JPH0455200B2 - - Google Patents
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- JPH0455200B2 JPH0455200B2 JP59217312A JP21731284A JPH0455200B2 JP H0455200 B2 JPH0455200 B2 JP H0455200B2 JP 59217312 A JP59217312 A JP 59217312A JP 21731284 A JP21731284 A JP 21731284A JP H0455200 B2 JPH0455200 B2 JP H0455200B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/38—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【発明の詳細な説明】
ａ 産業上の利用分野
本発明は、ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対する選択的吸着体及びそれを用いてヒト血漿中
よりヒトα2−プラスミンインヒビターを分離する
方法に関するものである。 ｂ 従来技術 ヒトのα2−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi and Aoki；The Journal of Biological
Chemistry，251，5956−5965（1976）参照〕。 またその血漿中の濃度は、健常人で6.13±0.88
mg／100mlであることも知られている〔N.Aoki
and T.Yamanaka，Clinica Chimica Acta
84，99−105（1978）参照〕。 一方ヒトのα2−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下こ
れを“リアクテイブサイト”ということがある）
〔B.Wiman and D.Collen；The Journal of
Biological Chemistry，254，9291−9297（1979）
参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側のプ
ラスミン結合部位〔B.Wiman and D.Collen；
European Journal of Biochemistry，84，573
−578（1978）参照〕であり、第３はアミノ基末端
のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata，etal.，
Thrombosis Research，16，279−282（1979）参
照〕。 最近、ヒトα2−プラスミンインヒビターの理学
的、生物学的性質の解明が進み、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターは線維素溶解機構に対して、重
要な作用をしていることが知られている〔例えば
青木延雄“医学のあゆみ”126，147−155（1983）
参照〕。 また、α2−プラスミンインヒビター先天的欠損
症患者の血液を試験管に入れ37℃に放置すると、
凝固はまつたく正常におこるが４〜８時間で凝固
は完全に自然溶解する 〔N.Aoki，etal.，Journal of Clinical
Investigation，63，877−884（1979）参照〕。 実際α2−プラスミンインヒビター欠損症に於て
は、止血栓の早期崩壊によるきわめて重篤な出血
傾向がみられる。 この事実は、逆に、重篤な血栓症に於て血液中
のα2−プラスミンインヒビターの量を減少させる
ことにより病因となつている血栓を速やかに溶解
し得ることを示唆しているものと考えられる。 ｃ 発明の構成 そこで、本発明者らは、ヒトα2−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体について
研究を重ねたところ、ヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体であつて、ヒ
トα2−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識しないヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナ
ル抗体を見出し、またこのモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞を創作し得、既に提
案した（特願昭59−75778号（特開昭60−222426
号））。 本発明者らは、かくして得られたモノクローナ
ル抗体の特異的な作用の利用について更に研究を
進めた結果、ヒトα2−プラスミンインヒビターを
特異的に吸着し得る吸着体及びそれを用いてヒト
血漿中のヒトα2−プラスミンインヒビターを選択
的に分離し得ることを見出し本発明に到達したも
のである。 すなわち、本発明はヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体であつて、ヒ
トα2−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識しないヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナ
ル抗体をリガンドとして不溶性担体に結合させた
ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する選択的
吸着体であり、またその吸着体を用いてヒト血漿
中よりヒトα2−プラスミンインヒビターを選択的
に分離する方法である。 一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の
分離・精製に利用するクロマトグラフイーは、ア
フイニテイークロマトグラフイーと呼ばれている
〔例えば、千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実
験と応用アフイニテイークロマトグラフイー」講
談社サイエンテイフイツク参照〕。 本発明におけるアフイニテイー、リガンド、不
溶性担体、吸着体なる語は、それぞれ下記に意味
に解するものとする。 アフイニテイー；２種物質間に存在する特異的親
和力 リガンド；吸着あるいは精製を目的とする物質と
