JPH05236977A - アミド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 リゾビウム属に属し、ニトリル類を分解する
能力を有する微生物（リゾビウム・エスピーＭＣＩ２６
１０号菌、リゾビウム・エスピーＭＣＩ２６４３号菌、
リゾビウム・ロティＩＡＭ１３５８８号菌、リゾビウム
・レグミノサーラムＩＡＭ１２６０９号菌およびリゾビ
ウム・メリオティＩＡＭ１２６１１号菌等）を用いて、
ニトリル類からアミド類を製造する。 【効果】 本発明の方法によれば、ニトリル類から工業
的に有用な純度の高いアミド類が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニトリル類を微生物の
作用により水和して対応するアミド類に変換させる方法
に関し、さらに具体的には、本発明は使用する微生物に
特徴を有するアミド類の生物学的製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
ニトリル類を原料として、対応するアミド類を生産する
方法としては、硫酸法、銅触媒法などによる化学法が広
く工業化されてきたが、近年微生物に由来する酵素を用
いた方法も報告されるようになった。微生物を用いた方
法の利点としては、反応条件が温和なため原料、生産物
の重合反応が起きにくい、副生物が少ない、反応装置が
小さくて済むなどがあげられる。ニトリル類に水を添加
してアミド類を生成する酵素活性を持った微生物として
は、グラム染色陽性の細菌（特公昭６２−２１５１９号
公報）、特にコリネ型細菌（アルスロバクター、ロドコ
ッカス、コリネバクテリウムなど：特公昭５６−１７９
１８号公報、特開昭５９−２６９３号公報、特開昭６１
−１６２１９３号公報、特開昭６２−９１１８９号公
報）や、真菌類（フザリウム：特開昭６４−８６８８９
号公報）などが報告され、グラム染色陰性の細菌として
は唯一シュードモナスが報告されている（特公昭５９−
３７９５１号公報）だけである。

【０００３】微生物は大きく分類すると真核細胞に分類
されるもの（担子菌、糸状菌、酵母など）と原核細胞に
分類されるもの（細菌、藍藻、放線菌など）に大別され
る。細菌はさらに細胞壁の構成により、グラム染色陽性
のもの（コリネ型細菌、枯草菌、ブドウ状球菌、乳酸
菌、酢酸菌、放線菌など）と、陰性のもの（腸内細菌、
緑膿菌、ビブリオ菌など）に分けられ、それぞれ分類学
的には大きく異なるものとされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、土壌から
の微生物のスクリーニングを広く行なった結果、以下に
示すように従来全く知られていなかったグラム染色陰性
のリゾビウム属に属する微生物がニトリル類からアミド
類への変換能を有することを見出してアミド類の新たな
製造法を確立した。

【０００５】すなわち本発明の要旨はニトリル類からア
ミド類を微生物の作用により製造する方法において、該
微生物がリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属し、
ニトリル類を分解する能力を有する微生物であることを
特徴とするアミド類の製造法に存する。

【０００６】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明において反応原料となるニトリル類としては、 ○アセトニトリル、プロピオノニトリル、ｎ−ブチロニ
トリル、イソブチロニトリルのような単純なニトリル
類； ○α−アミノプロピオニトリル、α−アミノメチルチオ
ブチロニトリル、α−アミノブチロニトリル、アミノア
セトニトリルのようなα−アミノニトリル類； ○ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリル、α−ヒ
ドロキシ−γ−メチルチオブチロニトリルのようなα−
ヒドロキシニトリル類； ○アミノ−３−プロピオニトリルのようなβ−アミノニ
トリル類； ○マロンニトリル、スクシノニトリル、アジポニトリル
のようなジニトリル類； ○アクリロニトリル、メタクリロニトリルのようなα−
不飽和ニトリル類； ○ホモベラトリンニトリル、ベンゾニトリルのようなα
−ベンゼンニトリル類； ○ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルのような複
素環式ニトリル類 等が挙げられ、中でもアセトニトリル、プロピオノニト
リル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブ
チロニトリル、イソブチロニトリルなどの炭素数２〜４
のニトリル類が好ましい。とくに好ましいのはアクリロ
ニトリルである。

【０００７】また上記のニトリル類から生成されるアミ
ド類は、上記の各ニトリル類に対応するアミド類、例え
ばアセトニトリルからはアセトアミドが、プロピオノニ
トリルからはプロピオンアミドが、アクリロニトリルか
らはアクリルアミドが生成される。次に本発明において
使用される微生物に付いて説明する。

