JPH0530984A

JPH0530984A - アミド類の製造法

Info

Publication number: JPH0530984A
Application number: JP19549891A
Authority: JP
Inventors: Kiyoyuki Miyasaka; 清幸宮坂; Masanori Ochiai; 正則落合; Kazunori Yamada; 和徳山田; Reiko Sashita; 玲子指田; Hironori Morimoto; 裕紀森本
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp; Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1991-08-05
Filing date: 1991-08-05
Publication date: 1993-02-09

Abstract

(57)【要約】【構成】シトロバクター属に属し、ニトリル類を分解す
る能力を有する微生物を用いて、ニトリル類からアミド
類を製造する方法。【効果】本発明の方法によれば新規なシトロバクター属
に属する微生物を用いて工業的に有用な純度の高いアミ
ド類が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物の作用によって
ニトリル類に水を付加し、対応するアミド類を製造する
方法に関し、さらに具体的には、本発明は使用する微生
物に特徴を有するアミド類の生物学的製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
ニトリル類を原料として、対応するアミド類を生産する
方法としては硫酸法、銅触媒法などによる化学法が広く
工業化されてきたが、近年微生物に由来する酵素を用い
た方法も報告されるようになった。微生物を用いた方法
の利点としては、反応条件が温和なため原料、生産物の
重合反応が起きにくい、副生物が少ない、反応装置が小
さくて済むなどがあげられる。ニトリル類に水を添加し
てアミド類を生成する酵素活性を持った微生物として
は、グラム染色陽性の細菌（特公昭６２−２１５１９号
公報）、特にコリネ型細菌（アルスロバクター、ロドコ
ッカス、コリネバクテリウムなど：特公昭５６−１７９
１８号公報、特開昭５９−２６９３号公報）、特開昭６
１−１６２１９３号公報、特開昭６２−９１１８９号公
報）や、真菌類（フザリウム：特開昭６４−８６８８９
号公報）などが報告され、グラム染色陰性の細菌として
は唯一シュードモナスが報告されている（特公昭５９−
３７９５１号公報）だけである。

【０００３】微生物は大きく分類すると真核細胞に分類
されるもの（担子菌、糸状菌、酵母など）と原核細胞に
分類されるもの（細菌、藍藻、放線菌など）に大別され
る。細菌は更に細胞壁の構成により、グラム染色陽性の
もの（コリネ型細菌、枯草菌、ブドウ状球菌、乳酸菌、
酢酸菌、放線菌など）と、陰性のもの（腸内細菌、緑膿
菌、ビブリオ菌など）に分けられ、それぞれ分類学的に
は大きく異なるものとされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】発明者らは土壌からの微
生物のスクリーニングを広く行った結果、以下に示すよ
うに従来全く知られていなかった腸内細菌科シトロバク
ター属に属する微生物がニトリル類からアミド類への変
換能を有することを見出して、アミド類の新たな製造法
を確立した。

【０００５】即ち本発明の要旨は、ニトリル類からアミ
ド類を微生物の作用により製造する方法において、該微
生物がシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に
属し、ニトリル類を分解する能力を有する微生物である
ことを特徴とするアミド類の製造法に存する。

【０００６】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明において反応原料となるニトリル類としては、 ○ アセトニトリル、プロピオノニトリル、ｎ−ブチ
ロニトリル、イソブチロニトリルのような単純なニトリ
ル類； ○ α−アミノプロピオニトリル、α−アミノ−メチ
ルチオブチロニトリル、α−アミノブチロニトリル、ア
ミノアセトニトリルのようなα−アミノニトリル類； ○ ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリル、α
−ヒドロキシ−γ−メチルチオブチロニトリルのような
α−ヒドロキシルニトリル類； ○ アミノ−３−プロピオニトリルのようなβ−アミ
ノニトリル類； ○ マロニトリル、スクシノニトリル、アジポニトリ
ルのようなジニトリル類； ○ アクリロニトリル、メタクリロニトリルのような
α−不飽和ニトリル類； ○ ホモベラトリンニトリル、ベンゾニトリルのよう
なα−ベンゼンニトリル類； ○ ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルのよう
な複素環式ニトリル類等が挙げられ、中でもアセトニト
リル、プロピオノニトニル、アクリロニトリル、メタク
リロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル等の炭素数２〜４のニトリル類が好ましい。特に好ま
しいのはアクリロニトリルである。

【０００７】また上記のニトリル類から生成されるアミ
ド類は、上記の各ニトリル類に対応するアミド類であ
る。即ちアセトニトリルからはアセトアミドが、プロピ
オノニトリルからはプロピオンアミドが、アクリロニト
リルからはアクリルアミドが生成する。

【０００８】次に本発明において使用される微生物につ
いて説明する。本発明において使用される微生物として
はシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属
し、ニトリル類を分解してアミド類に変換させる能力を
有するものであれば特に制限はされない。かかる微生物
としてはシトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＭＣＩ２６１５（以下、
「本菌株」または「ＭＣＩ２６１５号菌」と略記する）
が挙げられ、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１２３９０号（ＦＥＲＭＰ−１２３９
０）として寄託されている。

【０００９】ＭＣＩ２６１５号菌は本発明者等により、
天然土壌から分離された細菌であり、その菌学的性状は
次の通りである。ａ）形態的性状ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ、３日間
培養１）細胞の大きさ、形：桿状２）細胞の多形性の有無：なし３）運動性：あり周毛４）胞子形成：なし５）グラム染色：陰性６）抗酸性：陰性

【００１０】ｂ）生育状態１）ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ３日間培養のコロニーの特徴１外形：円形２表面の隆起：半レンズ状３表面の形状：平滑４光沢：あり５色調：黄味灰色６透明度：半透明７周縁：波状

【００１１】ｃ）生理的性質１）空気中での生育：＋２）嫌気条件下での生育：＋３）カタラーゼ：＋４）オキシダーゼ：− ５）Ｏ−Ｆテスト：Ｆ６）ゼラチンの加水分解：− ７）リトマス・ミルク：酸性８）硝酸塩の還元：＋９）脱窒反応：＋１０）メチルレッドテスト：− １１）ＶＰテスト：− １２）インドールの生成：− １３）硫化水素の生成：＋１４）デンプンの加水分解：− １５）クエン酸の利用：＋（クリステンセン培地上）１６）無機窒素源の利用ＮＨ₄：＋ＮＯ₃ ：− １７）ウレアーゼ：＋１８）リジンの脱炭酸：− １９）オルニチンの脱炭酸：− ２０）ＤＮａｓｅ：− ２１）ＩＰＡ反応：− ２２）色素の生成：− ２３）生育温度域：１０〜４５°Ｃ２４）生育ｐＨ：ｐＨ４〜１０２５）唯一炭素源より酸及びガスの生成炭素源ＭＣＩ２６１５号菌酸ガス１Ｌ−アラビノース＋＋２Ｄ−キシロース＋＋３Ｄ−グルコース＋＋４Ｄ−マンノース＋＋５Ｄ−フラクトース＋＋６Ｄ−ガラクトース＋ − ７マルトース＋＋８シュクロース＋＋９ラクトース＋＋１０トレハロース＋＋１１Ｄ−ソルビット＋＋１２Ｄ−マンニット＋＋１３グリセリン＋＋１４デンプン ± −

【００１２】ｄ）化学分類学的性質ＤＮＡ中のＧＣ含量：５２％

【００１３】ｅ）分類学的考察 ○ 科レベルの同定本菌株ＭＣＩ２６１５号菌は、１）グラム陰性桿菌、
２）通性嫌気を示す、３）グルコースを発酵する、４）
オキシダーゼ陰性などの性質からＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａ
ｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ第一巻及びＣｏｗａｎとＳｔｅｅｌのＭａ
ｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ第２版
（１９７４年）に記載されている、Ｆａｃｕｌｔａｔｉ
ｖｅｌｙＡｎａｅｒｏｂｉｃＧｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉ
ｖｅＲｏｄｓ群のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａ
ｅ科に属することが判明した。