アフイニテイーを有する物質 不溶性担体；水に不溶性の支持体（これにはリガ
ンドは含まれない） 吸着体；リガンドを不溶性担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対する選択的吸着体及びヒト血漿中より
ヒトα2−プラスミンインヒビターを分離する方法
について詳細に説明する。 後述するヒトα2−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体を適当な不溶性担体（例
えばセフアロース）に化学的にリガンドとして結
合させ、これをカラムに詰め適当な緩衝溶液（例
えば50mMトリス緩衝液PH7.4、0.15M NaCl）に
よつて平衡化する。この吸着体に検体試料（ヒト
血漿）を添加して検体試験中のヒトα2−プラスミ
ンインヒビターを吸着させる。次に適当な洗浄溶
液（例えば、50mMトリス緩衝液、PH7.4、0.15M
NaCl）によつて、不純物を吸着体から除去する。
次いで血漿の『素通り画分』及び『洗浄画分』中
のヒトα2−プラスミンインヒビター量を測定す
る。かくしてその値からヒト血漿中からのヒトα2
−プラスミンインヒビターの分離の程度を算出す
ることができる。 本発明における選択的吸着体に用いられる不溶
性担体としては、種々のものが使用できるが、例
えば材質としてセフアロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、デキストラン、またはマレイン
酸ポリマー或いはこれらの混合物が好ましく用い
られる。これら不活性担体の形状としては、粉末
状、粒状、ペレツト状、ビーズ状、フイルム状、
線維状など種々の形態であることができる。 前記したように、本発明の吸着体に使用される
抗体である“ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プ
ラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線維
素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプラスミン
結合部位及びフイブリン結合部位のいずれをも認
識しないヒトα2−プラスミンインヒビターの線維
素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体”
は、本発明者らによつて初めて見出され先に特許
出願された（昭和59年４月17日出願；発明の名称
“モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞及び
モノクローナル抗体の製造方法”特願昭59−
75778号）。 本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されているが、以下にその内容を簡単に説明す
る。 Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーは前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中よ
り単離精製された。 Ｂ ヒトα2−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のα2−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さ
らに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に
融合の為に脾臓細胞を取り出す。 Ｃ 細胞融合； 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。 細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞
（以下P3−U1と略記する） 〔Yelton，D.E.etal.，Current Topicsin
Microbiology and Immunology，81，１
（1978）参照〕を用いた。これは、８−アザグ
アニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサ
ンチン−グアニンホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（hypoxanthineguanine phosporibosy
transferase）が欠失しており、それゆえに
HAT（ヒポキサンチン、アルミノプテリン、
チミジン）培地中では生存しない。また、この
細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌型である。 好ましい融合促進剤としては例えば平均分子
量が1000〜4000のポリエチレングリコールを有
利に使用できるが、この分野で知られている他
の融合促進剤を使用することもできる。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタ−プレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。 Ｅ 各容器中のヒトα2−プラスミンインヒビター
に対する抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）よりスクリーニングする。 Ｆ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活
性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた、抗体を含んだ培養
上澄液を濃縮し、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターと共に一定時間インキユベートした。さら
にこのヒトα2−プラスミンインヒビター混合液
にプラスミンを加え、フイブリンプレート上に
のせ、フイブリン溶解面積を測定した。このよ
うにして、ヒトα2−プラスミンインヒビター対
する活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を選択する。 Ｇ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することによ
り、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることがで
きる。第２の方法によればハイブリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの
腹腔に注射することができる。一定時間後の宿
主動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリ
ドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得
ることができる。 上記の如くして得られたモノクローナル抗体
は、ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識せず、かつプラスミンの線維素溶解作
用の阻止部位を認識し、その部位に選択的に結合
する。 本発明のヒト血漿中のα2−プラスミンインヒビ
ターの分離に用いる吸着体においては、かかるモ
ノクローナル抗体をリガンドとして不溶性担体に
化学的に結合させて使用する。かゝる結合方法と
しては一般にモノクローナル抗体を不溶性担体に
化学的に結合する方法であればよい。 以上、本発明によれば、ヒト血漿中よりα2−プ
ラスミンインヒビターを容易に且つ選択的に分離
することが可能である。 以上実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例 ヒト血漿よりα2−プラスミンインヒビターの分
離 α2−プラスミンインヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体1D10C1をリガンドとして化学的に結
合させた吸着体（0.5ml）をカラムに詰め、洗浄
液（50ｍＭトリス緩衝液PH7.4、0.15MNaCl）で
十分に洗浄後、ヒト血漿1.0mlを添加した。さら
に、上記洗浄液1.0mlでカラム内壁を洗浄し、溶
出した画分を「素通り画分」とした。次に未吸着
物質を上記洗浄液2.0mlで溶出し、「洗浄画分」と
した。以上の操作はすべて４℃で行なつた。分取
した「素通り画分」及び「洗浄画分」は、即に４
℃で脱塩、濃縮を行なつた。 ヒトα2−プラスミンインヒビター検量線の作成 α2−プラスミンインヒビター量は、本発明者ら
が、先に出願した明細書（昭和59年５月１日付出
願；発明の名称“ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的
測定試験及びキツト”特願昭59−86101号（特開
昭60−231168号））に記載された、サンドイツチ
法を用いて測定した。 本実施例で使用した第１及び第２抗体は、本発
明者らが先に出願した明細書（昭和59年４月17日
付出願；発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778号）に記載された方法によ
つて得られた下記のものを使用した。 第１抗体 前記出願明細書（特願昭59−75778号）の実施
例３において得られた抗体名“1D10C1”を使用
し、これを下記の如く不溶性担体（マイクロタイ
タープレート）に固定化させて用いた。この抗体
はヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミン結合部位及びフイブリン結合部位のいずれ
をも認識せず、かつプラスミンの線維素溶解作用
の阻止部位を認識し、その部位に選択的に結合す
るモノクローナル抗体である。 第２抗体 前記出願明細書（特願昭59−75778号）の実施
例３において得られた抗体名“1B10G11”を使
用した。この抗体はα2−プラスミンインヒビター
におけるリアクテイブサイト以外の部位を特異的
に認識するモノクローナル抗体であり、アルカリ
性フオスフアターゼで標識化して使用した。 濃度20μｇ／mlのヒトα2−プラスミンインヒビ
ターにおけるリアクテイブサイトを特異的に認識
するモノクローナル抗体（1D10C1）をマイクロ
タイタープレート上に４℃で一晩放置し固定化し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15ｍＭ Na2CO3、35ｍＭ NaHCO3、３ｍＭ
NaN3）を加え室温で４時間放置した後、１％
牛血清アルブミンを含む洗浄液（20ｍＭリン酸緩
衝液、0.135M NaCl、２ｍＭ NaN3、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20ｍＭリン酸緩衝液PH7.4、0.135M NaCl）で
種々の濃度となるように希釈したα2−プラスミン
インヒビターを加え、室温で４時間放置した。 その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカ
リ性フオスフアターゼで標識したα2−プラスミン
インヒビターにおけるリアクテイブサイト以外の
部位を認識するモノクローナル抗体（1B10G11）
を加え４℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄後
アルカリ性フオスフアターゼ基質溶液を１mg／ml
の濃度で加え、MICROPLATE
PHOTOMETER（コロナ電気(株)製、MTP−20）
で20分後に405nｍの波長における吸光度を測定
した。その結果を添付図面に示した。この図面か
らα2−プラスミンインヒビターの濃度と吸光度と
の関係は直線関係になることが理解できる。従つ
てα2−プラスミンインヒビターにおけるリアクテ
イブサイトを特異的に認識するモノクローナル抗
体をサンドイツチ法における一つの抗体として使
用することによつて、α2−プラスミンインヒビタ
ーの量を容易に測定することができる。 添付図面を検量線として用い、ヒト血漿「素通
り画分」及び「洗浄画分」のα2−プラスミンイン
ヒビター量を測定した。 試料中のα2−プラスミンインヒビター量の測定 ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるリア
クテイブサイトを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（1D10C1）を濃度20μｇ／mlでマイクロタ
イタープレート上に４℃で一晩放置し固定化し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15ｍＭ Na2CO3、35ｍＭ NaHCO3、３ｍＭ
NaN3）を加え室温で４時間放置した後、１％
牛血清アルブミンを含む洗浄液（20ｍＭリン酸緩
