JPH052310B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ａ 産業上の利用分野 本発明はヒトα₂−プラスミンインヒビター（α₂
−plasmin inhibitor；α₂−antiplasmin）に対す
るモノクローナル抗体、特にヒトα₂−プラスミン
インヒビターの線維素溶解作用阻害部位
（reactive site）を抗原として認識し、その結果
ヒトα₂−プラスミンインヒビターのプラスミンの
線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、線溶
促進させる働きを優するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞に関するものである。 ｂ 従来技術 ヒトのα₂−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている ［Mori ＆ aoki；The Journal of Biological
Chemistry、251、5956−5965（1976）参照］。 一方ヒトα₂−プラスミンインヒビターには３種
類の活性部位があることが知られている。第１は
プラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これ
を“リアクテイブサイド”ということがある）
［B.Wiman ＆ D.Collen；The Journal of
Biological Chemistry、254、9291−9297（1979）
参照］であり、第２はカルボキシル基末端側のプ
ラスミン結合部位［B.Wiman ＆ D.Collen；
European Journal of Biohemistry、84、573−
578（1978）参照］であり、第３はアミノ基末端の
フイブリン結合部位である［Y.Sakata、et al.、
Thro−mbosis Research、16、279−282（1979）
参照］。 ヒトα₂−プラスミンインヒビターにおけるこれ
ら３種類の活性部位のうち、リアクテイブサイト
を抗原として選択的に認識するモノクローナル抗
体を提供できれば、これを使用することによつて
ヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
害作用を直接抑え、線溶を促進することができる
ので血栓溶解促進剤として利用することができ
る。また、この抗体を用いることにより、溶液中
のα₂−プラスミンインヒビターあるいはα₂−プラ
スミンインヒビター・プラスミン複合体を測定す
ることも可能である。 ｃ 発明の構成 本発明によれば、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターで免疫されたマウスから得られた脾臓細胞
と、マウスミエローマ細胞とを融合させることに
より得られるハイブリドーマ細胞であり、かつ該
ハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナ
ル抗体が、ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体であつて、ヒトα₂−プラ
スミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素
溶解作用の阻止部位を認識し、かつプラスミン結
合部位及びフイブリン結合部位のいずれをも認識
しないヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維素
溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体であ
ることを特徴とするハイブリドーマ細胞が提供さ
れる。 本発明のハイブリドーマ細胞は、ケーラーとミ
ルシユタインの方法［Ko¨hler and Milstein、
Nature 256、495−497（1975）］として知られた
手法によつて産生される。すなわち、ヒトα₂−プ
ラスミンインヒビターでマウスを免疫した後、こ
のマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融
合させ、得られたハイブリドーマ細胞は、マイク
ロタイタープレート（microtiter plates）に固定
されたヒトα₂−プラスミンインヒビターと反応す
る抗体に対し系統的に検査し選択される。このよ
うにしてヒトα₂−プラスミンインヒビターに対す
る抗体を合成し、分泌するハイブリドーマ細胞を
選別する。得られたハイブリドーマ細胞を無血清
培地で培養し、その培養上清中に分泌されたヒト
α₂−プラスミンインヒビターに対する抗体は、フ
イブリンプレート（fibrin plates）上でヒトα₂−
プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害作用を
抑える活性について検査を行なう。その結果、ヒ
トα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止
作用を特異的に抑える活性を有するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が単離され
た。 次に本発明のハイブリドーマ細胞を産生する具
体的方法について詳細に説明する。 Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーは前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中よ
り単離精製された。 Ｂ ヒトα₂−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のα₂−プラスミンイン
ヒビターである間隔で腹腔に数回免疫の後、さ
らに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に
融合のために脾臓細胞を取り出す。 Ｃ 細胞融合； 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約10⁸個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。 細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞
（以下P3−U1と略記する）［Yelton、D.E.et
al.、CurrentTopics in Micrbiology and
Immu−nology、81、１（1978）参照］を用い
た。これは、８−アザグアニン耐性の細胞ライ
ンであり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフエラーゼ
（hypoxanthine−guanine phosphoribosyl
transferase）が欠失しており、それゆえHAT
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）
培地中では生存しない。また、この細胞ライン
は、それ自体抗体を分泌しない、いわゆる非分
泌型である。 好ましい融合促進剤としては例えば平均分子
量が1000〜4000のポリエチレングリコールを有
利に使用できるが、この分野で知られている他
の融合促進剤を使用することもできる。本発明
の実施例では平均分子量1540のポリエチレング
リコールを用いた。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。 Ｅ 各容器中のヒトα₂−プラスミンインヒビター
に対する抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。 Ｆ ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する活
性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
選択； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた、抗体を含んだ培養
上澄液を濃縮し、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターと共に一定時間インキユベートした。さら
にこのヒトα₂−プラスミンインヒビター混合液
にプラスミンを加え、フイブリンプレート上に
のせ、フイブリン溶解面積を測定した。このよ
うにして、ヒトα₂−プラスミンインヒビターに
対する活性を持つ抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を選択する。具体的には、微工研国際寄
託No.FERM BP−1781およびFERM BP−
1782のハイブリドーマ細胞が挙げられる。 以下実施例を掲げ本発明を詳細に説明する。 実施例 １ (1) ヒトα₂−プラスミンインヒビターの調製 前記、青木および諸井の方法に従い、ヒト血
漿2360mlからヒトα₂−プラスミンインヒビター
7.7mgを得た。 (2) マウスの免疫 雄のBalb／ｃマウスをヒトα₂−プラスミン
インヒビター100μｇと完全なフロイントのア
ジユバント（Complete Freund′s adjuvant）
とのエマルジヨン（emulsion）で21日間の間
隔をおいて２回腹腔に免疫した。さらに７日後
および88日後にヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ー30μｇを生理食塩水とともに静脈に追加投与
した。最終免疫の４日後にその脾臓細胞を細胞
融合のために用いた。 (3) 脾臓細胞の懸濁液の調製 脾臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツ
シユを通過させることにより単細胞懸濁液が得
られた。細胞をＬ−グラタミン0.39ｇ／、硫
酸カナマイシン0.2ｇ／およびNaHCO₃2.0
ｇ／を補充したRPMI−1640培地（GIBCO
製）に移した。増殖した細胞をRPMI−1640で
３回洗浄しRPMI−1640培地に再懸濁させた。 (4) 骨髄腫細胞の調製 マウス骨髄腫栽培P3−U1は、Ｌ−グルタミ
ン0.39ｇ／、硫酸カナマイシン0.2ｇ／、
NaHCO₃2.0ｇ／および10％のウシ胎児血清
で補充されたRPMI−1640培地（10％FCS−
RPMI−1640と略記する）中で培養した。骨髄
腫細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対数期に
あつた。 (5) 細胞融合 脾臓細胞と骨髄腫細胞とを10：１の比率で無
血清RPMI−1640培地中に懸濁し、５分間約
200ｇで遠心分離した。上澄液培地を除去した
後、沈降物を平均分子量1540の50％ポリエチレ
ングリコール溶液（PH8.2）１mlと共に２分間
37℃でインキユベーシヨンした。次いで無血清
RPMI−1640倍地９mlを加え、細胞を５分間注
意深く再懸濁した。次いでこの懸濁液を５分間
約200ｇで遠心分離し、その後８×10⁶細胞／ml
の濃度が得られるように10％FCS−RPMI−
1640培地に再懸濁し、次いで96マイクロウエル
プレート上に分配した（ウエル１個につき約
100μ）。この融合細胞は37℃において５％
CO₂を使用して培養した。 (6) ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体産生ハイブリドーマ細胞の選択及び培養 細胞融合の１日後にHAT培地をウエル１個
につき100μ加えた。以後２日間隔で半分量
の培地を新たにHAT培地と交換して培養し
た。８日後、ハイブリドーマ細胞の培養上澄液
中のヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
抗体について酵素免疫定量法によりスクリーニ
ングを行なつた。スクリーニングに用いられた
抗原はヒトα₂−プラスミンインヒビター、第２
抗体はアルカリフオスフアターゼ
（alkaliphosphatase）標識付のウサギ抗マウス
抗体であつた。 総数349個のウエルの全てが酵素免疫定量法
により陽性であり、α₂−プラスミンインヒビタ
ーに対する抗体を産生しているという結果が得
られた。 細胞の増殖が活発になつたと観察されたと
き、HT培地を加えた。１日間隔で計４回HT
培地を用いて培地交換を行ない、その後は通常
の10％FCS−RPMI−1640培地を用いて培養し
た。 実施例 ２ （ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生するハイブリドーマ細胞の選択） 上記ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
抗体を産生しえいるハイブリドーマ細胞中からヒ
トα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
活性を抑える働きを持つた抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を次の方法でスクリーニングした。 各ウエルのハイブリドーマを10％FCS−RPMI
−1640倍地中で培養し、細胞数を約２×10⁷個と
した。この細胞を５分間約200ｇで遠心分離し、
培養上澄液を除去した後、細胞を無血清RPMI−
1640倍地10mlで洗浄した。さらに５分間約200ｇ
で遠心分離し、上澄液を除去し、細胞を２−メル
カプトエタノール5.0ml／、インシユリン7.5
ml／、トランスフエリン5.0ml／、エタノー
ルアミン5.0ml／、ナトリウムセレナイト5.0
ml／、Ｌ−グルタミン0.39ｇ／、硫酸カナマ
イシン0.2ｇ／、Hepes2.38ｇ／および
NaHCO₃1.5ｇ／で補充されたPRMI−1640：
Dulbecco′s MEM：Ham′s Ｆ−12（２：１：１）
の混合無血清倍地（以下これを“MITES倍地”
と略記する）10mlに懸濁し、３日間培養した。 培養上澄液を回収し、これを25倍に濃縮した。
この濃縮液25μにヒトα₂−プラスミンインヒビ
ター0.4μｇを加え、37℃で30分間インキユベーシ
ヨンした。次いでプラスミノーゲン0.025ユニツ
ト及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加え液量を
40μとした。このうち10μをフイブリンプレ
ートにのせた。フイブリンプレートは、37℃、湿
度95％以上の条件下で18時間静置し溶解した面積
を測定した。 その結果、1D10ハイブリドーマ細胞（微工研
国際寄託No.FERM BP−1781）の産生する抗体
に加えたヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維
素溶解阻害活性を完全に抑える働きが見出され
た。 参考例 １ ハイブリドーマ細胞のクローニング； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
の活性試験において陽性の結果を示したハイブリ
ドーマ細胞（1D10）を次の方法でクローン化し
た。 1D10細胞を96ウエルマイクロタイタープレー
トの１ウエルあたり0.9細胞となるよう希釈し、
Balb／ｃマウス胸腺細胞をフイーダー細胞とし
て加えプレートに分配し10％FCS−RPMI−1640
倍地で培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシン
グルセルコロニーであることを認めた。ハイブリ
ドーマ細胞の培養上澄液中のヒトα₂−プラスミン
インヒビターに対する抗体につき酵素免疫定量法
によりスクリーニングを行なつた。 総数26個のウエルが酵素免疫定量法により陽性
でありヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体を産生していた。 モノクローナル抗体の精製； 大量のヒトα₂−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体を産生させるために、約
10⁷個のハイブリドーマ細胞をプリスタンで前処
理したBalb／ｃマウスに腹腔内注射した。約１
週間後採取された腹水液よりEyらの方法［P.L.
Ey、S.J.Prowse and C.R.Jenkin、
Immunochemistry、15、429−436（1978）参照］
に従いプロテインＡ−セフアロース4B（protein
Ａ−Sepharose 4B）カラムを用いて抗体を精製
した。腹水液2.5mlよりヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターに対するモノクローナル抗体20mgを得
た。 精製したモノクロナール抗体の特徴； 精製したモノクローナル抗体の特定のクラス
を、クラス特異性抗マウス抗血清を使用してオク
タロニーゲル拡散試験で決定した。その結果を下
記表１に示した。ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対する抗体は、その多くがＨ鎖r₁、Ｌ鎖Ｋで
あつた。

【表】 ここで抗体1B10G11は、微工研国際寄託No.