【０００８】本発明において使用される微生物として
は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属し、ニト
リル類を分解してアミド類に変換させる能力を有するも
のであれば特に制限はされない。かかる微生物として
は、リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓ
ｐ．）ＭＣＩ２６１０（以下、「ＭＣＩ２６１０号菌」
と略記することもある）、リゾビウム・エスピーＭＣＩ
２６４３（以下、「ＭＣＩ２６４３号菌」と略記するこ
ともある）、リゾビウム・ロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｌｏｔｉ）ＩＡＭ１３５８８（以下、「ＩＡＭ１３５
８８号菌」と略記することもある）、リゾビウム・レグ
ミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｍｉｎｏｓ
ａｒｕｍ）ＩＡＭ１２６０９（以下、「ＩＡＭ１２６０
９号菌」と略記することもある）、リゾビウム・メリオ
ティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｏｔｉ）ＩＡＭ１
２６１１（以下、「ＩＡＭ１２６１１号菌」と略記する
こともある）が挙げられる。

【０００９】これらの菌株中、ＭＣＩ２６１０号菌およ
びＭＣＩ２６４３号菌は、それぞれ通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２４５７号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４５７）および微工研菌寄第１２
４５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４５８）として寄託さ
れ、１９９２年７月２９日にそれぞれ同所に微工研条寄
第３９５２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５２）および微工
研条寄第３９５３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５３）とし
て移管された。また、ＩＡＭ１３５８８号菌、ＩＡＭ１
２６０９号菌及びＩＡＭ１２６１１号菌は、東京大学応
用微生物研究所が所有する菌株である。上記菌株中、Ｍ
ＣＩ２６１０号菌およびＭＣＩ２６４３号菌は、本発明
者らにより、天然土壌から分離された細菌であり、その
菌学的性質は次の通りである。

【００１０】

【表１】 ａ） 形態的性状 普通寒天培地上、３０℃、３日間培養 ＭＣＩ２６１０号菌 ＭＣＩ２６４３号菌 １） 細胞の大きさ、形 ： 桿状 桿状 ２） 細胞の多形性の有無 ： なし なし ３） 運動性 ： あり 周毛 あり 周毛 ４） 胞子形成 ： なし なし ５） グラム染色 ： 陰性 陰性 ６） 抗酸性 ： 陰性 陰性

【００１１】

【表２】 ｂ） 生育状態 普通寒天培地上、３０℃、３日間培養のコロニーの特徴 １） 外形 ： 円形 円形 ２） 表面の隆起 ： 半レンズ状 半レンズ状 ３） 表面の形状 ： 平滑 平滑 ４） 光沢 ： あり あり ５） 色調 ： 黄身白色 黄身白色 ６） 透明度 ： 不透明 不透明 ７） 周縁 ： 全縁 全縁 ８） 粘性 ： ややあり あり

【００１２】

【表３】 ｃ） 生理的性質 ＭＣＩ２６１０号菌 ＭＣＩ２６４３号菌 １） 空気中での生育 ： ＋ ＋ ２） 嫌気条件下での生育 ： − − ３） カタラーゼ ： ＋ ＋ ４） オキシダーゼ ： ＋ ＋ ５） Ｏ−Ｆテスト ： Ｏ Ｏ ６） ゼラチンの加水分解 ： − − ７） リトマス・ミルク ： 変化なし 変化なし ８） 硝酸塩の還元 ： ＋ ＋ ９） 脱窒反応 ： ± ＋ １０） メチルレッドテスト ： − ＋ １１） ＶＰテスト ： − − １２） インドールの生成 ： − − １３） 硫化水素の生成 ： − − １４） デンプンの加水分解 ： − − １５） クエン酸の利用 ： − −

【表４】 （クリステンセン培地上） １６） 無機窒素源の利用 ＮＨ₄ ： ＋ ＋ ＮＯ₃ ： − ＋ １７） ウレアーゼ ： ＋ ＋ １８） リジンの脱炭酸 ： ± ± １９） オルニチンの脱炭酸 ： ＋ ＋ ２０） アルギニンの加水分解： − − ２１） ＤＮａｓｅ ： − − ２２） フォスファターゼ ： ＋ ＋ ２３） チロシンの分解 ： ＋ ＋ ２４） キチンの分解 ： − − ２５） Ｔｗｅｅｎ８０の分解： − − ２６） ３−ｋｅｔｏｌａｃｔｏｓｅの生成： − − ２７） 色素の生成 ： 茶色色素 − ２８） 生育温度域 ： １０〜４０℃ １０〜４０℃ ２９） 生育ｐＨ ： ｐＨ５〜１０ ｐＨ５〜１０ ３０） ＮａＣｌ耐性 ： ２％で生育 ２％で生育

