JPH05244948A - アスコルビン酸酸化酵素の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明はアスコルビン酸酸化酵素の安定化方法
に関する。 【構成】アスコルビン酸酸化酵素の精製工程、製剤工程
並びに製剤の保存・管理において、アスコルビン酸酸化
酵素にスキムミルク、ラクトース、シュクロースまたは
可溶性デンプンから選ばれる１種以上を含有せしめるこ
とによりアスコルビン酸酸化酵素を安定化することがで
きる。アスコルビン酸酸化酵素の活性を長期間維持せし
め、なお且つ優れた賦形性を有する安定なアスコルビン
酸酸化酵素組成物を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアスコルビン酸酸化酵素
の安定化方法に関する。更に詳細にはアスコルビン酸酸
化酵素にスキムミルク、ラクトース、シュクロースまた
は可溶性デンプンから選ばれる１種以上を含有せしめる
ことを特徴とするアスコルビン酸酸化酵素の安定化方法
に関する。

【０００２】アスコルビン酸酸化酵素は、近年食品分野
に用いられることが期待されている。その目的は、食品
中にアスコルビン酸とアスコルビン酸酸化酵素を共存さ
せることによりデヒドロアスコルビン酸を生成させるこ
とにある。このデヒドロアスコルビン酸は、魚畜肉製
品，水産ねり製品の品質を決定する重要な因子である結
着性やあし（のび）と呼ばれる弾力性を改善するもので
ある。

【０００３】しかし、このデヒドロアスコルビン酸は現
在食品添加物として認可されていない。よってアスコル
ビン酸とアスコルビン酸酸化酵素を食品に添加すること
により、デヒドロアスコルビン酸を生ぜしめ食品の品質
改善を得るものである。

【０００４】

【従来の技術】アスコルビン酸酸化酵素は、カボチャ、
キュウリ、ニンジン等野菜類の果皮又は微生物により得
られており、該酵素の精製並にその性質が詳細に研究さ
れてきた。しかしながら、本酵素の安定性は著しく低
く、実用に供し得るものではなかった。その為、安定化
を図る添加剤の検討がなされてきた。

【０００５】アスコルビン酸酸化酵素を安定化せしめる
添加剤としては、希薄溶液中におけるゼラチンの安定化
効果（Methods in Enzymology，２巻，835頁，1955
年）、牛血清アルブミン、ホウ酸塩、塩基性アミノ酸よ
り構成される一種又は二種以上の添加剤を含んでなる安
定化方法（特開昭57-26587）等がある。

【０００６】しかしながら、前者においては酵素活性測
定における短時間の希薄酵素溶液中における安定性の記
載のみであり、又乾燥状態での安定性に関する報告はな
されていない。

【０００７】一方、後者では塩基性アミノ酸又はホウ酸
塩の添加量を多くしないと充分な効果が得られないこと
や有機溶剤沈降時の精製工程では安定化効果が見られな
い。更に、これらの添加物は賦形性が悪く製剤加工に困
難性を伴うことがあることや、食品として使用出来ない
添加剤もあること等の欠点を有している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、かかる事
情に鑑みアスコルビン酸酸化酵素の精製工程、製剤工程
並びに製剤の保存・管理においてアスコルビン酸酸化酵
素を安定化させ、その活性を長期間維持せしめ、なお且
つ優れた賦形性を有する安定なアスコルビン酸酸化酵素
組成物を得る方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アスコル
ビン酸酸化酵素を精製工程で安定化し、なお且つその製
剤化に於いて優れた賦形性を具備し、食品として好適で
新規な安定化剤を検索した。そして全く意想外にもスキ
ムミルク、ラクトース、シュクロースまたは可溶性デン
プンをアスコルビン酸酸化酵素に添加することにより顕
著な安定化効果をもたらすことを見い出したのである。

【００１０】特にスキムミルクはその構成成分としてカ
ゼイン、乳糖を主体としたものであるが、これらを単独
に或いは組み合わせて用いた時に比し、卓越した安定化
作用をもたらしたことは驚くべきことであった。

【００１１】本発明におけるアスコルビン酸酸化酵素は
キュウリ或いはカボチャの果皮より分離され、水溶性有
機溶剤沈降、塩折、脱塩・濃縮、クロマトグラフイー分
離等、通常酵素精製の常套手段を用いて精製し製剤化す
る。精製されるアスコルビン酸酸化酵素の純度は高度に
精製されたものである必要はなく、その使用用途に応じ
て適宜使いわけることができる。

【００１２】ここで用いられる安定化剤はスキムミル
ク、ラクトース、シュクロースまたは可溶性デンプンで
あり、スキムミルクは通常市販されている脱脂乳又は粉
末化した脱脂粉乳である。

【００１３】上記安定化剤は、アスコルビン酸酸化酵素
の精製工程即ち、抽出、水溶性有機溶剤沈降、透析、塩
折、クロマトグラフイー分離、濃縮、凍結乾燥、真空乾
燥等の各工程で任意に使用される。特に、アスコルビン
酸酸化酵素は水溶性有機溶剤沈降工程や乾燥工程の際に
失活が著しい為、この工程でスキムミルクを添加してお
くことは好ましく安定性に大きく寄与する。

【００１４】スキムミルク等の安定化剤を添加する量と
しては、通常その液量又は重量に対し１〜30％、好まし
くは５〜20％である。スキムミルクによる安定化効果は
１％以下では得られない。又、30％以上ではアスコルビ
ン酸酸化酵素の単位活性が下がってしまい実用的ではな
い。

【００１５】スキムミルク等の安定化剤は粉末のまま添
加してもよいし、予め水又は緩衝液に溶解させておいて
もよい。安定化剤を含むアスコルビン酸酸化酵素組成物
はその性状が液状の組成物であってもよいし、更にこれ
を凍結乾燥, 真空乾燥等の何らかの乾燥手段により乾燥
した組成物となしたものでもよい。又、得られた乾燥品
は粉砕、分級、混合等の製剤加工により、更に必要とあ
らばアスコルビン酸酸化酵素の含量を調整する目的でス
キムミルク等の安定化剤又は適当な賦形剤を添加して完
成された組成物となすことができる。

【００１６】かくして長期間にわたり品質の維持を可能
ならしめたアスコルビン酸酸化酵素組成物を得ることが
できたのである。

【００１７】アスコルビン酸酸化酵素の活性は以下の方
法によって測定した。 基質溶液 17.6mgのL-アスコルビン酸を50mlのpH5.6
のリン酸緩衝液に溶解する。用時、その10mlを39mlの緩
衝液で希釈して用いる。 酵素溶液 0.08〜0.35U/mlになるようにリン酸二ナト
リウム４mmol/L、アルブミン0.05％溶液で希釈する。 反応停止液 塩酸0.2mol/Lを調製する。 反応方法 基質１mlをキュベットに入れ、25℃、５分
間予熱後、酵素液0.1mlを加えて５分間反応させる。塩
酸溶液３mlを加えて反応を停止した後十分攪拌し245nm
の吸光度を測定する。 酵素単位 245nmの吸光度の減少から分解されたアス
コルビン酸量を求め、酵素力価を算出する。なお、ここ
で表示する１Ｕとは１分間に１μmolのアスコルビン酸
が分解される酵素量を示す。 以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

実施例１ キュウリを破砕後、得られた抽出濃縮液（241U/ml）100
mlに各々のスキムミルク（雪印乳業製品）を入れて混合
し、−25℃のエタノール400ml中に攪拌しながら添加し
てアスコルビン酸酸化酵素を沈澱せしめ、沈澱部分を真
空乾燥した。結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】これから明らかなように、スキムミルクを
添加したものはアルコール沈降に対し、アスコルビン酸
酸化酵素を安定化する作用があることが判る。

【００２１】実施例２ 実施例１の抽出濃縮液を更に濃縮し520U/mlとした液に
ついて、同様の試験をした。結果を表２に示す。

【００２２】

【表２】

【００２３】これから明らかなように、スキムミルクを
添加したものは著しい安定化効果をもたらした。

【００２４】実施例３ キュウリの抽出濃縮液（183U／ml）に各々の添加剤（10
％水溶液、pH未調整）100mlを加えて凍結乾燥した。コ
ントロールは水を用いた。乾燥品を37℃にて14日間孵卵
器で保存し、その後酵素活性を測定した。結果を表３に
示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】これから明らかなように、スキムミルクの
安定化は顕著でコントロールに比べ約３倍の活性を維持
している。又、二糖類にも安定化作用がみられる。

【００２７】実施例４ キュウリを破砕後、抽出しこれに硫安を添加し塩折し
た。沈澱を溶解後、CM−セフアロース（登録商標、フア
ルマシア製品）によるクロマトグラフイーにて分離し、
脱塩濃縮した濃縮液（423U/ml）を得た。これに実施例
３で用いた方法と同じ添加剤を加えて凍結乾燥し、経時
変化をみた。結果を表４に示す。

【００２８】

【表４】

【００２９】これから明らかなように、高度に精製した
アスコルビン酸酸化酵素についてもスキムミルクは顕著
な安定化効果を示している。

【００３０】実施例５ アスコルビン酸酸化酵素溶液（32U/ml）５mlにスキムミ
ルク（Difco Laboratories社製品）及びスキムミルクの
構成成分である化合物５mlを加えて凍結乾燥し、37℃、
20日間の経時変化をみた。結果を表５に示す。

【００３１】

【表５】

【００３２】これから明らかなように、スキムミルクの
構成成分であるラクトース及びミルクカゼインを組み合
わせて用いたものよりもはるかにスキムミルク単独での
安定化作用が高いことが判る。尚、０日目の数値は凍結
乾燥上りの活性値（U/tube）を示す。

【００３３】実施例６ カボチャ果皮の抽出液をUF濃縮しその濃縮液（250U/m
l）100mlにスキムミルク（雪印乳業製品）又は糖類を加
えて、20℃、14日間の経時変化をみた。結果を表６に示
す。

【００３４】

【表６】

【００３５】これから明らかなようにスキムミルク又は
糖類の添加効果はアスコルビン酸酸化酵素が液状の場合
でもみられることが判る。尚、表中の数値はml当りの活
性（U/ml）を示す。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、不安定なアスコルビン酸酸化
酵素に食品として好適なスキムミルクを添加することに
よって長期間にわたり優れた品質を保持することができ
るため、食品添加物として実用に供し得るものとなった
ばかりでなく、良好な賦形性により製剤の加工・管理も
容易ならしめたのである。又、スキムミルク等の添加剤
は安価に得られるため経済的に製造することが可能であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アスコルビン酸酸化酵素にスキムミルク、
   ラクトース、シュクロースまたは可溶性デンプンから選
   ばれる１種以上を含有せしめることを特徴とするアスコ
   ルビン酸酸化酵素の安定化方法。