衝液、0.135M NaCl、２ｍＭ NaN3、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20ｍＭリン酸緩衝液、0.135M NaCl）で種々の
濃度となるように希釈した試料（前記「素通り画
分」、「洗浄画分」及びヒト血漿）を加え室温で４
時間放置した。 その後、前記洗浄液で５回洗浄し、アルカリ性
フオスフアターゼで標識したヒトα2−プラスミン
インヒビターにおけるリアクテイブサイト以外の
部位を認識するモノクローナル抗体（1B10G11）
を加え、４℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄
後、アルカリ性フオスフアターゼ基質溶液１mg／
mlの濃度で加え、MICROPLATE
PHOTOMETER（コロナ電気(株)製、MTP−12）
で20分後に405nｍの波長における吸光度を測定
した。 結果を下記表に示す。「素通り画分」、「洗浄画
分」にはα2−プラスミンインヒビターは検出され
ず、ヒト血漿を前記吸着体に添加することによつ
てヒト血漿からα2−プラスミンインヒビターが完
全に分離されたことが確認できた。 【表】
対する選択的吸着体及びそれを用いてヒト血漿中
よりヒトα2−プラスミンインヒビターを分離する
方法に関するものである。 ｂ 従来技術 ヒトのα2−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi and Aoki；The Journal of Biological
Chemistry，251，5956−5965（1976）参照〕。 またその血漿中の濃度は、健常人で6.13±0.88
mg／100mlであることも知られている〔N.Aoki
and T.Yamanaka，Clinica Chimica Acta
84，99−105（1978）参照〕。 一方ヒトのα2−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下こ
れを“リアクテイブサイト”ということがある）
〔B.Wiman and D.Collen；The Journal of
Biological Chemistry，254，9291−9297（1979）
参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側のプ
ラスミン結合部位〔B.Wiman and D.Collen；
European Journal of Biochemistry，84，573
−578（1978）参照〕であり、第３はアミノ基末端
のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata，etal.，
Thrombosis Research，16，279−282（1979）参
照〕。 最近、ヒトα2−プラスミンインヒビターの理学
的、生物学的性質の解明が進み、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターは線維素溶解機構に対して、重
要な作用をしていることが知られている〔例えば
青木延雄“医学のあゆみ”126，147−155（1983）
参照〕。 また、α2−プラスミンインヒビター先天的欠損
症患者の血液を試験管に入れ37℃に放置すると、
凝固はまつたく正常におこるが４〜８時間で凝固
は完全に自然溶解する 〔N.Aoki，etal.，Journal of Clinical
Investigation，63，877−884（1979）参照〕。 実際α2−プラスミンインヒビター欠損症に於て
は、止血栓の早期崩壊によるきわめて重篤な出血
傾向がみられる。 この事実は、逆に、重篤な血栓症に於て血液中
のα2−プラスミンインヒビターの量を減少させる
ことにより病因となつている血栓を速やかに溶解
し得ることを示唆しているものと考えられる。 ｃ 発明の構成 そこで、本発明者らは、ヒトα2−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体について
研究を重ねたところ、ヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体であつて、ヒ
トα2−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識しないヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナ
ル抗体を見出し、またこのモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞を創作し得、既に提
案した（特願昭59−75778号（特開昭60−222426
号））。 本発明者らは、かくして得られたモノクローナ
ル抗体の特異的な作用の利用について更に研究を
進めた結果、ヒトα2−プラスミンインヒビターを
特異的に吸着し得る吸着体及びそれを用いてヒト
血漿中のヒトα2−プラスミンインヒビターを選択
的に分離し得ることを見出し本発明に到達したも
のである。 すなわち、本発明はヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体であつて、ヒ
トα2−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識しないヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナ
ル抗体をリガンドとして不溶性担体に結合させた
ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する選択的
吸着体であり、またその吸着体を用いてヒト血漿
中よりヒトα2−プラスミンインヒビターを選択的
に分離する方法である。 一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の
分離・精製に利用するクロマトグラフイーは、ア
フイニテイークロマトグラフイーと呼ばれている
〔例えば、千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実
験と応用アフイニテイークロマトグラフイー」講
談社サイエンテイフイツク参照〕。 本発明におけるアフイニテイー、リガンド、不
溶性担体、吸着体なる語は、それぞれ下記に意味
に解するものとする。 アフイニテイー；２種物質間に存在する特異的親
