品名
でシミーク・ポワンテツト・ジラール社から発売
されている公知化合物が挙げられる。部分的に疎水性の支持体としては、網状化アガ
ロースをベースとするフエニルセフアロースCL
−4B、オクチルセフアロースCL−4B（フアルマ
シア・フアイン・ケミカルス社）という商品名で
知られる製品、第四アンモニウム基を担持するビ
ニルトルエンをベースとする重合体で被覆したシ
リカであるスフエロシルQMA（ローヌ・プーラ
ン研究所）という商品名で知られる製品を挙げる
ことができる。本発明で使用する血漿は動物由来のもの、特に
牛血漿、またはヒト血漿でもよい。血漿は血液の
デカンテーシヨンまたは遠心分離、あるいはプラ
スマフエレーゼのモジユール上での限外過によ
り得られる。新鮮なもしくは解凍した全血漿、も
しくは低温沈澱の上清、のみならず他の分離法に
より得られた分画を使用することができる。イオン交換体を使用して分画する血漿は前処理
をして塩類を少なくとも一部除去し、好ましく
は、不安定な蛋白複合体を構成する真正グロブリ
ンを除去する。これらの前処理はポリエチレング
リコールのような清澄化もしくは沈澱助剤または
粉末状燃焼シリカのような吸着剤を使用する必要
がないが、もちろんそのような前処理を施した血
漿溶液にも本発明の方法は適用できる。脱塩とPHおよびイオン強度条件の調整は特に隔
膜過または透過クロマトグラフイーにより行な
うことができる。さらに詳しくいうと、脱塩は、
例えば網状化ポリビニルラクタムのような親水性
重合体の薄膜で被覆した孔をもつ多孔性無機質支
持体上での透過クロマトグラフイーにより達成す
ることができる。この操作に使用する無機質支持
体は孔径が40〜300Å、比表面積が100〜800m²／
ｇおよび粒径が4μμ〜５mmであるのが有利であ
る。被覆は支持体上に重合体を単に吸着させること
によつて得られるが、好ましい使用態様としては
被覆は前記の化合物から選ばれた多官能網状化剤
の存在下、陽イオン交換樹脂の調製のための前記
の方法で例えばＮ−ビニルピロリドンのようなＮ
−ビニルラクタムの溶液を使用して現場重合する
ことにより実現される。網状化剤としては無機質
支持体とポリビニルラクタムとの間に安定な結合
を形成し得るシラン誘導体を使用するのが好まし
い。単量体の量は支持体の表面に１〜15mg／m²、
好ましくは１〜６mg／m²の厚さの重合体の薄膜が
得られるように選ばれ、網状化剤の量は単量体の
総重量に対して１〜50重量％の範囲内で変えられ
る。低イオン強度ではPH５近傍で血漿からそれに含
まれている真正グロブリンを除去することがで
き、次いで遠心分離し、清澄化した血漿溶液を分
離する。本発明の方法に従えば、血漿溶液は少なくとも
一種の部分的に疎水性の支持体と少なくとも一種
の親水性支持体とに接触させられる。部分的に疎
水性の支持体は必ずしもイオン交換基を含有して
いる必要はないが、少なくとも一種の陰イオン交
換支持体と少なくとも一種の陽イオン交換支持体
を使用する必要がある。陰イオン交換体を陽イオ
ン交換体に先行させるのが有利である。本発明の好適な実施態様においては、収率を増
加させより純度の高いアルブミンを得るために、
部分的に疎水性の支持体として陰イオン交換体を
使用し、親水性支持体として陽イオン交換体を使
用する。最も好適な実施態様においては一方が親水性で
あつてもよく他方が部分的に疎水性である二つの
陰イオン交換体と親水性の陽イオン交換体とを組
み合わせて分離を行なう。後者の二つの支持体に
通す順序はどちらが先でもよい。イオン強度を調整し、好ましくは清澄化した血
漿の分画は一種以上の陰イオン交換体と陽イオン
交換体とを順次使用しPHとイオン強度をアルブミ
ンであれ他の蛋白もしくは不純物であれ選択的に
固着されるように調整することによつて行なわれ
る。例えば、血漿の溶液を予め平衡化した部分的に
疎水性の陰イオン交換支持体と接触させ主として
アルブミンとα−グロブリンがPH５以上で固着さ
れるようにすることができる。PHが4.4〜4.8で適
当なイオン強度の緩衝液を使用して溶離すること
によりアルブミンに富み、残余α−およびβ−グ
ロブリンを含む溶液が得られる。例えばPH4.7の
0.025M酢酸塩緩衝液を使用することができる。
PH5.0以上に調整した溶離液を次いで予め同じPH
の緩衝液で平衡化した陽イオン交換体と接触させ
ると、この陽イオン交換体上にアルブミン以外の
蛋白のほとんど全部が保持される。他の使用例では、血漿溶液を親水性陰イオン交
換体、部分的に疎水性の支持体、好ましくは陰イ
オン交換体、次いで親水性陽イオン交換体を順次
に接触させる。血漿溶液のPHとイオン強度を上記
のように調整して最初の親水性陰イオン交換体上
にアルブミンと若干のα−およびβ−グロブリン
が保持されるようにする。溶離後、アルブミンを
含む溶液を部分的に疎水性の支持体と接触させる
とそれに種々の不純物が保持される。これらの不
純物のうちリポ蛋白はPH4.5〜6.0、好ましくはPH
4.7〜5.2で0.025〜0.06Mの酢酸塩緩衝液を使用し
て固着することができる。アルブミンを含む溶離
液を上記の条件下で陽イオン交換体で最終的に精
製する。陰イオン交換支持体を横断する免疫グロブリン
は溶液のPHとイオン強度を変えて別のイオン交換
支持体と接触させることにより精製することがで
きる。無機酸化物をベースとする支持体を使用する好
適な実施態様においては陰イオン交換体の量は血
漿１当り250〜2000mlにしてもよく、陽イオン
交換体の量は血漿１当り200〜1000mlにしてよ
い。血漿溶液と各交換体との接触時間は約15分以
上である。本発明の方法によれば最初の血漿に含まれてい
る蛋白全体を評価することができるとともに、電
気泳動法により50ｇ／の濃度で測定した純度が
99％以上100％にも達し得るアルブミンを溶液で
得ることができる。ゲル過分析によりアルブミ
ンの重合体は存在しないことが示されている。ア
ルブミン溶液の純度は免疫沈降技術により評価す
ることができる。特に、ゲロースを使用した二重
免疫拡散技術に従いリポ蛋白α1およびβの不存
在を示すことができる。場合によつて検出できる
痕跡量のα1アンチトリブシンとハブトグロビン
はアルブミンの品質にとつて不都合ではない。こ
のアルブミン溶液は例えば限外過のような任意
の公知方法により濃縮し、次いで調整および安定
化して法定の加熱処理を60℃で10時間行なつてア
ルブミン溶液を注射可能にする。イオン交換体に
保持されているアルブミン以外の蛋白は再生溶液
を使用して溶離することができる。流出溶液と再
生溶液に含まれる蛋白混合物はクロマトグラフイ
ー技術により最終的にそれぞれの蛋白に分離する
ことができる。血漿の処理は一連のカラムを使用してタンク内
で不連続的、半連続的または連続的に行なうこと
ができる。連続的処理は工業的実施にとくに適し
ている。カラムで連続的に行なう方法にり殺菌度
の高い条件下で製品の収率と純度を向上させるこ
とができる。以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、これらの実施例は例示であり本発明は
これらに限定されない。実施例１Ａ−排除クロマトグラフイー用支持体の調製
（GPC）粒径40〜100μm、比表面積400m²／ｇ、平均孔
径80Åおよび気孔容積１ml／ｇのシリカ2000ｇを
減圧下150℃で５時間乾燥する。得られた乾燥シリカをフルゲン11（CCl₃F）500
ml、Ｎ−ビニルピロリドン160ml、ビニルトリエ
トキシシラン30mlおよび過酸化ジラウロイル１ｇ
を含む均質溶液中に導入する。フルゲン11を周囲
温度で蒸発させ、次いで含浸シリカを80℃で17時
間加熱して網状化させる。次いでこのシリカを800mlの流水中に懸濁し、
５時間沸騰させる。過後シリカを流水およびア
セトンで順次洗浄し、次いで真空下40℃で乾燥さ
せる。分析の結果、被覆シリカに対して12重量％
の炭素量が得られた。Ｂ−支持体上の陰イオン交換体の調製粒径100〜300μm、比表面積25m²／ｇ、平均孔
径1250Å、気孔容積１ml／ｇのシリカを官能基−
N⁽⁺⁾−（CH₃）₃Cl^(-)をもつビニルトルエンの網状
化により得られ下記の特性を示す共重合体で3.6
mg／m²の厚さに被覆して支持体上にイオン交換体
を調製する。炭素量 6.1％窒素量 0.42％イオン交換能 0.30meq／ｇＣ−支持体上の陽イオン交換体の調製粒径100〜300μm、比表面積25m²／ｇ、平均孔
径1250Åおよび気孔容積１ml／ｇのシリカ100ｇ
を減圧下150℃で５時間乾燥する。得られた乾燥シリカを、Ｎ−ビニルピロリドン
50ml、アクリル酸２ml、ビニルトリエトキシシラ
ン15mlおよび過酸化ジラウロイルを250mlのフル
ゲン11に均質化した溶液中に導入する。周囲温度
で溶媒を蒸発させた後、含浸シリカを80℃で16時
間加熱して網状化させる。次いでこのシリカを400mlの流水中に懸濁し５
時間沸騰させる。過後シリカを流水およびアセ
トンで順次洗浄し、次いで真空下40℃で乾燥させ
る。このようにして得られた微量の陽イオン交換体
を結合したシリカは下記の特性を示す。％Ｃ 6.05 ％Ｈ 1.09 ％Ｎ 0.3 イオン交換能：0.20meq／ｇ固定重合体量：3.2mg／m² 血漿の前処理直径2.6cmのカラムに上記支持体Ａを装入し圧
縮状態に保つ。このカラムに0.025M酢酸ナトリウム緩衝溶液
200ml、プラスマフエレーゼのモジユールからの
新鮮血漿60mlおよび新たに0.025M酢酸ナトリウ
ム緩衝溶液100mlを順次30ml／ｈの流速で注入す
る。全蛋白を使用緩衝溶液の固有抵抗に近い固有
抵抗を有する溶液65ml中に集める。６％酢酸溶液を徐々に加えることによりこの蛋
白溶液のPHを5.1に調整する。沈澱した真正グロ
ブリンを遠心分離する。このようにして得られた蛋白溶液は下記の特性
を示す。固有抵抗： 520Ωcm²／cm 全蛋白： 43.8ｇ／組成：アルブミン 66.8％ α−グロブリン 9.2％ β−グロブリン 6.6％ γ−グロブリン 17.4％血漿溶液の分画直径1.6cmのカラムに上記陰イオン交換体
B25ｇを装入し圧縮状態に保つ。このカラムをPH
5.1の0.025M酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化す
る。直径１cmのカラムに上記陰イオン交換体B10
ｇを装入し圧縮状態に保つ。このカラムをPH4.7
の0.025M酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。直径１cmのカラムに上記陽イオン交換体C5
ｇを装入し圧縮状態に保つ。このカラムをPH5.5
の0.1M酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。カラムに前処理した血漿溶液58mlを一定流速
70ml／ｈで、PH5.1の0.025M酢酸ナトリウム緩衝
溶液100ml、次いでPH4.7の0.025M酢酸ナトリウ
ム緩衝溶液を順次注入する。カラムから溶離した溶液185mlを回収したと
ころ、全蛋白量は8.8ｇ／であり下記の組成を
示した。アルブミン 93％ α−グロブリン 1.6％ β−グロブリン３％ γ−グロブリン 2.4％このカラムのアルブミン抽出収率は89.2％であ
る。カラムの溶離液130mlを一定流速40ml／ｈで
カラムに注入する。次いでカラムにPH4.7の
0.025M酢酸ナトリウム緩衝溶液110mlを注入す
る。これらの流出液と洗浄液を混合して全蛋白量
4.2ｇ／の下記組成をもつ溶液を得る。アルブミン 96.5％ α−グロブリン 0.8％ β−グロブリン 2.7％カラムのアルブミン抽出収率は91.4％であ
る。カラムで集めた溶液を塩化ナトリウムの添加
によりPH5.5および固有抵抗180Ωcm²／cmに調整す
る。この溶液94mlをカラムに流速40ml／ｈで注
入する。このカラムをPH5.5の0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝溶液26mで洗浄する。流出液と洗浄液を混
合して全蛋白量が3.0ｇ／の下記組成をもつ溶
液を得る。アルブミン 99.5％ α−グロブリン 0.5％カラムのアルブミン抽出収率は94％である。分画全体のアルブミン抽出収率は76.6％であ
る。カラムとカラムはPH4.0の1M酢酸ナトリウ
ム緩衝溶液で再生できるが、カラムは
0.5NHCl溶液で再生できる。カラムの液（すなわち流出液）はγ−グロ
ブリン75％、β−グロブリン25％および痕跡量の
α−グロブリンを含有している。この液をカラ
ムと同じカラムにPHを5.8およびイオン強度
を0.050Mに調整してから注入すると、γ−グロ
ブリンの純度が100％近い溶液が回収される。γ
−グロブリンの全体の抽出収率は80％である。実施例２プラズマフエレーゼのモジユール由来の−40℃
で貯蔵された血漿100mlを＋４℃で徐々に解凍し
遠心してフアクターを含有する沈澱を除去す
る。得られた血漿である「低温型沈降物の上清」
を隔膜過によりPH7.4の0.005M酢酸塩緩衝溶液
に対して透析する。６％酢酸によりPH5.1に溶液
を酸性化し次いで遠心して真正グロブリンを除去
した後、得られた蛋白溶液は下記の特性をもつ。固有抵抗： 1.066Ωcm²／cm 全蛋白量：39.4ｇ／組成：アルブミン 67.3％ α−グロブリン 9.1％ β−グロブリン 7.2％ γ−グロブリン 16.3％血漿の分画前記の蛋白溶液58mlを流速70ml／ｈで実施例１
に載のカラムに注入する。このカラムは陰イ
オン交換体Ｂを含有しPH5.1の0.025M酢酸ナトリ
ウム緩衝溶液で予め平衡衡化してある。このカラムを同じ緩衝溶液100mlで洗浄し、次
いでPH4.5の0.025M酢酸塩緩衝溶液で溶離する。このようにして集めた溶離液の全蛋白量は10.1
ｇ／であり下記の組成をもつ。アルブミン 95.0％ α−グロブリン 1.8％ β−グロブリン 3.2％ γ−グロブリン０％このカラムのアルブミン抽出収率は78％であ
る。溶離液50mlを一定流速40ml／ｈで、陽イオン交
換体Ｃを含有しPH5.5の0.1M酢酸塩緩衝溶液で予
め平衡化した実施例１のカラムと同じ第２のカ
ラムに注入する。このカラムを同じ緩衝溶液15ml
で洗浄する。流出液と洗浄液を混合して全蛋白量
が7.27ｇ／で下記組成をもつ溶液を得る。アルブミン 99.0％ α−グロブリン 1.0％このカラムのアルブミン抽出収量は97.5％であ
り、この分画法により得られたアルブミンの全体
の抽出収率は76％である。実施例３遠心により得た牛血漿100mlを隔膜過により
PH7.4の0.005M酢酸塩緩衝溶液に対して透析す
る。前記実施例１および２と同様にして真正グロブ
リンを除去して得られた蛋白溶液は全蛋白量が
39.1ｇ／であり下記の組成をもつ。アルブミン 66.1％ α−グロブリン 8.0％ β−グロブリン 10.0％ γ−グロブリン 15.9％この蛋白溶液58mlを流速70ml／ｈで、陰イオン
交換体Ｂを含有しPH5.1の0.025M酢酸塩緩衝溶液
で予め平衡化した実施例１に記載のカラムに注
入する。このカラムを前記実施例と同様に処理す
る。集められた溶離液（167ml）は蛋白7.5ｇ／
を含有し、蛋白の組成は下記の通りである。アルブミン 95.3％ α−グロブリン 1.6％ β−グロブリン 3.1％ γ−グロブリン０％次いで、この溶離液67mlを流速40m／ｈで、陽
イオン交換体Ｃを含有しPH5.5の0.1M酢酸塩緩衝
溶液で予め平衡化した実施例１に記載のカラム
と同じ第２のカラムに注入する。このカラムを同
じ緩衝溶液23mlで洗浄する。流出液と洗浄液を混合すると、全蛋白量が5.1
ｇ／であり下記組成の溶液が得られる。アルブミン 99.1％ α−グロブリン 0.9％この分画法により得られるアルブミンの収率は
75.6％である。実施例４血漿溶液の調製血漿250mlを37℃で解凍し、濃HClでPH5.2に調
整し、PH5.2の0.01M燐酸塩緩衝溶液60に対し
て透析する。遠心して全蛋白量が35.5ｇ／であり下記組成
をもつ血漿溶液293mlを得る。アルブミン 56.5％ α−アルブリン 12.9％ β−グロブリン 9.5％ γ−グロブリン 21.1％分画下記のものを直列に設備する。 − 実施例１に記載の部分的に疎水性の陰イオン
交換支持体Ｂを15ｇ含有するカラム（直径
1.6cm） − 上記と同じ陰イオン交換体Ｂを５ｇ含有する
カラム（直径１cm） − 粒径100〜300μm、比表面積32m²／ｇ、平均
粒径1150Åおよび気孔容積1.2ml／ｇのシリカ
をＮ−ビニルピロリドン−アクリル酸共重合で
５mg／m²の厚さに被覆して成る陽イオン交換支
持体Ｄを５ｇ含有するカラム（直径１cm）。この支持体は単量体の割合を変えた以外は陽
イオン交換体Ｃ用の実施例１に記載の方法によ
り調製する。陽イオン交換支持体Ｄの特性は下
記の通りである。炭素量 8.46％窒素量 1.29％イオン交換能 0.19meq／ｇ前記のように調製した血漿溶液35mlを流速60
ml／ｈで、PH5.2の0.025M酢酸塩緩衝溶液で予め
平衡化したカラムに注入する。このカラムを平
衡化に使用した緩衝溶液65mlで洗浄した後、同じ
流速（60ml／ｈ）でPH4.7の0.025M酢酸塩緩衝溶
液を注入する。溶離溶液160ml（蛋白濃度3.72
ｇ／）はアルブミン92.5％、α−グロブリン３
％ならびにβ−およびγ−グロブリン4.5％を含
有している。溶離溶液の一部（138ml）を流速40
ml／ｈで、PH4.7の0.025M酢酸塩緩衝溶液で予め
平衡化したカラムに注入する。このカラムを同じ緩衝溶液22mlで洗浄する。流
出液と洗浄液を混合すると、蛋白濃度は3.06ｇ／
でアルブミン93.6％、α−グロブリン2.5％お
よびβ−グロブリン3.5％を含有している。前記混合溶液の一部（140ml）をNaOHの添加
によりPH5.5および1M NaClの添加により固有抵
抗270Ωcm²／cmに調整し、次いで流速20ml／ｈで、
PH5.5の0.05M酢酸塩緩衝溶液で予め平衡化した
カラムに注入する。このカラムを同じ緩衝溶液
25mlで洗浄する。流出液と洗浄液の濃縮混合液を電気泳動にかけ
たところアルブミンに不純物の混入はみられなか
つた（アルブミン100％）。出発血漿溶液に含まれるアルブミンに対する全
収率は71％である。カラム、およびは0.1N HCl溶液、蒸留
水および緩衝溶液によりそれぞれ再生される。実施例５下記ＡおよびＢを調製する。Ａ−多孔性無機質支持体に担持した親水性陰イオ
ン交換体−「陰イオン交換体Ｅ」粒径100〜200μ、比表面積30m²／ｇ、平均孔
径1250Å、気孔容積１ml／ｇの多孔性シリカ
（スフエロシルXOB015）100ｇを水酸化ナトリ
ウムの添加によりPH11.5に調整した7.5％DEAE
デキストラン水溶液200mlに添加する。このペーストを回転乾燥室内で80℃の温度で
15時間乾燥する。得られた粉末を、１，４−ブ
タンジオール−ジグリシジルエーテルの0.15％
エチルエーテル溶液に添加し、エーテルを窒素
気流中周囲温度で蒸発除去する。次いで80℃で
15時間加熱して網状化する。使用前にこの支持
体を0.1N NaOH溶液10容、0.1N HCl溶液10
容およびエチルアルコール溶液10容で洗浄し、
次いで乾燥し使用時まで貯蔵する。このようにして、DEAEデキストラン13％を
含有し0.2meq／ｇのClイオンを固定する能力
をもつ粉末115ｇを得る。Ｂ−多孔性無機質支持体上に担持した部分的に疎
水性の陰イオン交換体−「陰イオン交換体Ｆ」このイオン交換体の調製に使用する支持体は
前記Ａと同様に調製されるが、最終的にDEAE
デキストランを5.7％しか含有していない。支持体100ｇを、10ｇ／のNaClを含有する
0.05Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO₄）水
溶液500mlで周囲温度で２時間酸化する。10
ｇ／ NaCl溶液、次いでエチルアルコール
で洗浄した後、生成物を窒素気流中40℃で乾燥
する。酸化支持体100ｇをヘキサデシルアミンの６
％エチルアルコール溶液100mlに添加し、周囲
温度で48時間放置する。このようにして形成されたイミン結合のアミ
ン結合への還元は水素化ホウ素ナトリウム
NaBH₄を添加して50％の水の存在下0.2Mの濃
度にすることにより行なわれる。アルコールで
洗浄した後0.1N HClで洗浄をくり返し、洗浄
支持体を乾燥して使用時まで貯蔵する。血漿の前処理クエン酸ナトリウムで予備洗浄したヒト血漿
200mlを16％エタノール水溶液200mlに０℃で添加
する。生じた沈澱を遠心で除去する。上清を＋４
℃で（Ｎ HClで）酸性にしPH5.25にする。２時
間後、生じた沈澱を遠心により除去し、上清を限
外過セル内で隔膜過し、PH5.25の0.01M燐酸
塩緩衝溶液で平衡化できるようにする。真正グロ
ブリンの沈澱を新たに遠心により除去し、得られ
た上清を多孔度0.2μのメンブランで過する。そ
の固有抵抗は1200Ωcm²／cmである。血漿溶液の分画 − 直径2.5cmのカラムに陰イオン交換体E50ｇ
（105ml）を充填する。このカラムをPH5.25の
0.01M燐酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。 − 直径2.5cmのカラムに陰イオン交換体F30ｇ
（63ml）を充填する。このカラムをPH５の
0.054M酢酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化する。 − 直径2.5cmのカラムに実施例４に記載され
た陽イオン交換体D60ｇ（126ml）を充填する。
このカラムをPH5.5の0.054M酢酸ナトリウム緩
衝溶液で平衡化する。上記の前処理法に従つて得られた血漿200ml
に相当する清澄化した溶液をカラムに流速
400ml／ｈで注入する。このカラムをPH5.25の
0.01M燐酸塩緩衝溶液200mlで洗浄し、次いで
固着したアルブミンをPH4.7の0.025M酢酸塩緩
衝溶液500mlで溶離する。溶離液を集めたとこ
ろ400mlの体積であつた。このようにして得られた溶離液をＮ
NaOHの添加によりPH５に調整し次いでNaCl
を添加して固有抵抗を270Ωcm²／cmにする。こ
の溶液をカラムに流速100ml／ｈで注入する。この条件下ではアルブミンの大半は固着され
ず液とともにカラムを通過する。カラムをPH
５の0.054M酢酸ナトリウム緩衝溶液120mlで洗
浄する。アルブミンを含有する混合物をNaOHの添
加によりPH5.5に調整し、カラムに流速200
ml／ｈで注入する。このカラムをPH5.5の
0.054M酢酸ナトリウム緩衝溶液200mlで洗浄す
る。流出液を混合し、アミコンPM10メンブラ
ンで限外過して濃縮し濃度を50〜200ｇ／
にする。50ｇ／におけるアルブミン溶液の純
度を局方記載の条件下で酢酸セルロースを使用
した電気泳動および免疫電気泳動により評価す
る。これらの純度は100％であつた。種々の血
漿蛋白の特異抗血清に対するゲロースを使用し
た二重免疫拡散分散液により蛋白不純物、特に
α−およびβ−リポ蛋白、が存在しないことが
証明された。精製アルブミンの最終濃度が130
ｇ／であるときは、電気泳動では見えない痕
跡量のα1抗トリブシンとハプトグロビンが対
応する抗血清に対する二重免疫拡散により検出
することができる。これらの痕跡量の不純物が存在することは正
常であり、最終的に得られるアルブミン溶液の
安定性または動物もしくはヒトに静脈内投与す
るときの良好な寛容に対して影響を与えない。アルブミンの収率と純度に関する結果は表
に示す。三つのカラム全体をPH４の0.1M酢酸塩溶液
または20ｇ／ NaCl溶液で洗浄することが
でき、これにより保持されているアルブミンを
回収し次のサイクルのときにまたは独立の処理
においてこれを再使用することができる。次いてこれらのカラムは0.1N HClと60％エ
タノールで順次洗浄することとにより再生す
る。場合によつて、これらのカラムは湿法（ホ
ルモール２％）で定期的に消毒することができ
る。実施例６この実施例では親水性陰イオン交換支持体、疎
水性陰イオン交換支持体および親水性陽イオン交
換支持体を使用する。下記のカラムを直列に配置する。 − 実施例５に記載された陰イオン交換支持体14
ｇを含有するカラム（直径1.6cm）。このカラ
ムをPH5.2の0.01M燐酸塩緩衝溶液で平衡化す
る。 − 陰イオン交換体Ｂを含有する実施例４のカラ
ムと同じカラム。 − 陽イオン交換体Ｄを含有する実施例４のカラ
ムと同じカラム。同じ血漿溶液61mlから出発し実施例と同様にし
てかつカラムの溶離用およびカラムおよびカ
ラムの洗浄用の緩衝溶液を使用して操作する。カラム、およびの流量はそれぞれ60ml／
ｈ、20ml／ｈおよび20ml／ｈである。 50ｇ／に濃縮した最終溶液の電気泳動分析に
よりアルブミンに不純物の混入はないことが示さ
れた。130ｇ／に濃縮した溶液の二重免疫拡散
のコントロールは蛋白不純物が全く存在しないこ
とを示している。アルブミンの％とカラムの収率は表に測定結
果を示す。実施例７カラムとカラムの順序を入れ換えた以外は
実施例６と同様に操作する。カラムから出た溶離液をNaOHでPH5.5にか
つ1M NaClで固有抵抗270Ωcm²／cmに調整しカラ
ムに注入する。カラムから来る溶液（流出液＋洗浄液）を
1N HClでPH4.7に調整してカラムに注入する。カラム、およびの流速はそれぞれ60ml／
ｈ、20ml／ｈおよび20ml／ｈである。 130ｇ／に濃縮した最終溶液の電気泳動およ
び免疫拡散分析によりアルブミンに不純物の混入
はないことが示された。％アルブミンと収率の結果は表に示した。実施例８カラムを非イオン交換体の部分的に疎水性の
支持体を含有する新しいカラムで置き換えた以
外は実施例６と同様に操作する。この支持体は粒
径100〜300μm、比表面積25m²／ｇ、平均孔径
1250Åおよび気孔容積１ml／ｇのシリカを網状化
したビニルトルエン−ビニルトリエトキシシラン
共重合体で3.3mg／m²の厚さに被覆した炭素量が
7.3のシリカから成る。カラムを95％エタノール50ml、次いでPH4.7
の0.025M酢酸塩緩衝溶液50mlで平衡化する。カラム、およびの流速はそれぞれ60ml／
ｈ、20ml／ｈおよび20ml／ｈである。カラムの流出液はアルブミン99.3％およびα
−グロブリン0.7％を含有している。結果は表に示す。実施例９カラムを同じ大きさおよび使用条件のCMセ
フアロースCL−6B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルス社、スウエーデン国ウプサラ市）のカ
ラムで置き換えた以外は実施例５と同じ条件で操
作する。結果は表に示す。実施例 10 カラムを同じ大きさおよび使用条件のCMト
リスアクリル−Ｍ（試薬IBF、ポワンテツト−ジ
ラール社、フランス国ビルネーブ・ラ・ガレン
ヌ）のカラムで置き換えた以外は実施例６と同じ
条件下で操作する。結果を表に示す。実施例 11 カラムを同じ大きさおよび使用条件のDEAE
セフアロースCL6B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルス社、スウエーデン国ウプサラ市）のカ
ラムで置き換えた以外は実施例９と同じ条件下で
操作する。結果を表に示す。実施例 12 カラムを同じ大きさおよび使用条件のDEAE
トリスアクリルＭ（試薬IBF、ポワンテツト・ジ
ラール社、フランス国ビルネーブ・ラ・ガレン
ヌ）のカラムで置き換えた以外は実施例10と同じ
条件下で操作する。結果を表に示す。実施例 13 − 直径2.5cmのカラムに実施例５に記載の陰
イオン交換体100ｇ（210ml）を充填する。この
カラムをPH5.25の0.025M酢酸ナトリウム緩衝
溶液で平衡化させる。 − 直径2.5cmのカラムにヘキサデシルアミン
を結合したセフアロースCL 4B 63mlを充填
し、PH５の0.054M酢酸ナトリウムで平衡化す
る。ヘキサデシルアミンの結合は臭化シアン法
により下記の手順に従つて行われる。すなわち、セフアロースCL 4B 100mlを脱
イオン水で順次３回デカンテーシヨンを行なう
ことにより洗浄し、水200mlを追加する。ソー
ダ（NaOH）を連続的に添加することにより
PHを11に保ち、BrCN ９ｇを添加する。反応
を約15分間継続する。PHがそれ以上増加しなく
なつたら支持体を0.1M重炭酸塩で洗浄し次い
で95％エチルアルコールで洗浄する。アルコール200mlにヘキサデシルアミン20ｇ
を溶解した溶液を支持体に40℃で加え、15時間
反応させる。最後に、支持体を数度0.1N HCl溶液および
95％アルコール溶液で順次洗浄し、次いで前記
のように平衡化した。 − 直径2.5cmのカラムに実施例４に記載の陽
イオン交換体Ｄ 60ｇ（126ml）を充填する。
このカラムをPH5.5の0.054M酢酸ナトリウム緩
衝溶液で平衡化する。ヒト血漿の前処理低温型沈降物の上清200mlを０℃で16％エタノ
ール水溶液200mlに添加する。生じた沈澱を遠心
により除去する。上清を＋４℃で（Ｎ HClによ
り）酸性にしてPH5.25にする。２時間後、生じた
沈澱を遠心により除去し、上清を限外過セル内
で隔膜過してPH5.25の0.025M酢酸塩緩衝溶液
で平衡化する。真正グロブリンの沈澱を遠心によ
り新たに除去し、得られた上清を多孔度0.2μのメ
ンブランで過する。その固有抵抗は630Ωcm²／
cmである。この溶液をカラムに流速400ml／ｈ
で注入する。このカラムをPH5.25の0.025M酢酸
塩緩衝溶液200mlで洗浄し、次いで固着されたア
ルブミンをPH4.7の0.025M酢酸塩緩衝溶液400ml
で溶離する。溶離液を集めたところ、その体積は
350mlであつた。このようにして得られた溶離液をNaOHの添
加によりPH５に調整し、次いでNaClを添加して
固有抵抗270Ωcm²／cmにする。この溶液をカラム
に流速100ml／ｈで注入する。このカラムにより無視できない量のアルブミン
が固着されたが、前記の諸実施例のカラムで使
用した支持体に比べて収率が20〜30％減少してい
る。カラムを通過した溶液はアルブミンと若干の
α−およびβ−グロブリンを含有している。この
カラムをPH５の0.054M酢酸ナトリウム緩衝溶液
120mlで洗浄する。アルブミンを含有する混合物
をNaOHの添加によりPH5.5に調整し、カラム
に流速200ml／ｈで注入する。このカラムをPH5.5
の0.054M酢酸ナトリウム緩衝溶液200mlで洗浄す
る。流出液を混合し、アミコンPM10メンブラン
で限外過することにより濃縮して濃度を50ｇ／
にする。この溶液の純度は、局方記載の条件下で酢酸セ
ルロースを使用して電気泳動で評価たところ99.1
％であつて、従つて現行の基準に照らして満足な
ものと考えられる。種々の血漿蛋白の特異抗血清
に対するゲロースを使用した二重免疫拡散分析に
より次の不純物：トランスフエリン、α1抗トリ
プシン、α2マクログロブリンおよびハプトグロ
ビン、の存在を検出することができる。三つのカラムは各サイクル毎に前記実施例と同
様にして再生および消毒することができる。この精製方法の全収率は55％にとどまつた。結果を表に示す。実施例14 （比較例）疎水性セフアロースのカラムの代わりに親水
性の陰イオン交換体Ｅのカラムを同じ使用条件で
使用した以外は実施例13と同じ条件下で操作す
る。得られた結果（表参照）は、前記の諸実施
例の結果とは異なる。アルブミンの最終純度は99
％未満である。とくにその存在がアルブミンの最
終溶液の安定性とくに60℃に加熱したときの安定
性を損なうα1−リポ蛋白の統一的存在が検出さ
れた。この実施例は非常に高純度のアルブミンを得る
ために部分的に疎水性の支持体で過する工程を
包含する必要性を示している。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１血漿の溶液を、イオン交換体かもしくはイオ
ン交換体でない少なくとも一種の部分的に疎水性
の支持体と、天然多糖類重合体マトリツクス、合
成重合体マトリツクス、多糖類重合体で被覆した
無機酸化物および架橋合成重合体の薄膜で被覆し
た無機酸化物から成る群より独立に選ばれた少な
くとも一種の親水性イオン交換体支持体とに接触
させることを特徴とする陰イオン交換体および陽
イオン交換体を使用して血漿蛋白を分画する方
法。２該部分的に疎水性の支持体が陰イオン交換体
であり、該親水性支持体が陽イオン交換体である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。３該血漿の溶液を、一方が親水性であつてもよ
く、他方が部分的に疎水性である二つの陰イオン
交換体支持体と、親水性陽イオン交換体支持体と
に接触させることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。４該部分的に疎水性の支持体が、疎水基を固定
することにより変性した多糖類重合体、合成重合
体吸収剤、疎水基を固定することにより変性した
多糖類重合体で被覆した無機酸化物、および疎水
性の架橋重合体の薄膜で被覆した無機酸化物から
成る群より選ばれたことを特徴とする特許請求の
範囲第１または３項のいずれか一つに記載の方
法。５該親水性支持体が多糖類重合体、水不溶性親
水性合成重合体、多糖類重合体で被覆した無機酸
化物および親水性架橋重合体の薄膜で被覆した無
機酸化物から成る群より選ばれたことを特徴とす
る特許請求の範囲第１または３項のいずれか一つ
に記載の方法。６該無機酸化物は粒径が4μm〜５mm、孔径が
250〜3000Åおよび比表面積が５〜150m²／ｇであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜５項の
いずれか一つに記載の方法。７イオン交換能が2meq／ｇ未満のイオン交換
体として、粒径4μm〜５mm、孔径500〜2500Å、
比表面積５〜150m²／ｇの多孔性無機質支持体を、
少なくとも一方のイオン交換体用にアミノ基もし
くは第四アンモニウム塩を含有または担持する疎
水性の架橋重合体の薄膜を15mg／m²の量で被覆し
たもの、および他方のイオン交換体用にカルボン
酸基を担持する架橋ポリビニルラクタムの薄膜を
15mg／m²の量で被覆したものを使用したことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。８該血漿の溶液をさらに同じ特性の多孔性無機
質支持体をアミノ基または第四アンモニウム塩を
担持する多糖類重合体で被覆したものと接触させ
ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
方法。９直列のカラムを使用して連続的に実施するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいず
れか一つに記載の方法。