JPH05239099A - 新規タンパク質及び抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の方法よりもより安全に強力な抗腫瘍免
疫細胞を誘導できる誘導物質及び誘導刺激材を提供す
る。 【構成】 ポークウィードマイトージェンより得られ
る、分子量が３５，０００±５，０００、かつ等電点が
４±１の純化されたタンパク質、またはこれよりなる抗
腫瘍免疫細胞誘導物質。さらに、特定のアミノ酸配列を
持つ純化されたタンパク質、またはこれよりなる抗腫瘍
免疫細胞誘導物質。及び、水不溶性担体の表面に上記よ
りなる物質を有することを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘
導刺激材。 【効果】 この物質及び誘導材は、全血液あるいは体液
細胞成分中の白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞を誘導
し悪性腫瘍を治療するのに有用なものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、全血液あるいは体液細
胞成分中の白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞を誘導す
る機能を持つ、悪性腫瘍治療用の新規タンパク質及び抗
腫瘍免疫細胞誘導刺激材に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、癌患者の治療法として、患者から
取り出した白血球をインターロイキン２（ＩＬ−２、以
下ＩＬ−２と呼ぶ）と共に培養することにより活性化さ
せた細胞を、あるいはＩＬ−２の存在下で培養した腫瘍
内浸潤白血球を癌患者の体内に戻すことにより治療を行
う免疫療法が試みられている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．，３１６，８８９〜８９７，１９８７），（Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９，１６７６〜１６８０，
１９８８）。

【０００３】この治療法は、癌患者から大量の白血球、
さらには、腫瘍細胞を取り出し、無菌的に長期間ＩＬ−
２の存在下で培養した後に、癌患者に輸液注入するとい
う操作面で非常に煩雑であること、また、時間的にも１
回の操作あたり３〜４日の時間を要すること、さらに
は、一人の患者あたり医師の相当な手間が必要なことか
ら、莫大な治療費がかかる等の問題がある。

【０００４】本発明者らは、これらの問題点を解決する
ため、従来の方法よりも操作性よく、さらに強力な抗腫
瘍免疫細胞を誘導できる刺激材及び刺激方法を提供して
きた（特開昭６０−１２０８２１号公報）。すなわち、
レクチンの一種であるポークウィードマイトージェン
（以下、ＰＷＭと呼ぶ）に抗腫瘍免疫細胞を誘導する活
性があることを見い出し、このタンパクを水不溶性担体
に固定化し、体内に入らないようなものにした。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ここで使用し
てきた刺激材に結合させた抗腫瘍免疫細胞の誘導物質
は、レクチンとしてのＰＷＭであり、抗腫瘍免疫細胞誘
導能を持たない不純物も含まれている。癌の治療に使用
する場合、不純物が含まれていては十分な効果が得られ
ないだけではなく、副作用を引き起こすことが懸念され
る。したがって、単一物質でより強い抗腫瘍免疫細胞の
誘導できる物質が望まれている。

【０００６】本発明の目的は、上記のごとき従来技術に
基づく抗腫瘍免疫細胞の誘導の問題点に鑑み、従来の方
法よりもより安全に強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導できる
誘導物質及び誘導刺激材を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
に沿って鋭意研究した結果、特許請求の範囲第１項から
第４項記載の物質に、強力な抗腫瘍免疫細胞の誘導能が
あることを見出した。さらに、水不溶性担体の表面に、
特許請求の範囲第１項から第４項記載の物質の中の一つ
を有することを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材で
白血球を刺激することにより、強力な抗腫瘍免疫細胞が
誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、特許請求の範囲第１
項から第４項記載の物質及び水不溶性担体の表面に、特
許請求の範囲第１項から第４項記載の物質の中の一つを
有することを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材に関
わる。

【０００９】本発明でいうＰＷＭとは、アメリカヤマゴ
ボウ（フィトラッカ・アメリカーナＰｈｙｔｏｌａｃｃ
ａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）の根より抽出したレクチンで
ある。従来用いられているＰＷＭは、たとえば以下の文
献に例示する方法で調製された粗精製品であり、数種類
のタンパク質が混入している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
１２４，８５９〜８７２，１９６６），（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，４
２７，４４３〜４５２，１９７６）。ＰＷＭに含まれて
いるタンパク質としては５種類が明らかになっており、
それぞれのイソレクチンの構成アミノ酸残基も明らかに
なっているが、それぞれが示す生理活性としては、Ｔ細
胞あるいはＢ細胞に対するマイトジェン活性のみである
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，３６７１〜３６７
７，１９７４），（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，５０，３５４〜３６１，１９７８）。

【００１０】抗腫瘍免疫細胞の誘導にＰＷＭが作用する
ことは、ＩＬ−２の存在下で知られているのみならず
（日本輸血学会雑誌，３６，３０９，１９９０、第２回
ＪＢＲＭ学会学術集会総会プログラム・抄録集，ｐ３
３，１９８９）、ＰＷＭ単独でも作用することが調べら
れている（人工臓器，１８，１４０１〜１４０５，１９
８９）。しかし、いずれも粗精製のＰＷＭを用いた結果
である。本発明の新規タンパク質は、粗精製のＰＷＭよ
り抗腫瘍免疫細胞を誘導する物質として分離精製するこ
とができる。

【００１１】粗精製ＰＷＭからの分離精製方法として
は、タンパク質化学において通常使用される方法、例え
ば、担体による吸着法、イオン交換法、分別沈澱法、ゲ
ルろ過法、電気泳動法、各種アフィニティークロマトグ
ラフィー、これらを単独あるいは組み合わせて使用でき
る。かくして得られた特許請求の範囲第１項あるいは第
２項記載のタンパク質は、電気泳動上で単一のものであ
ることが確認できる。抗腫瘍免疫細胞誘導能は粗精製Ｐ
ＷＭよりはるかに強く、その用途としては、癌患者に直
接投与し、腫瘍を縮小させ癌を治療する医薬として、さ
らには、癌患者から取り出した白血球に作用させ、洗い
流した後に活性化した白血球のみを患者の体内に戻すこ
とによって、異種蛋白であるが故に生じる毒性を回避す
ることができ、より望ましい癌の治療をするための医薬
として用いることができる。さらには、リンパ球の機能
を測定する、レクチンに対するリンパ球の幼若化能測定
においてマイトージェンとして用いれば、従来ＰＷＭの
ロットが異なると同一検体であっても測定値にばらつき
が見られていたのが、安定した測定結果が得られるよう
になる。

【００１２】本発明の、特許請求の範囲第１項から第４
項記載の物質の具体的な分離精製法の一例を挙げる。本
発明で言うタンパク質とは、特許請求の範囲第１項から
第４項記載の物質であればよく、精製法は下記の方法に
限定されるものではない。

【００１３】粗精製ＰＷＭをリン酸緩衝液（Ｃａ，Ｍｇ
不含）（以下、ＰＢＳ（−）と呼ぶ）に溶解し、ＰＢＳ
（−）で平衡化したゲルろ過カラムに通し、分子量約３
０，０００から４０，０００の画分を回収する。回収し
た液に硫酸アンモニウムを添加し最終濃度を１Ｍにし、
１Ｍ硫酸アンモニウム／ＰＢＳ（−）で平衡化したオク
チルセファロース（ファルマシア（株）製）カラムを通
し、吸着成分をＰＢＳ（−）で回収する。回収した成分
を限外ろ過システム等で濃縮した後、生理食塩水で平衡
化したゲルろ過カラムに通し、分子量３５，０００±
５，０００の画分を回収する。

【００１４】この物質に抗腫瘍免疫細胞誘導能があるこ
とは、例えば、新リンパ球機能検索法，ｐ１８７〜１９
８，中外医学社，１９８７年発行、臨床免疫，１９，２
５０〜２５６，１９８７の方法により確認することがで
きる。かくして得られる新規タンパク質の物理化学的性
質について以下に説明する。

【００１５】１）分子量：３５，０００±５，０００ ＳＤＳで変性及び２−メルカプトエタノールで還元した
条件での、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より測定した。 ２）等電点：４±１ Ａｍｐｈｏｌｉｎｅを用いた等電点電気泳動法により測
定した。 ３）アミノ酸分析：（表１） 加水分解の後にアミノ酸分析を行ったが、文献に記載さ
れているイソレクチンＰａ−１〜Ｐａ−５のいずれとも
異なる値であった（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，
３６７１〜３６７７，１９７４）。

【００１６】

【表１】

【００１７】本発明の抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材は、水
不溶性担体の表面に、特許請求の範囲第１項から第４項
記載の物質の中の一つを結合させることにより得ること
ができる。誘導刺激材としては、白血球と接触できるも
のであればよく、担体あるいは結合方法は特に規定しな
い。この誘導刺激材は表面に、特許請求の範囲第１項か
ら第４項記載の物質の中の一つのみを結合しているた
め、白血球と接触させたとき強い抗腫瘍免疫細胞を誘導
でき、その他の生体に悪影響を及ぼす細胞の誘導はなく
なる。この誘導刺激材の用途としては、癌患者から取り
出した白血球をこの誘導刺激材と接触させることによ
り、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導し、癌患者の体内に戻
すことにより腫瘍を縮小させ、癌を治療する治療器とし
て用いることができる。

【００１８】本発明でいう分子量とは、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（例えば、生化学実験講座
１，タンパク質の化学Ｉ，ｐ４６９〜４９２，日本生化
学会編，東京化学同人発行，１９７６年３月２２日発
行）により測定した、ＳＤＳ変性状態及び２−メルカプ
トエタノール還元状態での分子量である。

【００１９】本発明でいう等電点とは、等電点電気泳動
の原理（例えば２１１７ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐ４８〜９５，１９８９
年，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）により測定した等電点である。

【００２０】本発明で用いられる水不溶性担体は、親水
性担体，疎水性担体いずれも使用できる。水不溶性担体
の形状は、粒子状，繊維状，中空糸状，膜状等いずれの
公知の形状も用いることができる。粒状もしくは球状の
水不溶性担体としては、粒径１〜３０００ミクロンのも
のが使用できる。粒径１ミクロン以下では、活性化白血
球との分離が困難である。とくに粒径５０ミクロン以上
であれば、活性化白血球との分離が容易に可能である。
粒径３０００ミクロン以上では、白血球との担体単位重
量あたりの接触面積が低下するため好ましくない。特に
好ましくは、粒径８０〜２０００ミクロンのものであ
る。また、粒状もしくは球状の水不溶性担体の比重が
１．０７以上であれば、遠心もしくは静置による活性化
白血球との分離が容易に可能である。平膜状あるいは中
空糸状の多孔性担体を使用する場合、その孔径が細胞は
通過できないが培地成分は自由に通過できる０．０５〜
１０ミクロンのものを使用すれば、膜の一方の面に結合
した白血球に膜の他方の面より栄養を補給でき、高濃度
の抗腫瘍免疫細胞を誘導することが可能である。特に
０．１〜５ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸状の
多孔性担体が良好に使用できる。

【００２１】水不溶性担体の材質としては、無機ベース
のものにあっては活性炭，ガラス等及びその誘導体があ
り、天然高分子由来担体にはセルロース，セファロー
ス，デキストラン，デンプン等の多糖類及びその誘導体
がある。

【００２２】また、合成高分子にあっては、ビニル系高
分子にはスチレン，酢酸ビニル，メタクリル酸エステ
ル，アクリル酸エステル，ハロゲン化ビニル，ハロゲン
化ビニリデン，アクリロニトリル，アクリルアミド，メ
チルビニルケトン，ビニルピロリドン，２−ビニルピリ
ジン，エチレン，プロピレン，ブタジエン，イソプレン
等及びその誘導体の重合体及び共重合体がある。環状化
合物の開環重合体にはジメチルシクロプロパン，スピロ
−ジ−ｏ−キシリレン，ノルボルネン，シクロブテン，
トリオキサン，ラクチド，シクロポリシロキサン，塩化
ホスホニトリル，Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物
等及びその誘導体の重合体及び共重合体がある。ポリホ
ルムアルデヒド，ポリエチレンオキシド，ポリプロピレ
ングリコール，ポリ−３，３−ビス（クロルメチル）オ
キサシクロブタン，ポリテトラヒドロフラン，ポリカプ
ロラクタム等及びその誘導体がある。

【００２３】また、重縮合体には、ポリエステル，ポリ
アミド，ポリアンヒドリド，ポリカーボネート，ポリ尿
素，ポリスルホンアミド，ポリイミド，ポリベンゾイミ
ダゾール等及びその誘導体がある。樹脂その他のものに
あっては、アクリル樹脂，メタクリル樹脂，フッ素樹
脂，エポキシ樹脂，尿素樹脂，アミノ樹脂，スチレン樹
脂，メラミン樹脂，ポリウレタン，シリコン樹脂，アル
キド樹脂等及びその誘導体が例示できる。

【００２４】以上にあげた高分子担体は、必要に応じて
適当なコモノマー，架橋剤を用いて水不溶性担体を得る
ことができる。架橋剤にあっては、硫黄，有機過酸化
物，フェノール樹脂，ジイソシアナート，エポキシ化合
物，ジエン，グルタルアルデヒド等、被架橋物の官能基
に合わせて種々のものを選択できる（大成社，「架橋剤
ハンドブック」，ｐ３〜７７，１９８１）。

【００２５】また、上記水不溶性担体の表面にリガンド
を固定する方法としては、共有結合，イオン結合，物理
吸着等あらゆる公知の方法を用いることができるが、溶
出性から考えると共有結合で固定して用いることが望ま
しい。そのためには通常固定化酵素，アフィニティクロ
マトグラフィーで用いられる方法を用いることができ
る。例えば、アガロース，セファロース等を臭化シアン
（ＣＮＢｒ）で活性化し、またはエピクロルヒドリンで
エポキシ活性化し、あるいはシリカガラスビーズをγ−
アミノプロピルトリエトキシシランと反応させてアルキ
ルアミノガラスを得て、これをグルタルアルデヒドで活
性化し、結合させる等の方法を用いることができる。ま
た、必要に応じて、水不溶性担体との間に任意の長さの
分子（スペーサー）を導入して使用することもできる。
例えば、アガロースのヒドロキシル基とヘキサメチレン
ジイソシアナートの片側のイソシアナート基を反応結合
させ、残ったイソシアナート基と抗体のアミノ基を反応
結合させるごとく実施することができる。

【００２６】以上の要素よりなる本発明の誘導刺激材の
製造法は、その構成要素の結合順序を規定したものでは
ない。すなわち、本発明で使用する誘導刺激材は基本的
には、水不溶性担体表面に特許請求の範囲第１項から第
４項記載の物質の中の一つが存在すればよいのであり、
製造方法に左右されるものではない。

【００２７】本発明における抗腫瘍免疫細胞とは、例え
ば、新リンパ球機能検索法，ｐ１８７〜１９８，中外医
学社，１９８７年発行、臨床免疫，１９，２４１〜２５
６，１９８７におけるキラー細胞をいう。

【００２８】本発明における白血球とは、血液細胞のう
ち赤血球及び血小板を除いた、いわゆる白血球を指す
が、この白血球より顆粒球あるいはＢ細胞を除去した細
胞分画も、本発明における白血球の概念に含まれる。本
発明において活性化を行う白血球は、公知の連続遠心分
離法にて末梢血より採取した白血球分画を用いてもよ
く、また、公知のフィコールパーク重層遠心分離法にて
分離した単核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細
胞より公知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼッ
ト形成で分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強力な
抗腫瘍免疫細胞の誘導が可能である。

【００２９】本発明において誘導活性化する抗腫瘍免疫
細胞は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロファージを
除くリンパ球分画に属し、とりわけＴ細胞の性質を有し
ている。特許請求の範囲第１項から第４項記載の抗腫瘍
免疫細胞誘導物質は、従来よりも強力な抗腫瘍免疫細胞
誘導物質であり、これを表面に結合させた水不溶性担体
は従来よりも強力な抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材である。
以下に測定方法を明示する。

【００３０】分子量：ＳＤＳで変性及び２−メルカプト
エタノールで還元した抗腫瘍免疫細胞誘導物質を試料と
して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
う。ゲルとしては１３％の均一濃度ゲルもしくは４〜２
０％の勾配濃度ゲルを用いる。分子量マーカーとしては
ホスホリラーゼｂ（９４，０００），アルブミン（６
７，０００），オブアルブミン（４３，０００），カー
ボニック・アンヒドラーゼ（３０，０００），トリプシ
ンインヒビター（２０，０００），α−ラクトアルブミ
ン（１４，０００）からなるＬＭＷ ｋｉｔＥ（ファル
マシア（株）製）を用いる。

【００３１】等電点：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ電気泳
動システム（ファルマシア（株）製）及びＡｍｐｈｏｌ
ｉｎｅ ＰＡＧ Ｐｌａｔｅ（ファルマシア（株）製）
ｐＨ３．５〜９．５を用い、取扱い説明書に従い、抗腫
瘍免疫細胞誘導物質の等電点を求める。等電点値はｐＩ
カリブレーションキット２．５〜６．５（ファルマシア
（株）製）を用いて決定する。

【００３２】抗腫瘍免疫細胞誘導活性：ヒト白血球を次
のように調製する。すなわち、抗凝固剤を加えて採血し
たヒト末梢血を１，６００ｒｐｍで１５分間遠心し、上
清（血漿）を移し取る。沈澱（細胞）にＲＰＭＩ１６４
０培地（ニッスイ製）を、採血量の約２．５倍量加えて
撹拌した後、フィコール・パーク液（ファルマシア
（株）製）３ｍｌの上に１０ｍｌずつ重層して、１，６
００ｒｐｍで２５分間遠心する。中間層（白血球層）を
取り出して、これをＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した
後、自己血清１０％添加したＲＰＭＩ１６４０培地に２
×１０⁶ 細胞／ｍｌの濃度で浮遊させる。

【００３３】抗腫瘍免疫細胞の誘導は次のように行う。 ［抗腫瘍免疫細胞誘導物質で誘導する場合］白血球浮遊
液を２ｍｌ取り、１，２００ｒｐｍで７分間遠心して上
清を除去する。沈澱（白血球）に、抗腫瘍免疫細胞誘導
物質を含む自己血清１０％添加ＲＰＭＩ１６４０培地を
２ｍｌ加えて、細胞を浮遊させる。ＣＯ₂ インキュベー
ター（３７℃）中で１５分間静置した後、１，２００ｒ
ｐｍで７分間遠心して上清（抗腫瘍免疫細胞誘導物質
液）を除去する。沈澱を自己血清１０％添加ＲＰＭＩ１
６４０培地で３回繰り返し洗浄した後、自己血清１０％
添加ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを加えて浮遊させ、培
養用４８ウェルプレートに移す。ＣＯ₂ インキュベータ
ー（３７℃）中で２０時間静置した後、誘導した抗腫瘍
免疫細胞を１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地
で回収して、１０⁷ 細胞／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ
る。

【００３４】［抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材で誘導する場
合］白血球浮遊液１．５ｍｌを誘導刺激材１５０μｌに
加えて、８００ｒｐｍで５分間遠心する。ＣＯ₂ インキ
ュベーター（３７℃）中で１０分間静置した後、１ｍｌ
の自己血清１０％添加ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてピ
ペッティングを３０回行い、誘導刺激材が沈んだ後で白
血球を含む上清を回収する。再度、誘導刺激材に２ｍｌ
の自己血清１０％添加ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、同
様にして白血球を含む上清を回収する。両者を合わせて
１，２００ｒｐｍで７分間遠心した後、沈澱の白血球を
２×１０⁶ 細胞／ｍｌの濃度で自己血清１０％添加ＲＰ
ＭＩ１６４０培地に浮遊させる。浮遊液１ｍｌを、４８
ウェル培養用プレートに移して、ＣＯ₂ インキュベータ
ー（３７℃）中で２０時間静置し、誘導した抗腫瘍免疫
細胞を１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で回
収して、１０⁷ 細胞／ｍｌの濃度で浮遊させる。

【００３５】これらの抗腫瘍免疫細胞が示す抗腫瘍免疫
細胞活性は、次のような測定法で評価する。すなわち、
標的細胞であるヒト癌細胞株を１０⁶ 細胞／ｍｌ濃度で
浮遊させ、浮遊液５ｍｌとアセトンに溶解したカルボキ
シフルオレセインジアセテイト（ｃＦＤＡ）１ｍｇを茶
褐色ガラスビンに入れ、３７℃水浴中で１時間振とう
し、標的細胞を蛍光標識する。１０％牛胎児血清添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ加えて撹拌した後、８００
ｒｐｍで５分間遠心する。上清を除いた後、１０％牛胎
児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に再度浮遊して、５×
１０⁵ 細胞／ｍｌ濃度に調製し、１０μｌをマイクロテ
ストプレートに入れる。ここで抗腫瘍免疫細胞を１０％
牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で回収して、１０
⁷ 細胞／ｍｌ濃度に浮遊させ、これを１０μｌ取りマイ
クロテストプレートに入れて、標的細胞と混合する。Ｃ
Ｏ₂ インキュベーター（３７℃）中で３時間静置する。
この間に、抗腫瘍免疫細胞により殺傷された標的細胞は
蛍光を細胞外に放出するため、その後インクを５μｌ加
えて、細胞外の蛍光を消去し、自動蛍光測定装置（ライ
ツＭＰＶ−ＭＴ２）で蛍光を測定する。抗腫瘍免疫細胞
活性は、次式により計算される。 抗腫瘍免疫細胞活性
＝｛１−（抗腫瘍免疫細胞を添加した場合の蛍光−ＮＰ
４０を添加した場合の蛍光）／（抗腫瘍免疫細胞を誘導
していない白血球を添加した場合の蛍光−ＮＰ４０を添
加した場合の蛍光）｝×１００％（ＮＰ４０：Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０（界面活性剤））

【００３６】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に述
べる。 実施例１ まず、抗腫瘍免疫細胞誘導物質を調製する方法の具体例
を述べる。 （１）製法 ＰＷＭ（（株）ホーネンコーポレーション製）を２０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で、ＰＢＳ（−）に溶解した。ハイロード
２６／６０スーパーデックス７５ｐｇカラム（２．６×
６０ｃｍ、ファルマシア（株）製）をＰＢＳ（−）で平
衡化し、ＰＷＭ溶解液２０ｍｌをアプライして、ＰＢＳ
（−）でゲルクロマトグラフィーを行った。１５０〜１
８０ｍｌの位置に溶出した画分を回収した（図１）。

【００３７】回収画分に硫酸アンモニウムを、最終濃度
が１Ｍになるよう添加した。オクチルセファロース（フ
ァルマシア（株）製）１００ｍｌを詰めたカラムを１Ｍ
硫酸アンモニウム／ＰＢＳ（−）で平衡化し、上記回収
画分をアプライした。５００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウ
ム／ＰＢＳ（−）で非吸着成分を洗い流し、２００ｍｌ
のＰＢＳ（−）で吸着成分を回収した。回収した成分を
限外ろ過システムＮＭ−３ミニモジュール（旭化成工業
（株）製）で濃縮した。

【００３８】生理食塩水（大塚製薬（株）製）で平衡化
したハイロード２６／６０スーパーデックス７５ｐｇカ
ラム（２．６×６０ｃｍ、ファルマシア（株）製）に濃
縮した液４ｍｌをアプライし、ゲルクロマトグラフィー
を行った。１８０〜２００ｍｌの画分に溶出してきたも
のを抗腫瘍免疫細胞誘導物質とした（図２）。ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クーマシーブ
リリアントブルーで染色した結果、単一のバンドのみが
検出された。

【００３９】（２）分子量測定 抗腫瘍免疫細胞誘導物質の分子量は、３５，０００±
５，０００であった。 （３）等電点測定 抗腫瘍免疫細胞誘導物質の等電点は４±１であった。 （４）アミノ酸分析 抗腫瘍免疫細胞誘導物質のアミノ酸分析を行い、表１の
結果を得た。文献に記載されているイソレクチンＰａ−
１〜Ｐａ−５いずれとも異なる値であった。

【００４０】（５）Ｎ末端アミノ酸配列解析 抗腫瘍免疫細胞誘導物質のＮ末端アミノ酸配列をＡｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製気相プロテインシ
ーケンサー４７０Ａでエドマン分解を行い、ＰＴＨアナ
ライザー１２０Ａを用いてＰＴＨ−アミノ酸の同定を行
った。その結果、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｖａｌ−Ｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−（Ｘ，
Ｙは任意のアミノ酸）の配列であった。

【００４１】さらに、抗腫瘍免疫細胞誘導物質をピリジ
ルエチル化（ＰＥ化）し、シーケンス分析を行った。そ
の結果、４サイクル目と１３サイクル目にＰＥ−Ｃｙｓ
が認められ、未同定であったアミノ酸はＣｙｓであっ
た。このことより、抗腫瘍免疫細胞誘導物質のＮ末端ア
ミノ酸配列は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
であった。

【００４２】（６）抗腫瘍免疫細胞誘導活性 抗腫瘍免疫細胞誘導物質で誘導した細胞は、ヒト胃癌細
胞株ＭＫＮ−１を標的細胞として、最終濃度１ｎｇ／ｍ
ｌの抗腫瘍免疫細胞誘導物質で誘導した場合６２％、最
終濃度１０ｎｇ／ｍｌで誘導した場合８３％の活性を示
した。比較例１と比較すると、抗腫瘍免疫細胞誘導物質
は、粗精製ＰＷＭの１０分の１以下の量で同等の抗腫瘍
免疫細胞誘導活性を示した。

【００４３】比較例１ 実施例１と同様の抗腫瘍免疫細胞活性測定において、従
来の粗精製ＰＷＭは、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで誘導
した場合７１％の抗腫瘍免疫細胞誘導活性を示した。

【００４４】実施例２ （１）誘導刺激材の作製 実施例１と同様にして、抗腫瘍免疫細胞誘導物質を調製
した。水不溶性担体として、メチルメタアクリレート−
ジビニルベンゼン共重合体の粒子ＡＸＴ−３１（東京有
機（株）製）を分球し、５００〜７１０μｍを調製し
た。１００ｍｌのＡＸＴ−３１に、２−ヒドロキシエチ
ルメタアクリレートとジエチルアミノエチルメタアクリ
レートとのランダム共重合体の２％（ｗ／ｖ）メタノー
ル溶液１００ｍｌを反応させ、コーティングを施した。
１００ｍｌのコーティングしたＡＸＴ−３１、１２０ｍ
ｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、８０ｍｌのエ
ピクロルヒドリン、１０ｍｌの５０％ＮａＯＨ溶液で５
時間、３０℃で振とうしＡＸＴ−３１にエポキシ基を導
入した。１００ｍｌのエポキシ活性化ＡＸＴ−３１と、
所定量の抗腫瘍免疫細胞誘導物質を含んだ１００ｍｌの
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．０）を２０時間振
とうして抗腫瘍免疫細胞誘導物質をＡＸＴ−３１に結合
させた。洗浄の後、残ったエポキシ基を１Ｍエタノール
アミン溶液中で振とうすることでブロックし、洗浄の後
１００ｍｌの抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材を得た。

【００４５】（２）抗腫瘍免疫細胞誘導活性 抗腫瘍免疫細胞誘導活性測定は、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ
−１を標的細胞として行った。結合反応時に抗腫瘍免疫
細胞誘導物質を１０ｍｇ及び８０ｍｇ添加して作製した
誘導刺激材により誘導された抗腫瘍免疫細胞は、それぞ
れ５１％及び８９％の活性を示した。比較例２と比較す
ると、抗腫瘍免疫細胞誘導物質を結合させた誘導刺激材
は、約８倍濃度の粗精製ＰＷＭを結合させた誘導刺激材
と同等の抗腫瘍免疫細胞誘導活性を示した。

【００４６】比較例２ 実施例２と同様の抗腫瘍免疫細胞誘導活性測定におい
て、従来の粗精製ＰＷＭを結合反応時に１０ｍｇ及び８
０ｍｇ添加で結合させた誘導刺激材は、それぞれ１９％
及び４８％の抗腫瘍免疫細胞誘導活性を示した。

【００４７】実施例３ 実施例２と同様の抗腫瘍免疫細胞誘導活性測定におい
て、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、及びヒト
バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを標的細胞とし
て、抗腫瘍免疫細胞誘導物質を８０ｍｇ添加で結合させ
た誘導刺激材は、それぞれ７８％及び６９％の抗腫瘍免
疫細胞誘導活性を示した。

【００４８】比較例３ 実施例３と同様の抗腫瘍免疫細胞誘導活性測定におい
て、従来の粗精製ＰＷＭを８０ｍｇ添加で結合させた誘
導刺激材は、それぞれ４２％及び２３％の抗腫瘍免疫細
胞誘導活性を示した。

【００４９】実施例４ ４頭のＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウスの体重１ｋｇ当た
り２５ｍｇの抗腫瘍免疫細胞誘導物質を投与したが、１
４日後も死亡は認められなかった。また、３頭のＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスに、マウスの体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの
抗腫瘍免疫細胞誘導物質を投与したところ、１０日目に
１頭が死亡した。比較例５と比較すると、はるかに毒性
が低下していることがわかる。

【００５０】比較例４ ３頭のＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウスの体重１ｋｇ当た
り２５ｍｇの粗精製ＰＷＭを投与したところ、８日目ま
でにすべての死亡が認められた。また、３頭のＢＡＬＢ
／ｃマウスに、マウスの体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの粗
精製ＰＷＭを投与したところ、５日目までにすべての死
亡が認められた。

【００５１】

【発明の効果】本発明の新規タンパク質及び抗腫瘍免疫
細胞誘導刺激材は、以上述べてきたように、ヒト末梢血
白血球を効率良くかつ安全に活性化し、従来よりも強力
な抗腫瘍免疫細胞を誘導するものであり、胃癌，肺癌，
乳癌，肝癌等の癌治療に用いようとするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】粗精製ＰＷＭをＰＢＳ（−）中でゲルクロマト
グラフィーを行い、ＰＷＭを分画したグラフである。

【図２】分画したＰＷＭを生理食塩水中でゲルクロマト
グラフィーを行い、抗腫瘍免疫細胞誘導物質を分画した
グラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポークウィードマイトージェンより得ら
   れる、分子量が３５，０００±５，０００、かつ等電点
   が４±１の純化されたタンパク質。
2. 【請求項２】 特許請求の範囲第１項よりなる抗腫瘍免
   疫細胞誘導物質。
3. 【請求項３】 ポークウィードマイトージェンより得ら
   れる、アミノ酸配列として Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
   Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
   ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓ
   ｐ−Ｌｅｕよりなる配列を持つ特許請求の範囲第１項よ
   りなる純化されたタンパク質。
4. 【請求項４】 特許請求の範囲第３項よりなる抗腫瘍免
   疫細胞誘導物質。
5. 【請求項５】 水不溶性担体の表面に、特許請求の範囲
   第１項から第４項記載の物質の中の一つを有することを
   特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導刺激材。