和力 リガンド；吸着あるいは精製を目的とする物質と
アフイニテイーを有する物質 不溶性担体；水に不溶性の支持体（これにはリガ
ンドは含まれない） 吸着体；リガンドを不溶性担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトα2−プラスミンインヒ
ビターに対する選択的吸着体及びヒト血漿中より
ヒトα2−プラスミンインヒビターを分離する方法
について詳細に説明する。 後述するヒトα2−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体を適当な不溶性担体（例
えばセフアロース）に化学的にリガンドとして結
合させ、これをカラムに詰め適当な緩衝溶液（例
えば50mMトリス緩衝液PH7.4、0.15M NaCl）に
よつて平衡化する。この吸着体に検体試料（ヒト
血漿）を添加して検体試験中のヒトα2−プラスミ
ンインヒビターを吸着させる。次に適当な洗浄溶
液（例えば、50mMトリス緩衝液、PH7.4、0.15M
NaCl）によつて、不純物を吸着体から除去する。
次いで血漿の『素通り画分』及び『洗浄画分』中
のヒトα2−プラスミンインヒビター量を測定す
る。かくしてその値からヒト血漿中からのヒトα2
−プラスミンインヒビターの分離の程度を算出す
ることができる。 本発明における選択的吸着体に用いられる不溶
性担体としては、種々のものが使用できるが、例
えば材質としてセフアロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、デキストラン、またはマレイン
酸ポリマー或いはこれらの混合物が好ましく用い
られる。これら不活性担体の形状としては、粉末
状、粒状、ペレツト状、ビーズ状、フイルム状、
線維状など種々の形態であることができる。 前記したように、本発明の吸着体に使用される
抗体である“ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プ
ラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線維
素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプラスミン
結合部位及びフイブリン結合部位のいずれをも認
識しないヒトα2−プラスミンインヒビターの線維
素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体”
は、本発明者らによつて初めて見出され先に特許
出願された（昭和59年４月17日出願；発明の名称
“モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞及び
モノクローナル抗体の製造方法”特願昭59−
75778号）。 本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されているが、以下にその内容を簡単に説明す
る。 Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーは前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中よ
り単離精製された。 Ｂ ヒトα2−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のα2−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さ
らに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に
融合の為に脾臓細胞を取り出す。 Ｃ 細胞融合； 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。 細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞
（以下P3−U1と略記する） 〔Yelton，D.E.etal.，Current Topicsin
Microbiology and Immunology，81，１
（1978）参照〕を用いた。これは、８−アザグ
アニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサ
ンチン−グアニンホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（hypoxanthineguanine phosporibosy
transferase）が欠失しており、それゆえに
HAT（ヒポキサンチン、アルミノプテリン、
チミジン）培地中では生存しない。また、この
細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌型である。 好ましい融合促進剤としては例えば平均分子
量が1000〜4000のポリエチレングリコールを有
利に使用できるが、この分野で知られている他
の融合促進剤を使用することもできる。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタ−プレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。 Ｅ 各容器中のヒトα2−プラスミンインヒビター
に対する抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）よりスクリーニングする。 Ｆ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活
性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた、抗体を含んだ培養
上澄液を濃縮し、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターと共に一定時間インキユベートした。さら
にこのヒトα2−プラスミンインヒビター混合液
にプラスミンを加え、フイブリンプレート上に
のせ、フイブリン溶解面積を測定した。このよ
うにして、ヒトα2−プラスミンインヒビター対
する活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を選択する。 Ｇ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することによ
り、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることがで
きる。第２の方法によればハイブリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの
腹腔に注射することができる。一定時間後の宿
主動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリ
ドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得
ることができる。 上記の如くして得られたモノクローナル抗体
は、ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミン結合部位及びフイブリン結合部位のいず
れをも認識せず、かつプラスミンの線維素溶解作
用の阻止部位を認識し、その部位に選択的に結合
する。 本発明のヒト血漿中のα2−プラスミンインヒビ
ターの分離に用いる吸着体においては、かかるモ
ノクローナル抗体をリガンドとして不溶性担体に
化学的に結合させて使用する。かゝる結合方法と
しては一般にモノクローナル抗体を不溶性担体に
化学的に結合する方法であればよい。 以上、本発明によれば、ヒト血漿中よりα2−プ
ラスミンインヒビターを容易に且つ選択的に分離
することが可能である。 以上実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例 ヒト血漿よりα2−プラスミンインヒビターの分
離 α2−プラスミンインヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体1D10C1をリガンドとして化学的に結
合させた吸着体（0.5ml）をカラムに詰め、洗浄
液（50ｍＭトリス緩衝液PH7.4、0.15MNaCl）で
十分に洗浄後、ヒト血漿1.0mlを添加した。さら
に、上記洗浄液1.0mlでカラム内壁を洗浄し、溶
出した画分を「素通り画分」とした。次に未吸着
物質を上記洗浄液2.0mlで溶出し、「洗浄画分」と
した。以上の操作はすべて４℃で行なつた。分取
した「素通り画分」及び「洗浄画分」は、即に４
℃で脱塩、濃縮を行なつた。 ヒトα2−プラスミンインヒビター検量線の作成 α2−プラスミンインヒビター量は、本発明者ら
が、先に出願した明細書（昭和59年５月１日付出
願；発明の名称“ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的
測定試験及びキツト”特願昭59−86101号（特開
昭60−231168号））に記載された、サンドイツチ
法を用いて測定した。 本実施例で使用した第１及び第２抗体は、本発
明者らが先に出願した明細書（昭和59年４月17日
付出願；発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778号）に記載された方法によ
つて得られた下記のものを使用した。 第１抗体 前記出願明細書（特願昭59−75778号）の実施
例３において得られた抗体名“1D10C1”を使用
し、これを下記の如く不溶性担体（マイクロタイ
タープレート）に固定化させて用いた。この抗体
はヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミン結合部位及びフイブリン結合部位のいずれ
をも認識せず、かつプラスミンの線維素溶解作用
の阻止部位を認識し、その部位に選択的に結合す
るモノクローナル抗体である。 第２抗体 前記出願明細書（特願昭59−75778号）の実施
例３において得られた抗体名“1B10G11”を使
用した。この抗体はα2−プラスミンインヒビター
におけるリアクテイブサイト以外の部位を特異的
に認識するモノクローナル抗体であり、アルカリ
性フオスフアターゼで標識化して使用した。 濃度20μｇ／mlのヒトα2−プラスミンインヒビ
ターにおけるリアクテイブサイトを特異的に認識
するモノクローナル抗体（1D10C1）をマイクロ
タイタープレート上に４℃で一晩放置し固定化し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15ｍＭ Na2CO3、35ｍＭ NaHCO3、３ｍＭ
NaN3）を加え室温で４時間放置した後、１％
牛血清アルブミンを含む洗浄液（20ｍＭリン酸緩
衝液、0.135M NaCl、２ｍＭ NaN3、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20ｍＭリン酸緩衝液PH7.4、0.135M NaCl）で
種々の濃度となるように希釈したα2−プラスミン
インヒビターを加え、室温で４時間放置した。 その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカ
リ性フオスフアターゼで標識したα2−プラスミン
インヒビターにおけるリアクテイブサイト以外の
部位を認識するモノクローナル抗体（1B10G11）
を加え４℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄後
アルカリ性フオスフアターゼ基質溶液を１mg／ml
の濃度で加え、MICROPLATE
PHOTOMETER（コロナ電気(株)製、MTP−20）
で20分後に405nｍの波長における吸光度を測定
した。その結果を添付図面に示した。この図面か
らα2−プラスミンインヒビターの濃度と吸光度と
の関係は直線関係になることが理解できる。従つ
てα2−プラスミンインヒビターにおけるリアクテ
イブサイトを特異的に認識するモノクローナル抗
体をサンドイツチ法における一つの抗体として使
用することによつて、α2−プラスミンインヒビタ
ーの量を容易に測定することができる。 添付図面を検量線として用い、ヒト血漿「素通
り画分」及び「洗浄画分」のα2−プラスミンイン
ヒビター量を測定した。 試料中のα2−プラスミンインヒビター量の測定 ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるリア
クテイブサイトを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（1D10C1）を濃度20μｇ／mlでマイクロタ
イタープレート上に４℃で一晩放置し固定化し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15ｍＭ Na2CO3、35ｍＭ NaHCO3、３ｍＭ
NaN3）を加え室温で４時間放置した後、１％
牛血清アルブミンを含む洗浄液（20ｍＭリン酸緩
衝液、0.135M NaCl、２ｍＭ NaN3、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20ｍＭリン酸緩衝液、0.135M NaCl）で種々の
濃度となるように希釈した試料（前記「素通り画
分」、「洗浄画分」及びヒト血漿）を加え室温で４
時間放置した。 その後、前記洗浄液で５回洗浄し、アルカリ性
フオスフアターゼで標識したヒトα2−プラスミン
インヒビターにおけるリアクテイブサイト以外の
部位を認識するモノクローナル抗体（1B10G11）
を加え、４℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄
後、アルカリ性フオスフアターゼ基質溶液１mg／
mlの濃度で加え、MICROPLATE
PHOTOMETER（コロナ電気(株)製、MTP−12）
で20分後に405nｍの波長における吸光度を測定
した。 結果を下記表に示す。「素通り画分」、「洗浄画
分」にはα2−プラスミンインヒビターは検出され
ず、ヒト血漿を前記吸着体に添加することによつ
てヒト血漿からα2−プラスミンインヒビターが完
全に分離されたことが確認できた。 【表】
添付書類はヒトα2−プラスミンインヒビターの
濃度と吸光度との関係を示すものである。
濃度と吸光度との関係を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プラスミン
インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作
用の阻止部位を認識し、かつプラスミン結合部位
及びフイブリン結合部位のいずれをも認識しない
ヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
止作用を抑制するモノクローナル抗体を不溶性担
体に結合させたヒトα2−プラスミンインヒビター
に対する選択的吸着体。 ２ 該不溶性担体が、セフアロース、ポリアクリ
ルアミド、セルロース、デキストラン及びマレイ
ン酸ポリマーなる群から選ばれた少くとも一種で
ある特許請求の範囲第１項記載の選択的吸着体。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217312A JPS6197230A (ja) | 1984-10-18 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
| DK170485A DK166627B1 (da) | 1984-04-17 | 1985-04-16 | Monoklont antistof, der er specifikt over for human-alfa-2-plasmininhibitor, fremgangsmaade til fremstilling af et hybridom, der producerer antistoffet, anvendelse af antistoffet til immunologisk analyse for human-alfa-2-plasmininhibitor og anvendelse af antistoffet til fraskillelse og udvinding af human-alfa-2-plasmininhibitor |
| NO851518A NO171169C (no) | 1984-04-17 | 1985-04-16 | Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor |
| DE3587714T DE3587714T2 (de) | 1984-04-17 | 1985-04-17 | Menschliches alpha 2-Plasmin spezifischer monoklonaler Antikörper. |
| EP85104629A EP0159025B1 (en) | 1984-04-17 | 1985-04-17 | Monoclonal antibody specific to human alpha2-plasmin |
| US07/716,694 US5534255A (en) | 1984-04-17 | 1991-06-17 | Monoclonal antibody specific to human α2 -plasmin inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217312A JPS6197230A (ja) | 1984-10-18 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6197230A JPS6197230A (ja) | 1986-05-15 |
| JPH0455200B2 true JPH0455200B2 (ja) | 1992-09-02 |
Family
ID=16702182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59217312A Granted JPS6197230A (ja) | 1984-04-17 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6197230A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2520424B2 (ja) * | 1987-07-03 | 1996-07-31 | 帝人株式会社 | 血液線溶活性の測定方法 |
| JPH01233298A (ja) * | 1988-03-11 | 1989-09-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 抗体、その製造法、ｈｍｌｃを測定するための試薬、ならびにモノクローナル抗体 |
-
1984
- 1984-10-18 JP JP59217312A patent/JPS6197230A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6197230A (ja) | 1986-05-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |