JPH0522508B2 - - Google Patents
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- JPH0522508B2 JPH0522508B2 JP61233285A JP23328586A JPH0522508B2 JP H0522508 B2 JPH0522508 B2 JP H0522508B2 JP 61233285 A JP61233285 A JP 61233285A JP 23328586 A JP23328586 A JP 23328586A JP H0522508 B2 JPH0522508 B2 JP H0522508B2
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- strain
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明の産業上の利用分野
本発明は所望の蛋白を高効率で分泌生産させる
ことが出来る枯草菌菌株及びその枯草菌菌株を用
いて蛋白を高効率で分泌生産させる技術に関す
る。
ことが出来る枯草菌菌株及びその枯草菌菌株を用
いて蛋白を高効率で分泌生産させる技術に関す
る。
本発明は更に特に菌体外プロテアーゼ活性を低
下させた枯草菌にバチルス属由来のプロテアーゼ
産生促進遺伝子を導入して得られる蛋白分解活性
が親株と比しさらに低下した宿主菌株と、プロテ
アーゼ遺伝子またはそれに由来するDNA塩基配
列に所望の蛋白の遺伝子を結合して横築した組換
えDNAを組み合わせることにより所望の蛋白を
高効率で分泌生産させる方法に関するものであ
る。
下させた枯草菌にバチルス属由来のプロテアーゼ
産生促進遺伝子を導入して得られる蛋白分解活性
が親株と比しさらに低下した宿主菌株と、プロテ
アーゼ遺伝子またはそれに由来するDNA塩基配
列に所望の蛋白の遺伝子を結合して横築した組換
えDNAを組み合わせることにより所望の蛋白を
高効率で分泌生産させる方法に関するものであ
る。
従来の技術とこの発明が解決しようとする問題点
近年組換えDNA技術により微生物を宿主とし
て異種遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物
を生産することが可能となつた。
て異種遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物
を生産することが可能となつた。
宿主菌としては通常、大腸菌、枯草菌等の細菌
あるいは酵母などが一般的に用いられている。
あるいは酵母などが一般的に用いられている。
近来、物質生産の観点から異種蛋白を培養液上
清中に分泌生産させる試みが広く検討されている
が、この場合の宿主微生物としては元来プロテア
ーゼ、アミラーゼ等を菌体外に多量に分泌生産す
る性質を有するバチルス属細菌が好ましいと考え
られている。
清中に分泌生産させる試みが広く検討されている
が、この場合の宿主微生物としては元来プロテア
ーゼ、アミラーゼ等を菌体外に多量に分泌生産す
る性質を有するバチルス属細菌が好ましいと考え
られている。
特にバチルス属細菌のなかでも枯草菌は、遺伝
学的・生化学的、分子生物学的・応用微生物学的
知見が多く得られておりかつ安全性も高いため注
目を集め、これにより異種蛋白の菌体外分泌のた
めの宿主−組換えDNA系をつくる努力がなされ
ている。
学的・生化学的、分子生物学的・応用微生物学的
知見が多く得られておりかつ安全性も高いため注
目を集め、これにより異種蛋白の菌体外分泌のた
めの宿主−組換えDNA系をつくる努力がなされ
ている。
しかしながら枯草菌を宿主として異種蛋白を分
泌する試みは、、異種蛋白が特に高等真核生物由
来のものである場合その分泌量は極めて少ないた
め未だ産業的実施の見地からは充分なものとなつ
ていない。
泌する試みは、、異種蛋白が特に高等真核生物由
来のものである場合その分泌量は極めて少ないた
め未だ産業的実施の見地からは充分なものとなつ
ていない。
この原因は、枯草菌宿主中で真核生物由来の異
種蛋白をコードする遺伝子からのメツセンジヤー
RNA合成量は充分多いにも拘らず、メツセンジ
ヤーRNAを翻訳することで出来る蛋白の分泌量
が少ないことから真核生物由来の異種蛋白は細胞
内あるいは分泌時に宿主枯草菌により分解される
ことによるとされている（参考文献１）。
種蛋白をコードする遺伝子からのメツセンジヤー
RNA合成量は充分多いにも拘らず、メツセンジ
ヤーRNAを翻訳することで出来る蛋白の分泌量
が少ないことから真核生物由来の異種蛋白は細胞
内あるいは分泌時に宿主枯草菌により分解される
ことによるとされている（参考文献１）。
従来の知見からは、枯草菌宿主菌株としては異
種蛋白の分解防止のために菌体外プロテアーゼ活
性を低下させた株が望ましいと考えられるが、そ
のようにしてもこれまでに報告されている実験結
果からは未だ充分な量の高等真核生物由来の異種
蛋白を分泌することが出来る枯草菌菌株は知られ
ていない。
種蛋白の分解防止のために菌体外プロテアーゼ活
性を低下させた株が望ましいと考えられるが、そ
のようにしてもこれまでに報告されている実験結
果からは未だ充分な量の高等真核生物由来の異種
蛋白を分泌することが出来る枯草菌菌株は知られ
ていない。
例えばパルヴアらは、菌体外プロテアーゼ活性
を低下させた枯草菌宿主を造成し、α−アミラー
ゼの分泌ジグナルをコードする塩基配列のうしろ
にヒトインターフエロン−α遺伝子を結合した組
換えDNAを該宿主に導入し、その結果得られた
形質転換株を用いた研究で、インターフエロンを
培地１当たり105単位分泌している。
を低下させた枯草菌宿主を造成し、α−アミラー
ゼの分泌ジグナルをコードする塩基配列のうしろ
にヒトインターフエロン−α遺伝子を結合した組
換えDNAを該宿主に導入し、その結果得られた
形質転換株を用いた研究で、インターフエロンを
培地１当たり105単位分泌している。
この値はインターフエロン−αが培地１当た
り１mg程度分泌されたことを示すが、α−アミラ
ーゼ自身の分泌量に比べると低い値となつている
のである（参考文献２）。
り１mg程度分泌されたことを示すが、α−アミラ
ーゼ自身の分泌量に比べると低い値となつている
のである（参考文献２）。
またカワムラおよびドイによつて中性プロテア
ーゼおよびアルカリ性両菌体外プロテアーゼ活性
を低下させた枯草菌DB104株の造成が封告され
ている（参考文献３）。
ーゼおよびアルカリ性両菌体外プロテアーゼ活性
を低下させた枯草菌DB104株の造成が封告され
ている（参考文献３）。
一方本発明者らは、中性・アルカリ性両菌体外
プロテアーゼ活性を低下させた菌株を宿主として
ヒトインターフエロン−β、ヒト成長ホルモンを
枯草菌系で分泌生産した結果では、該株を用いて
いるにもかかわらずそれらの分泌量は期待する程
多くなくそれぞれ培地１当たり10mg、30−50mg
であり、しかも培養時間の経過に伴い生産された
異種蛋白が急速に分解してしまうことを認めてい
る（参考文献４）。
プロテアーゼ活性を低下させた菌株を宿主として
ヒトインターフエロン−β、ヒト成長ホルモンを
枯草菌系で分泌生産した結果では、該株を用いて
いるにもかかわらずそれらの分泌量は期待する程
多くなくそれぞれ培地１当たり10mg、30−50mg
であり、しかも培養時間の経過に伴い生産された
異種蛋白が急速に分解してしまうことを認めてい
る（参考文献４）。
このように単に菌体外アルカリ性、中性両プロ
テアーゼ活性円を低下させた枯草菌を異種蛋白分
泌用宿主としただけでは所望する高等真核生物由
来の異種蛋白の充分な蓄積をなし得ないものであ
る。
テアーゼ活性円を低下させた枯草菌を異種蛋白分
泌用宿主としただけでは所望する高等真核生物由
来の異種蛋白の充分な蓄積をなし得ないものであ
る。
発明の構成
この点に鑑み本発明者らは検討を重ねた結課、
既に本発明者らによりプロテアーゼ産生促進遺伝
子（参考文献５）として単離された遺伝子を、菌
体外プロテアーゼ活性を低下させておいた枯草菌
に導入した場合は、蛋白分解活性の指標となるカ
ゼイン寒天培地上のハロー形成が予期に反し逆に
抑制されることを見出し特許請求の範囲に記載の
本発明を完成した。
既に本発明者らによりプロテアーゼ産生促進遺伝
子（参考文献５）として単離された遺伝子を、菌
体外プロテアーゼ活性を低下させておいた枯草菌
に導入した場合は、蛋白分解活性の指標となるカ
ゼイン寒天培地上のハロー形成が予期に反し逆に
抑制されることを見出し特許請求の範囲に記載の
本発明を完成した。
実施例に示した本発明の効果を要約して述べる
と、プロテアーゼ産生促進遺伝子を染色体中に有
し菌体外プロテアーゼ活性を低下させてある枯草
菌へ、ヒト成長ホルモン遺伝子をプロテアーゼ遺
伝子のプロモーター及びプレプロペプタイドコー
デイング領域に由来するDNA塩基配列の下流に
結合して構築した組換えDNAを導入し、かくし
て得られた形質転換株を用いて、培地１当り
200mgのヒト成長ホルモンを分泌生産させること
に成功している。そしてこの量は、親株である菌
体外アルカリ性・中性プロテアーゼ活性を低下さ
せたのちの菌株を宿主とした場合の５〜10倍にも
及んでいる。
と、プロテアーゼ産生促進遺伝子を染色体中に有
し菌体外プロテアーゼ活性を低下させてある枯草
菌へ、ヒト成長ホルモン遺伝子をプロテアーゼ遺
伝子のプロモーター及びプレプロペプタイドコー
デイング領域に由来するDNA塩基配列の下流に
結合して構築した組換えDNAを導入し、かくし
て得られた形質転換株を用いて、培地１当り
200mgのヒト成長ホルモンを分泌生産させること
に成功している。そしてこの量は、親株である菌
体外アルカリ性・中性プロテアーゼ活性を低下さ
せたのちの菌株を宿主とした場合の５〜10倍にも
及んでいる。
以下本発明を詳細に説明する。
問題を解決する為の手段
バチルス属細菌の菌体外プロテアーゼ産生促進
遺伝子としては遺伝学的な解析からその存在が知
られているpap（参考文献６）、sacQ（参考文献
７）、hpr（参考文献８）等がある。
遺伝子としては遺伝学的な解析からその存在が知
られているpap（参考文献６）、sacQ（参考文献
７）、hpr（参考文献８）等がある。
本発明に用いるプロテアーゼの産生を促進する
遺伝子としてはこれら既知のものであつても新た
に遺伝子組換えの手法により単離されたものであ
つても、菌体外プロテアーゼ活性を低下させた枯
草菌に導入された場合にカゼイン−寒天培地上で
のハロー形成を親株であるプロテアーゼ欠損株に
比し低く抑制するものであればよい。
遺伝子としてはこれら既知のものであつても新た
に遺伝子組換えの手法により単離されたものであ
つても、菌体外プロテアーゼ活性を低下させた枯
草菌に導入された場合にカゼイン−寒天培地上で
のハロー形成を親株であるプロテアーゼ欠損株に
比し低く抑制するものであればよい。
実施の容易さからは遺伝子組換えの方法で単離
されたものは即ちそのDNA塩基配列を手中に有
する訳でより好ましい。
されたものは即ちそのDNA塩基配列を手中に有
する訳でより好ましい。
特許請求の範囲第２項に記載のDNA塩基配列
は既に本発明者らがバチルス アミロリキフアシ
エンス（B.amyloliquefaciens）からプロテアー
ゼ産生促進遺伝子として単離するのに成功してい
るものである（参考文献９）。
は既に本発明者らがバチルス アミロリキフアシ
エンス（B.amyloliquefaciens）からプロテアー
ゼ産生促進遺伝子として単離するのに成功してい
るものである（参考文献９）。
プロテアーゼ産生促進遺伝子を染色体DNA中
に導入して枯草菌形質転換体を造成するには該プ
ロテアーゼ産生促進遺伝子のDNA塩基配列と枯
草菌染色体DNAの塩基配列の相同性を利用した
通常の遺伝子的組換えの方法を用いればよい。ま
たそれ以外の方法でも染色体DNA中にプロテア
ーゼ産生促進遺伝子を導入せしめることが可能で
あれば如何なる方法でもよい。
に導入して枯草菌形質転換体を造成するには該プ
ロテアーゼ産生促進遺伝子のDNA塩基配列と枯
草菌染色体DNAの塩基配列の相同性を利用した
通常の遺伝子的組換えの方法を用いればよい。ま
たそれ以外の方法でも染色体DNA中にプロテア
ーゼ産生促進遺伝子を導入せしめることが可能で
あれば如何なる方法でもよい。
菌体外中性または／およびアルカリ性プロテア
ーゼの活性を低下させた枯草菌ニトロソグアニジ
ン等の変異剤処理、UV照射、γ−線照射による
変異処理法あるいは遺伝子組換えの手法で得たプ
ロテアーゼ遺伝子をin vitroで欠失させ再枯莽草
菌中に導入する方法およびそれらを組み合わせた
方法で得ることが出来る。
ーゼの活性を低下させた枯草菌ニトロソグアニジ
ン等の変異剤処理、UV照射、γ−線照射による
変異処理法あるいは遺伝子組換えの手法で得たプ
ロテアーゼ遺伝子をin vitroで欠失させ再枯莽草
菌中に導入する方法およびそれらを組み合わせた
方法で得ることが出来る。
遺伝子組換えの方法はより合目的に該プロテア
ーゼ遺伝子自身に欠失をおこすことが出来る点で
より好ましい。
ーゼ遺伝子自身に欠失をおこすことが出来る点で
より好ましい。
なをこのような方法で造成した菌体外プロテア
ーゼ活性を低下させた枯草菌菌株に上記のプロテ
アーゼ産生促進遺伝子をプラスミドに含まれてい
る状態あるいは染色体に存在する状態で導入した
場合おどろくべきことに導入前に残存していたプ
