JPH05236995A - １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法Info
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- JPH05236995A JPH05236995A JP35905591A JP35905591A JPH05236995A JP H05236995 A JPH05236995 A JP H05236995A JP 35905591 A JP35905591 A JP 35905591A JP 35905591 A JP35905591 A JP 35905591A JP H05236995 A JPH05236995 A JP H05236995A
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- anhydroglucitol
- measuring
- oxidase
- hydrogen peroxide
- pyranose oxidase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボース
オキシダーゼを用いて１，５−アンヒドログルシトール
を測定する方法であって、感度良く１，５−アンヒドロ
グルシトールを定量することができ、また、たとえピラ
ノースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキ
シドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として含ん
でいる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもっ
て１，５−アンヒドログルシトールの定量ができる１，
５−アンヒドログルシトールの測定方法を提供するこ
と。 【構成】 １，５−アンヒドログルシトールにピラノー
スオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼを作用
させ、この酵素反応により生成する過酸化水素の量を測
定することにより１，５−アンヒドログルシトールを測
定する方法において、前記酵素反応をスーパーオキシド
ジスムターゼの存在下において行なうことを特徴とする
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法を提供し
た。
オキシダーゼを用いて１，５−アンヒドログルシトール
を測定する方法であって、感度良く１，５−アンヒドロ
グルシトールを定量することができ、また、たとえピラ
ノースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキ
シドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として含ん
でいる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもっ
て１，５−アンヒドログルシトールの定量ができる１，
５−アンヒドログルシトールの測定方法を提供するこ
と。 【構成】 １，５−アンヒドログルシトールにピラノー
スオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼを作用
させ、この酵素反応により生成する過酸化水素の量を測
定することにより１，５−アンヒドログルシトールを測
定する方法において、前記酵素反応をスーパーオキシド
ジスムターゼの存在下において行なうことを特徴とする
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法を提供し
た。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、１，５−アンヒドログ
ルシトールの測定方法に関する。
ルシトールの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，５−アンヒドログルシトールはヒト
髄液及び血清中に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病に
おいて血清中の量が低下することが報告されている化合
物である。
髄液及び血清中に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病に
おいて血清中の量が低下することが報告されている化合
物である。
【０００３】血液中の１，５−アンヒドログルシトール
の測定は、従来主としてガスクロマトグラフィーによっ
て行なわれていた（「糖尿病」第２５巻１１１５〜１１
１８項、１９８２年）。しかしながら、この方法では被
検液の処理と１，５−アンヒドログルシトールのラベル
化が必要である上に、測定に長時間を要し、多数の検体
を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の
維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点が有り
実際の臨床に応用するには不便であった。
の測定は、従来主としてガスクロマトグラフィーによっ
て行なわれていた（「糖尿病」第２５巻１１１５〜１１
１８項、１９８２年）。しかしながら、この方法では被
検液の処理と１，５−アンヒドログルシトールのラベル
化が必要である上に、測定に長時間を要し、多数の検体
を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の
維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点が有り
実際の臨床に応用するには不便であった。
【０００４】一方、１，５−アンヒドログルシトールを
検出するための酵素としてピラノースオキシダーゼ及び
Ｌ−ソルボースオキシダーゼが知られており、これら酵
素を利用して糖アルコールの一種である１，５−アンヒ
ドログルシトールを酸化し、生成する過酸化水素の量か
ら検体中の１，５−アンヒドログルシトールを定量する
方法が開発された（特開昭６３−１８５３９７号公報、
特開平２−１０４２９８号公報等）。しかし、この方法
において用いられるピラノースオキシダーゼ及びＬ−ソ
ルボースオキシダーゼの酸化によって生成する過酸化水
素の効率は約７０％以下と低く、測定感度に問題があ
る。また、市販のピラノースオキシダーゼには過酸化水
素あるいはスーパーオキシドアニオンを分解する未知の
酵素が不純物として含まれていることがあり、このよう
な不純物が含まれていると、測定の感度又は信頼性が低
下するという問題がある。
検出するための酵素としてピラノースオキシダーゼ及び
Ｌ−ソルボースオキシダーゼが知られており、これら酵
素を利用して糖アルコールの一種である１，５−アンヒ
ドログルシトールを酸化し、生成する過酸化水素の量か
ら検体中の１，５−アンヒドログルシトールを定量する
方法が開発された（特開昭６３−１８５３９７号公報、
特開平２−１０４２９８号公報等）。しかし、この方法
において用いられるピラノースオキシダーゼ及びＬ−ソ
ルボースオキシダーゼの酸化によって生成する過酸化水
素の効率は約７０％以下と低く、測定感度に問題があ
る。また、市販のピラノースオキシダーゼには過酸化水
素あるいはスーパーオキシドアニオンを分解する未知の
酵素が不純物として含まれていることがあり、このよう
な不純物が含まれていると、測定の感度又は信頼性が低
下するという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを用いて１，５−アンヒドログルシトールを測定
する方法であって、感度良く１，５−アンヒドログルシ
トールを定量することができ、また、たとえピラノース
オキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキシドア
ニオンを分解する未知の酵素を不純物として含んでいる
場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもって１，
５−アンヒドログルシトールの定量ができる１，５−ア
ンヒドログルシトールの測定方法を提供することであ
る。
は、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを用いて１，５−アンヒドログルシトールを測定
する方法であって、感度良く１，５−アンヒドログルシ
トールを定量することができ、また、たとえピラノース
オキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキシドア
ニオンを分解する未知の酵素を不純物として含んでいる
場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもって１，
５−アンヒドログルシトールの定量ができる１，５−ア
ンヒドログルシトールの測定方法を提供することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボース
オキシダーゼによる１，５−アンヒドログルシトールの
酸化反応を、スーパーオキシドジスムターゼの存在下で
行なうことにより、ピラノースオキシダーゼあるいはＬ
−ソルボースオキシダーゼによって１，５−アンヒドロ
グルシトールを酸化した時生成するスーパーオキシドア
ニオンをスーパーオキシドジムスターゼの作用により効
率良く過酸化水素に変換させることが可能となり、その
結果、１，５−アンヒドログルシトールの定量を感度良
く行なうことができるようになり、また、たとえピラノ
ースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキシ
ドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として含んで
いる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもって
１，５−アンヒドログルシトールの定量ができることを
見出し本発明を完成した。
究の結果、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボース
オキシダーゼによる１，５−アンヒドログルシトールの
酸化反応を、スーパーオキシドジスムターゼの存在下で
行なうことにより、ピラノースオキシダーゼあるいはＬ
−ソルボースオキシダーゼによって１，５−アンヒドロ
グルシトールを酸化した時生成するスーパーオキシドア
ニオンをスーパーオキシドジムスターゼの作用により効
率良く過酸化水素に変換させることが可能となり、その
結果、１，５−アンヒドログルシトールの定量を感度良
く行なうことができるようになり、また、たとえピラノ
ースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパーオキシ
ドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として含んで
いる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性をもって
１，５−アンヒドログルシトールの定量ができることを
見出し本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、１，５−アンヒドロ
グルシトールにピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボ
ースオキシダーゼを作用させ、この酵素反応により生成
する過酸化水素の量を測定することにより１，５−アン
ヒドログルシトールを測定する方法において、前記酵素
反応をスーパーオキシドジスムターゼの存在下において
行なうことを特徴とする１，５−アンヒドログルシトー
ルの測定方法を提供する。
グルシトールにピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボ
ースオキシダーゼを作用させ、この酵素反応により生成
する過酸化水素の量を測定することにより１，５−アン
ヒドログルシトールを測定する方法において、前記酵素
反応をスーパーオキシドジスムターゼの存在下において
行なうことを特徴とする１，５−アンヒドログルシトー
ルの測定方法を提供する。
【０００８】本発明の方法に用いられるスーパーオキシ
ドジスムターゼは、スーパーオキシドジスムターゼであ
ればいかなる由来のものをも用いることができ、哺乳類
赤血球由来の酵素あるいは微生物由来の酵素、さらには
遺伝子工学的に生産されたものをも用いることができ
る。
ドジスムターゼは、スーパーオキシドジスムターゼであ
ればいかなる由来のものをも用いることができ、哺乳類
赤血球由来の酵素あるいは微生物由来の酵素、さらには
遺伝子工学的に生産されたものをも用いることができ
る。
【０００９】本発明の方法におけるスーパーオキシドジ
スムターゼの反応液中の濃度は、特に限定されないが、
２００００Ｕ／Ｌないし８００００Ｕ／Ｌ程度が好まし
く、さらに好ましくは３００００Ｕ／Ｌないし６０００
０Ｕ／Ｌ程度である。
スムターゼの反応液中の濃度は、特に限定されないが、
２００００Ｕ／Ｌないし８００００Ｕ／Ｌ程度が好まし
く、さらに好ましくは３００００Ｕ／Ｌないし６０００
０Ｕ／Ｌ程度である。
【００１０】反応させる温度は２０〜６０℃の範囲が好
ましく、また反応の媒体として用いられる緩衝液として
はリン酸緩衝液、トリス緩衝液などであり、酵素が作用
しやすい５〜８のｐＨを有することが好ましい。また、
反応時間は１分間ないし６０分間程度が好ましく、特に
１分間ないし１０分間程度が好ましい。
ましく、また反応の媒体として用いられる緩衝液として
はリン酸緩衝液、トリス緩衝液などであり、酵素が作用
しやすい５〜８のｐＨを有することが好ましい。また、
反応時間は１分間ないし６０分間程度が好ましく、特に
１分間ないし１０分間程度が好ましい。
【００１１】本発明の方法において用いられる、ピラノ
ースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼの濃度
は、従来と同様、１０００Ｕ／Ｌないし５０００００Ｕ
／Ｌ程度が好ましい。
ースオキシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼの濃度
は、従来と同様、１０００Ｕ／Ｌないし５０００００Ｕ
／Ｌ程度が好ましい。
【００１２】ピラノースオキシダーゼやＬ−ソルボース
オキシダーゼによる１，５−アンヒドログルシトールの
酸化により生成される過酸化水素を測定する方法はこの
分野において周知の方法のいずれをも採用することがで
きる。例えば、ペルオキシダーゼの存在下、トリフェニ
ルメタン系ロイコ色素のような発色試薬と反応させ、生
成する色素を吸光度測定等の比色定量により定量するこ
とにより生成した過酸化水素の量、ひいては検体中の
１，５−アンヒドログルシトールの量を測定することが
できる。これらの過酸化水素定量のための酵素及び発色
試薬も最初から反応混合物に含ませておくことができ
る。
オキシダーゼによる１，５−アンヒドログルシトールの
酸化により生成される過酸化水素を測定する方法はこの
分野において周知の方法のいずれをも採用することがで
きる。例えば、ペルオキシダーゼの存在下、トリフェニ
ルメタン系ロイコ色素のような発色試薬と反応させ、生
成する色素を吸光度測定等の比色定量により定量するこ
とにより生成した過酸化水素の量、ひいては検体中の
１，５−アンヒドログルシトールの量を測定することが
できる。これらの過酸化水素定量のための酵素及び発色
試薬も最初から反応混合物に含ませておくことができ
る。
【００１３】
【実施例】以下、本発明の実施例及び比較例を示し、本
発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記
実施例に限定されるものではない。
発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記
実施例に限定されるものではない。
【００１４】実施例１、比較例１ ピラノースオキシターゼ４０００Ｕ／Ｌ，ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）；６０００Ｕ／Ｌ，種々の濃度のスーパ
ーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、発色試薬（〔ビス
［４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミ
ノフェニル］〕［４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェ
ニル］メタン二ナトリウム塩）１００μＭを含むトリス
−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）１ｍｌに
１，５−アンヒドログルシトールを２５μｇ／ｍｌ含む
被検液１０μｌを加え２５℃の恒温槽に２０分間放置し
た。反応終了後、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定
した（実施例１）。一方、比較のため、ＳＯＤを含まな
いことを除き実施例１と同じ実験を行なった（比較例
１）。
ーゼ（ＰＯＤ）；６０００Ｕ／Ｌ，種々の濃度のスーパ
ーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、発色試薬（〔ビス
［４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミ
ノフェニル］〕［４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェ
ニル］メタン二ナトリウム塩）１００μＭを含むトリス
−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）１ｍｌに
１，５−アンヒドログルシトールを２５μｇ／ｍｌ含む
被検液１０μｌを加え２５℃の恒温槽に２０分間放置し
た。反応終了後、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定
した（実施例１）。一方、比較のため、ＳＯＤを含まな
いことを除き実施例１と同じ実験を行なった（比較例
１）。
【００１５】結果を図１に示す。図１は横軸にリットル
当りのＳＯＤ活性、縦軸に吸光度をプロットしたもので
ある。図１に示されるように、ＳＯＤを加えた場合に
は、ＳＯＤを加えない場合（すなわちＳＯＤ活性０Ｕ／
Ｌ）に比べ、吸光度がＳＯＤの濃度に依存して増加して
おり、６００００Ｕ／Ｌ加えた場合には４０％以上も吸
光度が増加した。このことから、ＳＯＤ存在下に１，５
−アンヒドログルシトールの酸化反応を行なうことによ
り、１，５−アンヒドログルシトールの測定精度が高ま
ることが明らかになった。
当りのＳＯＤ活性、縦軸に吸光度をプロットしたもので
ある。図１に示されるように、ＳＯＤを加えた場合に
は、ＳＯＤを加えない場合（すなわちＳＯＤ活性０Ｕ／
Ｌ）に比べ、吸光度がＳＯＤの濃度に依存して増加して
おり、６００００Ｕ／Ｌ加えた場合には４０％以上も吸
光度が増加した。このことから、ＳＯＤ存在下に１，５
−アンヒドログルシトールの酸化反応を行なうことによ
り、１，５−アンヒドログルシトールの測定精度が高ま
ることが明らかになった。
【００１６】実施例２、比較例２ 過酸化水素又はスーパーオキシドアニオンを分解する未
知の酵素を不純物として含むことが知られている市販の
ピラノースオキシダーゼ；４０００Ｕ／Ｌ；ＰＯＤ；６
０００Ｕ／Ｌ，ＳＯＤ；６００００Ｕ／Ｌ，実施例１と
同じ発色試薬１００μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液
（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）１ｍｌに１，５−アンヒド
ログルシトールを０〜５０μｇ／ｍｌ含む被検体１０μ
ｌを加え２５℃の恒温槽に２０分間放置した。反応終了
後、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定した（実施例
２）。一方、比較のため、ＳＯＤを含まないことを除
き、実施例２と同じ実験を行なった（比較例２）。
知の酵素を不純物として含むことが知られている市販の
ピラノースオキシダーゼ；４０００Ｕ／Ｌ；ＰＯＤ；６
０００Ｕ／Ｌ，ＳＯＤ；６００００Ｕ／Ｌ，実施例１と
同じ発色試薬１００μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液
（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）１ｍｌに１，５−アンヒド
ログルシトールを０〜５０μｇ／ｍｌ含む被検体１０μ
ｌを加え２５℃の恒温槽に２０分間放置した。反応終了
後、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定した（実施例
２）。一方、比較のため、ＳＯＤを含まないことを除
き、実施例２と同じ実験を行なった（比較例２）。
【００１７】結果を図２に示した。図２から明らかなよ
うに、ＳＯＤを加えた本発明の方法は、従来法に比べ明
らかな吸光度の増加と高い直線性を示した。これによ
り、ピラノースオキシダーゼが不純物を含む場合であっ
ても、１，５−アンヒドログルシトールの定量が感度良
く、信頼性高く行なうことができることが明らかになっ
た。
うに、ＳＯＤを加えた本発明の方法は、従来法に比べ明
らかな吸光度の増加と高い直線性を示した。これによ
り、ピラノースオキシダーゼが不純物を含む場合であっ
ても、１，５−アンヒドログルシトールの定量が感度良
く、信頼性高く行なうことができることが明らかになっ
た。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、感度良く１，５−アンヒ
ドログルシトールを定量することができ、また、たとえ
ピラノースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパー
オキシドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として
含んでいる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性を
もって１，５−アンヒドログルシトールの定量ができる
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法が提供され
た。
ドログルシトールを定量することができ、また、たとえ
ピラノースオキシダーゼが過酸化水素あるいはスーパー
オキシドアニオンを分解する未知の酵素を不純物として
含んでいる場合であっても感度良好にかつ高い信頼性を
もって１，５−アンヒドログルシトールの定量ができる
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法が提供され
た。
【図１】横軸にＳＯＤの濃度、縦軸に吸光度（５９５ｎ
ｍ）をとりＳＯＤ添加、未添加を比較した図である。
ｍ）をとりＳＯＤ添加、未添加を比較した図である。
【図２】横軸に１，５−アンヒドログルシトール量、縦
軸に吸光度（５９５ｎｍ）をとり、ＳＯＤの添加効果を
見た結果を示す図である。
軸に吸光度（５９５ｎｍ）をとり、ＳＯＤの添加効果を
見た結果を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 １，５−アンヒドログルシトールにピラ
ノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼを
作用させ、この酵素反応により生成する過酸化水素の量
を測定することにより１，５−アンヒドログルシトール
を測定する方法において、前記酵素反応をスーパーオキ
シドジスムターゼの存在下において行なうことを特徴と
する１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35905591A JPH05236995A (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35905591A JPH05236995A (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236995A true JPH05236995A (ja) | 1993-09-17 |
Family
ID=18462507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35905591A Pending JPH05236995A (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05236995A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007148797A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | １，５－アンヒドログルシトールの測定方法及び１，５－アンヒドログルシトール測定試薬組成物 |
-
1991
- 1991-12-27 JP JP35905591A patent/JPH05236995A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007148797A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | １，５－アンヒドログルシトールの測定方法及び１，５－アンヒドログルシトール測定試薬組成物 |
| US8945864B2 (en) | 2006-06-22 | 2015-02-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Method of determining 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determining 1,5-anhydroglucitol |
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