【００１４】○ 属及び種レベルの同定ＭＣＩ２６１５号菌の同定本菌株を他のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ科に
属し硫化水素を発生する菌群（ＣｏｗａｎとＳｔｅｅｌ
のＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ
第２版（１９７４年）及びＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔ
ｅｓＶｏｌ．２記載）と比較した。下表に示したよう
に本菌はイノシトールの資化性を除いてＣｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉの性質とよく一致した。イノ
シトールの資化能の有無は種内変異と考えられるため、
本菌をＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉと同
定した。また本菌株のＤＮＡ中のＧＣ含量は５２％であ
り、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉの５０〜
５３％の範囲とも一致している。

【００１５】

【００１６】本発明によるニトリル類の微生物学的水和
反応は、使用する微生物が特定のものであるという点を
除けば、公知の方法と本質的には変わらない。従って、
本発明で「ニトリル類を微生物の作用により水和して対
応するアミド類に変換させる」ということはニトリルの
存在下に微生物を培養する場合、ならびに微生物培養後
の培養液、菌体またはこれらの処理物とニトリル類を接
触させる場合のいずれをも包含するものとする。また、
微生物菌体、またはこの微生物が菌体内もしくは菌体外
に産生する酵素を固定化して反応に利用する場合をも含
むものである。

【００１７】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはグルコー
ス、グリセロール、水飴、澱粉などの炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、大豆
粉、酵母エキス、ペプトン、尿素などの有機窒素源、及
び燐酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの
無機塩類を適当な割合で含有する通常の培地が使用され
る。また目的の酵素を誘導するために培地中にアセトニ
トリルなどのニトリル類、アクリルアミドなどのアミド
類や酵素活性に必要な無機塩類、例えば鉄イオン、コバ
ルトイオンを添加することも望ましい。これらの培地の
ｐＨは５〜１０とし温度は２０〜３７°Ｃで１〜５日間
培養を行う。

【００１８】ニトリル類からアミド類への変換は、当該
微生物を水和を目的とするニトリルの存在下で培養して
行うことも可能であるが、好ましくは以下の方法によ
る。当該微生物を前述の方法で培養しその培養液から菌
体を遠心分離により集め、これを水、生理食塩水、リン
酸やトリスなどのｐＨ４〜１１の緩衝液中に懸濁し、こ
れに目的とするニトリル例えばアクリロニトリルを加
え、適当な温度条件の下、たとえば氷点以上４０°Ｃ以
下で共存させれば良い。その場合目的とするニトリルを
反応の進行と共に逐次添加していくことも可能である。

【００１９】上記のように培養した微生物菌体または培
養上清から、破砕、硫安沈澱、イオン交換、ゲル炉過、
疎水性担体などのカラムクロマトグラフィーの手段によ
り酵素を精製し、得られた酵素を用いて上記のような反
応を行わせることも可能である。また上記の方法で得ら
れた微生物菌体または酵素を、ポリアクリルアミド、光
架橋性樹脂、寒天、カラギーナンなどのゲルで包括固定
化し、上記に示したと同様適当なｐＨ、温度条件下で撹
拌型反応槽内でニトリル類と反応させ、またはカラムに
充鎮しニトリル類を含有する液を流通させることにより
反応させることも可能である。

【００２０】反応後得られたアミド類はそのまま水溶液
として、または膜濃縮やスプレイドライ濃縮などの方法
により濃縮し粉末として利用することができる。場合に
よっては活性炭、イオン交換樹脂、イオン交換膜などの
方法によりさらに純度を上げることも可能である。