ロテアーゼ活性が導入により抑制されることは、
本発明の端緒として本発明者らにより見出された
ものである。
ーゼ活性を低下させた枯草菌菌株に上記のプロテ
アーゼ産生促進遺伝子をプラスミドに含まれてい
る状態あるいは染色体に存在する状態で導入した
場合おどろくべきことに導入前に残存していたプ
ロテアーゼ活性が導入により抑制されることは、
本発明の端緒として本発明者らにより見出された
ものである。
上記の如くに得たプロテアーゼ産生促進遺伝子
を染色体DNA中に有する枯草菌を宿主として所
望の異種蛋白を分泌生産するためにはバチルス属
細菌の菌体外プロテアーゼ遺伝子の発現・分泌を
司さどる領域、即ちプロモーター、プレプロペプ
タイドコーデイング領域の下流に所望の異種蛋白
をコードする遺伝子あるいはそれを含むDNA塩
基配列を結合して構築した組換えDNAを該宿主
中へ導入すればよい。
を染色体DNA中に有する枯草菌を宿主として所
望の異種蛋白を分泌生産するためにはバチルス属
細菌の菌体外プロテアーゼ遺伝子の発現・分泌を
司さどる領域、即ちプロモーター、プレプロペプ
タイドコーデイング領域の下流に所望の異種蛋白
をコードする遺伝子あるいはそれを含むDNA塩
基配列を結合して構築した組換えDNAを該宿主
中へ導入すればよい。
ここで用いることのできる組換えDNAとして
は、本発明者らは既にヒトインターフエロン−β
分泌用のpPIF25（参考文献10）等を構築してい
る。
は、本発明者らは既にヒトインターフエロン−β
分泌用のpPIF25（参考文献10）等を構築してい
る。
バチルス アミロリキフアシエン由来の菌体外
プロテアーゼ遺伝子としてはバチルス アミロリ
キフアシエンスの菌体外中性プロテアーゼ、菌体
外アルカリ性プロテアーゼ等を挙げることが出来
る。
プロテアーゼ遺伝子としてはバチルス アミロリ
キフアシエンスの菌体外中性プロテアーゼ、菌体
外アルカリ性プロテアーゼ等を挙げることが出来
る。
上記の発現・分泌の為の組換えDNAを、プロ
テアーゼ産生促進遺伝子が染色体DNA中に存在
する枯草菌宿主に導入するには通常のプロトプラ
スト形質転換法で実施可能である。
テアーゼ産生促進遺伝子が染色体DNA中に存在
する枯草菌宿主に導入するには通常のプロトプラ
スト形質転換法で実施可能である。
かくして得られた形質転化株を用い所望の蛋白
を得るにはその菌株を通常の方法で液体培養すれ
ばよい。
を得るにはその菌株を通常の方法で液体培養すれ
ばよい。
培養液からの所望の蛋白の調製は通常の方法で
培養上清から回収精製をおこなえば実施可能であ
る。特に本発明の方法を用いれば真該生物由来の
異種蛋白を枯草菌を宿主として従来達し得なかつ
たレベルで分泌生産出来るものであり、所望の蛋
白の回収・精製はより容易となるものである。
培養上清から回収精製をおこなえば実施可能であ
る。特に本発明の方法を用いれば真該生物由来の
異種蛋白を枯草菌を宿主として従来達し得なかつ
たレベルで分泌生産出来るものであり、所望の蛋
白の回収・精製はより容易となるものである。
以下本発明を具体例で説明するが本発明はこの
例により何ら限定されるものではない。
例により何ら限定されるものではない。
実施例 １
菌体外プロテアーゼ産生促進遺伝子を染色体
DNA中に有する枯草菌形質転換体の造成。
DNA中に有する枯草菌形質転換体の造成。
菌体外中性プロテアーゼおよびアルカリ性プロ
テアーゼ両者を欠損させた枯草菌MT−400株
（FERM BP−1078）は、その菌体外蛋白分解活
性が野性株に比し５％以下となつているものであ
る。
テアーゼ両者を欠損させた枯草菌MT−400株
（FERM BP−1078）は、その菌体外蛋白分解活
性が野性株に比し５％以下となつているものであ
る。
MT−400株の染色体DNAへのプロテアーゼ産
生促進遺伝子の導入は以下のように行つた。
生促進遺伝子の導入は以下のように行つた。
まず、プロテアーゼ産生促進遺伝子を含むプラ
スミドpNP181（参考文献11）を有する枯草菌MT
−0181株（FERM BP−343）からGryczanらの
方法に従いpNP181を調製した。
スミドpNP181（参考文献11）を有する枯草菌MT
−0181株（FERM BP−343）からGryczanらの
方法に従いpNP181を調製した。
調製にあたつては１のLB培地を用い30℃で
12時間培養した菌体を使用した。得られたプラス
ミドの一部は制限酵素切断部位を調べこのプラス
ミドがpNP181であることを確認した。
12時間培養した菌体を使用した。得られたプラス
ミドの一部は制限酵素切断部位を調べこのプラス
ミドがpNP181であることを確認した。
次に、Saitoらの方法に従いMT−400株のコン
ピテント細胞を調製した。
ピテント細胞を調製した。
得られたコンピテント細胞を含む培養液500μ
に上述したpNP181 0.5μgを添加し、37℃で１
時間培養した。
に上述したpNP181 0.5μgを添加し、37℃で１
時間培養した。
１時間後にその培養液500μ全量を、20mlの
Schaeffer胞子形成培地（参考文献12）に添加し
て37℃で24時間培養をつづけた。
Schaeffer胞子形成培地（参考文献12）に添加し
て37℃で24時間培養をつづけた。
その培養液の1.5mlをとり出し70℃で10分間加
熱後104倍、105倍、106倍に希釈しTBAB培地
（Difco社製）に各希釈液100μをプレーテイン
グした。
熱後104倍、105倍、106倍に希釈しTBAB培地
（Difco社製）に各希釈液100μをプレーテイン
グした。
このものを37℃で一夜培養して得られたコロニ
ーをTBAB培地およびカナマイシン5μg含有
TBAB培地にうえつぎ37℃で15時間培養した。
ーをTBAB培地およびカナマイシン5μg含有
TBAB培地にうえつぎ37℃で15時間培養した。
TBAB培地では生育し、カナマイシン含有
TBAB培地では生育しなかつたコロニー200個を
選びカゼイン培地（参考文献13）に植え37℃で60
時間培養した。
TBAB培地では生育しなかつたコロニー200個を
選びカゼイン培地（参考文献13）に植え37℃で60
時間培養した。
60時間後にコロニーのまわりに形成されたハロ
ーの大きさを調べた結果、ひとつのコロニーを除
いて全部のコロニーのまわりに明確なハローが生
じていた。ハローを生じていない株（MT−430
と命名）をペンアツセイブロス（Difco社製）を
用いて液体培養すると対数増殖期の菌体は長く伸
長する特徴を示した。この特徴はpNP181を有す
る枯草菌に普遍的にみられるものである。
ーの大きさを調べた結果、ひとつのコロニーを除
いて全部のコロニーのまわりに明確なハローが生
じていた。ハローを生じていない株（MT−430
と命名）をペンアツセイブロス（Difco社製）を
用いて液体培養すると対数増殖期の菌体は長く伸
長する特徴を示した。この特徴はpNP181を有す
る枯草菌に普遍的にみられるものである。
またpNP181を有するMT−400株は同様にハロ
ーを形成せず菌体の伸長をみせること、更にMT
−430株（FERM BP−1079）にはプラスミドが
存在しなかつたことから、MT−430株の染色体
にはpNP181に含まれているプロテアーゼ産生促
進遺伝子が存在するものと判断した。
ーを形成せず菌体の伸長をみせること、更にMT
−430株（FERM BP−1079）にはプラスミドが
存在しなかつたことから、MT−430株の染色体
にはpNP181に含まれているプロテアーゼ産生促
進遺伝子が存在するものと判断した。
またMT−430株の染色体DNAを用いて菌体外
プロテアーゼについては野性株である枯草菌を形
質転換すると大型のハローをカゼイン培地上に形
成する形質転換株が得られることを利用した遺伝
学的解析によつてもプロテアーゼ産生促進遺伝子
がMT−430株の染色体DNA中に存在することが
明らかとなつた。
プロテアーゼについては野性株である枯草菌を形
質転換すると大型のハローをカゼイン培地上に形
成する形質転換株が得られることを利用した遺伝
学的解析によつてもプロテアーゼ産生促進遺伝子
がMT−430株の染色体DNA中に存在することが
明らかとなつた。
実施例 ２
プロテアーゼ遺伝子にヒト成長ホルモン遺伝子
を結合したヒト成長ホルモン分泌用組換えDNA
のMT−430株への導入 ヒト成長ホルモン分泌用組換えDNAとしてB.
amyloliquefaciensの中性プロテアーゼ遺伝子の
プロモーター、プレペプタイドコーデイング領域
およびそれに続くプロペプタイドコーデイング領
域の一部（21アミノ酸をコードする63ヌクレオチ
ドより成る。）を有するDNA塩基配列の下流に成
熟ヒト成長ホルモンをコードするDNA塩基配列
を含むDNAフラグメントを結合したphGH427
（第１図）を用いた。
を結合したヒト成長ホルモン分泌用組換えDNA
のMT−430株への導入 ヒト成長ホルモン分泌用組換えDNAとしてB.
amyloliquefaciensの中性プロテアーゼ遺伝子の
プロモーター、プレペプタイドコーデイング領域
およびそれに続くプロペプタイドコーデイング領
域の一部（21アミノ酸をコードする63ヌクレオチ
ドより成る。）を有するDNA塩基配列の下流に成
熟ヒト成長ホルモンをコードするDNA塩基配列
を含むDNAフラグメントを結合したphGH427
（第１図）を用いた。
phGH427は既に本発明者により構築されてい
たB.amyloliquefaciens中性プロテアーゼクロー
ンpNP150（参考文献14）の中性プロテアーゼ遺
伝子のプレプロペプタイドコーデイング領域中に
存在する制限酵素Pvul切断部位からエキソヌク
レアーゼBal31で加水分解して得たDNAフラグ
メントにヒト成長ホルモン遺伝子を含むDMAフ
ラグメントを結合して構築したものである。
たB.amyloliquefaciens中性プロテアーゼクロー
ンpNP150（参考文献14）の中性プロテアーゼ遺
伝子のプレプロペプタイドコーデイング領域中に
存在する制限酵素Pvul切断部位からエキソヌク
レアーゼBal31で加水分解して得たDNAフラグ
メントにヒト成長ホルモン遺伝子を含むDMAフ
ラグメントを結合して構築したものである。
pNP150は枯草菌MT−0150株（FERM BP−
425）から常法に従い調製した。ヒト成長ホルモ
ン遺伝子の全DNA塩基配列においては化学合成
で得たヒト成長ホルモン遺伝子を含むDNAフラ
グメントを使用した。
425）から常法に従い調製した。ヒト成長ホルモ
ン遺伝子の全DNA塩基配列においては化学合成
で得たヒト成長ホルモン遺伝子を含むDNAフラ
グメントを使用した。
phGH427のMT−430株への導入はプロトプラ
スト法に従い実施した。
スト法に従い実施した。
得られたカナマイシン耐性形質転換株を50株選
び、その培養上清への成長ホルモンの分泌の有無
を酵素免疫測定法および免疫二重拡散法を用いて
検定した結果その全てが成長ホルモンを分泌生産
していることが判明した。尚、上記検定にはLB
培地で30℃15時間振盪培養した培養液の上清を用
いた。
び、その培養上清への成長ホルモンの分泌の有無
を酵素免疫測定法および免疫二重拡散法を用いて
検定した結果その全てが成長ホルモンを分泌生産
していることが判明した。尚、上記検定にはLB
培地で30℃15時間振盪培養した培養液の上清を用
いた。
得られたMT−430（phGH427）株（FERM
BP−1080）を用いて次に成長ホルモンの菌体外
分泌生産について検討した。
BP−1080）を用いて次に成長ホルモンの菌体外
分泌生産について検討した。
実施例 ３
MT−430（phGH427）株を用いたヒト成長ホル
モンの分泌生産 MT−430（phGH427）株および対照としてMT
−400株にphGH427を実施例２で述べたところと
全く同様にして導入したMT−400（phGH427）
株の両者を２倍濃度のLB培地（100ml）を用い30
℃で17時間振盪培養した。
モンの分泌生産 MT−430（phGH427）株および対照としてMT
−400株にphGH427を実施例２で述べたところと
全く同様にして導入したMT−400（phGH427）
株の両者を２倍濃度のLB培地（100ml）を用い30
℃で17時間振盪培養した。
17時間後の培養液から全量の菌体を高速遠心に
より回収しその全部を新鮮な２倍濃度のLB培地
に懸濁し30℃で振盪培養を継続した。
より回収しその全部を新鮮な２倍濃度のLB培地
に懸濁し30℃で振盪培養を継続した。
８時間後にMT−430（phGH427）およびMT−
400（phGH427）株の培養液濃度（A660）はそれ
ぞれ9.86および10.00であつた。また培養上清の
PHはそれぞれ8.06、7.98であつた。
400（phGH427）株の培養液濃度（A660）はそれ
ぞれ9.86および10.00であつた。また培養上清の
PHはそれぞれ8.06、7.98であつた。
この培養上清を用いて酵素免疫測定法により培
地中の成長ホルモン濃度を測定した結果MT−
430株を宿主とした場合は培地１当たり205mg、
MT−400株を宿主とした場合は培地１当たり
30mgあつた。
地中の成長ホルモン濃度を測定した結果MT−
430株を宿主とした場合は培地１当たり205mg、
MT−400株を宿主とした場合は培地１当たり
30mgあつた。
免疫二重拡散性の結果からMT−430
（phGH427）およびMT−400（phGH427）株の分
泌する成長ホルモンはヒト下垂体由来のものと区
別できなかつた。
（phGH427）およびMT−400（phGH427）株の分
泌する成長ホルモンはヒト下垂体由来のものと区
別できなかつた。
またMT−430（phGH427）を17時間培養して
得た上清100μにトリクロル酢酸を添加して得
た沈でんを30μのサンプルバツフアーに再溶解
してSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
試して培養上清中の蛋白を解析した結果、該培養
上清に存在する蛋白の20％〜30％が成長ホルモン
であることが判明した。
得た上清100μにトリクロル酢酸を添加して得
た沈でんを30μのサンプルバツフアーに再溶解
してSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
試して培養上清中の蛋白を解析した結果、該培養
上清に存在する蛋白の20％〜30％が成長ホルモン
であることが判明した。
発明の効果
以上の結果からMT−430株およびプロテアー
ゼ遺伝子を用いた異種蛋白分泌用組換えDNAの
組合わせで得られる主−プラスミド系は、これま
で達し得なかつた多量の異種蛋白の分泌生産を可
能としていることが示された。
ゼ遺伝子を用いた異種蛋白分泌用組換えDNAの
組合わせで得られる主−プラスミド系は、これま
で達し得なかつた多量の異種蛋白の分泌生産を可
能としていることが示された。
（参考文献一覧）
１ Ulmanen，I.（1985）J.Bacheriol.、162 176
−182、Yamane，K.et al.（1985）in
“Moleclar Biology of Miorcbial
Differentiation”Hoch，J.A.，and Setlow.P.
Ecl 117−123、American Soc.for Microbiol. ２ Palva，I.et al.（1983）Gene、22 229−235. ３ Kawamura，F.and Doi，R.H.（1984）J.
Bacterial.、160 442−444. ４ Honjo，Met al（1985）J.Biotech，、３ 73
−84.Honjo，M.et al.（1986）In‘Genetics
and Biotechnology of Bacilli'２Ganesan，
A.，and Hoch，J.A.Ed Academic Press. ５ Tomioka，N.，et al.（1985）J.
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Genet.、148 281−285、Yoneda，Y.and
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1481−1487. ８ Higerd，T.et al.（1972）J.Bacteriol.、112
1026−1028. ９ Tomioka，N.et al.（1985）J.Biotechnol.、
３ 85−96. 10 Honjo，M.et at.（1985）J.Biotechnol.、３
73−84. 11 Tomioka，N.et al.（1985）J.Biotechnol.、
３ 85−96. 12 Schaeffer，P.and Ionesco，H.（1960）
Comt.Rerd.、251 3125 13 Honjo，M.et al.（1985）J.Biotechnol.、１
73−84. 14 Honjo，M.et al.（1984）J.Biotechnol.、１
265−277；Shimada，H.et al.（1985）J.
Biotechnol.、２ 75−85.
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73−84. 14 Honjo，M.et al.（1984）J.Biotechnol.、１
265−277；Shimada，H.et al.（1985）J.
Biotechnol.、２ 75−85.
第１図は、phGH427の構造を示す図である。
斜線部は中性プロテアーゼ遺伝子に由来する部
分を示し、同様にPmはプロモーターを、prepro
はプレプロペプタイドコーテイング領域に由来す
る部分を示し、又hGHはヒト成長ホルモン遺伝
子を含むDNAフラグメントである。第２図は、
phGH427に含まれる中性プロテアーゼ遺伝子の
プレプロペプタイドコーデイング領域のDNA塩
基配列および対応するアミノ酸配列を示す図であ
る。
分を示し、同様にPmはプロモーターを、prepro
はプレプロペプタイドコーテイング領域に由来す
る部分を示し、又hGHはヒト成長ホルモン遺伝
子を含むDNAフラグメントである。第２図は、
phGH427に含まれる中性プロテアーゼ遺伝子の
プレプロペプタイドコーデイング領域のDNA塩
基配列および対応するアミノ酸配列を示す図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス アミロリキフアシエンス由来の菌
体外プロテアーゼ産生促進遺伝子を菌体外プロテ
アーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌の染色体DNA
中に挿入することにより菌体外プロテアーゼ活性
を低下させた枯草菌菌株。 ２ バチルス アミロリキフアシエンス由来の菌
体外プロテアーゼ産生促進遺伝子のDNA塩基配
列の一方の鎖が以下のDNA塩基配列を含むもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の枯草菌菌株。 【表】 【表】 ３ バチルス アミロリキフアシエンス由来の菌
体外プロテアーゼが菌体外中性プロテアーゼ、菌
体外アルカリ性プロテアーゼのうちいずれが一方
あるいはその両方であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の枯草菌菌株。 ４ 枯草菌菌株が枯草菌菌株MT−430である特
許請求の範囲第１項に記載の枯草菌菌株。 ５ 枯草菌菌株が枯草菌菌株MT−430
（phGH427）である特許請求の範囲第１項に記載
の枯草菌菌株。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61233285A JPS6387975A (ja) | 1986-10-02 | 1986-10-02 | 枯草菌菌株 |
| GB8723033A GB2198439B (en) | 1986-10-02 | 1987-10-01 | Bacillus subtilis strain of reduced extracellular protease activity; secreting proteins using the strain. |
| FR8713672A FR2604726B1 (fr) | 1986-10-02 | 1987-10-02 | Souche de bacillus subtilis dont les activites de protease extra-cellulaire sont reduites, procede pour obtenir la souche et procede pour faire secreter des proteines en utilisant la souche |
| US07/553,356 US5084383A (en) | 1986-10-02 | 1990-07-18 | Bacillus subtilis strain whose extracellular protease activities are reduced, method for obtaining the strain and method for secreting proteins by using the strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61233285A JPS6387975A (ja) | 1986-10-02 | 1986-10-02 | 枯草菌菌株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30163592A Division JP2857730B2 (ja) | 1992-10-15 | 1992-10-15 | 枯草菌菌株による蛋白分泌の方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6387975A JPS6387975A (ja) | 1988-04-19 |
| JPH0522508B2 true JPH0522508B2 (ja) | 1993-03-29 |
Family
ID=16952702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61233285A Granted JPS6387975A (ja) | 1986-10-02 | 1986-10-02 | 枯草菌菌株 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5084383A (ja) |
| JP (1) | JPS6387975A (ja) |
| FR (1) | FR2604726B1 (ja) |
| GB (1) | GB2198439B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6437284A (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-07 | Md Res | Bacillus subtilis having lowered protease productivity |
| GB8727772D0 (en) * | 1987-11-27 | 1987-12-31 | Celltech Ltd | Host cells |
| CA1333777C (en) | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| WO1991002803A1 (en) * | 1989-08-25 | 1991-03-07 | Henkel Research Corporation | A method of suppressing chromosomal gene expression |
| US5585253A (en) * | 1989-11-27 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of California | Extracellular serine protease and a Bacillus subtilis alkaline neutral an serine protease mutant strain |
| CN111705050B (zh) * | 2020-05-19 | 2022-07-22 | 江苏大学 | 一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711843A (en) * | 1980-12-31 | 1987-12-08 | Cetus Corporation | Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis |
| JPS58162291A (ja) * | 1982-03-23 | 1983-09-26 | Res Dev Corp Of Japan | 耐熱性プロテア−ゼの製造法 |
| JPS59190A (ja) * | 1982-06-25 | 1984-01-05 | ヤマハ株式会社 | 楽譜表示装置 |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| CA1311429C (en) * | 1983-07-06 | 1992-12-15 | Vasantha Nagarajan | Vector for polypeptides in bacilli |
| JPH0659224B2 (ja) * | 1983-09-12 | 1994-08-10 | 工業技術院長 | Ｄνａ塩基配列及びそのｄνａ塩基配列を含む組換え体プラスミドの創製法 |
| EP0149241B1 (en) * | 1983-12-28 | 1991-03-27 | Agency Of Industrial Science And Technology | Dna base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant dna including the whole or a part of the dna base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant dna |
| EP0151760A1 (en) * | 1984-01-06 | 1985-08-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel DNA and use thereof |
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| US4801537A (en) * | 1984-06-08 | 1989-01-31 | Genex Corporation | Vector for expression of polypeptides in bacilli |
| US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
| GB2171703B (en) * | 1985-01-18 | 1989-11-15 | Agency Ind Science Techn | Expression-secretion vector for gene expression and protein secretion, recombinant dna including the vector, and method of producing proteins by use of the re |
-
1986
- 1986-10-02 JP JP61233285A patent/JPS6387975A/ja active Granted
-
1987
- 1987-10-01 GB GB8723033A patent/GB2198439B/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-02 FR FR8713672A patent/FR2604726B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-07-18 US US07/553,356 patent/US5084383A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2198439B (en) | 1990-10-10 |
| JPS6387975A (ja) | 1988-04-19 |
| FR2604726A1 (fr) | 1988-04-08 |
| US5084383A (en) | 1992-01-28 |
| GB8723033D0 (en) | 1987-11-04 |
| FR2604726B1 (fr) | 1990-12-21 |
| GB2198439A (en) | 1988-06-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |