JPH05219948A

JPH05219948A - サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、その製造法、およびその酵素をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH05219948A
Application number: JP4799392A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Uozumi; 武司魚住; Haruhiko Masaki; 春彦正木; Akira Nakamura; 顕中村; Keiga Shin; 敬娥申
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1992-02-04
Publication date: 1993-08-31
Anticipated expiration: 2016-04-09
Also published as: JP3155324B2

Abstract

(57)【要約】【構成】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノブ・Ｃ
−１４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-1400 ）由
来の配列番号１のアミノ酸配列において、１８８番目の
チロシンがアラニン、またはトリプトファンに改変され
たサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、
それをコードする改変されたサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼ遺伝子、および前記遺伝子を導
入した形質転換微生物を培養し、培養液から改変サイク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼを取得する
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの製
造法。【効果】野生型ＣＧＴａｓｅと比べてβ−ＣＤに対する
γ−ＣＤの相対生産量が増大する。アラニン、セリン置
換体変異酵素ではβ−ＣＤとγ−ＣＤがほぼ同率で生成
し、トリプトファン置換体変異酵素はγ−ＣＤの生産量
が対糖収率で１５％に達する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ、その製造法、およびその
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】サイクロデキストリン（以下、ＣＤとい
う。）はグルコース分子が環状に連なった非還元性のマ
ルトオリゴ糖で、グルコース分子の数により、α（６
個）、β（７個）およびγ（８個）の３種が存在する。
ＣＤはバチルス属（Bacillus）をはじめとする多くの微
生物が生産するＣＤ生産酵素によりデンプンから生産さ
れる。

【０００３】ＣＤは、その分子構造により各種有機化合
物を分子空洞内に取り込んで優れた物性を持つ安定した
包接化合物を形成することが知られており、そのような
特性から、揮発性物質の安定化、酸化性・光分解性物質
の保護、溶解度や色、味などの性質の変化、水不溶性物
質の乳化などに広く用いられている物質であり、食品、
医薬品、香料などをはじめとする種々の分野でのＣＤの
需要が急速に高まりつつある。特に、γ−ＣＤは、その
溶解度や生分解性において優れている他、分子内空洞が
最も大きいために多種類の物質を包接できる点で利用価
値が大きいが、３種のＣＤのうちでは最も生産量が少な
い。

【０００４】サイクロデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅという。）は、デンプン
を基質として直鎖状のデキストリンを生成すると同時
に、転移反応により上記３種のＣＤの混合物を生成する
転移酵素であり、同一の酵素分子が多種類の反応を触媒
する代表的な多機能酵素である。ＣＧＴａｓｅは、表１
に示すようにバチルス属をはじめとする多くの微生物か
ら産生されることが知られており、これらは反応初期に
αまたはβ−ＣＤを主として生成するが、反応の進行と
ともに主生産物以外のＣＤも生成してくる。

【０００５】

【表１】

【０００６】ＣＧＴａｓｅは酵素反応の主産物の相違に
より、α−ＣＤ生産型、β−ＣＤ生産型の２グループに
大別される。γ−ＣＤ生産型酵素についてはバチルス・
スブチリス（Bacillus subtilis） No.313 が生産する
ＣＧＴａｓｅが知られているだけであり、通常γ−ＣＤ
はデンプンからα−ＣＤ、あるいはβ−ＣＤを生産する
ときの副産物として少量生産されるにすぎない。バチル
ス・スブチリス（Bacillus subtilis） No.313 ＣＧＴ
ａｓｅの場合でも、デンプンからのγ−ＣＤの生産量は
対糖収率で２〜３％にすぎない状態であり、この値はα
−ＣＤ生産型やβ−ＣＤ生産型の酵素が副産物として生
産するγ−ＣＤの量以下である。

【０００７】一方、好アルカリ性細菌の１種であるバチ
ルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis） C-1400 株
より生産されるＣＧＴａｓｅは、デンプンを基質として
β−ＣＤを生産し、実際に工業的レベルでβ−ＣＤの生
産に利用されている酵素である。そのアミノ酸配列およ
びそのＤＮＡ配列は本発明者らによって解明されてお
り、その遺伝子を大腸菌等に導入してそれらの発現系を
用いることによる大量生産も可能になった（特開平3-21
6191号）。この酵素は、通常の反応条件下ではαーＣＤ
をほとんど生産しないことや、他のβ−ＣＧＴａｓｅに
比べて比較的大量にγ−ＣＤを生産するという特徴を持
っているが、β−ＣＤとγ−ＣＤとの混合物を分離する
際、ＨＰＬＣを用いなければならず、コストの面で大き
な問題となっている。

【０００８】このように、γ−ＣＤはその用途が最も多
いにもかかわらず、生産量が少なく高価であるのが現状
である。一方、遺伝子操作技術の普及とともに、ＣＧＴ
ａｓｅ遺伝子のクローン化が続々となされており、これ
までのＣＧＴａｓｅの構造と機能の相関の研究ととも
に、遺伝子を改変することにより酵素蛋白質を改良する
試みも行われている。例えば、木村らは、デンプンから
β−ＣＤを主に生産する好アルカリ性バチルス（Bacill
us） 1011 ＣＧＴａｓｅのＣ末端側の１０個あるいは１
３個のアミノ酸を欠失させると、β−ＣＤ以外に相当量
のグルコース、マルトオリゴ糖およびα−ＣＤを生産す
るようになることを示した（Biochemical and Biophysi
cal Research Communications, 161, 1273(1989)および
日本農芸化学大会講演要旨, 65, 286(1991) 参照）。し
かし、γ−ＣＤを大量に得ることを目的として行なわれ
た報告例は今だにない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
はバチルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis） C-1
400 株より生産されるＣＧＴａｓｅの遺伝子操作技術に
よってγ−ＣＤ生産性に優れたＣＧＴａｓｅ、その製造
法、およびそのＣＧＴａｓｅをコードする遺伝子を提供
することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス
・オーベンシス（Bacillus ohbensis） C-1400 株より
生産されるＣＧＴａｓｅが、通常の反応条件下ではαー
ＣＤをほとんど生産しないことや、他のβ−ＣＧＴａｓ
ｅに比べて比較的大量にγ−ＣＤを生産するという特徴
を持つことに着目し、α−ＣＤを主に生産するＣＧＴａ
ｓｅとβ−ＣＤを主に生産するＣＧＴａｓｅの構造を比
較したところ、酵素特異性に関与すると考えられるいく
つかの領域において、大きく異なる点が存在することを
確認した。また、バチルス・オーベンシス（Bacillus
ohbensis） C-1400 株より生産されるＣＧＴａｓｅの特
定部位を他のアミノ酸に改変することにより、デンプン
から従来よりも高い収率でγ−ＣＤを生産できることを
見出し、本発明に至った。

【００１１】すなわち、本発明は１）バチルス・オーベンシス・エスピー・ノブ・Ｃ−１
４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-1400 ）由来の
配列番号１のアミノ酸配列において、１８８番目のチロ
シンがアラニン、セリンまたはトリプトファンに改変さ
れたサイクロデキストリングルカノトランスフェラー
ゼ、２）バチルス・オーベンシス・エスピー・ノブ・Ｃ−１
４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-1400 ）のＤＮ
Ａにおける配列番号１の塩基配列を含む遺伝子におい
て、１７５６〜１７５８番目“ＴＡＴ”が“ＧＣＴ”、
“ＧＣＣ”、“ＧＣＡ”、ＧＣＧ”、“ＴＣＴ”、“Ｔ
ＣＣ”、ＴＣＡ”、“ＴＣＧ”、“ＡＧＴ”、“ＡＧ
Ｃ”または“ＴＧＧ”に改変されたサイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼ遺伝子、および３）前記２に記載の遺伝子を導入した形質転換微生物を
培養し、培養液からサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼを取得することを特徴とするサイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法を提
供したものである。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明者
らは、まずα−ＣＤ生産型の代表的酵素としてバチルス
・マセランス（Bacillus macerans）ＣＧＴａｓｅ、
β−ＣＤ生産型の代表的酵素としてバチルス・ステアロ
テルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）Ｃ
ＧＴａｓｅを用いて、バチルス・オーベンシス（Bacill
us ohbensis） C-1400 ＣＧＴａｓｅと比較した。

【００１３】バチルス・ステアロテルモフィルス（Baci
llus stearothermophilus）ＣＧＴａｓｅは、β−Ｃ
Ｄ生産型の代表的酵素として知られており、Ｘ線結晶解
析による立体構造が解明されている（Kubota,M., Mikam
i,B., Tsujisaka,Y., & Morita,Y.,: J.Biochem., 104,
12(1988) および久保田倫夫，松浦良樹，堺修造，勝部
幸輝：日本農芸化学大会講演要旨，65, 671(1991) 参
照）数少ないＣＧＴａｓｅのひとつである。その立体構
造における活性中心近傍には、生成するＣＤの種類の決
定に関与すると考えられる構造上の特徴が認められる。
特に、生成したＣＤの空洞部にはフェニルアラニン１９
１が存在すると推定され、この部位のアミノ酸残基が空
間的に大きいものになると、小さなＣＤの生成が困難に
なるものと考えられる。バチルス・ステアロテルモフィ
ルス（Bacillus stearothermophilus）ＣＧＴａｓｅの
フェニルアラニン１９１の相当部としては、バチルス・
マセランス（Bacillus macerans）ＣＧＴａｓｅでは
チロシン１９５、バチルス・オーベンシス（Bacillus
ohbensis） C-1400 ＣＧＴａｓｅではチロシン１８８
残基であることがわかった。そこで、バチルス・オーベ
ンシス（Bacillus ohbensis） C-1400 ＣＧＴａｓｅ
におけるチロシン１８８残基を、バチルス・ステアロテ
ルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）型のフ
ェニルアラニンより空間的に大きいトリプトファンの
他、ヒスチジン、アラニンおよびセリンへと置換した場
合の酵素特性を調べたところ、アラニンおよびセリン置
換体ではβ−ＣＤとγ−ＣＤがほぼ同率で生成し、また
トリプトファンへ置換したときはγ−ＣＤの生産量が対
糖収率で１５％になることが確認され、この知見に基づ
き本発明に至ったものである。

【００１４】本発明において用いる、アミノ酸あるいは
塩基の置換を起こさせる方法としては、目的とするアミ
ノ酸または塩基の置換を起こさせることができるもので
あれば如何なる方法を用いてもよい。高頻度で変異を起
こさせる方法の一つに部位特異的変異法が挙げられる。
これは、２本鎖ＤＮＡプラスミドに組み込んだ遺伝子を
鋳型として、目的変異部位に置換塩基を有するオリゴヌ
クレオチドを変異源として用いる方法(M.J.Zoller, M.S
mith, "Method in Enzymology", vol.100, R.Wu, L.Gro
ssmann, K.Moldave ed., P468, Academic Press (198
3)）で、Kunkel法(Kunkel,T.A. (1985) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA.,82, 488.) やGrapped duplex法(Karmer,
W. et al.(1984)Nucl. AcidsRes.,12, 9441) などいく
つかの改良法があるが、そのいずれを用いて改変を行な
ってもよい。

【００１５】また、アミノ酸の置換を起こさせる方法に
は、部位特異的変異法に限らず、ポリメラーゼチェーン
リアクション（ＰＣＲ）を用いる方法(Mullis,K., Falo
ona,F.,Scharf, S.,Saiki, R/.Horn,G., and Erlich,
H.,(1986) Cold Spring Harber Symp. 51:263) や、カ
セットミュータジェネシス法(J.H.Richards, Nature, 3
23, 187 (1986)) などがあり、これらの方法を用いるこ
とも可能である。

【００１６】本発明において用いる、変異の鋳型として
の野生型ＣＧＴａｓｅ遺伝子は、バチルス・オーベンシ
ス・エスピー・ノブ・Ｃ−１４００（Bacillus ohbensi
s sp. nov. C-1400 ）よりクローンしたＤＮＡ断片であ
る。クローニングは、公知の方法、例えば、特開平3-21
6191号に示された方法で行なうことができるが、その他
の方法を用いても構わない。このＤＮＡ断片中には、少
なくともプレプロ体部分を含む構造遺伝子がコードされ
ている部分が含まれていれば、そのＤＮＡの長さや両端
の制限酵素切断部位には特に制限はなく如何なるもので
あってもよい。また、実際に変異操作を行なう際には、
必ずしもＤＮＡ断片の全てを用いる必要はなく、変異を
行なう部分を含んだ一部のＤＮＡ断片のみを変異操作に
用い、その後他の部分と結合し、その後の操作に用いて
もよい。本発明における改変したＣＧＴａｓｅは、変異
を起こさせた遺伝子を微生物中に導入し、その微生物を
培地中に培養することにより生産させ、培養液からＣＧ
Ｔａｓｅを回収することによって取得できる。

【００１７】この際、用いるＤＮＡとしては、バチルス
・オーベンシス・エスピー・ノブ・Ｃ−１４００（Baci
llus ohbensis sp. nov. C-1400 ）由来の発現生産に関
与する部分を全て含んでいるＣＧＴａｓｅ遺伝子を用い
てもよいし、ＣＧＴａｓｅの構造遺伝子部分に別のプロ
モーター領域や、シグナル配列、ターミネーター領域等
を結合したＤＮＡ断片を用いることも可能である。この
際用いるプロモーター領域や、シグナル配列、ターミネ
ーター領域等は、遺伝子を導入する宿主菌中でＣＧＴａ
ｓｅを発現、生産することができればどのようなものを
用いてもよい。

【００１８】宿主菌としては、改変したＣＧＴａｓｅ遺
伝子を導入でき、発現・生産可能なものであればよい
が、生産した改変ＣＧＴａｓｅを菌体外に分泌すること
から、工業的生産にはバチルス属細菌を用いることが望
ましい。さらに、バチルス・スブチリス（Bacillus su
btilis）２０７−２１（Otozaki,K., et. al., J. Gen.
Appl. Microbial.,30,15(1984) ）あるいはその変異株
を用いると、より好適に実施できる。

【００１９】宿主菌の形質転換は通常の方法で可能であ
る。例えば、バチルス属細菌では、コンピーテントセル
法(J.Spizizen, Proc. Natl. Sci. USA,44, 1072 (195
8))、プロトプラスト法(Chang,S., S.N.Cohen, Molec.
Gen. Genet. 168, 111 (1979)) 等で実施できるが、こ
れらの方法に限られない。導入した変異ＣＧＴａｓｅ遺
伝子は、プラスミド等を用いて、染色体外に存在、複製
する方法で安定に維持させてもよいし、染色体中に組み
込む（インテグレーション）方法でもよい。染色体外に
存在、複製する方法の場合には、宿主菌中で複製可能な
ベクターを用いる。例えば、バチルス属細菌を宿主とし
て用いる場合、ｐＵＢ１１０、ｐＵＰ１１０、ｐＣ１９
４、ｐＥ１９４、ｐＴＰ５、ｐＳＤ３５０１など公知の
枯草菌用プラスミドや、上記の枯草菌プラスミドと大腸
菌プラスミドとのシャトルベクターなどを用いることが
できるが、宿主菌内で複製可能であれば、これに限られ
ない。

【００２０】一方、染色体中に組み込む方法では、ベク
ターを用いないか、あるいは宿主菌内で複製しないもの
を用いることが望ましく、例えば、大腸菌プラスミドｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ３９６、ｐＳＤ３１
６５、ｐＡＣＹＣ１８４、等を用いることができる。形
質転換株の選択は、導入遺伝子に結合した遺伝子マーカ
ーの発現等により行なうことができる。

【００２１】上記のようにして得た形質転換株を培養す
る培地としては特に制限はなく、該形質転換株が生育す
るものであればどのような培地でも用いることができ
る。培養液からのＣＧＴａｓｅの分離精製は、一般的な
蛋白質の分離精製法に従って行なうことができる。例え
ば、コーンスターチのようなデンプンを添加して吸着・
沈殿させてから緩衝液に酵素を溶出させることにより可
能であるが、これに限らず他の方法でも可能である。

【００２２】本発明においては、ＣＧＴａｓｅの活性は
以下に示すようにｂｌｕｅｖａｌｕｅ法により測定し
た。すなわち、可溶性デンプン（potato starch,シグマ
社製）を、５０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃−ＮａＨＣＯ₃緩衝
液（ｐＨ10.0）に、可溶性デンプン（potato starch,シ
グマ社製）が0.025 ％になるように溶かしたものを基質
溶液とした。基質溶液2.5 ｍｌに対して酵素溶液0.2 ｍ
ｌを加え、４０℃で１０分間反応させた後に、0.6 Ｎ
ＨＣｌ２ｍｌを加えて反応を停止させ、0.1 ％ＫＩ
−0.01％Ｉ₂１ｍｌを加え、６６０ｎｍでの吸光度を測
定した。酵素１単位は上記の条件下、６６０ｎｍでの吸
光度を1.0 減少させる量とした。

【００２３】

【実施例】以下に本発明について代表的な例を示し、さ
らに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示で
あり、本発明はこれらのみに限られるものではない。実施例１：改変ＣＧＴａｓｅ遺伝子の構築改変ＣＧＴａｓｅ遺伝子を図１(1) 〜(5) に示すように
構築した。

【００２４】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノブ
・Ｃ−１４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-1400
）からクローニングされた野生型ＣＧＴａｓｅの遺伝
子をＳｐｈＩとＨｉｎｄIII で部分消化することにより
約4.8 ＫｂのｐＵＣ１９ＣＧＴ５Ａ断片を切り出し、こ
れをプラスミドｐＵＰ１１０ＢＳＣｓａｃＱ（Uozumi,
T., et. al., Agric. Biol. Chem.,55(9),2367-2374(19
91)）と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ処理して
連結した。このプラスミドをｐＵＰ１１０Ｃｅ−ＣＧＴ
とした。さらに、ＣＧＴａｓｅ遺伝子の発現量を増加さ
せるために、バチルス・スブチリスセルラーゼ遺伝子
の発現量を上昇させることが知られているバチルス・ス
ブチリスｓａｃＱ遺伝子を、プラスミド上のＢａｍＨＩ
−ＳｐｈＩの間に組み込んだ。こうして得られたプラス
ミドをｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱとする。このＤ
ＮＡを用い、大腸菌ＭＶ１１８４に形質転換を行ない、
アンピシリンに耐性の形質転換体を選択した。この形質
転換体より、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出、精製
し、分析したところ、野生型プラスミドＤＮＡｐＵＰ１
１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱを保有していた。