【００２１】

【実施例】以下、本発明につき実施例を挙げて具体的に
説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定される
ものではない。なお、ニトリル類およびアミド類の分析
は、高速液体クロマトグラフィーにより行った。

【００２２】実施例シトロバクターＭＣＩ２６１５号菌をグリセロール０．
４％、酵母エキス０．２％、ポリペプトン０．０５％、
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
０．００１％、ＮａＣｌ０．２％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．０４％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．２５％を含む培地により、
３０°Ｃで３日間好気的に培養した。終了後遠心により
菌体を分離した後生理食塩水で洗浄し、リン酸緩衛液
（ｐＨ７．０、０．１Ｍ）に懸濁した。この内の０．８
ｍｌをサンプリングし、７％アクリロニトリル水溶液
０．２ｍｌ混和し、３０°Ｃで１時間反応させた。その
結果反応液中にアクリルアミドが検出された。

【００２３】

【発明の結果】上記で示したように本発明の方法によれ
ば、新規なシトロバクター属に属する微生物を用いて、
ニトリル類から工業的に有用な純度の高いアミド類が得
られる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年８月２８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】次に本発明において使用される微生物につ
いて説明する。本発明において使用される微生物として
はシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属
し、ニトリル類を分解してアミド類に変換させる能力を
有するものであれば特に制限はされない。かかる微生物
としてはシトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＭＣＩ２６１５（以下、
「本菌株」または「ＭＣＩ２６１５号菌」と略記する）
が挙げられ、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１２３９０号（ＦＥＲＭＰ−１２３９
０）として寄託され、１９９２年７月２９日に同所に微
工研条寄第３９５１号（ＦＥＲＭＢＰ−３９５１）と
して移管された。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはグルコー
ス、グリセロール、水飴、澱粉などの炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、大豆
粉、酵母エキス、ペプトン、尿素などの有機窒素源、及
び燐酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの
無機塩類を適当な割合で含有する通常の培地が使用され
る。また目的の酵素を誘導するために培地中にアセトニ
トリルなどのニトリル類、アクリルアミドなどのアミド
類や酵素活性に必要な無機塩類、例えば鉄イオン、亜鉛
イオン、コバルトイオン等を添加することも望ましい。
これらの培地のｐＨは５〜１０とし温度は２０〜３７°
Ｃで１〜５日間培養を行う。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】ニトリル類からアミド類への変換は、当該
微生物を水和を目的とするニトリルの存在下で培養して
行うことも可能であるが、好ましくは以下の方法によ
る。当該微生物を前述の方法で培養しその培養液から菌
体を遠心分離により集め、これを水、生理食塩水、リン
酸やトリスなどのｐＨ４〜１１の緩衝液中に懸濁し、こ
れに目的とするニトリル例えばアクリロニトリルを加
え、適当な温度条件の下、たとえば氷点以上６０°Ｃ以
下で共存させれば良い。その場合目的とするニトリルを
反応の進行と共に逐次添加していくことも可能である。

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成４年８月５日旧寄託機関の名称】工業技術院微生物工業研究所

【旧受託番号】微工研菌寄第１２３９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２３９０）

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所

【新受託番号】微工研条寄第３９５１号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−３９５１）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者指田玲子神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者森本裕紀神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ニトリル類からアミド類を微生物の作
用により製造する方法において、該微生物がシトロバク
ター属に属し、ニトリル類を分解する能力を有する微生
物であることを特徴とするアミド類の製法。
【請求項２】微生物の培養液にニトリル類を添加し
てこれを対応するアミド類に変換させることを特徴とす
る請求項１に記載の製法。
【請求項３】ニトリル類の添加を連続的または間欠
的に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の製
法。
【請求項４】ニトリル類がアクリロニトリルである
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製
法。
【請求項５】微生物がシトロバクター・フロンディ
ＭＣＩ２６１５号菌であることを特徴とする請求項１〜
４のいずれかに記載の製法。