【００１３】

【表５】 ３１） 唯一炭素源より酸の生成（２週間培養） ─────────────────────────────────── 炭素源 ＭＣＩ２６１０号菌 ＭＣＩ２６４３号菌 ─────────────────────────────────── １ Ｌ−アラビノース ＋ ＋ ２ Ｄ−キシロース ＋ ＋ ３ Ｄ−グルコース ＋ ＋ ４ Ｄ−マンノース ＋ ＋ ５ Ｄ−フラクトース ＋ ＋

【表６】 ６ Ｄ−ガラクトース ＋ ＋ ７ マルトース ＋ ＋ ８ シュクロース ＋ ＋ ９ ラクトース − ＋ １０ トレハロース ＋ ＋ １１ Ｄ−ソルビット ＋ ＋ １２ Ｄ−マンニット ＋ ＋ １３ グリセリン ＋ ＋ １４ デンプン − − １５ セロビオース ＋ ± １６ Ｌ−ラムノース ＋ ＋ １７ ラフィノース − − １８ メレジトース − − １９ アドニトール − ± ２０ ズルチトール − − ２１ エリスリトール ＋ ＋ ２２ サリシン ＋ − ２３ エタノール − ＋

【００１４】３２） 有機酸の利用（２週間培養）

【表７】 ─────────────────────────────────── 有機酸 ＭＣＩ２６１０号菌 ＭＣＩ２６４３号菌 ─────────────────────────────────── １ 酢酸 ＋ − ２ 安息香酸 − − ３ クエン酸 ＋ｌａｔｅ ＋ ４ マロン酸 − ＋ ５ プロピオン酸 − − ６ ピルビン酸 ＋ ＋ ７ Ｌ−酒石酸 − ＋ ８ リンゴ酸 − ＋ ９ グルコン酸 − − １０ アジピン酸 − − ───────────────────────────────────

【００１５】ｄ） 化学分類学的性質

【表８】 ＭＣＩ２６１０号菌 ＭＣＩ２６４３号菌 １） ＤＮＡ中のＧＣ含量 ６６％ ６３％ ２） ユビキノン Ｑ−１０ Ｑ−１０ ３） 菌体脂肪酸 Ｃ_18:1 Ｃ_18:1 ３ＯＨ−Ｃ_14:0 ３ＯＨ−Ｃ_14:0 ３ＯＨ−Ｃ_16:0 ３ＯＨ−Ｃ_16:0 ３ＯＨ−Ｃ_18:0 ３ＯＨ−Ｃ_18:0

【００１６】ｅ） ＭＣＩ２６１０号菌の分類学的考察 １） 高次の分類学上の位置 ＭＣＩ２６１０号菌は細胞中に芽胞を欠き、少数の周ベ
ン毛を有する好気性、グラム陰性桿菌であり、多くの糖
類を資化でき、また、菌体外多糖類を産生する。化学分
類学的性状は６６％の高いＧＣ含量を持ち、キノン系は
ユビキノンＱ１０である。菌体脂肪酸組成は直鎖型でＣ
_18:1を多く含有し、また、ハイドロキシ脂肪酸は主に３
ＯＨ−Ｃ_14:00を含有し、２−ハイドロキシ脂肪酸を含
まない。これらの菌学的性状から、ＭＣＩ２６１０号菌
はＢｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第一版、ｐ２
３４，１９８４年）記載のリゾビアシーエ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉａｃｅａｅ）に帰属することが判明した。

【００１７】２） 属レベルの固定 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第一版、ｐ２３
４〜２５６，（１９８４年）によれば、リゾビアシーエ
の中には、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラジ
ヒゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィロ
バクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の４
属が含まれており、これら４属は以下の性状により識別
されている。

【００１８】

【表９】 ─────────────────────────────────── Rhizobi- Bradyrh- Agroba- Phyllob- MCI2610 um izobium cterium acterium 号菌 ─────────────────────────────────── ベン毛部位 極毛又は 極毛 周毛 極毛 周毛 周毛 ─────────────────────────────────── 根粒形成能 ＋ ＋ − − ─────────────────────────────────── 葉面上の − − − ＋

【表１０】 コブ形成能 ─────────────────────────────────── ニトロゲナーゼ ＋ ＋ − − ─────────────────────────────────── 宿主異常肥大 − − ＋ − ─────────────────────────────────── ３−ケト − − ＋／− − ラクトース ─────────────────────────────────── ＹＭＡ上での ＋ − ＋ ＋ ＋ 迅速発育性 ─────────────────────────────────── 糖類のアルカリ化 − ＋ − − − ─────────────────────────────────── Ｈ₂ Ｓ産生能 ＋／− − − − ─────────────────────────────────── ビオチン要求性 ＋ ＋ − − ─────────────────────────────────── 菌体外多糖類の β−２−結合 ＋ ＋ ＋ グルカン ─────────────────────────────────── ＧＣ含量 59−64 61−65 57−63 60−61 66 （ｍｏｌ％） ────────────────────────────────────

【００１９】これらの４属とＭＣＩ２６１０号菌の性状
を比較したところ、ＭＣＩ２６１０号菌はリゾビウム、
アグロバクテリウムあるいはブラジヒゾビウムに近いこ
とが示唆された。また、化学分類学的性状においては、
本菌株のＧＣ含量は６６％の高い値を示し、この点では
ブラジヒゾビウム（６１〜６５％）に最も近いＧＣ含量
を持っている。しかしながら、本菌株は周ベン毛を持
ち、ＹＭＡ培地上で迅速な発育を示すという点でブラジ
ヒゾビウムとは明らかに異なっている。

【００２０】次に菌体脂肪酸の一つである、ハイドロキ
シ脂肪酸について比較を行った。特にハイドロキシ脂肪
酸はグラム陰性菌の分類、同定に有効な指標とされてい
る。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ，Ｏｓａｋａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎ ｖｏｌ．１５，ｐ５７〜７５（１９９
１）によれば、リゾビアシーエに属する菌群は種または
種より下の分類群で特徴あるハイドロキシ脂肪酸のパタ
ーンを示し、共通する３ＯＨ−Ｃ_14:0以外のハイドロキ
シ脂肪酸組成から９つのグループに分けられる。そこで
本菌株の脂肪酸パターンについて検索したところ、下表
のように本菌株は１）２−ハイドロキシ脂肪酸を持たな
い、２）少量の３ＯＨ−Ｃ_18:0及び３ＯＨ−Ｃ_16:0を有
することから、リゾビウム・メリロティ（Ｒ．ｍｅｌｉ
ｌｏｔｉ）、リゾビウム・フレディ（Ｒ．ｆｒｅｄｉ
ｉ）及びリゾビウム・ガレガ（Ｒ．ｇａｌｅｇａｅ）に
類似していた。またアグロバクテリウム属の菌群のパタ
ーンとはいずれも一致しなかった。

【００２１】以上の結果から属レベルの同定としては、
本菌株（ＭＣＩ２６１０号菌）はリゾビウム属に属する
とするのが妥当であると思われる。従って本菌株（ＭＣ
Ｉ２６１０号菌）をＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．と同定
した。

【００２２】ｆ） ＭＣＩ２６４３号菌分類学的考察 １） 高次の分類学上の位置 ＭＣＩ２６４３号菌は細胞中に芽胞を欠き、少数の周ベ
ン毛を有する好気性、グラム陰性桿菌であり、多くの糖
類を資化でき、また、菌体外多糖物質を産生する。化学
分類学的性状は、６３％の高いＧＣ含量を持ち、キノン
系はユビキノンＱ１０である。脂肪酸組成は直鎖型でＣ
１８：１を多く含有し、また、ハイドロキシ脂肪酸は主
に３ＯＨ−Ｃ１４：００を含有し、２−ハイドロキシ脂
肪酸を含まない。これらの菌学的性状から、ＭＣＩ２６
４３号菌もＭＣＩ２６１０号菌と同様リゾビアシーエ
（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に帰属することが判明し
た。

【００２３】２） 属レベルの固定 前述したリゾビウム、ブラジヒゾビウム、アグロバクテ
リウムおよびフィロバクテリウムの４属とＭＣＩ２６４
３号菌の性状を比較した結果、ＭＣＩ２６４３号菌はリ
ゾビウムあるいはアグロバクテリウムに近いことが示唆
された。また化学分類学的性状においては、本菌株のＧ
Ｃ含量は６３％の高い値を示し、この点ではブラジヒゾ
ビウム（６１〜６５％）に最も近いＧＣ含量を持ってい
る。しかしながら、本菌株は周ベン毛を持ち、ＹＭＡ培
地上で迅速な発育を示すという点でブラジリゾビウムと
は明らかに異なっている。次に菌体脂肪酸の一つであ
る、ハイドロキシ脂肪酸について比較を行った。ハイド
ロキシ脂肪酸は特にグラム陰性菌の分類、同定に有効な
指標とされている。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｖｏｌ．１５，ｐ５７
〜７５（１９９１）によれば、リゾビアシーエに属する
菌群は種または種より下の分類群で特徴あるハイドロキ
シ脂肪酸のパターンを示し、共通する３ＯＨ−Ｃ_14:0以
外のハイドロキシ脂肪酸組成から９つのグループに分け
られる。そこで本菌株の脂肪酸パターンについて検索し
たところ、下表のように本菌株は１）２−ハイドロキシ
脂肪酸を持たない、２）少量の３ＯＨ−Ｃ_18:0及び３Ｏ
Ｈ−Ｃ_16:0を有することから、リゾビウム・メリロティ
（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、リゾビウム・フレディ
（Ｒ．ｆｒｅｄｉｉ）及びリゾビウム・ガレガ（Ｒ．ｇ
ａｌｅｇａｅ）に類似していた。またアグロバクテリウ
ム属の菌群のパターンとはいずれも一致しなかった。

【００２４】以上の結果から属レベルの同定としては、
本菌株（ＭＣＩ２６４３号菌）はリゾビウム属に属する
とするのが妥当であると思われる。従って本菌株（ＭＣ
Ｉ２６４３号菌）をＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．と同定
した。

【００２５】

【表１１】 ＭＣＩ２６１０号菌及びＭＣＩ２６４３号菌のハイドロキシ脂肪酸パターン ─────────────────────────────────── ３ ２ ３ ３ ３ ３ ３ ３ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ リゾビアシーエに ケ OH OH OH OH OH OH OH 帰属する微生物 ト 脂 12 ｉ ｉ ai 16 18 ラ 肪 ： ｜ ｜ ｜ ： ： ク 酸 ０ 13 15 15 ０ ０ ト ： ： ： ｜形 ０ ０ ０ ス成 ─────────────────────────────────── １ Bradyrhizobium − − ＋ − − − − − ２ R. leguminosarum − − − − − ＋ ＋ ＋ ３ R. meliloti, − − − − − − ± ＋ R. fredii ４ R. galegae − − − − − − ＋ ＋ ５ R. loti − − ＋ ＋ − − ＋ ＋ ６ Agrobacterium ＋ − − − − − ＋ − biovar 1 ７ Agrobacterium − ＋ − − ＋ − ＋ ＋ biovar 2 ８ Agrobacterium − ＋ − − − − ＋ ＋ biovar 3 ９ A. rubi − − − − − − ＋ − ───────────────────────────────────

【表１２】 ＭＣＩ２６１０ − − − − − − ＋ ＋ ＭＣＩ２６４３ − − − − − − ＋ ＋ ───────────────────────────────────

【００２６】本発明によるニトリル類の微生物学的水和
反応は、使用する微生物が特定のものであるという点を
除けば、公知の方法と本質的には変わらない。従って、
本発明で「ニトリル類を微生物の作用により水和して対
応するアミド類に変換させる」ということはニトリル類
の存在下に微生物を培養する場合、ならびに微生物培養
後の培養液、菌体またはこれらの処理物とニトリル類を
接触させる場合のいずれをも包含するものとする。ま
た、微生物菌体、またはこの微生物が菌体内もしくは菌
体外に産生する酵素を固定化して反応に利用する場合を
も含むものである。

【００２７】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはグルコー
ス、グリセロール、水飴、澱粉などの炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、大豆
粉、酵母エキス、ペプトン、尿素などの有機窒素源、及
び燐酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの
無機塩類を適当な割合で含有する通常の培地が使用され
る。また目的の酵素を誘導するために培地中にアセトニ
トリルなどのニトリル類、アクリルアミドなどのアミド
類や酵素活性に必要な無機塩類、例えば鉄イオン、亜鉛
イオン、コバルトイオン等を添加することも望ましい。
これらの培地のｐＨは５〜１０とし、温度は２０〜３７
℃で１〜５日間培養を行う。

【００２８】ニトリル類からアミド類への変換は、当該
微生物を水和を目的とするニトリルの存在下で培養して
行うことも可能であるが、好ましくは以下の方法によ
る。当該微生物を前述の方法で培養し、その培養液から
菌体を遠心分離により集め、これを水、生理食塩水、リ
ン酸やトリスなどのｐＨ４〜１１の緩衝液中に懸濁し、
これに目的とするニトリル類例えばアクリロニトリルを
加え、適当な温度条件の下、たとえば氷点以上６０℃以
下で共存させれば良い。その場合目的とするニトリル類
を反応の進行と共に逐次添加していくことも可能であ
る。

【００２９】上記のように培養した微生物菌体または培
養上清から、破砕、硫安沈澱、イオン交換、ゲル濾過、
疎水性担体などのカラムクロマトグラフィーの手段によ
り酵素を精製し、得られた酵素を用いて上記のような反
応を行わせることも可能である。また上記の方法で得ら
れた微生物菌体または酵素を、ポリアクリルアミド、光
架橋性樹脂、寒天、カラギーナンなどのゲルで包括固定
化し、上記に示したと同様適当なｐＨ、温度条件下で攪
拌型反応槽内でニトリル類と反応させ、またはカラムに
充填しニトリル類を含有する液を流通させることにより
反応させることも可能である。

【００３０】反応後得られたアミド類はそのまま水溶液
として、または膜濃縮やスプレイドライ濃縮などの方法
により濃縮し粉末として利用することができる。場合に
よっては活性炭、イオン交換樹脂、イオン交換膜などの
方法によりさらに純度を上げることも可能である。

【００３１】

【実施例】以下、本発明につき実施例を挙げて具体的に
説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定される
ものではない。なお、ニトリル類およびアミド類の定量
は高速液体クロマトグラフィーにより行った。

【００３２】実施例１ クレブシエラＭＣＩ２６１０号菌をグリセロール０．４
％、酵母エキス０．２％、ポリペプトン０．０５％、Ｆ
ｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．００１％、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂
Ｏ０．００１％、ＮａＣｌ０．２％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ０．０４％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．２５％、アクリルア
ミド０．０２５％を含む培地により、３０℃で３日間好
気的に培養した。培養終了後遠心分離より菌体を分離し
た後、生理食塩水で洗浄し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０、０．１Ｍ）に懸濁した。この内の０．８ｍｌをサン
プリングし、７％アクリロニトリル水溶液を０．２ｍｌ
混和し、３０℃で１時間反応させた。反応終了後、反応
液中にアクリルアミドが検出された。

【００３３】実施例２ 実施例１においてＭＣＩ２６１０号菌の代わりにＭＣＩ
２６４３号菌を用いた他は同様にして反応させたとこ
ろ、反応液中にアクリルアミドの生成が確認された。

【００３４】実施例３ 実施例１においてＭＣＩ２６１０号菌の代わりにリゾビ
ウム・ロティ ＩＡＭ１３５８８号を用いた他は同様に
して反応させたところ、反応終了液１ｍｌ中にアクリル
アミドが約４ｍｇ生成していた。

【００３５】実施例４、５ 実施例１において、ＭＣＩ２６１０号菌の代わりにリゾ
ビウム・レグミノサーラムＩＡＭ１２６０９号菌および
リゾビウム・メリオティＩＡＭ１２６１１号菌を用いた
他は同様にして反応させたところ、いずれも反応液中に
アクリルアミドが検出された。

【発明の効果】上記で示したように、本発明の方法によ
ればリゾビウム属に属する微生物を用いて、ニトリル類
から工業的に有用な純度の高いアミド類が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺西 豊 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニトリル類からアミド類を微生物の作用
   により製造する方法において、該微生物がリゾビウム属
   に属するニトリル類を分解する能力を有する微生物であ
   ることを特徴とするアミド類の製造法。
2. 【請求項２】 微生物の培養液にニトリル類を添加して
   これを対応するアミド類に変換させることを特徴とする
   請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 ニトリル類の添加を連続的または間欠的
   に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の製造
   法。
4. 【請求項４】 ニトリル類がアクリロニトリルであるこ
   とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造
   法。
5. 【請求項５】 微生物がリゾビウム・エスピーＭＣＩ２
   ６１０号菌、リゾビウム・エスピーＭＣＩ２６４３号
   菌、リゾビウム・ロティＩＡＭ１３５８８号菌、リゾビ
   ウム・レグミノサーラムＩＡＭ１２６０９号菌およびリ
   ゾビウム・メリオティＩＡＭ１２６１１号菌であること
   を特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の製造法。