【００２５】部位特異的変異は、以下のようにＫｕｎｋ
ｅｌ法に従って行なった。プラスミドｐＵＰ１１０Ｃｅ
ＣＧＴｓａｃＱを大腸菌ＣＪ２３６に形質転換し、プラ
スミドｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱをもつ大腸菌Ｃ
Ｊ２３６を得る。この大腸菌から、Messing らの方法(V
ieira,J. and Messing,J. (1987) Methodin Enzymolog
y, 153, 3)に従い１本鎖ＤＮＡを調整しＤＮＡ中のデオ
キシチアミン（ｄＴ）の一部がデオキシウラシル（ｄ
Ｕ）に置き代わった１本鎖ＤＮＡを得る。配列番号２〜
６に示したオリゴヌクレオチドを各々化学合成し、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端をリン酸化す
る。

【００２６】このオリゴヌクレオチドを用いて上記の１
本鎖ＤＮＡをアニーリングバッファー（２００ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ 8.0，１００ｍＭＭｇＣｌ₂，
５００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＤＴＴ）中で混合
し、６５℃で１５分間静置後、さらに３７℃で１５分間
静置し、オリゴヌクレオチドを変異の目的部位にアニー
リングさせた。次に、このＤＮＡ混合液に 2.5倍量のエ
クステンションバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ 8.0，６０ｍＭ酢酸アンモニウム，５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂，５ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＮＡＤ， 0.5ｍ
ＭｄＮＴＰ（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ））を加え、さらにＥ．
ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
加えて２５℃で２時間静置して相補鎖の合成を行なっ
た。その後、このＤＮＡを大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍ
ｕｔＳに常法に従い形質転換しアンピシリン耐性の形質
転換株を選択した。得られた形質転換株のいくつかか
ら、常法に従い１本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒら
によるジデオキシ法により塩基配列を決定し、チロシン
１８８をコードする遺伝子の塩基である“ＴＡＴ”が
“ＴＧＧ”、“ＧＣＴ”、“ＴＣＴ”、“ＴＴＴ”およ
び“ＣＡＴ”に改変されているプラスミドＤＮＡｐＵＰ
１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｗ、ｐＵＰ１１０
ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ａ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣ
ＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｓ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓ
ａｃＱ−Ｙ１８８ＦおよびｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａ
ｃＱ−Ｙ１８８Ｈを取得した。

【００２７】実施例２：バチルス・スブチリス（Bacill
us subtilis）２０７−２１による改変ＣＧＴａｓｅの
生産実施例１で得られた野生型プラスミドＤＮＡｐＵＰ１１
０ＣｅＣＧＴｓａｃＱおよび改変プラスミドＤＮＡｐＵ
Ｐ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｗ、ｐＵＰ１１
０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ａ、ｐＵＰ１１０Ｃｅ
ＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｓ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴ
ｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｆ、およびｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴ
ｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｈを用い、バチルス・スブチリス
（Bacillussubtilis）２０７−２１をプロトプラスト法
により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転換体を選
択した。これらの形質転換体より、常法によりプラスミ
ドＤＮＡを抽出、精製し、分析したところ、いずれも、
野生型プラスミドＤＮＡｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃ
Ｑおよび改変プラスミドＤＮＡｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴ
ｓａｃＱ−Ｙ１８８Ｗ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃ
Ｑ−Ｙ１８８Ａ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ
１８８Ｓ、ｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８
Ｆ、およびｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓａｃＱ−Ｙ１８８
Ｈを保有していた。該形質転換株を、終濃度で１０μｇ
／ｍｌのカナマイシンを含有するＬ−ｂｒｏｔｈ１０ｍ
ｌ中で３７℃、３６時間振盪培養し、培地中に改変酵素
を生産させた。この培養液を、４℃、15000rpmで遠心分
離し、菌体を除去して、上清をとり、粗酵素液を調製し
た。なお、プラスミドＤＮＡｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴｓ
ａｃＱ−Ｙ１８８Ｗを組入れた微生物であるバチルス・
スブチリス（Bacillus subtilis）２０７−２１（ｐＵ
Ｐ１１０ＣｅＣＧＴａｓｅｓａｃＱ（Ｙ１８８Ｗ））は
微生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第12720 号
（ＦＥＲＭＰ−12720 ）で1992年１月２２日に寄託さ
れている。

【００２８】実施例３：改変ＣＧＴａｓｅの精製実施例２により得られた各種粗酵素液に対して、デンプ
ンを２％になるように加え、４℃で１時間撹拌して酵素
を吸着させた。遠心分離（４℃、7000rpm ）にデンプン
を集め、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ 6.8）
で洗浄後、同じ緩衝液に懸濁し、４０℃で２時間撹拌す
ることにより酵素を溶出させた。遠心分離によりデンプ
ンを除去し、その上清を精製酵素標品とした。必要によ
りセントリプレップ−３０（アミコン社製）を用いて限
外ろ過を行ない、酵素溶液の濃縮を行なう。なお、精製
過程はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。

【００２９】実施例４：改変ＣＧＴａｓｅの酵素特性実施例３により得られた酵素液を用いて、各変異酵素の
特性を野生型酵素と比較することによって調べた。（１）分子量の測定実施例３で得られた各種変異酵素の分子量をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより調べ、野生型のＣＧＴａｓｅと比較したと
ころ、分子量はすべて約80,000ダルトンであることがわ
かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるゲル上のバンドの様子
を図２に示す。

【００３０】（２）至適ｐＨの測定可溶性デンプンを基質として、４０℃で１０分間反応さ
せ、各種変異酵素のｐＨによる活性を調べた。最大活性
に対する相対活性の測定結果を図３に示す。野生型ＣＧ
ＴａｓｅがｐＨ5.0 とｐＨ10.0の２つの活性領域を有す
るのに対して、アラニン、ヒスチジン、セリン置換体変
異ＣＧＴａｓｅでは、その至適ｐＨがｐＨ6.0 付近に変
化していた。

【００３１】（３）酵素反応生産物の分析デンプンを基質として、各種変異酵素の加水分解能を経
時的に調べた。生産物であるＣＤの分析はＨＰＬＣによ
り行なった。１００ｍＭＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液
（ｐＨ6.0 ）に可溶性デンプンが６％になるように溶か
した基質溶液2.5 ｍｌに対して、１５単位の酵素溶液を
各々0.5 ｍｌ加え、５０℃で１〜２４時間反応させた後
に、１０分間の煮沸で酵素反応を停止し、分析に用い
た。ＮＨ₂−1251−Ｎ（4.6 ×２５０ｍｍ、センシュー
科学社製）カラムに反応液２０μｌを添加し、６５％ア
セトニトリルを用いて、1.5 ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出
させ、屈折率検出機（ＥＲＣ−7510、ＥｒｍａＯｐｔ
ｉｃａｌＷｏｒｋｓ社製）で生産物であるＣＤを検出
した。

【００３２】各変異酵素の反応生産物の経時的変化を図
４に示す。図４からもわかるように、野生型ＣＧＴａｓ
ｅにおけるチロシン１８８置換体変異酵素において、ア
ラニン、セリンおよびトリプトファン置換体変異酵素
は、野生型ＣＧＴａｓｅと比べてβ−ＣＤに対するγ−
ＣＤの相対生産量が増大していることがわかる。特に、
アラニン、セリン置換体変異酵素ではβ−ＣＤとγ−Ｃ
Ｄがほぼ同率で生成された。また、トリプトファン置換
体変異酵素はγ−ＣＤの生産量が対糖収率で１５％に達
した。

【００３３】

【発明の効果】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノ
ブ・Ｃ−１４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-140
0 ）由来の配列番号１のアミノ酸配列において、１８８
番目のチロシンを他のアミノ酸に置換することにより、
産生される酵素の性質や、その酵素と基質とも相互作用
に大きな影響を及ぼし、チロシン１８８残基をより空間
的に大きな他のアミノ酸であるトリプトファンの他、ア
ラニン、セリンに置換した場合、その置換変異ＣＧＴａ
ｓｅのデンプンから生産するＣＤは、野生型ＣＧＴａｓ
ｅと比べてβ−ＣＤに対するγ−ＣＤの相対生産量が増
大する。アラニン、セリン置換体変異酵素ではβ−ＣＤ
とγ−ＣＤがほぼ同率で生成され、トリプトファン置換
体変異酵素はγ−ＣＤの生産量が対糖収率で１５％に達
したことから、公知である分野への応用に限らず、従来
困難であったγ−ＣＤの大量生産に利用できる。

【００３４】

【配列表】

【００３５】配列番号：１配列の長さ：４７８５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源：バチルス・オーベンシス・エスピー・ノブ・C-14
00（Bacillus ohbensissp. nov. C-1400 ）配列の特徴特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1195．．3219 特徴を決定した方法：Ｓ配列 GAGCTCGCCG CCTTCGTAAG CGCCTTCATT ATTTAAACCA ACATCCTCCG TATCATATTC 60 CCCTACATCA CCGCCAAAAA TATAGGCACC GTAATTTTTG AGGAAAGGAA AAGCAAAATA 120 GAGATCATTA GGTCTCATCA GAAATCCATA TTGATCAGCT GATGCATCCG TATTTTCTTC 180 AAGAATCGTT CTTAAATCTT CGATCGTCTC TGGTGCTTCT GGTACAATTT CTTTATTGTA 240 GAATATTCCA TATGTTTCGA TAACAGCTGG AACTCCATAA ATATCCGTTT CTCCTTCGAA 300 CTCATAGGTG ACCGCATCTA TAGAGGAACT AGCATAATTG CTTAACTCGT CATCTGATAG 360 AGTAAGAGGA TCAGCTAATC CTTGTGCCAC AATATTTCCG ATCTGGTCAT GTGGCTGGAA 420 AAATAAATCG GGACCATTCC CTTCTGGACC TGCTAATGAC AATTCCTGCA ATTGGTCCAT 480 CATCGGCTTT GTCTCAACCT TCACGTTAAT TCCCGTTTGC TCTGTATAAT CGTTGCTATT 540 TTTTCAATCG CCTCTAATTG CTCTTCTCTA TCATTTGCCC AGATGGGTTA ATTCTTCAGG 600 TTGATCCGCT TCCCCACCAT TTGTATCCGT GGTTACTGCC TCTTCTTCCC GTTCAGGTGC 660 ACATGCCGCT AAGAGAATAA TCATTAAAAA CATGGTAATC AGTGATAATA ATGAAAAACC 720 TTTTTTCATT TCATTTCCCC CCTGAAAAAA TTATATTAAT CTAGTAAATG TTGAGCTACC 780 TTTACATAAA GGAAAGTAAC GCAAACGTTT GCACTAGATT AGATACAACA ATCATACATG 840 GCAATTCAAT TTTTTGCAAT CGTTTACAGT AAAGAATTTT TTGAATTTTT ATTTAGTTAC 900 AATTACCTAT TTACAAATGA AATGTCTATG AGATAAAAAT AAATTAACAA CTATGAATGT 960 TCATATTCTC AATACGAGGG CAATGCTTTT GTTTTTTACA AACAACCCCG TCTTTTATTC 1020 CATTAAAAGG CGGGGTTATT TTATTGGATA AGGAGGGTTG TATTGCTTGT TCATACGATT 1080 CATTTTTAAT GTATAGGGGG AGTATTT TTG AAA AAT TTA ACG GTT TTA TTG AAA 1134 Met Lys Asn Leu Thr Val Leu Leu Lys -25 ACG ATT CCA TTA GCT CTG TTA CTT TTC ATC CTT CTT TCT TTA CCA ACA 1182 Thr Ile Pro Leu Ala Leu Leu Leu Phe Ile Leu Leu Ser Leu Pro Thr -20 -15 -10 -5 GCG GCT CAG GCT GAC GTT ACA AAT AAG GTT AAT TAT ACA AGA GAT GTT 1230 Ala Ala Gln Ala Asp Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Thr Arg Asp Val 1 5 10 ATT TAT CAA ATT GTG ACC GAC CGT TTT TCT GAT GGA GAT CCA TCC AAC 1278 Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asp Pro Ser Asn 15 20 25 AAC CCA ACG GGG GCG ATT TAT AGT CAG GAT TGT AGC GAC CTT CAT AAA 1326 Asn Pro Thr Gly Ala Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Ser Asp Leu His Lys 30 35 40 TAT TGT GGG GGC GAC TGG CAA GGA ATT ATC GAC AAA ATC AAT GAC GGG 1374 Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly 45 50 55 60 TAT TTA ACC GAT TTA GGA ATT ACA GCG ATT TGG ATT TCA CAG CCT GTA 1422 Tyr Leu Thr Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 GAA AAT GTC TAT GCT CTT CAT CCG AGT GGT TAT ACC TCT TAT CAC GGG 1470 Glu Asn Val Tyr Ala Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly 80 85 90 TAT TGG GCA AGA GAT TAT AAA AGA ACG AAC CCT TTT TAT GGC GAT TTC 1518 Tyr Trp Ala Arg Asp Tyr Lys Arg Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asp Phe 95 100 105 TCT GAC TTT GAC CGG TTA ATG GAT ACT GCA CAT AGT AAT GGC ATT AAG 1566 Ser Asp Phe Asp Arg Leu Met Asp Thr Ala His Ser Asn Gly Ile Lys 110 115 120 GTA ATC ATG GAC TTT ACG CCC AAC CAT TCA TCA CCA GCT CTT GAA ACC 1614 Val Ile Met Asp Phe Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr 125 130 135 140 GAT CCA AGC TAT GCC GAG AAC GGA GCG GTT TAT AAT GAT GGC GTA TTA 1662 Asp Pro Ser Tyr Ala Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly Val Leu 145 150 155 ATA GGC AAT TAT TCT AAC GAC CCT AAC AAC CTC TTT CAC CAT AAT GGT 1710 Ile Gly Asn Tyr Ser Asn Asp Pro Asn Asn Leu Phe His His Asn Gly 160 165 170 GGG ACA GAT TTT TCA TCC TAT GAA GAT AGC ATT TAT CGA AAT CTA TAT 1758 Gly Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr 175 180 185 GAT TTA GCC GAC TAT GAT TTA AAC AAT ACT GTA ATG GAC CAA TAT TTA 1806 Asp Leu Ala Asp Tyr Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr Leu 190 195 200 AAA GAA AGT ATA AAG CTT TGG TTA GAT AAA GGA ATT GAT GGG ATT CGA 1854 Lys Glu Ser Ile Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg 205 210 215 220 GTC GAT GCG GTC AAA CAT ATG TCC GAG GGC TGG CAA ACC TCC TTA ATG 1902 Val Asp Ala Val Lys His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu Met 225 230 235 AGT GAT ATT TAT GCA CAC GAG CCT GTC TTT ACA TTT GGC GAA TGG TTT 1950 Ser Asp Ile Tyr Ala His Glu Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe 240 245 250 TTA GGA TCA GGG GAA GTC GAC CCA CAA AAT CAT CAC TTT GCC AAT GAA 1998 Leu Gly Ser Gly Glu Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn Glu 255 260 265 AGT GGT ATG AGC TTA CTA GAC TTT CAG TTT GGT CAA ACG ATT AGA GAT 2046 Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg Asp 270 275 280 GTA TTA ATG GAC GGT AGC AGC AAT TGG TAT GAC TTT AAT GAG ATG ATT 2094 Val Leu Met Asp Gly Ser Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met Ile 285 290 295 300 GCA AGC ACC GAA GAG GAT TAT GAC GAA GTG ATT GAT CAG GTT ACG TTT 2142 Ala Ser Thr Glu Glu Asp Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe 305 310 315 ATT GAT AAT CAT GAC ATG AGC CGT TTT TCC TTT GAA CAA TCT TCA AAC 2190 Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Ser Phe Glu Gln Ser Ser Asn 320 325 330 CGC CAT ACA GAC ATT GCT TTA GCT GTC CTG TTA ACC TCT CGT GGA GTT 2238 Arg His Thr Asp Ile Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val 335 340 345 CCG ACT ATA TAT TAC GGT ACA GAG CAA TAT TTA ACA GGA GGC AAC GAC 2286 Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Gly Asn Asp 350 355 360 CCT GAA AAC CGC AAG CCG ATG AGC GAT TTT GAC CGT ACG ACA AAT TCT 2334 Pro Glu Asn Arg Lys Pro Met Ser Asp Phe Asp Arg Thr Thr Asn Ser 365 370 375 380 TAT CAA ATT ATT AGT ACG CTT GCT TCC TTA AGA CAA AAC AAC CCG GCA 2382 Tyr Gln Ile Ile Ser Thr Leu Ala Ser Leu Arg Gln Asn Asn Pro Ala 385 390 395 TTA GGC TAT GGA AAT ACA AGC GAA CGA TGG ATT AAC TCC GAC GTT TAT 2430 Leu Gly Tyr Gly Asn Thr Ser Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val Tyr 400 405 410 ATT TAT GAA CGA TCC TTC GGA GAC AGT GTC GTG CTT ACT GCT GTT AAC 2478 Ile Tyr Glu Arg Ser Phe Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Ala Val Asn 415 420 425 AGT GGC GAT ACT AGT TAC ACG ATT AAT AAC TTA AAT ACC TCG TTA CCT 2526 Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Asn Thr Ser Leu Pro 430 435 440 CAA GGT CAA TAT ACA GAT GAG CTT CAG CAG CTT TTG GAT GGA AAT GAG 2574 Gln Gly Gln Tyr Thr Asp Glu Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gly Asn Glu 445 450 455 460 ATT ACA GTC AAT AGC AAT GGA GCT GTA GAC TCG TTC CAG CTA AGT GCA 2622 Ile Thr Val Asn Ser Asn Gly Ala Val Asp Ser Phe Gln Leu Ser Ala 465 470 475 AAT GGA GTA TCC GTG TGG CAA ATA ACC GAA GAG CAT GCT TCT CCT CTA 2670 Asn Gly Val Ser Val Trp Gln Ile Thr Glu Glu His Ala Ser Pro Leu 480 485 490 ATC GGC CAT GTA GGA CCA ATG ATG GGT AAA CAC GGA AAT ACT GTC ACT 2718 Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Lys His Gly Asn Thr Val Thr 495 500 505 ATA ACG GGA GAA GGC TTT GGT GAC AAT GAG GGA AGT GTT CTC TTT GAT 2766 Ile Thr Gly Glu Gly Phe Gly Asp Asn Glu Gly Ser Val Leu Phe Asp 510 515 520 TCT GAT TTC TCT GAT GTC CTT TCT TGG TCT GAC ACG AAA ATA GAA GTA 2814 Ser Asp Phe Ser Asp Val Leu Ser Trp Ser Asp Thr Lys Ile Glu Val 525 530 535 540 AGC GTT CCG GAT GTA ACA GCT GGT CAC TAT GAT ATT AGC GTT GTA AAT 2862 Ser Val Pro Asp Val Thr Ala Gly His Tyr Asp Ile Ser Val Val Asn 545 550 555 GCT GGA GAC AGC CAA AGT CCA ACG TAT GAT AAG TTT GAA GTA TTA ACC 2910 Ala Gly Asp Ser Gln Ser Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Glu Val Leu Thr 560 565 570 GGT GAC CAA GTT AGT ATC CGT TTT GCT GTT AAT AAT GCG ACC ACT AGC 2958 Gly Asp Gln Val Ser Ile Arg Phe Ala Val Asn Asn Ala Thr Thr Ser 575 580 585 CTT GGT ACC AAT CTG TAT ATG GTT GGA AAT GTG AAT GAG CTT GGA AAT 3006 Leu Gly Thr Asn Leu Tyr Met Val Gly Asn Val Asn Glu Leu Gly Asn 590 595 600 TGG GAC CCT GAT CAA GCG ATT GGG CCG ATG TTT AAT CAA GTG ATG TAT 3054 Trp Asp Pro Asp Gln Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met Tyr 605 610 615 620 CAA TAC CCA ACC TGG TAC TAT GAT ATA AGT GTT CCT GCC GAG GAA AAT 3102 Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu Asn 625 630 635 CTT GAA TAT AAA TTT ATT AAA AAG GAC AGC AGC GGA AAC GTC GTT TGG 3150 Leu Glu Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Val Val Trp 640 645 650 GAA AGT GGA AAT AAC CAT ACG TAT ACA ACA CCT GCA ACT GGA ACC GAT 3198 Glu Ser Gly Asn Asn His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala Thr Gly Thr Asp 655 660 665 ACA GTC CTC GTC GAC TGG CAA TAACACAAAA TACACATCAA CTTAAGGGCT 3249 Thr Val Leu Val Asp Trp Gln 670 675 ATGCATTGTG ATCATACACA ACAACCCCAT TTTCCAAGAT TGGAAATAGG GGTTGTTTTA 3309 TAATGAAAGG GGAATTTTCC TATGTTAAAA GAAGCGATTT ATCACCGACC AAAAAATAAT 3369 TATGCGTACG CCTATTCAAA GGATACGCTA CACATTCGTC TACGCACCAA AAAGAATGAT 3429 CTCACGCAAG TCGAGCTTCT CTATGCTGAT CCTTACAATT GGAATGAAGA TGGTTGGCTC 3489 TATGAGCAAA AAGCGATGCG TTTAGAGGCT TCTGACCACT TATTTGACTA TTGGATGATT 3549 GATGTTACCG TCCCATACCG TCGACTCCGC TATGGCTTTA AGCTTACAAG TGATGATGAA 3609 ACGTTATATT ATACGGAAAA AGGCTTTTAT GAAACAGCAC CTACCGATGA TACGGCTTAC 3669 TATTTTTGTT TTCCCTTTAT CAATCCTGTT GATATCTTTC AAGCTCCTGA ATGGGTCAAA 3729 AAGACCGTTT GGTATCAAAT CTTCCCGGAG CGTTTTGCCA ATGGTGACTC GAGCATTAAT 3789 CCAGCCTCAA CCCTCCCTTG GGGAAGTACA GAAGCTACAC CAACTAATTT TTTCGGTGGA 3849 GATTTCGAGG GAATACTTAA TCATTTAGAT TATTTAGTTG ATTAGGCATT AATGGCATTT 3909 ACTTTACTCG ATTTTTAAAG CTAAATCAAA CCATAAGTAC GATACGATTG ATTATATGGA 3969 AATGATCCAC AGTTTGGAGA TAAAGAAACC TTCCGGAAGC TCGTTAATGC CTGTCATGAA 4029 AAAGGGATAA AAATCATGCT TGATGCTGTA TTTAATCATA GTGGCTATTA TTTCGAAGCG 4089 TTTCAGGATG TCCTGAAGCA TCAGGAGCAA TCGAAGTATA AAGATTGGTT TCATATACGC 4149 GACTTTCCAG TCACTCCTGG TCCTAAGCCT AATTATGATA CATTTGGGTT TGTTGAATAT 4209 ATGCCGAAGT TAAATACGGA AAACCAAGAG GTGAAGGATT ATTTATTAAA AGTGGCGCGC 4269 TACTGGATCG AGGAATTTAA TATCGATGGC TGGCGTCTTG ATGTCGCCAA TGAAGTCGAC 4329 CATCAATTTT GGAGAGATTT TAGAAGAGAA GTAAAAGCGA TTAACCCCGA TGTTTATATC 4389 TTAGGTGAGA TATGGCATGA CTCGATGCCG TGGCTGCAGG GCGATCAGTT CGATGCCGTC 4449 ATGAATTATC CTTTTACGGT AGCGGCTCTC GATTATATTG CGAAGGATAA GATTAATGCC 4509 GAAGAGTTTG CTCATCAGCT GACCGATGTT CTTTGCTCGT ATCCAGCCAA TATTCATGAA 4569 GTGACCTTTA ACCTGCTTGG CAGTCATGAC ACTGCACGAG TCCTGACCGT ATGTAAGGAC 4629 AACAAAGAAA AAACGAAGCT ACTTTATTTA CTATTGTTAT CATCTAAAGG AAGTCCTTGC 4689 ATTTTTTATG GCGAGGAAAT CGGCATGGCC GGTGAAAACG ATCCAGGCTG CAGAGACTGC 4749 ATGATTTGGG AGGAAGACCA ACAAGACCTC GAATTC 4785

【００３６】配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCGAAATCTA TGGGATTTAG CCGA 24

【００３７】配列番号：３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATCGAAATCT AGCTGATTTA GCCG 24

【００３８】配列番号：４配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAAATCTATC TGATTTAGC 19

【００３９】配列番号：５配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAAATCTATT TGATTTAGC 19

【００４０】配列番号：６配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGAAATCTAC ATGATTTAG 19

【図面の簡単な説明】

【図１】(1) 〜(5) は本発明の改変ＣＧＴａｓｅ遺伝子
の構築を示す。

【図２】野生型ＣＧＴａｓｅおよび各種チロシン１８８
変異ＣＧＴａｓｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるゲル上の
バンドを示す図である。

【図３】野生型ＣＧＴａｓｅおよび各種チロシン１８８
変異ＣＧＴａｓｅのｐＨによる相対活性の変化を示すグ
ラフである。

【図４】野生型ＣＧＴａｓｅおよび各種チロシン１８８
変異ＣＧＴａｓｅにおける、デンプンを基質とした場合
の反応生成物であるＣＤの経時的変化を示すグラフであ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年３月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノ
ブ・Ｃ−１４００（Ｂａｃｉｌｌｕｓｏｈｂｅｎｓｉ
ｓｓｐ．ｎｏｖ．Ｃ−１４００）からクローニングさ
れた野生型ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持するｐＵＣ１９Ｃ
ＧＴ５Ａ（Ｓｉｎ，Ｋ．−Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３
５，６００−６０５（１９９１））をＳｐｈＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで部分消化することにより約２．５ＫｂのＤＮ
Ａ断片を切り出し、これをプラスミドｐＵＰ１１０ＢＳ
ＣｓａｃＱ（ＮａｋａｍｕｒａＡ．ｅｔ．ａｌ．，Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（９），２３６
７−２３７４（１９９１）のＳｐｈＩ・ＨｉｎｄＩＩＩ
消化物と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ処理して
連結した。このプラスミドをｐＵＰ１１０Ｃｅ−ＣＧＴ
とした。さらに、ＣＧＴａｓｅ遺伝子の発現量を増加さ
せるために、バチルス・スブチリスセルラーゼ遺伝子
の発現量を上昇させることが知られているｓａｃＱ遺伝
子を、プラスミド上のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩの間に
組み込んだ。こうして得られたプラスミドをｐＵＰ１１
０ＣｅＣＧＴｓａｃＱとする。このＤＮＡを用い、バチ
ルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）２０７−２１の形質転換を行ない、カナマイシンに
耐性の形質転換体を選択した。この形質転換体より、常
法によりプラスミドＤＮＡを抽出、精製し、分析したと
ころ、野生型プラスミドＤＮＡｐＵＰ１１０ＣｅＣＧＴ
ｓａｃＱを保有していた。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】実施例３：改変ＣＧＴａｓｅの精製実施例２により得られた各種粗酵素液に対して、デンプ
ンを２％になるように加え、４℃で１時間撹拌して酵素
を吸着させた。遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ）によ
りデンプンを集め、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）で洗浄後、同じ緩衝液に懸濁し、４０
℃で２時間撹拌することにより酵素を溶出させた。遠心
分離によりデンプンを除去し、その上清を精製酵素標品
とした。必要によりセントリプレップ−３０（アミコン
社製）を用いて限外ろ過を行ない、酵素溶液の濃縮を行
なう。なお、精製過程はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し
た。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】

【発明の効果】バチルス・オーベンシス・エスピー・
ノブ・Ｃ−１４００（Ｂａｃｉｌｌｕｓｏｈｂｅｎｓ
ｉｓｓｐ．ｎｏｖ．Ｃ−１４００）由来の配列番号１
のアミノ酸配列において、１８８番目のチロシンを他の
アミノ酸に置換することにより、産生される酵素の性質
や、その酵素と基質との相互作用に大きな影響を及ぼ
し、チロシン１８８残基をより空間的に大きな他のアミ
ノ酸であるトリプトファンの他、アラニン、セリンに置
換した場合、その置換変異ＣＧＴａｓｅのデンプンから
生産するＣＤは、野生型ＣＧＴａｓｅと比べてβ−ＣＤ
に対するγ−ＣＤの相対生産量が増大する。アラニン、
セリン置換体変異酵素ではβ−ＣＤとγ−ＣＤがほぼ同
率で生成され、トリプトファン置換体変異酵素はγ−Ｃ
Ｄの生産量が対糖収率で１５％に達したことから、公知
である分野への応用に限らず、従来困難であったγ−Ｃ
Ｄの大量生産に利用できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノ
ブ・Ｃ−１４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-140
0 ）由来の配列番号１のアミノ酸配列において、１８８
番目のチロシンがアラニン、セリンまたはトリプトファ
ンに改変されたサイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼ。
【請求項２】バチルス・オーベンシス・エスピー・ノ
ブ・Ｃ−１４００（Bacillus ohbensis sp. nov. C-140
0 ）のＤＮＡにおける配列番号１の塩基配列を含む遺伝
子において、１７５６〜１７５８番目の“ＴＡＴ”が
“ＧＣＴ”、“ＧＣＣ”、“ＧＣＡ”、ＧＣＧ”、“Ｔ
ＣＴ”、“ＴＣＣ”、ＴＣＡ”、“ＴＣＧ”、“ＡＧ
Ｔ”、“ＡＧＣ”または“ＴＧＧ”に改変されたサイク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼ遺伝子。
【請求項３】請求項２に記載の遺伝子を導入した形質
転換微生物を培養し、培養液からサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを取得することを特徴とす
るサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの
製造方法。