JPS58175498A - 液体中の物質の測定用試験系および試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体、特に体液中の物質を測定するだめの広い
測定範囲を有する試験系および方法に関する。

体液中の物質の測定は医療診断で極めて重要である。こ
れは定量的測定に対するばかりでなく、また個々の患者
の自己監視または簡易スクリーニングを可能にする半定
量的または定性的方法にもあてはまる。これらの試験の
重要性を示すよって、大多数の方法が開示されている。

最もしばしば゛使用される方法は高度の特異性を可能に
する酵素による測定方法である。このような方法では、
測定反応に関与する反応剤の増加または減少を肉眼によ
シ、光度計により、またはその他の光学的または物理化
学的方法を用いて、間接的にまたは直接に測定する。こ
れらの系の全てにおいて、常に１種だけの酵素または酵
素系を被測定物質と反応させ、その際１１−モル比また
は適当なモル比で反応、生成物を生成させるか、まだは
反応関与剤を消費させる点で共通している。従って、測
定範囲は全ての方法で規模がほとんど等しく、測定信号
および試料稀釈の感度に従い測定範囲を置換できる。

医学診断用試験には、正常範囲と病的範囲との境目域に
おける値かにだけ異なる数値の測定が信頼できるもので
あるばかりでなく、また同時に病的範囲のできるだけ広
い範囲を力・ぐ−できることが要求される。これはまだ
、特に、たとえば試験紙片の系を用いるスクリーニング
法にもあてはまる。慣用の試験で達成される測定範囲は
生起する課題のいくつかにとって不適当である。これは
特にグルコースの測定で明らかになる。この問題を、試
験の感度を変える添加剤を試験で使用することにより解
決しようとする試みがすでに行なわれているが、適当に
変えて調整した測定範囲を有する数回の試験を総合試験
に包含させた場合にだけ、広い測定範囲が達成されるに
すぎない。

本発明は慣用の試験系および方法に比較して、少なくと
も同じ測定正確度を伴なう非常に広い測定範囲を有する
試験系および方法を開発するという目的を有する。この
目的が相互に独立して、原料反応剤として同じ基質を転
換させるが、異なっていて区別できる最終生成物を生成
する数種の異なる酵素または酵素系を一緒に組合せるこ
とによシ達成された。

本発明は、液体中の物質の測定に対して拡大した測定範
囲を有する試験系に関し、相互に独立して、被験物質と
直接にまたは間接的に反応する数種の酵素または酵素系
を含有することを特徴とする。

本発明はまた液体中の物質の測定方法に関し、この方法
は試料溶液を、相互に独立して被験物質と直接にまたけ
間接的に反応し、測定技術により捷たけ肉眼で分析学的
に区別でき、評価できる種々の最終生成物を生成する、
数種の酵素または酵素・系で同時的に処理することを特
徴とする。

種々の酵素反応を順次組合せることは大多数の例から既
知であり、たとえばグルコース測定用のへキンキナーゼ
／グルコース−６−ホスフニートデヒドログナーゼ、捷
たけ尿素測定用のウレアーゼ／グルタメートデヒドロケ
９ナーゼ反応がある。これらの酵素系の共通点は、これ
らが順次的に作動すること、すなわち最初の反応の反応
生成物が第２の反応の原料基質であることである。

異なる酵素反応を平行して組合せると、すなわち同じ基
質を変化させる数種の酵素系を同時に存在させると、２
つの反応間に競合が生じ、これらの反応の相互依存が生
じる。従って、たとえばグルコースオキンダーゼ反応を
ＮＡＤ　−依存性グルコースデヒドログナーゼ反応と組
合せると、これら２つの反応が同時に生起する。各反応
で生成した最終生成物の比率は各場合における２種の酵
素の濃度に依存して変わる。たとえば、別の点では同一
の条件下に、グルコースオキシダーゼの濃度を増加する
と、同じグルコース濃度で生成するＮＡＤ＋が少なくな
る。これによって、測定範囲は総合的に広くなるが、測
定精度が犠牲になる。さらにまた、両反応が共通測定範
囲をカバーすることになる。

従って、相互に独立して、同じ基質を直接に、まだは間
接的に異なる生成物に転換する数種の酵素系を組合せる
ことができ、少なくとも２種の異なる測定信号が反応混
合物中で得られ、これらの各々により被測定物質の２種
の異なる濃度範囲がカバーされることは全く驚くべきこ
とである。本明細書において、相互に独立してという用
語は基質を転換する本発明による系の同時的存在下に、
第２の系による変換が、第１の系の補酵素がほとんど消
費された後にだけ生起することを意味する。このように
、２種の限定された測定範囲が総合的測定範囲で得られ
る。

本発明による酵素または酵素系は相互に独立している、
電子営容体または供与体を付随する。

デヒドロゲナーゼである。従って、本発明の試ａ）還元
まだは酸化されたニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤＨ，ＮＡＩ）＋）　ｉたけニコチンアミド
−アデニンジヌクレオチドリン酸エステル（ＮＡＤＰＨ
，ＮＡＤＰ＋）を転換する酵素または酵素系。

ｂ）前記ａ）に記載しだ補酵素を転換せず、これらの補
酵素とは区別できる測定信号を提供する電子受容体また
は供与体を転換する酵素または酵素系。この種の物質は
、たとえばシトクローム、キノンまたはピロロキノリン
−キノンの群に属する補酵素として既知であり、フラビ
ンヌクレオチド、ヘキサシアノフエレート、メチレンブ
ルー、ツェナノンメトスルフ１エート、ツェナノンエト
スルフェート、ベンゾキノン、ジクロルフェノールーイ
ンドフェノール、ジクロルインドフェノール、トリクロ
ルインドフェノールおよびその他もまた適当である。こ
れらの補酵素を転換する相応する酵素は文献から既知で
ある。

Ｃ）本発明による酵素系を用いる診断試験の実施に必要
な、緩衝剤、安定化剤、発色化合物等のような助剤およ
び補酵素の全部。

相互に補償して、拡大した総測定範囲を与える２つの限
定された測定範囲を有する本発明による試験系はａ）お
よびｂ）に挙げた各酵素または酵素系の１つを組合せる
ことによシ得られる。

例として、この試験・系を用いて測定できる物質の選別
を次表にまとめて示す、これは所望のように拡大するこ
とができる。ＮＡＤ−依存性および非ＮＡＤ−依存性酵
素に対し示した数字はＮＯ−ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　（
Ｈｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　工ｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌＵｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙの酵素命名法に相当する・。

アルコール　　　　　１．１．１．１　　　１．１．９
９．８グルコース　　　　　１．１．１．４７　　１．
１．９９．−グリセリン３−リン酸エステル　　　１．
１．１．８　　　　　１．１．９９．５グリンン　　　
　　　１．４．１．１０　　１．４．２．１ラクテート
　　　　　　１．１．１．２７　　１．１．２．３マレ
ート　　　　　１．１．１．３７　　１．１．９９．１
６マンニツト　　　　　　１．１．１．６７　　　１．
１．２．２グルコース測定の場合に、ＮＡＤ−依存性酵
素グルコースデヒドログナーゼ１．１．１．４７　　は
パンルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ　）からの酵素が好ましく、そして非ＮＡ
Ｄ−依存性酵素グルコースデヒドログナーゼ１．１．９
９　　はアチネトパクター・カルコアセチフス（ＡＣｉ
ｎｅｔＯ−ｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
　）からのものが好ましい。

各々が１方だけ（ＮＡＤ−依存性または非ＮＡＤ　−依
存性）のグルコースデヒドロｒナーゼヲ含有する系によ
りグルコースを測定する場合に、司じ試料稀釈度で、測
定範囲は位置的に異なるが、はぼ同じ範囲である。これ
に対して、２種の酵老系から組合せた系であると、可能
な測定範囲が可成広くなる。グルコースオキシダ−ゼと
グルコースオキシダーゼとの組合せはまだ確かに測定範
囲の拡大をもたらすが、競合により、測定精度の予想さ
れる減少も生じる。

ＮＡＤ含有酵素系はさらにまたテトラゾリウム塩および
そこに電子を移送する系、たとえばノアホラーゼを追加
して含有できる。

一般に、前記酵素は被測定物質を直接に転換する。しか
しながら、本発明による組合せ酵素系を１種またはそれ
以上の酵素反応と組合せることもできる。次の反応系を
例として示すことができる； グリセリン３−リン酸エステル＋ リン酸エステル この方法により、大多数の測定に対し拡大した測定範囲
を有する試験が実施できる。

同様に、本発明による試験系を使用して、測定する酵素
の転換により反応中に生成される基質を転換することが
できる。この方法により、特に、追加の空値のような干
渉作用を単純な方法で排除できる。従って、たとえばア
ミラーゼの測定において、第２の反応が付随する測定範
囲を生成されるグルコースの測定用に完全に保留しなが
ら、自己発生グルコースを第１の反応から除去できる。

本発明による試験系はまた、第２の測定範囲を未変化の
まま残しながら、１つの測定範囲を変えることも可能に
する。この方法により、本発明による試験系は慣用の方
法に相当する測定範囲が正常範囲と病的範囲との間をカ
バーする境界域に存在するようにすると同時に、病的範
囲に係る測定範囲を変化させ、医療診断の要求に適合さ
せることができる。グルコース測定の場合に、これはグ
ルコースオキンダーゼおよびパーオキ７ダーゼを加える
ことによシ達成できる。

本発明による試験系を用いる酵素的測定は両方の酵素系
を試料溶液に同時に加える以外は慣用の酵素法の方法で
実施する。評価は肉眼により、光度計により、またはそ
の他の光学的まだは物理化学的方法により実施できる。

光度計測定の場合に、評価は２種の限定された波長（た
とえば３３４ｎｍと６００ｎｍ　、または４６０ｎｍと
６ｓｏｎｍ　）で終点法により実施できる。同様に、１
種または２種の波長における反応の力学的進行を記録し
、評価することもできる。従って、この拡大した測定範
囲が原則的に、被験物質の上昇さえしだ病的範囲の一層
簡単な測定を回部にし、さらに希釈することは必要とし
ない。

本発明を次側によりさらに詳細に説明する。

例　　１ 補酵素としてＮＡＤを伴なうグルコースデヒドロゲナー
ゼおよび補酵素としてジクロルフェノール−インドフェ
ノールを伴なうグルコースデヒドロゲナーゼの組合せ系
を用いるグルコースの測定： ａ）リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　０．１２　モル／１
ＮＡＤ　　１．Ｑ　ミリモル／ｌ ｂ）リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　０．１２モル／ｌジ
クロルフェノールーインドフェノール０．１２ミリモル
／ｌを含有する反応混合物各１−を相互に混合し、種々
の特定グルコース濃度を有する４０μｔの血清（トリク
ロル酢酸０．３モル／ｌの１＋１で蛋白除去）を加える
。各場合に、１５分後に３３４ｎｍおよび６００ｎｍに
おける吸光度を測定する。得られた結果を第１図に示す
。

グルコース測定を０．５〜１２ミリモル／ｌについて実
施できる１つの反応と約２〜６０ミリモル／ｌについて
実施できるもう１つの反応との２つの個別の反応を用い
たにもかかわらず、第１図は本発明による組合せ系を用
いると、グルコースを０．５から１６０ミリモル／を以
上まで信頼性をもって測定できることを示している。１
ミリモル／ｌはグルコースの１８■チに相当する。

例　　２ グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼの存在
下にグルコースデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤ　ヲ用いるグ
ルコースの測定： 例１の条件およびｌａ）による混合物を使用する。反応
混合物はまたグルコースオキシダーゼＩＫｕ／ｌおよび
／４’−オキシダーセ４００　ｕ／／！、を含有する。

得られた測定曲線を第２図に示す。

第２図はグルコースデヒドロゲナーフ反応およびグルコ
ースオキシダーゼ反応を組合せると、また拡大した測定
範囲が得られるが、測定精度は曲線の道程が平坦である
ために、減少することを示している。

例　　３ グルコースデヒドロゲナーゼ／　ＮＡＤ　／ジアホラー
ゼ／テトラゾリウム塩およびグルコースデヒドロケ９ナ
ーゼ／ジクロルフェノール−インドフェノールの組合せ
系を用いるグルコースの肉眼による測定；測定範囲の変
更； 各々がリン酸塩緩衝液（１）Ｈ６，５）およびナトリウ
ムフルオレセイン１０〜３重量％を含有する４種の異な
る混合物の各２ｍ／！を反応混合物に使用する。これら
の混合物は次の成分をさらに含有する： 混合物Ａ　：　ＮＡＤ”　　１ミリモル／１３−（４−
インドフェニル）−２− （４−ニトロフェニル）−５−フェ ニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリ ド（工ＮＴ　）　０．ロアミリモル／ｌＢ、メガテリウ
ムからのグルコースデ ヒドロゲナーゼ　５Ｋｕ／ｌ および ジアホラーゼ　２５０ｕ／を 混合物Ｂｌ　　：　ＮＡＤ＋１ミリモル／ｌジクロルフ
ェノール−インドフェノ ール　０．２５ミリモル／１ ＩＮＴ　Ｑ、５７ミリモル／ｌ Ｂ、メガテリウムからのグルコースデ ヒドロゲナーゼ　２．５１Ｃｕ／ｌ Ａ、カルコアセチフスからのグルコー スデヒドロゲナーゼ　２５０　ｕ／ｚ および ジアホラーゼ　２５０　ｕ／を 混合物Ｂ２：混合物Ｂ１に示した同じ濃度の同じ反応剤 ＋グルコースオキシダーゼ　５００　ｕ／ｚ十ノや−オ
キシダーゼ２００　ｕ／を 混合物Ｂ３：混合物Ｂ１に示した同じ濃度の同じ反応剤 ＋グルコースオキシダーゼ　Ｉ　Ｋｕｌｔ＋パーオキシ
ダーゼ４００ｕ／１０ 各場合に、種々の一定のグルコース含有量を有する６０
μｔの血清（トリクロル酢酸０．３モル／ｌの１＋１で
蛋白除去）を反応混合物にピペットで装入する。加分後
罠、全溶液に現われた色を肉眼で評価する。総合的測定
範囲は肉眼で区別できるグルコース濃度から拡大してい
る。結果を第３図にグラフで示す。この組合せ系のより
広い測定範囲および広い変化可能性が明白に見られる。

例　　４ ラクテートデヒドロゲナーゼ／　ＮＡＤ　／ジアホラー
ゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼ／ジクロルフェノ
ール−インドフェノールの組合せ系を用いるラクテート
の測定： 次の成分を含有する反応混合物２　ｍｌに１００μｔの
血清（トリクロル酢酸０．３モル／ｌの１＋１で蛋白除
去）をピ波ットで装入する。

リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，ｏ　）　　０．２５モル／１
ＮＡＤ＋　　１　　ミ　リ　モル／　ｔノクロルフェノ
ールーインドフェノール　０．１２ミリモル／１ＩＮＴ
　Ｏ，６７ミリモル／を 豚心臓からのラクテートデヒドロゲナーゼ　５　Ｋｕ／
ｌノアホラーゼ　２５０　ｕ／ｌ および イーストからのラクテートデヒドロゲナーゼ２００ｕ／
ｌ。

各場合について、加分後に４６０ｎｍおよび６５０ｎｍ
で吸光値を測定する。得られた結果を第４図に示す。

０．２〜６ミリモル／ｌのラクテート測定反応と約０．
８〜２４ミリモル／ｌのラクテート測定反応との２つの
個別の反応を使用して実施できるとともに、この図面は
本発明による組合せ系を用いると、ラクテートを０．２
ミリモル／ｌかも（イ）ミリモル／を以上まで測定でき
ることを示している。

例　　５ アルコールデヒドロゲナーゼ／　ＮＡＴ）　／ジアホラ
ーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ／ジクロルフェ
ノール−インドフェノールの組合せ系ヲ用いるアルコー
ルの測定： 次の成分を含有する反応混合物２ｄに関μｔの血清（ト
リクロル酢酸０．３モル／ｌの１＋１で蛋白除去）をビ
被ットで装入する。

トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ
８，０）　０．３モル／１ ＮＡＤ＋）ミリモル／ｌ ジクロルフェノール−インドフェノール０．１２ミリモ
ル／１ ＩＮＴ　　Ｏ，ロアミリモル／ｌ イーストからノＡＤＨ２Ｋｕ／ｌ ジアホラーゼ　２５０　ｕ／ｌ および デソイドモナ、ｘ、　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　
ｓｐ、　Ｍ　２７２５０　ｕ／ｚ。

各場合に、側分後に４６０ｎｍおよび６５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定する。２つの個別の反応の測定範囲はア
ルコールの０．０２〜０．５　？／ｌおよび０．０８〜
２．２　？／ｌであるが、０．０２９／ｌから３ｙ／を
以上の拡大した測定範囲を得ることができる。

例　６ 試験片を使用する尿中のグルコースの測定：例３と同じ
であるが、四倍高い酵素濃度の溶液を吸着性材料に含浸
させ、注意深く乾燥し、次いで適当な支持材料上に固定
する。試料溶液に浸漬すると、そのグルコース含有量に
応じて、青から青−緑、緑、淡緑、ベージュ、オレンジ
および赤を経て暗赤色までの色の変化が得られる。評価
は標準色尺度との比較によシ実施できる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第４図は例１、例２および例４で
測定された吸光度をそれぞれ示すグラフであり、そして
第３図は例３で得られた色変化の結果を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）相互に独立して、被測定物質と直接にまたは間接
   的に反応する数種の酵素または酵素系を一緒に含有する
   ことを特徴とする、液体中の物質を測定するだめの拡大
   した測定範囲をｆｌする試験系。 （２）　　前記の酵素または酵素系が相互に独立してい
   る、電子受容体または供与体を伴なうデヒドロケ゛ナー
   ゼである特許請求の範囲第１項に記載の試験系。 （３）前記の酵素系の１つが還元または酸化されたニコ
   チンアミドーアデシフノヌクレオチドまだはソヌクレオ
   チドリン酸エステルを転換するデヒドロケ゛ナーゼを含
   有し、そして他の１つがこれらの補酵素を転換しない、
   別の電子受容体まだは供与体を伴なうデヒドロヶ゛す一
   ゼを含有する特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の試験系。 （／Ｉ）　　ＮＡＩ）を転換する酵素系がパシルス・メ
   ガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼを含有し
   、そしてＮＡＤを転換しない酵素系がアチネトバクメー
   カルコアセチクスからのグルコースデヒドロゲナーゼを
   含有する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１つ
   に記載のグルコース測定用の試験系。 （５）前記のＮＡＤを転換する酵素系がまたテトラゾリ
   ウム塩およびそこに電子を移送する系を含有する特許請
   求の範囲第１項〜第４頂のいずれか１つに記載の試験系
   。 （６）　グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダー
   ゼをさらに含有する特許請求の範囲第４項または第５項
   に記載の試験系。 （７）試料溶液を、相互に独立して被測定物質と直接ま
   たは間接的に反応する数種の酵素または酵素系で同時的
   に処理することからなり、測定技術まだは肉眼により分
   析学的に区別でき、評価できる種々の最終生成物を生成
   させることを特徴とする、液体中の物質の測定方法。