JPH052309B2 - - Google Patents
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- JPH052309B2 JPH052309B2 JP24049183A JP24049183A JPH052309B2 JP H052309 B2 JPH052309 B2 JP H052309B2 JP 24049183 A JP24049183 A JP 24049183A JP 24049183 A JP24049183 A JP 24049183A JP H052309 B2 JPH052309 B2 JP H052309B2
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は膜蛋白質の可溶化剤に関し、さらに詳
しくは細菌膜の蛋白質を安定に可溶化しうる可溶
化剤に関する。
しくは細菌膜の蛋白質を安定に可溶化しうる可溶
化剤に関する。
従来、生体膜の蛋白質を可溶化するために種々
の界面活性剤が用いられているが、蛋白質の安定
性等の点で生化学的に利用できるものは限られて
いる。
の界面活性剤が用いられているが、蛋白質の安定
性等の点で生化学的に利用できるものは限られて
いる。
本発明者らは、特に細菌膜蛋白質を安定に可溶
化しうる中性の界面活性剤を検索し、本発明に到
達した。
化しうる中性の界面活性剤を検索し、本発明に到
達した。
すなわち、本発明の要旨は、HLBが12〜20、
脂肪酸の炭素数が８〜14の蔗糖脂肪酸エステルを
含有してなる細菌膜蛋白質の可溶化剤にある。
脂肪酸の炭素数が８〜14の蔗糖脂肪酸エステルを
含有してなる細菌膜蛋白質の可溶化剤にある。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る可溶化剤の対象となる蛋白質は、
細菌膜蛋白質であり、たとえば大腸菌を始めとす
る中温細菌はもとよりそれとは異なつた細胞表層
を有し、安定な可溶化がより困難な低温細菌、好
熱細菌、好酸菌、好アルカリ菌もしくはメタン細
胞等の細菌膜蛋白質が挙げられる。
細菌膜蛋白質であり、たとえば大腸菌を始めとす
る中温細菌はもとよりそれとは異なつた細胞表層
を有し、安定な可溶化がより困難な低温細菌、好
熱細菌、好酸菌、好アルカリ菌もしくはメタン細
胞等の細菌膜蛋白質が挙げられる。
特に、本発明は、グリセリンと脂肪酸のエステ
ル結合を有する脂質二重層により膜を形成する一
般の細菌に比して、従来蛋白質を変性しないで安
定に可溶化することが困難であつたグリセリンと
脂肪酸とのエーテル結合を有する脂質一重層もし
くは二重層により膜を形成する細菌の膜蛋白質の
可溶化剤として有用である。
ル結合を有する脂質二重層により膜を形成する一
般の細菌に比して、従来蛋白質を変性しないで安
定に可溶化することが困難であつたグリセリンと
脂肪酸とのエーテル結合を有する脂質一重層もし
くは二重層により膜を形成する細菌の膜蛋白質の
可溶化剤として有用である。
このような細菌としては、たとえば、好塩菌、
メタン細菌（二重層）、サーモプラズマ
（Thermoplasma）、スルホロブス（Sulfolobus）
（一重層）等が挙げられる。
メタン細菌（二重層）、サーモプラズマ
（Thermoplasma）、スルホロブス（Sulfolobus）
（一重層）等が挙げられる。
つぎに、本発明における蔗糖脂肪酸エステルと
しては、膜蛋白質の可溶性、得られる蛋白質の安
定性、透析による除去性等の観点から、通常
HLBが12〜20程度、好ましくは15〜18であり、
かつ、脂肪酸の炭素数が８〜14程度、すなわちカ
プリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン
酸等、であるものが好適に使用される。
しては、膜蛋白質の可溶性、得られる蛋白質の安
定性、透析による除去性等の観点から、通常
HLBが12〜20程度、好ましくは15〜18であり、
かつ、脂肪酸の炭素数が８〜14程度、すなわちカ
プリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン
酸等、であるものが好適に使用される。
本発明に係る可溶化剤は、上記蔗糖脂肪酸エス
テルを含有してなるものであり、通常用いられる
濃度は、対象とする細菌膜の種類等により異なる
が0.1〜１％（ｗ／ｖ）である。そして通常、生
化学分野で常用される緩衝液溶液として使用さ
れ、PHは通常中性付近が選ばれる。
テルを含有してなるものであり、通常用いられる
濃度は、対象とする細菌膜の種類等により異なる
が0.1〜１％（ｗ／ｖ）である。そして通常、生
化学分野で常用される緩衝液溶液として使用さ
れ、PHは通常中性付近が選ばれる。
本発明に係る可溶化剤の使用に際しては、常法
により対象とする細菌膜蛋白質と混合され、超遠
心処理され、ついで可溶化された膜蛋白質を上清
として得ることができ、さらに必要に応じ常法よ
りに精製され得る。
により対象とする細菌膜蛋白質と混合され、超遠
心処理され、ついで可溶化された膜蛋白質を上清
として得ることができ、さらに必要に応じ常法よ
りに精製され得る。
本発明に係る可溶化剤は、細菌膜蛋白質を容易
に可溶化することができ、得られた可溶化蛋白は
実質的に変性されることなく安定であり、また、
透析により過剰な蔗糖脂肪酸エステルを除去しう
るので得られた蛋白の精製等の処理に有利であ
り、かつ紫外線吸収がないので、蛋白自体の紫外
線吸収による蛋白の定量が可能であるという利点
を有する。
に可溶化することができ、得られた可溶化蛋白は
実質的に変性されることなく安定であり、また、
透析により過剰な蔗糖脂肪酸エステルを除去しう
るので得られた蛋白の精製等の処理に有利であ
り、かつ紫外線吸収がないので、蛋白自体の紫外
線吸収による蛋白の定量が可能であるという利点
を有する。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。
する。
実施例 １
好酸好熱性細菌スルホロブス アシドカルダリ
ウス７（Sulfolobus acidocaldarius）（微工研寄
第7137号）をPH２、75℃で４時間培養（湿重量約
１ｇ／）した後、集菌した。ついで洗浄した後
に、PH7.0で凍結融解をくり返し、遠心により上
清と沈渣とに分離した。さらにこの沈渣を0.5M
KClで洗浄した後、遠心して細胞膜を沈渣として
得た。
ウス７（Sulfolobus acidocaldarius）（微工研寄
第7137号）をPH２、75℃で４時間培養（湿重量約
１ｇ／）した後、集菌した。ついで洗浄した後
に、PH7.0で凍結融解をくり返し、遠心により上
清と沈渣とに分離した。さらにこの沈渣を0.5M
KClで洗浄した後、遠心して細胞膜を沈渣として
得た。
このスルホロブス細胞膜（約10mg蛋白質）を、
0.5％（ｗ／ｖ）蔗糖カプリン酸エステル
“CPR1695”（三菱化成工業(株)製）（HLB16）、10
ｍＭ Tris−HCl（PH7.0）を含む、本発明に係る
可溶化剤0.6mlと混合し、ついで超遠心（10万×
Ｇ、１時間）して、可溶化蛋白質を上清（0.5ml）
として得た（約３mg蛋白質）。
0.5％（ｗ／ｖ）蔗糖カプリン酸エステル
“CPR1695”（三菱化成工業(株)製）（HLB16）、10
ｍＭ Tris−HCl（PH7.0）を含む、本発明に係る
可溶化剤0.6mlと混合し、ついで超遠心（10万×
Ｇ、１時間）して、可溶化蛋白質を上清（0.5ml）
として得た（約３mg蛋白質）。
ついで、得られた上清を“セフアクリル”
S200カラムクロマトグラフイー（カラム：1.7×
60cm、0.5％蔗糖カプリン酸エステル
“CPR1695”、10ｍＭ Tris−HCl、250ｍＭ
NaCl、PH7.0で展開）により分画し、膜に結合し
たエイテイーピーエースATP aseが可溶化後に
も活性を保持しているか否かを検討した。
S200カラムクロマトグラフイー（カラム：1.7×
60cm、0.5％蔗糖カプリン酸エステル
“CPR1695”、10ｍＭ Tris−HCl、250ｍＭ
NaCl、PH7.0で展開）により分画し、膜に結合し
たエイテイーピーエースATP aseが可溶化後に
も活性を保持しているか否かを検討した。
本菌細胞膜ではATP分解活性は酸性（PH2.5）
及び中性（PH7.0）に二種類存在するので、可溶
化分画におけるこれらの二種類の活性を後述の方
法により追跡した。
及び中性（PH7.0）に二種類存在するので、可溶
化分画におけるこれらの二種類の活性を後述の方
法により追跡した。
その結果を図１に示す。図中、▲及び△はそれ
ぞれPH2.5及びPH7.0におけるATP分解活性を示
す。○は蛋白濃度（280nｍにおける紫外吸収）
を示す。この結果より、得られた可溶化膜蛋白質
において、酸性（PH2.5）ATP aseの80％が一つ
のピーク（■）に回収され、一方、中性（PH7.0）
ATP aseは、複数の画分としてほぼ100％（合計
量）が回収されたことがわかり、膜蛋白質が非常
に安定した状態で可溶されたことが示された。
ぞれPH2.5及びPH7.0におけるATP分解活性を示
す。○は蛋白濃度（280nｍにおける紫外吸収）
を示す。この結果より、得られた可溶化膜蛋白質
において、酸性（PH2.5）ATP aseの80％が一つ
のピーク（■）に回収され、一方、中性（PH7.0）
ATP aseは、複数の画分としてほぼ100％（合計
量）が回収されたことがわかり、膜蛋白質が非常
に安定した状態で可溶されたことが示された。
なお、比較のために、上記と同様にして得られ
たスルホロブス細胞膜（約４mg蛋白質）を、0.2
％オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（“Triton”×100、ローム・アンド・ハーフ社
製）、10ｍＭ Tris−HCl（PH7.0）を含む可溶化
剤を用いて、同様に可溶化膜蛋白質（約１mg蛋白
質）を上清として得た。
たスルホロブス細胞膜（約４mg蛋白質）を、0.2
％オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（“Triton”×100、ローム・アンド・ハーフ社
製）、10ｍＭ Tris−HCl（PH7.0）を含む可溶化
剤を用いて、同様に可溶化膜蛋白質（約１mg蛋白
質）を上清として得た。
この上清を、“セフアクリル”S200カラムクロ
マトグラフイー（カラム：1.7×60cm、0.2％
“Triton”×100、10ｍＭ Tris−HCl、50ｍＭ
NaCl、PH7.0で展開）により分画し、上記と同様
にATP分解活性を測定し、結果を図−２に示す。
▲及び△は、図１におけると同様であり、○は蛋
白濃度（“Triton”×100が強い紫外吸収を示すた
めローリー法による500nｍにおける吸光度を測
定）を示す。
マトグラフイー（カラム：1.7×60cm、0.2％
“Triton”×100、10ｍＭ Tris−HCl、50ｍＭ
NaCl、PH7.0で展開）により分画し、上記と同様
にATP分解活性を測定し、結果を図−２に示す。
▲及び△は、図１におけると同様であり、○は蛋
白濃度（“Triton”×100が強い紫外吸収を示すた
めローリー法による500nｍにおける吸光度を測
定）を示す。
すなわち、特定しうるような活性の画分はみら
れず、活性ある画分として回収されておらないこ
とが示された。
れず、活性ある画分として回収されておらないこ
とが示された。
なお、上記ATP分解活性は、各画分20μに
80μの0.1M Gly−HCl、PH2.5（またはTris−
HCl、PH7.0）、２ｍＭ ATP1ｍＭ MgCl2の混
合液を加えて、550℃、30分間に遊離されるPi（無
機リン）の量を、リンLinらの方法（Anal.
Biochem.77，10，1977）により370nｍの吸収
（A370）で示した。
80μの0.1M Gly−HCl、PH2.5（またはTris−
HCl、PH7.0）、２ｍＭ ATP1ｍＭ MgCl2の混
合液を加えて、550℃、30分間に遊離されるPi（無
機リン）の量を、リンLinらの方法（Anal.
Biochem.77，10，1977）により370nｍの吸収
（A370）で示した。
図１及び２は、可溶化膜蛋白質のカラムクロマ
トグラフイーによる溶出パターン（蛋白濃度及び
ATP分解活性）を示す図である。
トグラフイーによる溶出パターン（蛋白濃度及び
ATP分解活性）を示す図である。
Claims (1)
- １ HLBが12〜20、脂肪酸の炭素数が８〜14の
蔗糖脂肪酸エステルを含有してなる細菌膜蛋白質
の可溶化剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24049183A JPS60130391A (ja) | 1983-12-20 | 1983-12-20 | 膜蛋白質の可溶化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24049183A JPS60130391A (ja) | 1983-12-20 | 1983-12-20 | 膜蛋白質の可溶化剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60130391A JPS60130391A (ja) | 1985-07-11 |
| JPH052309B2 true JPH052309B2 (ja) | 1993-01-12 |
Family
ID=17060300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24049183A Granted JPS60130391A (ja) | 1983-12-20 | 1983-12-20 | 膜蛋白質の可溶化剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60130391A (ja) |
-
1983
- 1983-12-20 JP JP24049183A patent/JPS60130391A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60130391A (ja) | 1985-07-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |