ES2197361T3 - Procedimiento para purificar apolipoproteinas. - Google Patents

Procedimiento para purificar apolipoproteinas.

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ES2197361T3 ES97939315T ES97939315T ES2197361T3 ES 2197361 T3 ES2197361 T3 ES 2197361T3 ES 97939315 T ES97939315 T ES 97939315T ES 97939315 T ES97939315 T ES 97939315T ES 2197361 T3 ES2197361 T3 ES 2197361T3
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Lena Nystrom
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION DE UN COMPUESTO HIDROFOBICO O AMFIFILICO, MEZCLANDO PRIMERO UN COMPUESTO QUE CONTIENE EL COMPUESTO HIDROFOBICO O AMFIFILICO CON UN PRIMER MATERIAL POLIMERICO, AGUA Y, POR LO MENOS, UN SEGUNDO MATERIAL POLIMERICO ASI COMO UN TENSIOACTIVO, SIN QUE SE PUEDAN MEZCLAR EL PRIMER COMPUESTO POLIMERICO Y EL SEGUNDO MATERIAL POLIMERICO Y/O EL TENSIOACTIVO EN LA SOLUCION ACUOSA PRIMARIA RESULTANTE. EL PROCEDIMIENTO CONSISTE LUEGO EN MANTENER LA SOLUCION ACUOSA PRIMARIA DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO SUFICIENTE PARA SEPARAR BASICAMENTE LAS FASES FORMADAS, Y LUEGO ELIMINAR LA FASE QUE CONTIENE LA PARTE PRINCIPAL DEL COMPUESTO HIDROFOBICO O AMFIFILICO Y EL SEGUNDO MATERIAL POLIMERICO Y/O EL TENSIOACTIVO. SE SEPARAN EL SEGUNDO MATERIAL POLIMERICO Y/O EL TENSIOACTIVO DEL COMPUESTO HIDROFOBICO O AMFIFILICO, Y SE RECICLAN LUEGO EN LA ETAPA INICIAL DE MEZCLA. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA COMPOSICION DESTINADA A SU USO EN LA PURIFICACION DE LA APOLIPOPROTEINA A (APOA) O LA APOLIPOPROTEINA A (APOE), COMPRENDIENDO DICHA COMPOSICION UN PRIMER COMPUESTO POLIMERICO Y UN TENSIOACTIVO, PUDIENDO DICHO PRIMER COMPUESTO POLIMERICO Y TENSIOACTIVO SER MEZCLADOS EN LA PRIMERA SOLUCION ACUOSA PRIMARIA OBTENIDA DESPUES DE LA MEZCLA CON AGUA. SE PUEDEN UTILIZAR LAS APOA O APOE PRODUCIDAS MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO DE ESTA INVENCION PARA LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO EN EL TRATAMIENTO DE LA ARTERIOESCLEROSIS Y LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES, LA SEPSIS O LA ARTERIOESCLEROSIS PERIFERICA, ASI COMO EN UN PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ARTERIOESCLEROSIS Y LAS ENFERMEDADES CARDIVASCULARES, LA SEPSIS O LA ARTERIOESCLEROSIS PERIFERICA CUANDO SE ADMINISTRA UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFICAZ.

Description

Procedimiento para purificar apolipoproteínas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar apolipoproteína A o apolipoproteína E mezclando un material de partida que contiene el compuesto diana, un primer material polimérico, agua y al menos un componente elegido entre un segundo material polimérico y un surfactante. Después de la separación en dos etapas, se recupera el compuesto diana mientras que el segundo material polimérico y el surfactante se reciclan a la etapa de mezcla. Más particularmente, el material de partida es un caldo de fermentación obtenido a partir de la producción recombinante mediante técnicas de ADN.
Antecedentes de la invención
Los sistemas bifásicos acuosos tienen una amplia aplicación en bioquímica y biotecnología para purificar materiales biológicos tales como células, proteínas, ácidos nucleicos y esteroides (véase, por ejemplo, P.-A. Albertsson, Partition of cell particles and macromolecules, 3ª ed., Wiley, New York City, NY, USA (1986) y H. Walter et al., Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press, Orlando, FL, USA (1985)). Los sistemas son adecuados para materiales biológicos debido a que cada una de las fases contiene alrededor de 70 a 90% en peso de agua, reduciendo con ello sustancialmente el riesgo de desnaturalización de las biomoléculas tales como proteínas (H. Walter et al., Aqueous two-phase systems, Methods in Enzymology, vol. 228, Academic Press, San Diego, CA, USA (1994)).
Los sistemas bifásicos acuosos están constituidos por dos materiales poliméricos inmiscibles, uno de los materiales poliméricos en combinación con una alta concentración de sal o uno de los materiales poliméricos en combinación con un surfactante. Al elevar las concentraciones por encima de un cierto valor crítico se obtienen dos fases acuosas inmiscibles en donde están repartidos los materiales poliméricos, material polimérico y sal o material polimérico y surfactante.
La repartición de proteínas en sistemas bifásicos acuosos depende principalmente de la hidrofobicidad, carga y tamaño de las proteínas. La repartición se puede ver influenciada por el cambio de materiales poliméricos, por el peso molecular de los materiales poliméricos, por el pH y por la adición de sales al sistema (G. Johansson, Acta Chem. Scand., B 28 (1974), pp. 873-882).
Los sistemas bifásicos acuosos pueden prepararse fácilmente en escala aumentada, puesto que la repartición de materiales biológicos tales como proteínas es esencialmente independiente del tamaño del sistema. Sin embargo, el tiempo para la separación de las fases puede alargarse en los sistemas a gran escala dependiendo, por ejemplo, de la geometría del recipiente usado en la separación.
A escala de laboratorio, se emplean normalmente dextrano y polietilenglicol (PEG) como los materiales poliméricos inmiscibles. Sin embargo, el dextrano es un material polimérico relativamente costoso y para la purificación a gran escala, por ejemplo, la extracción enzimática a escala industrial, es más frecuente el uso de varias combinaciones de PEG y sales (K. Köhler et al., Methods in Enzymology, vol. 228, Academic Press, Orlando, FA, USA, (1994), pp. 627-640).
La US-A-4.740.304 de Perstorp AB se refiere a composiciones que contienen hidroxialquilalmidón para utilizarse en sistemas con dos o más fases para la extracción, purificación, concentración y/o separación de sustancias biológicas. En una modalidad preferida, el hidroxialquilalmidón es hidroxipropilalmidón (HPS). En otra modalidad preferida, el hidroxialquilalmidón se combina con otro polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. En los ejemplos de US-A-4.740.304 se emplean varias enzimas.
Sin embargo, el uso de sistemas bifásicos acuosos para purificar biomoléculas ha quedado limitado, puesto que los productos diana resultan contaminados con un polímero de una fase del sistema, necesitándose así etapas de purificación adicionales y complicadas. Por tanto, hasta ahora los productos diana a purificar han sido repartidos en una solución de sal o han permanecido disueltos junto con un polímero de una fase del sistema. Para mitigar este problema, se ha introducido el uso, en sistemas bifásicos acuosos, de materiales poliméricos termo-separadores. Esto hace posible realizar una separación de fases, inducida por la temperatura, con lo que la biomolécula diana se puede separar del material polimérico de un modo muy eficaz. Esta técnica ha sido utilizada a escala de laboratorio para purificar varias enzimas. Así, la separación de fases, inducida por la temperatura, ha sido empleada para purificar 3-fosfoglicerato quinasa y hexoquinasa a partir de homogenado de levadura de pan (P.A. Harris et al., Bioseparation, vol. 2 (1991) pp. 237-246). Por otro lado, la separación de fases, inducida por la temperatura, se ha empleado para purificar dos ecdiesteroides y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa (P.A. Alred et al., J. Chromatogr., vol. 628 (1993) pp. 205-214 y P.A. Alred et al., Bioseparation, vol. 2 (1992), pp. 363-373, respectivamente). P.A. Alred et al., J. Chromatogr. A, 659 (1994) pp. 289-298, también describen la separación de fases, inducida por la temperatura, para purificar glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa y 3-fosfoglicerato quinasa a partir de levadura de pan.
La EP-A-262651 de Union Carbide se refiere a un método para recuperar enzimas a partir de soluciones acuosas que contienen al menos un material polimérico que exhibe características de solubilidad inversa. El método comprende elevar la temperatura de la solución por encima de la temperatura de precipitación del material polimérico y separar el precipitado polimérico de la solución que contiene enzimas. El material polimérico se elige preferentemente entre polialquilenglicoles, tal como polietilenglicol o polipropilenglicol, polímeros o copolímeros de poli(oxialquileno), surfactantes etoxilados, poliéteres modificados con silicona y polivinilpirrolidona. La temperatura se eleva adecuadamente a una temperatura menor de 90º C aproximadamente, con preferencia entre 50 y 75º C aproximadamente. En los ejemplos de EP-A-262651 se utiliza \lambda-amilasa.
La EP-A-0 574 050 de Gist-Brocades se refiere a la separación y purificación a gran escala de productos de fermentación hidrófobos. El método comprende añadir, a una mezcla del producto deseado y contaminantes, un surfactante no iónico, un agente floculante, un surfactante extra y una sal. El producto de fermentación es adecuadamente una proteína y con preferencia una enzima, que se puede emplear en composiciones detergentes.
La WO 96/23061 de Genencor International se relaciona con un proceso de extracción de enzimas, basado en el uso de surfactantes, en donde un producto de fermentación hidrófilo, especialmente una enzima de tipo detergente, se purifica poniendo en contacto un caldo de fermentación clarificado o entero, que contiene el producto deseado, con una o más sales y un surfactante adecuado con un valor HLB por encima de 12 aproximadamente. El caldo de fermentación, la sal y el surfactante se separan en dos fases, una de las cuales es rica en surfactante y en el producto deseado y la otra es rica en sal o sales.
Garg et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 20 (1994) pp. 199-215 describen el uso de un detergente para la formación de fases inducida por la temperatura (Triton X-114) como un vehículo ligando para la repartición por afinidad en un sistema trifásico acuoso. El Triton X-114 fue modificado con Cibacron Blue para proporcionar un conjugado de detergente-colorante, el cual se utilizó como un ligando de afinidad para la enzima lactato dehidrogenasa (LDH). Cuando se utilizó un exceso de detergente, se formó un sistema trifásico con una fase intermedia rica en detergente. El conjugado de detergente-colorante se repartió en esta fase rica en detergente. La enzima fue recuperada recogiendo la fase que contiene conjugado rico en detergente y sometiéndola a una separación de fases inducida por la temperatura.
Menet et al., Análisis, Volumen 23, 1995 se refiere a un procedimiento para purificar y separar proteínas con un sistema polimérico bifásico. Berggren et al., J. of Chrom A. 718 (1995), 67-79 describen los efectos de sales y de la hidrofobicidad de la superficie de las proteínas sobre la repartición de cinco proteínas en un sistema bifásico acuoso que contiene, como polímeros de la fase superior, PEG y copolímero al azar de óxido de etileno-óxido de propileno y, como polímero de la fase inferior, hidroxipropilalmidón. En CA Vol. 124, No. 7, 12.02.1996 se describe la separación de fases en mezclas concentradas de polímeros y surfactantes.
Como resulta evidente a partir de lo anterior, el uso de la separación en dos fases se ha dirigido principalmente a la purificación de macromoléculas hidrófilas, en particular enzimas. Sin embargo, ya es conocido el uso de sistemas bifásicos para purificar lipoproteínas hidrófobas. Así, Wiegel et al se relaciona con la repartición de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en sistemas bifásicos (J. Chromatogr. B, 661 (1994) pp. 159-164). Aquí se hace uso de dextrano y PEG para separar las partículas de HDL. El enriquecimiento preferido de partículas de HDL en la fase inferior hidrófila más rica en dextrano se atribuye al enlace de hidrógeno entre dextrano y las moléculas que constituyen las partículas de HDL (la apo-proteína de HDL).
La principal función de las lipoproteínas en el plasma es la de transportar lípidos, tales como colesterol y triglicéridos. Existen cuatro clases principales de lipoproteínas: quilomicras (CM), proteínas de muy baja densidad (VLDL), de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL). Entre estas, la HDL está implicada directamente en la eliminación de colesterol de tejidos periféricos, transportándolo de nuevo al hígado o bien a otras lipoproteínas, mediante un mecanismo conocido como ``transporte inverso de colesterol'' (RCT).
El papel ``protector'' de HDL ha sido confirmado en varios estudios. Estudios recientes dirigidos al mecanismo o mecanismos de protección ejercidos por HDL se han centrado en apolipoproteínas A-I (ApoA-I, de las cuales la Apo-AI-M es una variante, descrita en WO9012879), el principal componente de HDL. Los altos niveles de ApoA-I en plasma están asociados con un menor riesgo de CHD y de presencia de lesiones coronarias.
Se han propuesto varios métodos para purificar lipoproteínas, tales como ApoA y ApoE, bien del plasma o bien producidas por técnicas de ADN recombinante. A escala de laboratorio normalmente se utiliza centrifugado, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, focalización isoeléctrica, filtración en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (véase Methods in Enzymology, vol. 128, Academic Press, San Diego, CA, USA (1986)). La WO 93/00443 describe la purificación de Apolipoproteína E recombinante mediante el uso de iones magnesio y de un detergente no iónico. Sin embargo, existe la necesidad de disponer de otro método que sea más rápido, sensible y fiable para la preparación de ApoA y ApoE, especialmente a escala industrial o a escala de planta piloto.
Resumen de la invención
La presente invención se relaciona con un procedimiento para purificar apolipoproteína A o apolipoproteína E mezclando en primer lugar un material de partida que contiene apolipoproteína A o apolipoproteína E con un primer material polimérico, agua y al menos un componente elegido entre un segundo material polimérico y un surfactante, en donde el primer material polimérico y el segundo material polimérico y el surfactante son inmiscibles en la solución acuosa primaria resultante. El procedimiento comprende además mantener la solución acuosa primaria durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente las fases formadas, y luego separar la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E y el segundo material polimérico y el surfactante. El segundo material polimérico y el surfactante se separan de la apolipoproteína A o de la apolipoproteína E en una etapa inducida por la temperatura y posteriormente se recicla a la etapa de mezcla inicial. La ApoA o ApoE producida mediante el procedimiento se puede emplear para la preparación de un medicamento de utilidad en el tratamiento de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares, sepsis o aterosclerosis periférica, así como en un método de tratamiento de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares, sepsis o aterosclerosis periférica, cuando se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Descripción detallada de la invención
Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento de purificación eficaz para producir apolipoproteína A o apolipoproteína E con un contenido suficientemente bajo en impurezas para evitar así la necesidad de realizar otras etapas de purificación.
Otro objeto de la presente invención consiste en un procedimiento que proporciona un alto rendimiento de dicha apolipoproteína A o apolipoproteína E, es decir, un procedimiento con una pérdida mínima de producto.
Un objeto más de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento eficaz en donde, en el caso de entidades biológicas, se conserva esencialmente la actividad biológica de apolipoproteína A o apolipoproteína E.
Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento económico y respetuoso con el medio ambiente en donde se recicla una cantidad sustancial de los componentes para ser utilizados de nuevo.
Los objetos anteriores son satisfechos por la presente invención, la cual se relaciona con un procedimiento para la purificación de apolipoproteína A o apolipoproteína E, que comprende:
a)
mezclar, en orden arbitrario, el material de partida que contiene la apolipoproteína A o apolipoproteína E, un primer material polimérico hidrófilo, agua, un segundo material polimérico anfífilo y un surfactante, siendo el primer material polimérico y el segundo material polimérico y el surfactante inmiscibles en la solución acuosa primaria resultante y;
b)
mantener la solución acuosa primaria durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente las fases formadas;
(c)
separar la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E y el segundo material polimérico y el surfactante;
(d)
separar apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico y del surfactante en una separación inducida por la temperatura y a continuación
(e)
reciclar el segundo material polimérico y el surfactante separados a la etapa de mezcla inicial (a).
Una modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un procedimiento para purificar apolipoproteína A o apolipoproteína E, que comprende mezclar un material de partida que contiene apolipoproteína A o apolipoproteína E con un primer material polimérico, agua y al menos un componente elegido entre un segundo material polimérico y un surfactante, exhibiendo el segundo material polimérico y el surfactante características de solubilidad inversa, mantener la solución acuosa primaria resultante durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente las fases formadas y separar la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E y el segundo material polimérico y el surfactante. A continuación, se separa apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico y del surfactante calentado la fase separada a una temperatura por debajo de la temperatura en donde se presenta la degradación de apolipoproteína A o apolipoproteína E pero por encima del punto de turbidez del segundo material polimérico y del surfactante para precipitar dicho segundo material polimérico y dicho surfactante, tras lo cual se separa la fase que contiene el segundo material polimérico y el surfactante precipitados de la fase que contiene apolipoproteína A o apolipoproteína E.
La presente invención proporciona un procedimiento en dos fases acuosas, económico y respetuoso con el medio ambiente, para purificar apolipoproteína A o apolipoproteína E, puesto que el segundo material polimérico y el surfactante pueden ser reciclados varias veces con solo pequeñas pérdidas en cada ciclo, al tiempo que esencialmente no se alteran la pureza y el rendimiento de apolipoproteína A o apolipoproteína E producida según el presente procedimiento. En particular, los inventores de la presente invención han comprobado que la separación en dos fases acuosas en combinación con la separación de fases inducida por la temperatura y el reciclo de uno o más compuestos químicos del procedimiento, se pueden utilizar de un modo eficaz para purificar lipoproteínas tales como ApoA y ApoE.
Con la presente invención es posible reciclar, a la etapa de mezcla inicial, al menos un 60% aproximadamente de la cantidad inicial del segundo material polimérico y del surfactante, adecuadamente al menos el 70% y con preferencia al menos el 80% de la cantidad inicial del segundo material polimérico y del surfactante.
En la etapa principal de separación en dos fases acuosas, se pueden emplear varias combinaciones de componentes, es decir, un primer material polimérico y un segundo material polimérico, un primer material polimérico y un surfactante o un primer material polimérico, un segundo material polimérico y un surfactante. En todas estas modalidades, los componentes deben ser inmiscibles en la solución acuosa primaria. Por tanto, en una modalidad de la presente invención, uno de los materiales poliméricos deberá ser esencialmente hidrófilo y el otro más hidrófobo pero todavía soluble en agua, es decir, anfífilo. Igualmente, las concentraciones del primero y segundo materiales poliméricos deberán ser lo suficientemente altas para llevar a cabo una separación de fases en al menos dos fases. Ejemplos del primer material polimérico hidrófilo para utilizarse en la presente invención incluyen hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilalmidones, almidón, dextrano, pululano y mezclas de los mismos. El pululano es un polisacárido microbiano previamente utilizado para purificar enzimas en sistemas bifásicos acuosos (Nguyen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 27 (1988) pp. 341-346). Los hidroxialquilalmidones se eligen adecuadamente del grupo consistente en hidroximetilalmidón, hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón y mezclas de los mismos. El peso molecular del primer material polimérico hidrófilo puede ser del orden de 5.000 a 5.000.000 Da, adecuadamente del orden de 40.000 hasta 500.000 Da y con preferencia del orden de 100.000 hasta 300.000 Da. Ejemplos específicos de hidroxialquilalmidones adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen Reppal PE 100 y Reppal PES 200, siendo ambos hidroxipropilalmidones comercializados por Carbamyl AB of Kristianstad, Suecia. El peso molecular medio de Reppal PES 100 y Reppal PES 200 es de 100.000 Da y de 200.000 Da, respectivamente.
Como se ha indicado en el párrafo anterior, el segundo material polimérico deberá ser anfífilo y soluble en agua. La apolipoproteína A o la apolipoproteína E se extraerán en la fase más hidrófoba y con ello se separarán de los contaminantes más hidrófilos, tales como proteínas en bruto encontradas normalmente en plasma y en soluciones/caldos de fermentación en bruto o que se han purificado parcialmente procedentes de procesos de ADN recombinante. Ejemplos de dichos contaminantes son proteínas de E. Coli. En los experimentos descritos en los ejemplos de la presente solicitud, el co-polímero anfífilo y el surfactante fueron repartidos principalmente en la fase superior. Por tanto, en estos experimentos la porción principal de ApoA o ApoE fue distribuida en la fase superior rica en copolímero y surfactante.
En la presente invención, el segundo material polimérico exhibe preferentemente solubilidad inversa. La expresión ``solubilidad inversa'' significa que la solubilidad del material polimérico varía inversamente con la temperatura de la solución. Esto significa que la solubilidad del material polimérico disminuye a medida que aumenta la temperatura de la solución. Por tanto, la solubilidad inversa está directamente opuesta al efecto de temperatura exhibido por la mayoría de los solutos.
Dentro del alcance de la presente invención se encuentran también las composiciones que contienen tres o más materiales poliméricos. Así, la separación multi-fásica se puede obtener seleccionando combinaciones adecuadas de tres o más materiales poliméricos y concentraciones suficientemente altas de los mismos en la solución acuosa primaria.
En la presente invención, la expresión ``solución acuosa primaria'' se refiere a la etapa de separación inicial antes de la separación en al menos dos fases, salvo que se indique lo contrario.
La solución primaria es acuosa, es decir, la porción principal del disolvente es agua. El agua se puede añadir por separado o junto con cualesquiera de los componentes necesarios para la etapa de separación primaria. De este modo, se pueden emplear una o más soluciones acuosas que contienen apolipoproteína A o apolipoproteína E, primer o segundo material polimérico o surfactante para introducir el componente per se así como el agua requerida para constituir la solución acuosa primaria.
La concentración del compuesto diana en la solución acuosa primaria puede ser del orden de 0,1 a 50 g/l de la solución acuosa primaria, adecuadamente del orden de 0,5 a 20 g/l y preferentemente del orden de 1 a 10 g/l.
La concentración del primer material polimérico hidrófilo en la solución acuosa primaria puede ser del orden de 1 a 30% en peso del peso total de la solución acuosa primaria, adecuadamente del orden de 3 a 20% en peso y con preferencia del orden de 5 a 15% en peso.
En la solución acuosa primaria, la concentración del segundo material polimérico anfífilo puede ser del orden de 0,5 a 30% en peso del peso total de la solución acuosa, adecuadamente del orden de 3 a 20% en peso y con preferencia del orden de 5 a 15% en peso.
En la solución acuosa primaria, la relación entre la concentración del compuesto diana y el segundo material polimérico anfífilo puede ser del orden de 3:1 a 1:2.500, calculado en peso, adecuadamente del orden de 2:3 a 1:400 en peso y con preferencia del orden de 1:3 a 1:150 en peso.
En la solución acuosa primaria, la relación entre la concentración del primer material polimérico hidrófilo y el segundo material polimérico anfífilo puede ser del orden de 20:1 a 1:10, calculado en peso, adecuadamente del orden de 10:1 a 1:5 en peso y con preferencia del orden de 5:1 a 1:2 en peso.
Después de mezclar la apolipoproteína, es decir, ApoA o ApoE, con el primer material polimérico y con el segundo material polimérico y el surfactante, la solución acuosa primaria se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente las dos fases al menos formadas. Este periodo de tiempo puede ser del orden del 2 minutos a 5 horas, adecuadamente del orden de 5 minutos a 2 horas y con preferencia del orden de 10 minutos a 1 hora. Sin embargo, el periodo de tiempo requerido para la separación de fases se puede reducir empleando, por ejemplo, separación centrífuga, centrifugación centrífuga o decantación centrífuga, antes de dejar que la solución acuosa primaria se separe en al menos dos fases. Si se emplean dichos medios, el periodo de tiempo para la separación en al menos 2 fases puede oscilar desde 5 segundos hasta 60 minutos aproximadamente y adecuadamente desde 10 segundos a 30 minutos.
La temperatura de la solución acuosa primaria se encuentra Adecuadamente en el intervalo de 5 a 40º C y con preferencia en el intervalo de 15 a 30º C.
En otra modalidad de la presente invención, en la solución acuosa primaria está presente un compuesto que contiene 2 o 3 átomos de nitrógeno enlazados a un átomo de carbono. De este modo, se pueden mejorar la purificación y el rendimiento, puesto que el compuesto diana se reparte más fácilmente en la fase más hidrófoba. Ejemplos adecuados de dichos compuestos nitrogenados son urea, arginina, hidrocloruro de guanidina, benzamidina y mezclas de los mismos, preferentemente urea. En el caso de que se utilice, la concentración del compuesto que contiene dos o tres átomos de nitrógeno enlazados a un átomo de carbono deberá ser del orden de 0,5 M hasta la saturación, adecuadamente del orden de 1 M a 8 M y con preferencia del orden de 1,5 M a 6 M.
En la solución acuosa primaria, la relación entre el compuesto diana y el compuesto nitrogenado puede ser del orden de 1:1 a 1:5.000 aproximadamente, calculado en peso, adecuadamente del orden de 1:4 a 1:700 en peso y con preferencia del orden de 1:6 a 1:250 en peso.
La repartición del compuesto diana en la fase más hidrófoba se puede mejorar añadiendo un compuesto con un catión hidrófobo a la solución acuosa primaria. Compuestos adecuados incluyen sales inorgánicas que contienen cationes tales como trimetilamonio, trietilamonio, tripropilamonio, tributilamonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, tetrapropilamonio y tetrabutilamonio, todos ellos de cadena lineal o ramificada, y aniones tales como fosfatos, sulfato, nitrato, cloruro y bicarbonato. Un ejemplo específico es el fosfato de trietilamonio.
La repartición de moléculas entre las fases de sistemas bifásicos se describe por el coeficiente de repartición K. Este se define como K = C_{T}/C_{B}\eqnum{(1)} en donde
C_{T} = la concentración en la fase superior de la molécula de interés
C_{B} = la concentración en la fase inferior de la molécula de interés.
En muchos casos, en los experimentos de repartición se utiliza la relación de distribución G. Esta se define como la relación entre la cantidad total de sustancia repartida en cada fase:
G = Kx(V_{T}/V_{B})\eqnum{(2)}
en donde
V_{T} = volumen de la fase superior
V_{n} = volumen de la fase inferior.
La repartición de moléculas entre las fases de sistemas bifásicos se puede demostrar en diagramas de fases. Aquí, la línea límite entre una y otra fase recibe el nombre de curva binodial. La concentración de polímero de las dos fases en equilibrio entre sí viene definida por líneas de conexión en el diagrama de fases. El hecho de aumentar la concentración de polímero, es decir, aumentar la longitud de la línea de conexión, conduce a una repartición más extrema en sistemas bifásicos (G. Johansson, Methods in Enzymology, vol. 228 (1994) pp. 28-42). El experto en la materia podrá llevar a cabo experimentos para llegar a las condiciones idóneas para lograr una repartición adecuada entre las dos fases.
Dos combinaciones adecuadas de un primer material polimérico hidrófilo y de un segundo material polimérico anfífilo, para utilizarse en la presente invención, son Reppal PES 200 en combinación con UCON 50-HB-5100 y Reppal PES 200 en combinación con EO_{30}PO_{70}. Diagramas de fases que muestran la repartición entre las dos fases en estos sistemas pueden encontrarse en P.A. Alred et al, Journal of Chromatography, 659 (1994) pp. 289-298, y R.F. Modlin et al, Journal of Chromatography, 668 (1994) pp. 229-236, respectivamente.
La presencia de un surfactante en la solución acuosa primaria tiene como finalidad aumentar la repartición de apolipoproteína A o apolipoproteína E en la fase más hidrófoba. Por tanto, el surfactante es adecuadamente un anfífilo, es decir, un compuesto que contiene un grupo hidrófilo soluble en agua enfrentado al entorno acuoso y un grupo hidrófobo insoluble en agua enfrentado a apolipoproteína A o apolipoproteína E. Con preferencia, el grupo hidrófilo se asemeja a la estructura química del segundo material polimérico, puesto que ello facilita la repartición tanto del segundo material polimérico como del surfactante en la fase superior del sistema acuoso primario.
Los surfactantes anfífilos se caracterizan por la concentración micelar crítica (CMC), la cual es la concentración mínima para que el surfactante forme micelas completas. Los anfífilos se caracterizan además por su equilibrio hidrófilo- lipófilo (HLB). El valor HLB es una medida cuantitativa de la naturaleza hidrófila general del surfactante en cuestión, en donde un valor HLB más elevado representa un carácter hidrófilo mayor del surfactante. En la presente invención, el valor HLB es convenientemente del orden de 5 a 80, adecuadamente del orden de 8 a 30 y con preferencia del orden de 10 a 20. Los valores HLB para un número grande de surfactantes pueden encontrarse en McCutcheon's, vol. 1, Emulsifiers and Detergents, North American Ed., 1993.
En la presente invención, se emplea un segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa. En este caso, la separación de fases inducida por la temperatura se lleva a cabo después de la etapa principal de separación en dos fases acuosas calentando la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E a una temperatura por encima del punto de turbidez del segundo material polimérico. Este fenómeno se puede usar con ventaja en la presente invención también con surfactantes que exhibe solubilidad inversa. De este modo, seleccionando un surfactante adecuado y condiciones adecuadas del proceso con respecto, por ejemplo, a la concentración de los diversos componentes, pH, concentración iónica y temperatura, es posible separar el surfactante que exhibe solubilidad inversa de la apolipoproteína A o apolipoproteína E. En la presente invención también es concebible el uso de una combinación de un segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa y de un surfactante que exhibe solubilidad inversa, en donde el punto de turbidez puede ser el mismo o diferente para los dos componentes.
En general, en la presente descripción, la información referente al segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa es igualmente aplicable a los surfactantes que exhiben solubilidad inversa.
Ejemplos de surfactantes que pueden ser utilizados convenientemente en la solución acuosa primaria de la presente invención incluyen surfactantes no iónicos, aniónicos y catiónicos. Resulta adecuado usar un surfactante anfífilo que puede exhibir solubilidad inversa, y preferentemente un surfactante no iónico. Surfactantes no iónicos adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen alquiletoxilatos, ésteres de polioxietilensorbitán y de ácidos grasos, co-polímeros en bloque, polioxietilenalquiléteres, poliglicoléteres y alquilglicósidos. Se prefieren los surfactantes que contienen una cola de polietilenglicol que se asemejan a la estructura química de los segundos materiales poliméricos preferidos, por ejemplo, UCON 50-HB-5100 y Breox PAG 50A 1000. Ejemplos de alquiletoxilatos son polioxietilenoctilfeniléteres, por ejemplo, Triton® X-100 y Triton® X-114, ambos comercializados por Union Carbide en USA. Triton® X-100 y Triton® X-114 tienen una cabeza hidrófoba de octil-fenilo y una cola hidrófila de polioxietileno, con un punto de turbidez de 22ºC y 65ºC, respectivamente. El punto de turbidez para compuestos análogos se puede aumentar incrementando la longitud de la mitad hidrófila, mientras que el punto de turbidez se puede disminuir aumentando la longitud de la mitad hidrófoba. El compuesto Triton® X-100 se caracteriza además por un valor HLB de 13,5. Ejemplos de ésteres de polioxietilensorbitan y de ácidos grasos son monolaurato de polioxi-etilen-(20)-sorbitan, por ejemplo Tween® 80, y monooleato de polioxi-etilen-(20)-sorbitan, por ejemplo Tween® 20, ambos comercializados por ICI de Gran Bretaña. Ejemplos de co-polímeros en bloque son combinaciones de polipropilenglicol y polietilenglicol, por ejemplo Pluronic® comercializado por BASF en Alemania. Ejemplos adecuados de polioxietilenalquiléteres son C_{12}E_{5}, C_{12}E_{8} y Brij. Un ejemplo adecuado de un poliglicoléter es Tergitol.
Surfactantes aniónicos adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen diversos ácidos biliares y ésteres y sales de los mismos, tales como sales de ácido deoxicólico y ácido cólico. Ejemplos específicos incluyen deoxicolato sódico y colato sódico. Otros surfactantes aniónicos adecuados incluyen sales de ácido alquilsulfónico y ácido alquilsulfúrico, por ejemplo dodecilsulfato sódico (SDS).
Surfactantes catiónicos adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen sales de alquiltrimetilamonio, por ejemplo, CTAB y CTAC, sales de cetilpiridinio y sales de dimetiloctadecilamonio.
Los surfactantes usados en la presente invención pueden ser modificados para mejorar sus propiedades en los sistemas bifásicos acuosos. Por ejemplo, introduciendo colorantes, tal como Cibacron Blue. Sin embargo, por motivos de economía y sencillez es preferible usar surfactantes que están sin modificar.
La concentración del surfactante en la solución acuosa primaria puede ser del orden de 0,1 a 30% (p/p), adecuadamente del orden de 0,25 a 20% (p/p) y con preferencia del orden de 0,5 a 10% (p/p).
Es preferible que la concentración del surfactante en la solución acuosa primaria sea igual a o mayor que la CMC. La CMC depende principalmente del surfactante per se, de los componentes de la solución y de su concentración, de la temperatura y del pH. La CMC de ésteres de polioxietilensorbitán y de ácidos grasos (polisorbatos) se describe de manera específica en un artículo de Wan et al, J. Pharm. Sci., vol. 63, No. 1 (1974) pp. 136-137.
Después de la separación principal en dos fases, se separa la fase acuosa que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E y el segundo material polimérico y el surfactante. A continuación, se separa apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico y del surfactante mediante una etapa inducida por la temperatura.
En una modalidad preferida, la separación de fases inducida por la temperatura se efectúa calentando la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E a una temperatura por encima del punto de turbidez del segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa pero por debajo de la temperatura en donde se presenta la degradación de apolipoproteína A o apolipoproteína E. El punto de turbidez o la temperatura de separación de fases es un aspecto característico de materiales poliméricos que exhiben solubilidad inversa. Así, elevando la temperatura de una solución que contiene dicho material polimérico por encima del punto de turbidez, la solución se vuelve turbia debido a la separación en dos fases y a la precipitación del material polimérico que exhibe solubilidad inversa. Con ello se obtiene una segunda separación de fases, en donde se forman una fase rica en polímero y una fase rica en agua. La fase rica en agua está casi libre de polímero, es decir, generalmente contiene menos de 1% de polímero. De forma convencional, igualmente, la fase rica en polímero forma la fase inferior después del calentamiento, puesto que la densidad de la fase rica en polímero es normalmente más alta que la de la fase rica en agua. Sin embargo, las densidades se pueden invertir a través de diversas manipulaciones, por ejemplo, adición de compuestos químicos, tal como urea, en cantidades suficientes. En la presente invención, la apolipoproteína A o la apolipoproteína E se suelen repartir de forma casi exclusiva en la fase rica en agua, reduciendo con ello la necesidad de realizar una purificación adicional del producto en cuestión.
Para hacer posible el uso técnico y económico de materiales poliméricos que exhiben solubilidad inversa, el punto de turbidez debe estar por encima del punto de congelación de la solución y por debajo de 100ºC. En la presente invención, el punto de turbidez del segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa puede ser del orden de 5 a 90ºC, adecuadamente del orden de 10 a 65ºC. Con preferencia, el punto de turbidez del segundo material polimérico que exhibe solubilidad inversa reside en el intervalo de 15 a 60ºC, más preferentemente en el intervalo de 20 a 40ºC.
La temperatura a la cual debe elevarse la fase que contiene el segundo material polimérico, en la separación de fases inducida por la temperatura, se puede reducir seleccionando un segundo material polimérico con un punto de turbidez adecuadamente bajo, como resulta evidente a partir del párrafo anterior. Sin embargo, la temperatura a la cual debe elevarse la fase que contiene el segundo material polimérico para llevar a cabo la precipitación del segundo material polimérico, se puede reducir también añadiendo a dicha fase una pequeña cantidad de una sal orgánica o más normalmente inorgánica. De este modo, el punto de turbidez de UCON 50-HB-5100 que es de 50ºC en ausencia de sal, se puede disminuir, por ejemplo, a 37ºC por adición de sal. Sin embargo, es preferible que la separación de fases inducida por la temperatura se efectúe en ausencia esencial de sal, puesto que ello facilita la posterior purificación de apolipoproteína A o apolipoproteína E.
Materiales poliméricos que exhiben solubilidad inversa y adecuados para utilizarse en la presente invención como el segundo material polimérico pueden encontrarse en I.Y. Galaev et al, Enzyme Microb. Tech., vol. 15 (1993), pp. 354-366. Concretamente, los materiales poliméricos que exhiben solubilidad inversa y que son adecuados para utilizarse en la presente invención como el segundo material polimérico incluyen polialquilenglicoles, polímeros de poli(oxialquileno), copolímeros de poli(oxialquileno), polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, polivinilcaprolactama, polivinilmetiléter, almidones alcoxilados, celulosa alcoxilada, alquilhidroxialquilcelulosa, poliéteres modificados con silicona y mezclas de los anteriores. Polialquilenglicoles adecuados incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol y sus derivados, tales como polietilen- y polipropilenglicol acrílico- y metacrílico-sustituidos. Almidones alcoxilados y celulosa alcoxilada adecuados incluyen almidones y celulosa metoxilados y etoxilados. Alquilhidroxialquilcelulosas adecuadas incluyen aquellas celulosas en donde los grupos alquilo tienen de 1 a 4 átomos de carbono. Una alquilhidroxialquilcelulosa preferida es etilhidroxietilcelulosa (EHEC). Copolímeros de poli(oxialquileno) adecuados incluyen copolímeros al azar y en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno. La hidrofobicidad de los copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno aumenta a medida que lo hace el contenido en óxido de propileno. El contenido en óxido de propileno del copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno reside adecuadamente en el intervalo de alrededor de 30 a 90% en peso con respecto al peso total del copolímero, preferentemente en el intervalo de 40 a 80% en peso. Un ejemplo específico de un copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno, adecuado para utilizarse en la presente invención, es UCON 50-HB-5100 comercializado por Union Carbide, Corp., New York City, NY, USA. UCON 50-HB-5100 es un copolímero al azar no iónico, lineal, constituido por 50% en peso de óxido de etileno y 50% en peso de óxido de propileno, con un peso molecular (M_{r}) de 4.000 Da y un punto de turbidez de 50ºC. Otro ejemplo específico de un copolímero al azar compuesto por 50% en peso de óxido de etileno y 50% en peso de óxido de propileno es Breox PAG 50A 1000 comercializado por International Speciality Chemicals Ltd. de Southampton, England. Breox PAG 50A 1000 tiene un peso molecular (M_{r}) de 3.900 Da y un punto de turbidez de 50ºC. Otro ejemplo de un copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno, adecuado para usarse en la presente invención, es EO_{30}PO_{70} el cual es un copolímero al azar constituido por 30% en peso de óxido de etileno y 70% en peso de óxido de propileno, con un peso molecular (M_{r}) de 3.200 Da y un punto de turbidez de 38ºC. Otro ejemplo adecuado es EO_{20}PO_{80} el cual es un copolímero al azar constituido por 20% en peso de óxido de etileno y 80% en peso de óxido de propileno, con un peso molecular (M_{r}) de 3.300 Da y un punto de turbidez de 25ºC en una solución acuosa que contiene 10% en peso del copolímero. EO_{30}PO_{70} y EO_{20}PO_{80} son comercializados por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA.
La descripción de la patente japonesa publicada con el número JP 1994-228319 de Hidetoshi Tsuchida, describe otros materiales poliméricos que exhiben solubilidad inversa. Los materiales poliméricos comprenden copolímeros en bloque de óxido de propileno y otro polímero soluble en agua con un peso molecular por encima de 30.000 Da.
La concentración del producto diana en la segunda solución acuosa puede ser del orden de 0,1 a 50 g/l de la segunda solución acuosa, adecuadamente del orden de 0,5 a 20 g/l y con preferencia del orden de 1 a 10 g/l.
En la etapa de separación de fases, inducida por la temperatura, la fase más hidrófoba procedente de la etapa de separación acuosa primaria se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico. Este periodo de tiempo puede ser del orden de 60 segundos hasta varias horas, adecuadamente del orden de 5 minutos a 1 hora y preferentemente del orden de 10 a 30 minutos. Sin embargo, el periodo de tiempo requerido para la separación de fases se puede reducir empleando, por ejemplo, separación centrífuga, centrifugación centrífuga o decantación centrífuga, antes de dejar que se separe apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico. Si se utilizan dichos medios, el periodo de tiempo para la separación puede ser del orden de 5 segundos a 60 minutos y adecuadamente del orden de 10 segundos a 30 minutos.
El presente procedimiento puede ser continuo, por ejemplo realizado en una columna, o discontinuo.
La presente invención se puede emplear convenientemente para purificar apolipoproteína A o apolipoproteína E presente en caldos de fermentación sin tratar obtenidos en la producción mediante técnicas de ADN recombinante. En la presente invención, los caldos de fermentación pueden contener productos extracelulares y/o intracelulares tales como proteínas, así como restos celulares, tales como las células de los organismos de partida y/o fragmentos celulares. La presente invención se puede emplear convenientemente también para purificar caldos de fermentación que han sido tratados previamente, por ejemplo, mediante centrifugado, filtración, ultrafiltración o floculación, para separar la totalidad o esencialmente la totalidad de los restos celulares.
La presente invención se puede aplicar a ApoA o ApoE obtenidas de plasma, adecuadamente de plasma humano, o producidas por una técnica de ADN recombinante, adecuadamente en bacterias gram-negativas, y preferentemente en E. Coli. La ApoA o la ApoE pueden estar sin purificar, o esencialmente sin purificar, o bien pueden tratarse previamente antes de aplicar la presente invención. Ejemplos de tratamientos previos son diafiltración, precipitación con ultrafiltración y diversos tipos de cromatografía.
ApoA's conocidas son, por ejemplo, ApoA-I, ApoA-II y ApoA-IV. En la presente invención, adecuadamente, la ApoA es ApoA-I. La ApoA-I de plasma natural es una cadena de polipéptido simple de 243 aminoácidos, cuya secuencia primaria es conocida (Brewer et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Común. 80: 623-630). Más adecuadamente, la ApoA es una forma mutada de ApoA-I en donde al menos un residuo Cys ha sido sustituido por un residuo aminoácido, preferentemente un residuo Arg, posibilitando la formación de un dímero enlazado con disulfuro. En la secuencia de aminoácidos de la ApoA-I humana natural, los residuos Arg están situados en las posiciones 10, 27, 61, 83, 116, 123, 131, 149, 151, 153, 160, 171, 173, 177, 188 y 215.
La apolipoproteína humana A-IMilano (ApoA-IM) es una forma mutada de origen natural de ApoA-I normal (Weis graber et al. (1980) J. Clin. Invest. 66: 901-907). En ApoA-IM, un residuo del aminoácido arginina (Arg 173) ha sido reemplazado por un residuo del aminoácido cisteína (Cys 173). Dado que ApoA-IM contiene un residuo cisteína por cadena polipéptido, puede existir como un monómero o como un dímero enlazado con disulfuro. El peso molecular del monómero es de alrededor de 28.000 Da y para el dímero de alrededor de 56.000 Da. Estas dos formas son químicamente intercambiables y el término ApoA-IM no discrimina, en el presente contexto, entre las dos formas.
La ApoA-IM es una proteína que contiene al menos seis segmentos principales de hélice \alpha y con una estructura muy grasa. Varias de las hélices \alpha son anfífilas, creando una proteína anfífila en donde una superficie es hidrófoba y la otra es hidrófila (D. Eisenberg et al, Nature, vol. 299 (1982), pp. 371-374). Las propiedades anfífilas de ApoA-IM y de otras ApoAs crean una tendencia a la formación de estructuras micelares con otras proteínas y lípidos en soluciones acuosas.
Para hacer posible la producción de cantidades suficientes de ApoA-I en general, y más específicamente de ApoA-IM, se utilizan técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, en E. Coli. A este respecto, la preparación recombinante y el uso de ApoA-IM, monómeros así como dímeros, se describen en las patentes WO-A- 88/03166 cedida a Farmitalia Carlo Erba (FICE), WO-A-90/12879 cedida a Sirtori et al, así como WO-A-93/12143 y WO-A-94/13819 ambas cedidas a Pharmacia & Upjohn AB (formerly Kabi Pharmacia AB).
Los porcentajes y las partes son en peso, salvo que se indique lo contrario.
Experimental Materiales
La apolipoproteína recombinante A-IM fue producida en E. Coli por Pharmacia & Upjohn AB en Stockholm, Sweden. Las células fueron separadas y el filtrado se concentró cuatro veces por ultrafiltración usando una membrana con un corte de 10.000 Da. La concentración de ApoA-IM y la concentración total de proteína después de la ultrafiltración fueron de 3,5 mg/ml y 35 mg/ml, respectivamente. Este material se utilizó como material de partida en los ejemplos 1-4.
Los polímeros en la fase inferior fueron dos polímeros de hidroxipropilalmidón, Reppal PES 100 y Reppal PES 200, ambos obtenidos en Carbamyl AB de Kristianstad, Sweden, y un polímero de hidroxietilalmidón, Solfarex A85 obtenido en AVEBE de Vendum, the Netherlands. Reppal PES 100 y Reppal PES 200 tenían un peso molecular (M_{r}) de 100.000 y 200.000, respectivamente, y se emplearon en forma pura, seca, en la preparación de los sistemas bifásicos. Solfarex A85 tenía un peso molecular sin definir pero más elevado que Reppal PES 200. Se calentó una solución madre al 50% (p/p) de Solfarex A85 a 80-90º C para disolver el polímero hidrófilo antes de preparar los sistemas bifásicos.
El polímero de la fase superior Breox PAG 50A 1000 (M_{r} 3.200) se obtuvo en International Speciality Chemicals Ltd. de Southampton, England. Breox PAG 50A 1000 tiene un peso molecular (M_{e}) de 3.900 Da y un punto de turbidez de 50ºC. El Breox PAG 50A 1000 se utilizó en forma pura, seca, en la preparación de los sistemas bifásicos.
El peso total de los sistemas bifásicos primarios fue de 5 g. Se añadieron 3,75 g de la solución de proteína de partida al sistema, cuando se utilizó Reppal PES 100 como polímero de la fase inferior. Cuando se utilizó Solfarex A85 como polímero de la fase inferior, la cantidad de solución de proteína añadida a los sistemas fue de 3,35 g.
Se obtuvo Triton® X-100 en Boehringer Mannheim en Mannheim, Germany. Triton® X-100 es un surfactante no iónico con un punto de turbidez de 65ºC y una CMC de 3,1 x 10^{-4} mol/l. Se obtuvieron Tween® 20 y Tween® 80 en Sigma Chemicals Co. of Saint Louis, MO, USA. Tween® 20 es un surfactante no iónico con un punto de turbidez de 76ºC y una CMC de 5,9 x 10^{-5} mol/l. Tween® 80 es un surfactante no iónico con un punto de turbidez de 65ºC y una CMC de 1,0 x 10^{-5} mol/l.
Todos los compuestos químicos fueron de calidad de reactivos analíticos.
Métodos y cálculos analíticos
Se determinó el contenido total en proteína de acuerdo con Bradford, Anal. Biochem., vol. 72 (1976) pp. 248-254, empleando Coomassie Brilliant Blue G. Se midió la absorción en 595 y 465 nm y la absorción obtenida a 465 nm se restó entonces de la absorción obtenida a 595 nm. Se utilizó albúmina de suero bovino como referencia.
La purificación de ApoA-IM en las fases superiores fue analizada en electrofóresis en gel Phast, 20% SDS-PAGE (Pharmacia & Upjohn AB, Uppsala, Sweden). Los geles fueron manchados con Coomassie Blue y explorados con un densitómetro (Personal Densitometer SI, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Con ayuda del densitómetro, pudo determinarse el porcentaje de ApoA-IM de la concentración total de proteína. Este valor se utilizó para calcular el grado de purificación: Grado\;de\;purificación = P^{S}_{Apo}/P_{Apo}\eqnum{(3)} en donde
P^{S}_{Apo} = porcentaje de ApoA-IM de la proteína total en la muestra
P_{Apo} = porcentaje de ApoA-IM de la proteína total en el material de partida
Se utilizó la altura superior para calcular el rendimiento. Se efectuaron ajustes en cuanto al cambio de volumen y a la dilución de las muestras.
Rendimiento = (altura superior x V^{t} x dilución)_{muestra}/(altura superior x V x dilución)_{material de partida} x 100\eqnum{(4)}
en donde
V^{t} = volumen de la fase superior rica en agua después de la separación térmica
V = volumen del material de partida añadido al sistema bifásico.
El rendimiento en ApoA-IM puede calcularse también como:
Rendimiento = (C^{t}_{Apo }* V^{t}) / (C_{Apo }* V) x 100\eqnum{(5)}
en donde
C^{t}_{Apo} = concentración de ApoA-IM en la fase superior rica en agua después de la separación térmica
C_{Apo} = concentración de ApoA-IM en el material de partida
V^{t} = volumen de la fase superior rica en agua después de la separación térmica y
V = volumen del material de partida añadido al sistema bifásico.
El grado de purificación de ApoA-IM en los sistemas puede calcularse también como:
Grado\;de\;purificación = (C^{t}_{Apo}/C^{t}) / C_{Apo}/C)\eqnum{(6)}
en donde
C^{t}_{Apo} = concentración de ApoA-IM en la fase superior rica en agua después de la separación térmica
C_{Apo} = concentración de ApoA-IM en el material de partida
C^{t} = concentración total de proteína en la fase superior rica en agua después de la separación térmica y
C = concentración total de proteína en el material de partida.
Las concentraciones de polímero se calcularon como % en peso/peso (p/p).
En los experimentos con reciclo de copolímero y surfactante de la fase superior, se separó la fase superior del sistema primario después de la separación de fases y se pesó. Después de la separación térmica, las fases fueron aisladas y pesadas de nuevo. Las fases superiores fueron analizadas respecto al contenido en Triton® X-100 midiendo la absorción a 275 nm. Se calculó la concentración de Breox PAG 50A 1000 midiendo el índice de refracción y restando la parte procedente de Triton® X-100. De este modo, pudo determinarse la recuperación de polímero y surfactante.
Ejemplo 1
Empleando ApoA-IM como proteína diana se estudió el efecto sobre la purificación y rendimiento de la separación principal en dos fases acuosas seguido por la separación de fases inducida por la temperatura. Después de separar las células, se añadió una solución de fermentación de E. Coli que contiene ApoA-IM a una solución acuosa que contiene Reppal PES 100, Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100. Con ayuda de un agitador magnético se mezcló la solución acuosa primaria resultante que contiene 8% Reppal PES 100, 16% Breox PAG 50A 1000 y 0 a 4,0% (p/p) Triton® X-100. La temperatura de la solución acuosa primaria fue de 22º C. La separación en dos fases se mejoró centrifugando a 1.360 g durante 10 minutos. Después de la separación de fases en el sistema acuoso primario, se llevó a cabo la separación de fases inducida por la temperatura manteniendo la fase superior aislada a 60ºC durante 30 minutos.
El Triton® X-100 se repartió principalmente en la fase superior, siendo el coeficiente de repartición K de 5,5, calculado según la fórmula (1), a una concentración de surfactante de 1,0% (p/p).
En la tabla I se indican el grado de purificación y el rendimiento de ApoA-IM después de separarse de Reppal PES 100 en la etapa de separación principal en dos fases acuosas y de Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 en la separación de fases inducida por la temperatura. El grado de purificación y el rendimiento se determinaron mediante exploración en gel con un densitómetro.
TABLA I 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{4}{|c|}{Efecto
de la concentración del surfactante en una etapa de separación 
principal en dos fases acuosas}\\\multicolumn{4}{|c|}{sobre el
rendimiento y la purificación de ApoA  -  IM  después de
una  posterior etapa de
separación}\\\multicolumn{4}{|c|}{térmica}\\\hline  Ensayo  \+
Concentración de  \+ Grado de purificación  \+ Rendimiento (%) \\  
\+ surfactante (%) \+ \+ \\\hline  comparativo  \+ 0,0  \+ 1,4  \+ 8
\\\hline  1  \+ 0,25  \+ 6,7  \+ 69 \\\hline  2  \+ 0,5  \+ 6,8  \+
77 \\\hline  3  \+ 1,0  \+ 6,7  \+ 88 \\\hline  4  \+ 2,0  \+ 5,7 
\+ 91 \\\hline  5  \+ 4,0  \+ 5,5  \+ 88
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como resulta evidente a partir de la tabla I, el uso de una composición que contiene un surfactante y un primero y un segundo materiales poliméricos en la etapa de separación principal en dos fases acuosas mejora de forma drástica el rendimiento y la pureza resultantes de ApoA-1M después de una posterior etapa de separación térmica, en comparación con el experimento comparativo en donde el surfactante estaba ausente en la etapa de separación principal en dos fases acuosas.
Ejemplo 2
Se repitió el procedimiento según el ejemplo 1 con la diferencia de que se emplearon dos materiales poliméricos hidrófilos y tres surfactantes diferentes con concentraciones variables. La solución bifásica acusa primaria contenía 8% Reppal PES 100 o 8% Solfarex A85, 16% Breox PAG 50A 1000 y 1,0% Triton® X-100, 2,0% Tween® 80 o 2,0% Tween® 20. Los resultados se ofrecen en la tabla II.
TABLA II 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{5}{|c|}{Efecto
del surfactante y del polímero de la fase inferior sobre el 
rendimiento y la purificación
de}\\\multicolumn{5}{|c|}{ApoA  -  1M después de una
posterior etapa de separación térmica}\\\hline  Surfactante  \+
Reppal PES 100  \+ Reppal PES 100  \+ Solfarex A85  \+ Solfarex A85
\\\dddcline{2}{5}  concentración (%)  \+ Grado de  \+ Rendimiento
(%)  \+ Grado de  \+ Rendimiento (%) \\   \+ purificación  \+  \+
purificación \+ \\\hline  Triton® X  -  100 1,0%  \+ 7,2
 \+ 85  \+ 7,0  \+ 77 \\\hline  Tween® 80 2,0%  \+ 7,5  \+ 54  \+
5,5  \+ 45 \\\hline  Tween® 20 2,0%  \+ 7,4  \+ 40  \+ 6,5  \+ 54
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como se pone de manifiesto en la tabla 2, se pueden emplear las composiciones de la invención que contienen diversos surfactantes y concentraciones de los mismos y diversos primeros materiales poliméricos, para mejorar el rendimiento y la pureza resultantes de ApoA-1M después de una posterior etapa de separación térmica.
Ejemplo 3
Se estudió el efecto del surfactante sobre el coeficiente de repartición K y sobre la relación de distribución G para ApoA-1M y para la proteína total en la etapa de separación principal en dos fases acuosas, en una solución acuosa primaria que contiene 6% Reppal PES 100 y 12% Breox PAG 50A 1000, en combinación con 1% Triton® X-100, 2% Tween® 80 o sin surfactante, con fines comparativos, respectivamente.
Las proteínas en bruto de E. Coli fueron repartidas extensivamente en la fase superior de los tres sistemas. En los sistemas con surfactante, la ApoA-IM se repartió en la fase superior. En la tabla III se muestran el coeficiente de repartición K y la relación de distribución G para ApoA-IM y para la proteína total, calculados según las fórmulas (1) y (2) y en base a los resultados ELISA.
TABLA III 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{6}{|c|}{Efecto
del surfactante sobre el coeficiente de repartición K sobre la 
relación de distribución G
para}\\\multicolumn{6}{|c|}{ApoA  -  1M y para proteína
total en una etapa de separación principal en  dos fases
acuosas}\\\hline  Surfactante  \+  V_{superior}/V_{inferior} \+
 K_{proteína} \+   G_{proteína} \+
 K_{ApoA-IM} \+  G_{ApoA-IM} \\  concentración (%) \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline 
-  -  -  -   0%  \+ 6,0  \+ 0,07  \+ 0,39  \+ 1 
\+ 6 \\\hline  Triton® X  -  100 1,0%  \+ 4,1  \+ 0,11 
\+ 0,49  \+ 7  \+ 29 \\\hline  Tween® 80 2,0%  \+ 4,5  \+ 0,10  \+
0,50  \+ 4  \+ 18
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como resulta evidente a partir de la tabla III, el coeficiente de repartición K y la relación de distribución G aumentan de forma drástica para el compuesto diana ApoA-IM cuando está presente un surfactante en la solución acuosa primaria.
Ejemplo 4
Usando ApoA-IM como proteína diana se estudió la influencia de la separación en dos fases acuosas con un surfactante seguido por una etapa de separación térmica sobre la separación de ácidos nucleicos contaminantes. Se repitió el procedimiento según el ejemplo 2 con 6% Reppal PES 100, 12% Breox PAG 50A 1000 y 2% Tween® 80. Los resultados se indican en la tabla IV.
TABLA IV 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{Efecto
de una etapa de separación en dos fases acuosas con un  surfactante
seguido por una etapa de}\\\multicolumn{3}{|c|}{separación térmica
sobre la separación de ADN}\\\hline  Muestra  \+ Concentración
ADN  ( \mu g/ml)  \+ Grado de separación de ADN \\\hline 
Material de partida  \+ 2,1  \+ -  -  -  -  
\\\hline  Fase superior rica en agua después de la separación
térmica  \+  <0,002  \+  >1,000 \\  la separación térmica \+
\+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como resulta evidente a partir de la tabla IV, la concentración resultante de ADN en la fase acuosa que contiene proteína se redujo en más de 1.000 veces, en comparación con el material de partida.
Ejemplo 5
Usando ApoA-IM como compuesto diana se estudió el efecto de reciclar el surfactante y el polímero de la fase superior después de la separación de fases inducida por la temperatura. En la figura 1 se ilustra esquemáticamente la secuencia del procedimiento que incluye el reciclo. Se repitió el procedimiento según el ejemplo 1 con la diferencia de que el material proteico de partida contenía 0,9 mg/ml de ApoA-IM y 7 mg/ml de proteína total. Además, la solución bifásica acuosa primaria contenía 17% Reppal PES 200, 12% Breox PAG 50A 1000 y 1% Triton® X-100. La fase inferior obtenida después de la separación de fases inducida por la temperatura y que contiene Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 se separó de la fase superior que contiene ApoA-IM. La solución que contiene Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 fue reciclada al sistema bifásico acuoso primario. Las concentraciones de Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 en la solución reciclada fueron de 55% (p/p) y 4,9% (p/p) respectivamente. El sistema bifásico acuoso primario se preparó a partir de una nueva solución de proteína de partida añadiendo alrededor de 10-15% de la cantidad original de Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 para reponer las pérdidas producidas en cada ciclo. En cada ciclo, el polímero de la fase inferior constituía 100% de Reppal PES 200 nuevo.
Las recuperaciones medias de Breox PAG 50A 1000 y Triton® X-100 en cada ciclo fueron de 83% y 88%, respectivamente.
Se determinó la repartición de Triton® X-100 después de la separación de fases inducida por la temperatura a 60ºC. El Triton® X-100 se repartió de forma extensiva en la fase inferior que contiene copolímero con un coeficiente de repartición K de 0,004. La fase superior que contiene esencialmente agua y proteína contenía 0,02% de Triton® X-100 según se midió por espectrofotometría. La fase de copolímero-surfactante obtenida después del calentamiento a 60ºC tenía una concentración de 55% de Breox 50A 1000 y 4,9% de Triton® X-100.
Cuando se analizaron muestras de la fase de copolímero-surfactante por medio de SDS-PAGE y se mancharon con nitrato de plata, no pudo detectarse proteína alguna, es decir, no se perdió ApoA-IM detectable en la fase reciclada incluso después de efectuar el reciclo al menos tres veces.
En la tabla V resultan evidentes el grado de purificación y el rendimiento de ApoA-IM después de la separación de fases inducida por la temperatura. El grado de purificación y el rendimiento se calcularon según las fórmulas (5) y (6) en base a los resultados ELISA.
TABLA V 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{Efecto
del reciclo surfactante y del segundo material polimérico sobre  el
rendimiento y la}\\\multicolumn{3}{|c|}{purificación de
ApoA  -  1M en una etapa de separación en dos fases
acuosas  seguido por una etapa de}\\\multicolumn{3}{|c|}{separación
térmica}\\\hline  Números de reciclos  \+ Grado de purificación  \+
Rendimiento (%) \\\hline  0  \+ 4,2  \+ 76 \\\hline  1  \+ 4,6  \+
74 \\\hline  2  \+ 4,5  \+ 72 \\\hline  3  \+ 4,5  \+ 76
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como resulta evidente a partir de la tabla V, el grado de purificación y el rendimiento de ApoA-IM en los sistemas con polímero de la fase superior y surfactante reciclados fueron iguales a los del sistema bifásico acuoso inicial con nuevos polímeros y surfactante.
Ejemplo 6
Usando ApoA-IM como compuesto diana se estudió el efecto de reciclar el surfactante y el polímero de la fase superior después de la separación de fases inducida por la temperatura. Se repitió el procedimiento según el ejemplo 5 con la diferencia de que se utilizó EO_{30}PO_{70} como segundo material polimérico en lugar de Breox PAG 50A 1000. Se emplearon las mismas concentraciones de polímeros y de surfactante. Las concentraciones de EO_{30}PO_{70} y Triton® X-100 en la solución reciclada fueron de 80% (p/p) y de 6,3% (p/p), respectivamente. En la tabla VI se indican el grado de purificación y el rendimiento de ApoA-IM después de la separación de fases inducida por la temperatura. El grado de purificación y el rendimiento se calcularon según las fórmulas (5) y (6) en base a los resultados ELISA.
TABLA VI 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{Efecto
del reciclo surfactante y de segundo material polimérico sobre el 
rendimiento y la}\\\multicolumn{3}{|c|}{purificación de
ApoA  -  1M en una etapa de separación en dos fases
acuosas  seguido por una etapa de}\\\multicolumn{3}{|c|}{separación
térmica}\\\hline  Números de reciclos  \+ Grado de purificación  \+
Rendimiento (%) \\\hline  0  \+ 5,4  \+ 76 \\\hline  1  \+ 4,8  \+
53 \\\hline  2  \+ 5,5  \+ 74 \\\hline  3  \+ 4,6  \+ 54
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como resulta evidente a partir de la tabla VI, el grado de purificación y el rendimiento de ApoA-IM en los sistemas con reciclo de polímero de la fase superior y de surfactante pueden ser iguales a los del sistema bifásico acuoso inicial con nuevos polímeros y surfactante.

Claims (20)

1. Procedimiento para purificar apoliproteína A o apolipoproteína E, caracterizado porque comprende:
a)
mezclar, en orden arbitrario, el material de partida que contiene la apolipoproteína A o apolipoproteína E, un primer material polimérico hidrófilo, agua, un segundo material polimérico anfífilo y un surfactante, siendo el primer material polimérico y el segundo material polimérico y el surfactante inmiscibles en la solución acuosa primaria resultante y;
b)
mantener la solución acuosa primaria durante un periodo de tiempo suficiente para separar esencialmente las fases formadas;
(c)
separar la fase que contiene la porción principal de apolipoproteína A o apolipoproteína E y el segundo material polimérico y el surfactante;
(d)
separar apolipoproteína A o apolipoproteína E del segundo material polimérico y del surfactante en una separación inducida por la temperatura y a continuación
(e)
reciclar el segundo material polimérico y el surfactante separados a la etapa de mezcla inicial (a).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el primer material polimérico se elige del grupo consistente en hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilalmidones, almidón, dextrano, pululano y mezclas de los mismos.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el hidroxialquilalmidón se elige del grupo consistente en hidroximetilalmidón, hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón y mezclas de los mismos.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el peso molecular del primer material polimérico es del orden de 5.000 a 5.000.000 Da, adecuadamente del orden de 40.000 a 500.000 Da.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo material polimérico tiene un punto de turbidez del orden de 5 a 90º C, preferentemente del orden de 15 a 60º C.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el segundo material polimérico se elige del grupo consistente en polialquilenglicoles, polímeros de poli(oxialquileno), copolímeros de poli(oxialquileno), polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, polivinilcaprolactama, polivinilmetiléter, almidones alcoxilados, celulosa alcoxilada, alquilhidroxialquilcelulosa, poliéteres modificados con silicona y mezclas de los anteriores.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el copolímero de poli(oxialquileno) es un copolímero al azar o en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el contenido en óxido de propileno del copolímero es del orden de 30 a 90% en peso del peso total del copolímero, preferentemente del orden de 40 a 80% en peso.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la apolipoproteína se separa del segundo material polimérico y del surfactante por calentamiento de la fase separada a una temperatura por debajo de la temperatura en donde se presenta la degradación de la apolipoproteína pero por encima del punto de turbidez del segundo material polimérico y del surfactante, para precipitar dicho segundo material polimérico y dicho surfactante, y posterior separación de la fase que contiene el segundo material polimérico y el surfactante precipitados de la fase que contiene la apolipoproteína.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del primer material polimérico en la solución acuosa primaria es del orden de 1 a 30% en peso del peso total de la solución acuosa primaria, adecuadamente del orden de 3 a 20% en peso.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del segundo material polimérico en la solución acuosa primaria es del orden de 0,5 a 30% en peso del peso total de la solución acuosa primaria, adecuadamente del orden de 3 a 20% en peso.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de la apolipoproteína en la solución acuosa primaria es del orden de 0,1 a 50 g/l de la solución acuosa primaria, preferentemente del orden de 1 a 10 g/l.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el surfactante se elige del grupo consistente en surfactantes no iónicos, surfactantes aniónicos y surfactantes catiónicos.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el surfactante no iónico se elige del grupo consistente en alquiletoxilatos, ésteres grasos de polioxietilensorbitan, co-polímeros en bloque, polioxietilenalquiléteres, poliglicoléteres y alquilglicósidos.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del surfactante en la solución acuosa primaria se encuentra por encima de la concentración micelar crítica (CMC).
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos el 60% de la cantidad inicial del segundo material polimérico y el surfactante se reciclan a la etapa inicial de mezcla, preferentemente al menos el 80%.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ApoA o ApoE se obtiene mediante técnicas de ADN recombinante.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ApoA o ApoE se obtiene a partir de plasma humano.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ApoA es ApoA-I o mezclas de la misma.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque la ApoA es ApoA-I Milano.
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