FERM BP−1782のハイブリドーマ細胞によつ
て再生される。 参考例 ２ ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
によるヒトα₂−プラスミンインヒビター活性の
抑制 ヒトα₂−プラスミンインヒビター1μｇと各モ
ノクローナル抗体5μｇを0.05Mリン酸緩衝生理食
塩水（以下PBSと略す）50μｇに溶解させ、37℃
で30分間インキユベーシヨンした。次いでプラス
ミノーゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031
ユニツトを加え液量を60μとした。このうち
10μをフイブリンプレートにのせた。フイブリ
ンプレートは37℃、湿度95％以上の条件下で18時
間静置し、溶解した面積を測定した。その結果を
下記表２に示した。 なお、下記表の地はプラスミノーゲン0.025ユ
ニツトとウロキナーゼ0.031ユニツトとによる溶
解面積を100％とした時の相対値である。

【表】 参考例 ３ ヒトα₂−プラスミンインヒビターとフイブリン
の結合に及ぼすヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体の効果 I¹²⁵標識したヒトα₂−プラスミンインヒビター
0.01μMとα₂−プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体0.05μMを２％牛血清アルブ
ミン−0.05Mトリス緩衝液（PH7.4）−0.15M
NaClを加えて、37℃で30分間インキユベーシヨ
ン後、４℃で一晩放置した。この抗原−抗体反応
混液に、2.5ｍＭ CaCl₂、7μMフイブリノーゲン
画分、２ユニツト／mlトロンビンを加え、全量で
100μとし37℃で30分間インキユベーシヨンし
た。凝固物（フイブリン塊）の形成が認められ
た。30分後に200ｍＭ EDTAを100μ加え、カ
ルシウムイオンを除いた後、竹串でこの凝固物を
巻き取つた。竹串に巻き取つた凝固物は５分間、
３回洗浄液［２％BSA、0.05Mトリス緩衝液（PH
7.4）、0.15M NaCl、２ｍＭ EDTA］で洗つ
た。最後に凝固物を竹串から試験管に回収し、凝
固物の放射活性（cpm）を測定した。元の反応混
液中の放射活性に対する凝固物の放射活性の割合
を表３に示す。 なお表３中に通常の市販マウスIgGを比較抗体
として使用した結果を併せて示した。

【表】 この結果から各ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体はヒトα₂−プラス
ミンインヒビターのフイブリン結合部位を認識し
ていないモノクローナル抗体であることがわか
る。 参考例 ４ （ヒトα₂−プラスミンインヒビターのリアクテ
イブサイトを認識するモノクローナル抗体の検
索） 本実施例にはヒトα₂−プラスミンインヒビター
によるプラスミンの府活性化に及ぼすヒトα₂−プ
ラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗
体の効果を調べたものである。 α₂−プラスミンインヒビター0.15μMとα₂−プ
ラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗
体0.75μMを２％牛血清アルブミン溶液［0.05M
トリス緩衝液（PH7.4）、0.15M NaCl］中で37℃、
30分間インキユベーシヨンし、４℃で一晩放置し
た。 この反応混合分液60μとプラスミン溶液
（0.47μM）20μを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液
（PH7.4）、0.15M NaClを加えて全量を500μと
したものを各サンプルについて２本ずつ用意し、
37℃で２分又は20分間インキユベーシヨンした。
次に3.5ｍＭ合成基質Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−バリル−
Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジル−Ｐ−ニトロアニリ
ド・二塩酸塩）を200μ加え、分光光度計
（Beckman.DU−８）によつて単位時間当りの
405nｍの波長における吸光度の変化を測定した。
対照としてプラスミンのみを反応させた試料とモ
ノクローナル抗体を加えずにヒトα₂−プラスミン
インヒビターとプラスミンを反応させた試料につ
いても同様に吸光度の変化を調べた。その結果を
下記表４に示した。

【表】 以上参考例３及び４の結果から本発明のハイブ
リドーマ細胞から得られたモノクローナル抗体は
ヒトα₂−プラスミンインヒビターのリアクテイブ
サイドを特異的に認識し、プラスミン結合部位及
ぶフイブリン係合部位のいずれをも認識していな
いことがわかつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒトα₂−プラスミンインヒビターで免疫され
   たマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエロ
   ーマ細胞とを融合させることにより得られるハイ
   ブリドーマ細胞であり、かつ該ハイブリドーマ細
   胞から産生されるモノクローナル抗体が、ヒトα₂
   −プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
   ル抗体であつて、ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
   ーにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部
   位を認識し、かつプラスミン結合部位及びフイブ
   リン結合部位のいずれをも認識しないヒトα₂−プ
   ラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作用を抑
   制するモノクローナル抗体であることを特徴とす
   るハイブリドーマ細胞。