JPH05253290A - 生理活性物質固定化担体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生理活性物質の活性を保持したまま、簡便か
つ効果的に固定することができ、固定化生理活性物質の
遊離等不都合な事態を招くことのない生理活性物質固定
化担体の製造法を提供する。 【構成】 求核性を有する置換基を含有する水不溶性固
体表面に、ポリアルキレン骨格を有し両末端にトシル酸
エステルを持つ親水性スペーサーを作用させ、トシル酸
エステルと求核性置換基との反応により該親水性スペー
サーを固定し、さらに該親水性スペーサーの他端にある
トシル酸エステルを生理活性物質中の求核性置換基と同
様の反応を行わせて固定化することを特徴とする生理活
性物質固定化担体の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は求核性を有する置換基を
分子内に含有する水不溶性固体表面に、両末端がp-トル
エンスルホン酸（以下トシル酸と略記する）エステルと
なった親水性スペーサーを介して生理活性を有する物質
を固定することを特徴とする生理活性物質固定化担体の
製造法に関するものである。より詳細に述べると、求核
性を有する置換基を分子内に含有する水不溶性固体表面
に、ポリアルキレンオキサイド骨格を有し、両末端にト
シル酸エステルを持った親水性スペーサーを作用させて
結合せしめ、さらにスペーサーのもう一方のトシル酸エ
ステルと生理活性物質の求核性置換基とを同様の方法で
固定した生理活性物質固定化担体の製造法に関する。本
発明において生理活性物質とは、酵素、補酵素、酵素阻
害剤、ホルモン、抗菌剤、抗原、抗体、細胞、その他機
能を有する蛋白質、さらにこのような物質と親和性を有
する低分子化合物および（または）高分子化合物を指
し、これらをリガンドと称することもある。また、本発
明において生理活性物質を固定化する水不溶性固体を単
に担体と称することもあり、スペーサーとは生理活性物
質を担体表面から離して固定するための腕のことを指
す。

【０００２】

【従来の技術】生理活性物質を不溶性固体に固定し、得
られた生理活性物質固定化担体を化学反応触媒、分離精
製用特異的吸着材、臨床検査材料、医療用材料として利
用する方法は１９６０年代から活発な研究が開始され、
現在各国で盛んに研究が進められている。生理活性物質
を固体に担持させる方法は、物理的方法と化学的方法に
大別できる。前者はアガロースゲルなどに包み込んで閉
じこめる包括法や、非特異的な吸着力を利用した吸着法
などがある。後者には生理活性物質の官能基を利用して
化学結合させる共有結合法や、生理活性物質の持つ電荷
と反対の電荷を固体に付与して両者をイオン結合で結合
させるイオン結合法などがある。

【０００３】生理活性物質の固定で最も重要な問題とな
るのはいかにしてもとの活性を損なうことなく、安定に
固定し、なおかつ使用に際して生理活性物質の遊離が防
げるかということである。物理的方法によって固定した
場合、包括法では生理活性物質を包み込んでしまうた
め、酵素そのものは活性を維持していながら反応溶媒と
の接触が妨げられ、もとの活性が充分に発揮されない可
能性が大きく、吸着法では使用中の生理活性物質遊離の
問題がある。従って、このような問題を解決するには、
化学的方法、なかでも共有結合法によって固定化を行う
ことが望ましい。

【０００４】従来、共有結合法として採用されてきた方
法としては、臭化シアン法、エポキシ法が一般的であ
る。臭化シアン法は、担体上の水酸基と臭化シアン（Ｃ
ＮＢｒ）を作用させてシアン酸エステル（ＲＯＣＮ）ま
たはイミドカーボネート（(ＲＯ)₂Ｃ=ＮＨ）を生成さ
せ、これにアミノ基を有する物質をイソウレア結合（Ｒ
ＯＣ(=ＮＨ)ＮＨ-Ｌ）やウレタン結合（ＲＯ(ＣＯ)ＮＨ
-Ｌ）で固定する方法である。（Ｒは固定を行う担体、
Ｌは生理活性物質）この方法は比較的容易に固定化がで
きるので広く利用されているが、架橋部に形成されるイ
ミド基が帯電しているため、これとの静電相互作用によ
って非特異吸着が起こる。また、固定化された生理活性
物質と担体との結合が不安定であるため、生理活性物質
が遊離する可能性がある。リガンドが遊離するという欠
点は特に医療用材料、つまり、血液や血液成分を接触さ
せて含有される病因物質を吸着除去する吸着材では致命
的とも言える。さらに、臭化シアンはそれ自体毒性を持
った化合物であるため、未反応の臭化シアンが残存する
可能性のあるこの方法は医療用材料には事実上応用がで
きない。

【０００５】エポキシ法は臭化シアン法のこのような欠
点を解消するために考案された方法のひとつである。こ
の方法は例えば、担体上の水酸基とエピクロルヒドリン
をアルカリ性条件のもとで作用させてエポキシ基を導入
し、これに水酸基を有する物質を作用させてエーテル結
合により固定化させるものである。この方法は、水酸基
の代わりにアミノ基を利用して固定する方法や、担体に
直接エポキシ基を導入するのではなく、両末端にエポキ
シ基を有する化合物をスペーサーとして担体の水酸基と
反応させ、もう一方のエポキシ基を利用して含水酸基物
質を固定する方法などのバリエーションも考案されてい
る。

【０００６】エポキシ法では臭化シアン法と比べて （１）静電相互作用による非特異吸着がない。 （２）生理活性物質との結合部位にあるエーテル結合、
アルキルアミノ結合は安定であり、生理活性物質の遊離
が少ない。 などの利点を有する。しかし、このエポキシ法では生理
活性固定の際、高温のアルカリ溶液で長時間の処理を要
するという欠点があり、これは生理活性物質の失活を招
く恐れがおおいにある。

【０００７】さらに別の方法としては、以下のような手
段が考案されている。 （１）含オレフィン化合物溶液と酵素溶液とを担体表面
に塗布し、これに電離性放射線を照射する方法（特公平
３−６１４２６） （２）アミド化反応を利用して生理活性物質を固定する
方法（有機合成化学、第３８巻、１２８〜１３８頁（１
９８０年）；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第８７巻、５３５
〜５４０頁（１９８０年）） （３）両末端にアルデヒドを有する化合物をスペーサー
として導入し、これを介して生理活性物質を固定する方
法（特公平３−５９０８０）

【０００８】（１）の方法は包括法に分類されるもの
で、酵素水溶液およびガラス化性ビニル系重合性単量体
から成る混合物を多孔質粒子の表面に被覆した後電離性
放射線を照射して重合せしめ、酵素を固定するものであ
る。この方法では包括法の利点、すなわち活性の保持、
複数成分から成る複雑な酵素反応系をそのまま固定でき
ることなどを保ったまま、酵素の遊離が低く抑えられ
る。しかしながら、反応溶媒との接触が制限されてしま
うことは避けられず、また、固定化に電離性放射線の照
射を要するので装置が大がかりなものとなってしまい、
手軽に実施しにくい。

【０００９】（２）の方法は、エポキシ活性化担体をア
ンモニアでアミノ誘導体とした後、無水コハク酸で処理
し、スクシニルアミノ誘導体とし、これにカルボジイミ
ドとアミノ基を有する生理活性物質とを作用させて生理
活性物質の固定化を行うものである。しかし、水溶性カ
ルボジイミドを用いるこの方法では反応中間体の転位に
よる副反応が起こる可能性がある。また、最適酸性度で
あるｐＨ４．５でも、これよりも低いｐＨ値ではなおさ
ら、生理活性物質の重合が起こり易いという欠点がある
のは発明者自身も認めているところである。

【００１０】（３）の方法は、アミノ基を有する担体
（もしくはアミノ基を導入した担体）と、両末端にアル
デヒドを有する化合物を作用させ、シッフ塩基形成-還
元によってアルキルアミノ結合でこれを固定し、さらに
アミノ基を有する生理活性物質を同様にして結合させ
て、スペーサーを介して生理活性物質を担体に固定する
方法である。この方法は生理活性物質を固定するという
目的を達成するだけなら優れた方法であるが、使用時の
生理活性発揮について考えると、改善の余地がある。

【００１１】この発明においては両末端にアルデヒドを
有する化合物、すなわちスペーサーについての考慮が充
分でない。スペーサーの効果は生理活性物質の運動性を
高めることによって、使用の際にその活性を充分に引き
出すということが挙げられる。ところが、特公平３−５
９０８０の方法に用いられるスペーサーはその鎖長が、
炭素数にしてわずかに２〜１０となっている。このよう
に短いスペーサーでは生理活性物質の運動性向上に対す
る寄与は充分ではないと考えられる。

【００１２】また、生理活性物質固定化担体は主とし
て、水系溶媒中で使用されることが圧倒的に多い。特公
平３−５９０８０に挙げられたスペーサーは疎水性のメ
チレン鎖から成っているため水系溶媒中では充分に伸び
きったコンフォメーションをとるのが困難であり、スペ
ーサー鎖長と併せて考えると、本来スペーサーに期待さ
れる効果はほとんど発揮されないと言っても過言ではな
い。

【００１３】生理活性物質固定化担体が医療用材料、す
なわち血液や血液成分を接触させて含有される病因物質
を吸着除去する吸着材として使用される場合には親水性
スペーサーの持つ意義はさらに大きくなる。すなわち、
血液中の血球成分や、被吸着物質でない蛋白の付着を防
止することである。親水性スペーサーはその周辺に水を
吸着している。このため吸着材表面は水の層に覆われ、
この水の層が血球成分の付着を防いでいる（排除体積効
果）。また、水の層を形成するスペーサーが運動するこ
とにより、さらに血球成分の付着は困難になり、付着し
た血球成分は脱離しやすくなる。また、凝固因子や補体
の活性化が抑制されるといった利点を有する。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、簡便な方法で種々の生理活性物質の固
定を汎用的に、充分な濃度で、安定に行うことができ、
かつ生理活性物質の活性を充分に引き出すことのできる
生理活性物質固定化担体の製造法を提供しようとしたも
のである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の生理活性物質固
定化担体の製造法は、求核性を有する置換基を含有する
水不溶性固体表面に、両末端にトシル酸エステルを有す
る親水性スペーサーを介して生理活性を有する物質を固
定することを特徴とするものである。本発明の生理活性
物質固定化担体の製造法は、水不溶性固体がポリスチレ
ン、ポリメタクリル酸およびその誘導体或いはこれらの
共重合体などの合成有機高分子化合物、セルロース、キ
チン、キトサン等の天然有機高分子化合物、またはアシ
ルセルロース、アシルキチン等の改質天然有機高分子化
合物に適当な方法で求核性置換基を導入した化合物であ
ることが好ましい。これらの高分子化合物のうち、機械
的強度、親水性スペーサー導入の容易さ、親水性スペー
サー導入後の水不溶性の保持を考慮すると、適度に架橋
したポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその誘導体
或いはこれらの共重合体、セルロースに適当な方法で求
核性置換基を導入した化合物やキトサンが望ましく、さ
らに好ましくは架橋ポリメタクリル酸誘導体、セルロー
スに適当な方法で求核性置換基を導入した化合物、ある
いはキトサンが望ましい。

【００１６】本発明において求核性を有する置換基と
は、公知、またはこれから新規に合成されるであろうい
かなる求核性置換基をも包含する。具体的にはアミノ
基、イミノ基、ヒドロキシルアミノ基、水酸基、アルコ
キシド基、チオール基、ヒドロセレノ基（−ＳeＨ）、
ヒドロテルロ基（−ＴeＨ）、ホスフィノ基（−Ｐ
Ｈ₂）、アルシノ基（−ＡsＨ₂）、スチビノ基（−ＳbＨ
₂）、ビスムチノ基（−ＢiＨ₂）などの置換基あるい
は、ヒドラジン、ヒドラジド、スルフィド、ヒドロポリ
スルフィド（Ｒ−Ｓ_nＨ）、ポリスルフィド（Ｒ−Ｓ_n−
Ｒ）、セレニド（Ｒ−Ｓe−Ｒ）、テルリド（Ｒ−Ｔe−
Ｒ）、あるいはグリニャール試薬（ＲＭgＸ）や有機リ
チウムといった有機金属化合物などの構造を有する置換
基を指す。このなかで入手や取扱いの容易さ、反応性か
らアミノ基、イミノ基、水酸基が好ましく、反応後の生
成物の安定性を考えると、アミノ基、イミノ基、特に第
１級アミノ基が最も好ましい。

【００１７】本発明において利用される水不溶性担体は
求核性置換基を含有していることが必要である。キトサ
ンのようにすでに分子中にアミノ基を持っている化合物
はそのまま利用できるが、もともと求核性置換基のない
化合物にはあらかじめ求核性置換基を導入する必要があ
る。導入方法については特に制限されないが、ポリスチ
レンを利用する場合、以下のような方法でアミノ基を導
入する手段が利用され得る。

【００１８】（１）架橋ポリクロロメチルスチレンの合
成 ジビニルベンゼンを１重量％〜７０重量％、好ましくは
２重量％〜３５重量％含む架橋ポリスチレンにクロロホ
ルムを加え、室温で１５分以上、好ましくは３０分以上
撹拌して充分に膨潤させた後、クロロメチルメチルエー
テルと触媒を加え、２５℃〜１００℃、好ましくは３０
℃〜６０℃で３０分〜１２時間、好ましくは２時間〜７
時間窒素気流気下にて撹拌しながら反応させると、クロ
ロメチル基導入率１０％〜１００％、好ましくは２５％
から９５％の架橋ポリクロロメチルスチレンが得られ
る。上記触媒としては、塩化アルミニウムのようなアル
ミニウム系触媒、塩化錫のような錫系触媒、塩化亜鉛の
ような亜鉛系触媒が挙げられる。触媒は反応溶液中に
０．３％〜５．０％、好ましくは０．４％〜３．０％の
含量で添加される。上記クロロメチル化反応において、
各成分の混合重量比は次の通りである。ポリスチレンと
クロロホルムの重量比は２／１〜１／１０、好ましくは
１／１〜１／７；ポリスチレンとクロロホルムの合計量
とクロロメチルメチルエーテルの混合重量比は３０／１
〜１／５、好ましくは１５／１〜１／３である。

【００１９】（２）アミノ基の導入 ポリアミン化合物を不活性溶媒に溶解させる。これに上
記（１）で得たポリクロロメチルスチレンを加え、０℃
から徐々に室温まで反応温度を上げ、３０分〜１２時間
好ましくは１時間〜４時間に亘り反応させる。これに水
酸化ナトリウム水溶液を加え、約３０分撹拌した後、生
成物を回収する。以上の操作によってアミノ基含量０．
２０ｍｍｏｌ／ｇ〜２０ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは１．
０ｍｍｏｌ／ｇ〜１０ｍｍｏｌ／ｇの化合物下記（化
２）が得られる。

【００２０】

【化２】

【００２１】上記の反応に用いられる溶媒はクロロホル
ム、ベンゼンなどの有機溶媒、アルカリ水溶液などの水
系溶媒も用いられ得るが、テトラヒドロフラン、テトラ
ヒドロピラン、ジオキサン等の環状エーテル類が好まし
い。上記反応に用いられるポリアミン化合物はアンモニ
ア；ヒドラジン；エチレンジアミン；ジエチレントリア
ミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタ
ミンなどのエチレンジアミン縮合化合物；ジアミノプロ
パン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘ
キサン、トリアミノプロパン、トリアミノブタン、トリ
アミノペンタン、トリアミノヘキサンなどのポリアミノ
アルキル；ジアミノシクロペンタン、トリアミノシクロ
ペンタン、ジアミノシクロヘキサン、トリアミノシクロ
ヘキサンなどのポリアミノシクロアルキル；ジアミノベ
ンゼン、ジアミノナフタレン、トリアミノベンゼン、ト
リアミノナフタレンなどのポリアミノアリール等が挙げ
られるが、本発明の要旨であるトシル酸エステルとの反
応が容易なのは第１級アミノ基なので、第１級アミノ基
が少なくともひとつ、好ましくはふたつ以上含まれるポ
リアミン化合物が望ましい。上記反応におけるポリクロ
ロメチルスチレン中のクロロメチル基とポリアミン化合
物との混合モル比は３／１〜１／１０好ましくは１／１
〜１／５である。

【００２２】セルロースを利用する場合、以下のような
方法が利用され得る。 （１）アルデヒド基の導入 過沃素酸ナトリウムを０．１規定から５．０規定、好ま
しくは０．５規定から１．５規定の硫酸に溶解した溶液
に、粒状多孔質セルロースを添加し、１０℃から５０
℃、好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時
間、好ましくは１０時間から２４時間反応させる。上記
過沃素酸ナトリウム-硫酸溶液の過沃素酸ナトリウム濃
度は２重量％から１５重量％、好ましくは４重量％から
１０重量％である。また、上記粒状多孔質セルロースの
過沃素酸ナトリウム溶液への浴比は１０容量％から３０
容量％、好ましくは１５容量％から２５容量％である。
この反応混合物を濾過して生成物を回収し、充分に水洗
して、膨潤状態でアルデヒド含量０．１０ｍｅｑ／ｍｌ
から２．００ｍｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．２０ｍｅｑ
／ｍｌから１．５０ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセルロー
スを得る。このアルデヒドセルロースは下記（化３）に
示すように、一部のグルコースユニットが開環した構造
をしている。

【００２３】

【化３】

【００２４】（２）アミノ基の導入 ポリアミン化合物をｐＨ９．５の緩衝液に溶解させる。
これに上記（１）で得たアルデヒドセルロースを添加し
て撹拌しながら１０℃から５０℃好ましくは２０℃から
３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０時間か
ら２４時間反応させる。上記ポリアミン化合物-緩衝液
の濃度は０．２重量％から５．０重量％、好ましくは
０．４重量％から３．０重量％、この溶液へのアルデヒ
ドセルロースの浴比は３容量％から２０容量％、好まし
くは５容量％から１５容量％であり、アルデヒドセルロ
ースに含まれるアルデヒドとポリアミン化合物の混合モ
ル比が３／１〜１／１０好ましくは１／１〜１／５とな
るよう適当に調整されるのが望ましい。

【００２５】この反応混合物を濾過して生成物を回収、
水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０℃好ましく
は２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましく
は１０時間から２４時間反応させてシッフ塩基の水素添
加を行う。含シッフ塩基［セルロース］-［ポリアミン
化合物］の緩衝液への浴比は３容量％から２０容量％、
好ましくは５容量％から１５容量％、含シッフ塩基［セ
ルロース］-［ポリアミン化合物］と水素化ホウ素ナト
リウムの仕込比は２０／１から３／２、好ましくは１５
／１から３／１（いずれも容量／重量比）である。こう
してアミノ基含量０．０５０ｍｅｑ／ｍｌから３．００
ｍｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．２０ｍｅｑ／ｍｌから
２．００ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］-［ポリアミン
化合物］を得る。

【００２６】上記反応に用いられるポリアミン化合物は
アンモニア；ヒドラジン；エチレンジアミン；ジエチレ
ントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレ
ンペンタミンなどのエチレンジアミン縮合化合物；ジア
ミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジ
アミノヘキサン、トリアミノプロパン、トリアミノブタ
ン、トリアミノペンタン、トリアミノヘキサンなどのポ
リアミノアルキル；ジアミノシクロペンタン、トリアミ
ノシクロペンタン、ジアミノシクロヘキサン、トリアミ
ノシクロヘキサンなどのポリアミノシクロアルキル；ジ
アミノベンゼン、ジアミノナフタレン、トリアミノベン
ゼン、トリアミノナフタレンなどのポリアミノアリール
等が挙げられるが、本発明の要旨であるトシル酸エステ
ルとの反応が容易なのは第１級アミノ基なので、第１級
アミノ基が少なくともひとつ、好ましくはふたつ以上含
まれるポリアミン化合物が望ましい。さらに、ポリアミ
ン化合物の緩衝液への溶解性を考慮すると、エチレンジ
アミンおよびエチレンジアミン縮合化合物が望ましい。

【００２７】本発明において両末端にトシル酸エステル
を有する親水性スペーサーとは、具体的には前記の化１
の構造を有する化合物であることを特徴とするものであ
る。

【００２８】この化合物の合成方法については特に制限
されないが、両末端にトシル酸エステルを持つポリエチ
レングリコール（以下ＰＥＯトシレートと略記する。）
を合成する場合、分子量２００から２００００、好まし
くは４００から１００００、さらに好ましくは１０００
から５０００のポリエチレングリコールをピリジンの存
在下、トシル酸クロライド（p-ＣＨ₃(Ｃ₆Ｈ₄)ＳＯ₂Ｃ
l）を作用させることによって合成する方法が好まし
い。

【００２９】本発明に用いられる両末端にトシル酸エス
テルを有する親水性スペーサーの鎖長は、固定化される
生理活性物質の種類、得られた生理活性物質固定化担体
の用途によって適当に選択されることが好ましい。例え
ば、生理活性物質として抗ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）抗
体を固定し、血液中のＬＤＬを選択的に除去する吸着材
として用いる場合、ＰＥＯトシレートをスペーサーに用
いるのであれば、分子量にして２００から１００００、
好ましくは４００から５０００が望ましい。

【００３０】前記のような方法で水不溶性固体に導入し
た求核性置換基であるアミノ基や、他の求核性置換基を
利用して、両末端にトシル酸エステルを有する親水性ス
ペーサーを介し、生理活性物質の固定を行う。求核性置
換基は、親水性スペーサー末端トシル酸エステルのつい
た炭素原子を求核攻撃し、トシル酸をはじき出すことに
よって交換し、水酸基やアルコキシド基の場合はエーテ
ル、第１級アミノ基の場合はアルキルアミンを生成する
ことによって結合される。水酸基、第１級アミノ基の反
応についてその機構を以下に示す。（化４、化５）

【００３１】

【化４】

【００３２】

【化５】 化４、化５においてＲは水不溶性担体、Ｒ¹ は親水性ス
ペーサーを示す。

【００３３】水不溶性固体への両末端トシル酸エステル
親水性スペーサーの導入、さらに生理活性物質の固定化
については、例えば、アミノ基導入済みセルロースにＰ
ＥＯトシレートを介して抗ＬＤＬ抗体を固定する場合に
は以下のような方法が用いられ得る。

【００３４】（１）アミノ基導入済みセルロースへのＰ
ＥＯトシレートの導入 アミノ基含量０．０５０ｍｅｑ／ｍｌから３．００ｍｅ
ｑ／ｍｌ、好ましくは０．２０ｍｅｑ／ｍｌから２．０
０ｍｅｑ／ｍｌのアミノ基導入済みセルロースを、モレ
キュラーシーブを投入して脱水したジメチルスルホキシ
ド（以下ＤＭＳＯと略記する。）に分散させておく。こ
れに分子量２００から１００００、好ましくは４００か
ら５０００のＰＥＯトシレートを加え、１０℃から５０
℃、好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時
間、好ましくは１０時間から２４時間撹拌して反応させ
る。上記アミノ基導入済みセルロースとＰＥＯトシレー
トとの仕込比は、それぞれに含まれるアミノ基とトシル
基のモル比が３／１から１／１０、好ましくは２／１か
ら１／５となるよう適当に調整されるのが望ましい。こ
の反応混合物を濾過して生成物を回収する。

【００３５】（２）生理活性物質の固定 抗ＬＤＬ抗体を、モレキュラーシーブを投入して脱水し
たＤＭＳＯに分散、あるいは溶解させておく。これに上
記で得た［セルロース］-［ＰＥＯトシレート］を加
え、０℃から５０℃、好ましくは１５℃から３０℃で３
０分から３０時間、好ましくは１時間から２４時間、さ
らに好ましくは２時間から１８時間撹拌して反応させ
る。この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、
［セルロース］-［ＰＥＯトシレート］-［抗ＬＤＬ抗
体］を得る。上記抗ＬＤＬ抗体-ＤＭＳＯの濃度は０．
０５重量％から５．０重量％、好ましくは０．１重量％
から３．０重量％であり、この溶液への［セルロース］
-［ＰＥＯトシレート］の浴比は２容量％から２０容量
％、好ましくは４容量％から１５容量％である。

【００３６】上記は抗ＬＤＬ抗体固定化セルロースにつ
いての例であるが、生理活性物質は種類によって取扱い
方が極めて多様であり、また、固定化担体の用途によっ
て固定化量なども異なってくる。したがって、固定化す
る生理活性物質、固定化担体の用途に応じて適当な条
件、混合比などを設定することが必要である。また、こ
れも固定化する生理活性物質、およびその用途によって
であるが、生理活性物質固定化後に残存するスペーサー
末端の未反応トシル酸エステルが悪影響を及ぼす可能性
もあるので、必要に応じエタノールアミン等の適当な試
薬でブロックすることも推奨される。

【００３７】本発明に用いられる両末端にトシル酸エス
テルを有する親水性スペーサーは、水系の溶媒に対して
それほど安定ではないので、固定化に用いられる溶媒は
上記の反応例のように、ＤＭＳＯなどの不活性な有機溶
媒を用いることが望ましい。また、固定化を行うことに
よってトシル酸が遊離するので、ピリジンなどの複素環
型塩基性溶媒や、トリエチルアミンなどの第３級アミン
系溶媒などを添加することも推奨される。

【００３８】本発明に使用される水不溶性固体の形状は
粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用いられ
得るが、固定化される生理活性物質の種類、得られた生
理活性物質固定化担体の用途によって適当に選択される
ことが好ましい。

【００３９】例えば、生理活性物質として抗ＬＤＬ（低
比重リポ蛋白）抗体を固定し、血液中のＬＤＬを選択的
に除去する吸着材として用いる場合、粒子状担体の平均
粒径は１０μｍから５ｍｍ、好ましくは３０μｍから１
ｍｍ、さらに好ましくは５０μｍから５００μｍの範囲
にあることが望ましい。これより粒径が小さくなると血
液、あるいは血液成分の流通抵抗が大きくなり、粒径が
大きくなると担体充填量の減少、ひいては有効表面積の
減少を招くこととなる。粒子形状については、細胞に損
傷を与えにくいことや、物理的外力に対する強度、さら
に調整の容易さから、球状であることが望ましい。同じ
理由から、繊維状担体の繊維直径は０．１μｍから５０
μｍ、好ましくは０．３μｍから２５μｍ、さらに好ま
しくは０．５μｍから１５μｍが望ましい。

【００４０】固定化される生理活性物質の種類、得られ
た生理活性物質固定化担体の用途によっては、有効表面
積を拡大するために担体表面に微小孔が存在することが
好ましい場合も多い。例えば、生理活性物質として抗Ｌ
ＤＬ（低比重リポ蛋白）抗体を固定し、血液中のＬＤＬ
を選択的に除去する吸着材として用いる場合、粒子状担
体では、２０Åから２００００Å、好ましくは１００Å
から１５０００Å、さらに好ましくは１０００Åから１
２０００Å、繊維状担体では２０Åから３０００Å、好
ましくは１００Åから２０００Åの微小孔が存在するこ
とが望ましい。これより平均孔径が小さいと被吸着物質
が微小孔内部まで到達できず、これより大きいと有効表
面積を拡大する効果が不十分であり、また担体の強度低
下を招く恐れがある。

【００４１】

【実施例】以下実施例を用いて本発明を説明する。実施
例中の部は、とくに注釈を加えない限り重量部を意味す
る。 〈実施例１〉粒状多孔質セルロース（平均粒径５０μ
ｍ、平均孔径１５００Å）１０００部（容量）を、過沃
素酸ナトリウム３２５部を１規定-硫酸５０００部に溶
解した溶液に添加し、２５℃で１８時間反応させた後、
濾別、水洗し、アルデヒド含量１．２５ｍｅｑ／ｍｌの
アルデヒドセルロース（ＣＡ-１）を得た。アルデヒド
の定量はオキシム法によって行った。すなわち、ＣＡ-
１約１．０ｍｌを正確に秤量し（この量をＶ₁ｍｌとす
る）、これに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液
（塩酸ヒドロキシルアミン３５ｇを水１６０ｍｌに溶か
し、９５％エタノールで希釈して１ｌとしたもの）１０
ｍｌ、ピリジンブロムフェノールブルー溶液（４％ブロ
ムフェノールブルー０．２５ｍｌとピリジン２０ｍｌの
混合液を９５％エタノールに希釈して１ｌとしたもの）
３５ｍｌを加えた。この懸濁液（以下サンプルと呼ぶ）
を、ＣＡ-１を入れずに０．５規定塩酸ヒドロキシルア
ミン溶液１０ｍｌとピリジンブロムフェノールブルー溶
液３５ｍｌを加えたもの（以下ブランクと呼ぶ）と併せ
て超音波洗浄器内に１５分間放置した。サンプルとブラ
ンクを取り出し、サンプルの呈する色がブランクと同じ
になるまで０．１規定水酸化ナトリウム-メタノール溶
液を滴下した。この際滴下した水酸化ナトリウム量をＷ
₁ｍｌ、力価をＦ₁とすると、アルデヒド含量ｘ₁ｍｅｑ
／ｍｌは次式によって得られる。 ｘ₁＝（０．１×Ｆ₁×Ｗ₁）／Ｖ₁

【００４２】テトラエチレンペンタミン６２部をｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０００部（容量）に溶解させてお
き、これに上記で得たＣＡ-１を２５０部（容量）添加
して撹拌しながら２５℃で、１８時間反応させた。この
反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐ
Ｈ９．０の炭酸緩衝液５０００部（容量）に分散させ、
水素化ホウ素ナトリウム７０部を添加して２５℃で、１
８時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こう
してテトラエチレンペンタミン由来のアミノ基含量０．
９８ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］-［テトラエチレン
ペンタミン］（Ｃｅｎ-１）を得た。アミノ基の定量は
以下の方法によって行った。Ｃｅｎ-１約０．１ｍｌを
正確に秤量し（この量をＶ₂ｍｌとする）、０．１規定
塩酸水溶液１０ｍｌ（力価をＦ₂とする）を加え、この
懸濁液をジオキサンで希釈して全量で４０ｍｌにする
（この懸濁液を以下サンプルと呼ぶ）。サンプルを約３
０分撹拌した後、自動滴定装置（平沼産業製ＣＯＭＴＩ
ＴＥ１０１）を用いて０．１規定水酸化ナトリウム水溶
液（力価をＦ₂’とする）で滴定を行う。サンプルを中
和するまでに要した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液
の量をＷ₂ｍｌとすると、Ｃｅｎ-１のアミノ基含量ｘ₂
ｍｅｑ／ｍｌは次式によって得られる。 Ｖ₂×ｘ₂＋０．１×Ｆ₂’×Ｗ₂＝０．１×Ｆ₂×１０

【００４３】上記で得たＣｅｎ-１を１００部（容量）
取って、モレキュラーシーブを投入して脱水したＤＭＳ
Ｏ２０００部（容量）に分散させておき、これに分子量
４０００のＰＥＯトシレート６３０部を加えた。２５℃
で約１８時間撹拌して反応させ、生成物を回収、ジオキ
サンで充分に洗浄して［セルロース］-［ＰＥＯトシレ
ート］（ＣＰＥＯ-１）を得た。

【００４４】上記で得たＣＰＥＯ-１を１００部（容
量）取って、モレキュラーシーブを投入して脱水したＤ
ＭＳＯ２０００部（容量）に分散させておき、これに抗
ＬＤＬ抗体１０部を加えて２５℃で６時間撹拌して反応
させた。ここで用いた抗ＬＤＬ抗体は、以下の方法で得
た抗ヒトＬＤＬ抗体である。すなわち、ヒトＬＤＬを完
全アジュバントとともに注射により投与し免疫したレグ
ホンの鶏卵の卵黄部分を取り出し、その５倍量の０．１
％λカラギーナン水溶液を混合して１５００×ｇ，１０
分遠心分離し、その上清をＤＥＡＥクロマトグラフィお
よび塩析により精製した。生成物を回収、洗浄水がｐＨ
７．０になるまで充分にイオン交換水で洗浄して［セル
ロース］-［ＰＥＯトシレート］-［抗ＬＤＬ抗体］（Ｃ
ＰＥＯＩｇＹ-１）を得た。

【００４５】上記で得たＣＰＥＯＩｇＹ-１を８０部
（容量）取って１００ｍｌのカラムに充填し、１００Ｕ
／ｍｌのヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌ、続いて
１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌでカ
ラム内、および血液回路内を洗浄した。一方、クエン酸
加豚血１ｌをビーカーにとり、カラムを通して再びこの
ビーカーに戻すよう血液回路を組んだ。この装置を用い
て血液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで潅流実験を３時間連続し
て行い、カラム前後の血中ＬＤＬの量を測定した。ま
た、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白
量、血小板量を測定した。ＬＤＬの定量は和光純薬製β
−リポ蛋白Ｃ−テストワコーを用いてヘパリン沈澱・比
色法によって行った。アルブミン量はブロムクレゾール
グリーン法、総蛋白量はビウレット法、血小板量は自動
血球算定装置を用いて定量した。結果は表１、表２に示
した。なお、ＬＤＬの量は実際の測定値、アルブミン、
総蛋白、血小板については残存率で表示した。

【００４６】

【表１】 表１中、単位はｍｇ／ｄｌで示す。

【００４７】

【表２】 表２中、残存率は３時間灌流後の濃度（ｍｇ／ｄｌ）を
灌流前の濃度で除した値に１００を乗じたものである。
ただし、血小板については濃度ではなく個数（個／ｍ
ｌ）から算出したものである。（以下の表３においても
同様）。

【００４８】〈実施例２〉実施例１で得たＣＰＥＯ-１
を１００部（容量）取り、モレキュラーシーブを投入し
て脱水したＤＭＳＯ２０００部（容量）に分散させてお
き、これに市販ヒトハプトグロビン溶液（２０Ｕ／ｍ
ｌ；ミドリ十字社製）２００部（容量）を加えて２５℃
で６時間撹拌して反応させた。生成物を回収、充分にイ
オン交換水で洗浄し、これにｐＨ８．０のモノエタノー
ルアミン含有炭酸緩衝液２００部（容量）を添加し、２
５℃で３時間撹拌して過剰のトシル酸エステルをブロッ
クした。反応混合物を濾過して生成物を回収し、ｐＨ
８．３のリン酸緩衝液、０．５Ｍの食塩を含有する０．
００２Ｍ酢酸緩衝液で交互に洗浄、最後にｐＨ７．２の
リン酸緩衝液で洗浄し、［セルロース］-［ＰＥＯトシ
レート］-［ハプトグロビン］（ＣＰＥＯＨｐ-２）を得
た。

【００４９】上記で得たＣＰＥＯＨｐ−２を８０部取っ
て１００ｍｌのカラムに充填し、１００Ｕ／ｍｌのヘパ
リンを含む生理食塩液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌの
ヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌでカラム内、およ
び血液回路内を洗浄した。一方、抗ヒトハプトグロビン
抗体を固定化した担体を用いて、ヒト全血からヒト遊離
ハプトグロビンを除去したクエン酸加ハプトグロビンフ
リー血に、ヒト遊離ヘモグロビンを５０ｍｇ／ｄｌ添加
し、これを１ｌビーカーに取って、カラムを通して再び
このビーカーに戻すよう血液回路を組んだ。この装置を
用いて血液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで潅流実験を１時間連
続して行い、カラム後の血中ヒト遊離ヘモグロビン量を
測定した。また、潅流開始前後の全血液中のアルブミン
量、総蛋白量、血小板量を測定した。遊離ヘモグロビン
量はテトラメチルベンジジン法により定量した。アルブ
ミン量はブロムクレゾールグリーン法、総蛋白量はビウ
レット法、血小板量は自動血球算定装置を用いて定量し
た。結果は表３に示した。なお、アルブミン、総蛋白、
血小板については残存率で表示した。

【００５０】

【表３】

【００５１】〈実施例３〉実施例１で得たＣＰＥＯ-１
を５０部（容量）取り、モレキュラーシーブを投入して
脱水したＤＭＳＯ３５０部（容量）と、同様に脱水した
ピリジン１５０部（容量）の混液に分散させておき、こ
れにバチルス属由来のアミラーゼを６０００単位（ＪＩ
Ｓ Ｋ−７００１による糖化力）添加し、１０℃で４時
間撹拌して反応させた。生成物を回収、充分にイオン交
換水で洗浄し、これにｐＨ８．０のモノエタノールアミ
ン含有炭酸緩衝液１００部（容量）を添加し、１０℃で
１時間撹拌して過剰のアルデヒド基をブロックした。反
応混合物を濾過して生成物を回収し、充分に水洗して
［セルロース］-［ＰＥＯトシレート］-［アミラーゼ］
（ＣＰＥＯＡｍ-３）を得た。この反応に用いたアミラ
ーゼは、新規にスクリーニングを行って得られたバチル
ス属由来のもので、耐アルカリ性を有している（至適ｐ
Ｈは８から９）。

【００５２】上記で得られたＣＰＥＯＡｍ-３を、可溶
性デンプンを０．１％の濃度で溶解させた緩衝液に分散
させ、３７℃で３０分撹拌後、濾過を行い、濾液におけ
る加水分解度によってＣＰＥＯＡｍ-３におけるアミラ
ーゼ活性を測定した。活性測定は、反応溶液にヨウ素-
ヨウ化カリウム水溶液を加え、その吸光度低下率から算
出した。結果は表４に示した。なお、固定化酵素の活性
は固定を行っていない遊離アミラーゼのｐＨ８．５にお
ける活性を１００として百分率によって表示した。

【００５３】

【表４】 表４中のＦｒｅｅは、担体への固定をしていないアミラ
ーゼを示す。

【００５４】上記で得られたＣＰＥＯＡｍ−３をｐＨ１
０の緩衝液に分散させて撹拌し、経過時間と活性との関
係を測定した。結果は図１に示す。活性は、処理前の遊
離アミラーゼの活性を１００として、相対値で表示し
た。

【００５５】〈比較例１〉実施例１で得たＣｅｎ-１を
１００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２４０
０部（容量）に分散させておき、２５％グルタルアルデ
ヒド水溶液５０部を加えた。炭酸ナトリウムと重炭酸ナ
トリウムを適当に加えてｐＨを９．５に調節して、２５
℃で約１８時間撹拌して反応させた。生成物を回収、洗
浄水がｐＨ７．０になるまで充分にイオン交換水で洗浄
して［セルロース］-［グルタルアルデヒド］（ＣＧ-
４）を得た。

【００５６】上記で得たＣＧ-４を１００部（容量）取
ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２４００部（容量）に分散
させておき、これに抗ＬＤＬ抗体１０部を加えて２５℃
で６時間撹拌して反応させた。ここで用いた抗ＬＤＬ抗
体は、実施例１で用いたのと同じものである。生成物を
回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分にイオン交換
水で洗浄して含シッフ塩基［セルロース］-［グルタル
アルデヒド］-［抗ＬＤＬ抗体］（ｓ-ＣＧＩｇＹ-４）
を得た。

【００５７】上記ｓ-ＣＧＩｇＹ-４を１００部（容量）
取ってｐＨ９．０の炭酸緩衝液２４００部（容量）に分
散させておき、これに水素化ホウ素ナトリウム３０部を
加えて２５℃で４時間撹拌して反応させた。生成物を回
収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分にイオン交換水
で洗浄して［セルロース］-［グルタルアルデヒド］-
［抗ＬＤＬ抗体］（ＣＧＩｇＹ-４）を得た。

【００５８】上記で得たＣＧＩｇＹ-４のＬＤＬ吸着
能、アルブミン、総蛋白、血小板の残存率を実施例１と
同様の方法で評価した。結果は表１、表２に示した。

【００５９】〈比較例２〉実施例１で得たＣｅｎ-１を
１００部（容量）取ってｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２
０００部（容量）に分散させておき、Ｎ-シクロヘキシ
ル-Ｎ'-(２-モルホリノエチル)カルボジイミド-メト-ｐ
-トルエンスルホン酸塩０．２部、抗ＬＤＬ抗体１０部
を加えて、２５℃で約６時間撹拌して反応させた。ここ
で用いた抗ＬＤＬ抗体は、実施例１で用いたのと同じも
のである。生成物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるま
で充分にイオン交換水で洗浄して［セルロース］-［抗
ＬＤＬ抗体］（ＣＩｇＹ-５）を得た。

【００６０】上記で得たＣＩｇＹ-５のＬＤＬ吸着能、
アルブミン、総蛋白、血小板の残存率を実施例１と同様
の方法で評価した。結果は表１、表２に示した。

【００６１】〈比較例３〉比較例１で得たＣＧ-４を１
００部（容量）取り、ｐＨ８．５の炭酸緩衝液２４００
部（容量）に分散させておき、これに市販ヒトハプトグ
ロビン溶液（２０Ｕ／ｍｌ；ミドリ十字社製）２００部
（容量）を加えて２５℃で６時間撹拌して反応させた。
生成物を回収、充分にイオン交換水で洗浄して含シッフ
塩基［セルロース］-［グルタルアルデヒド］-［ハプト
グロビン］（ｓ-ＣＧＨｐ-６）を得た。

【００６２】上記ｓ-ＣＧＨｐ-６を１００部（容量）取
ってｐＨ８．０のモノエタノールアミン含有炭酸緩衝液
２００部（容量）を添加し、２５℃で３時間撹拌して過
剰のアルデヒド基をブロックした。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、充分に水洗した後、ｐＨ８．５の炭
酸緩衝液２４００部（容量）に分散させておき、これに
水素化ホウ素ナトリウム３０部を加えて２５℃で４時間
撹拌して反応させた。生成物を回収、これをｐＨ８．３
のリン酸緩衝液、０．５Ｍの食塩を含有する０．００２
Ｍ酢酸緩衝液で交互に洗浄、最後にｐＨ７．２のリン酸
緩衝液で洗浄し、［セルロース］-［グルタルアルデヒ
ド］-［ハプトグロビン］（ＣＧＨｐ-６）を得た。

【００６３】上記で得たＣＧＨｐ-６の性能を実施例２
と同様の方法で評価した。結果は表３に示した。 〈比較例４〉実施例１で得たＣｅｎ-１を１００部（容
量）取り、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２０００部（容
量）に分散させておき、Ｎ-シクロヘキシル-Ｎ'-(２-モ
ルホリノエチル)カルボジイミド-メト-ｐ-トルエンスル
ホン酸塩０．２部、市販ヒトハプトグロビン溶液（２０
Ｕ／ｍｌ；ミドリ十字社製）２００部（容量）を加えて
２５℃で６時間撹拌して反応させた。生成物を回収、充
分にイオン交換水で洗浄して含シッフ塩基［セルロー
ス］-［ハプトグロビン］（ＣＨｐ-７）を得た。

【００６４】上記で得たＣＨｐ-７の性能を実施例２と
同様の方法で評価した。結果は表３に示した。 〈比較例５〉比較例１で得たＣＧ-４を５０部（容量）
取り、ｐＨ８．５の炭酸緩衝液１０００部（容量）に分
散させておき、バチルス属由来のアミラーゼを６０００
単位（ＪＩＳ Ｋ−７００１による糖化力）を添加し、
１０℃で４時間撹拌して反応させた。ここで用いたアミ
ラーゼは実施例３で用いたのとおなじものである。生成
物を回収、充分にイオン交換水で洗浄して含シッフ塩基
［セルロース］-［グルタルアルデヒド］-［アミラー
ゼ］（ｓ-ＣＧＡｍ-８）を得た。

【００６５】上記ｓ-ＣＧＡｍ-８を５０部（容量）取っ
てｐＨ８．０のモノエタノールアミン含有炭酸緩衝液１
００部（容量）を添加し、１０℃で１時間撹拌して過剰
のアルデヒド基をブロックした。反応混合物を濾過して
生成物を回収し、充分に水洗した後、ｐＨ８．５の炭酸
緩衝液１２００部（容量）に分散させておき、これに水
素化ホウ素ナトリウム１５部を加えて１０℃で４時間撹
拌して反応させた。生成物を回収、イオン交換水で充分
に洗浄し、［セルロース］-［グルタルアルデヒドアル
デヒド］-［アミラーゼ］（ＣＧＡｍ-８）を得た。上記
で得られたＣＧＡｍ-８の性能を、実施例３と同様の方
法で評価した。結果は表４、図１に示した。

【００６６】〈比較例６〉実施例１で得たＣｅｎ-１を
５０部（容量）取り、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液１０
００部（容量）に分散させておき、Ｎ-シクロヘキシル-
Ｎ'-(２-モルホリノエチル)カルボジイミド-メト-ｐ-ト
ルエンスルホン酸塩０．２部、バチルス属由来のアミラ
ーゼを６０００単位（ＪＩＳ Ｋ−７００１による糖化
力）を添加し、１０℃で４時間撹拌して反応させた。こ
こで用いたアミラーゼは実施例３で用いたのとおなじも
のである。生成物を回収、充分にイオン交換水で洗浄し
て［セルロース］-［アミラーゼ］（ＣＡｍ-９）を得
た。上記で得られたＣＧＡｍ-８の性能を、実施例３と
同様の方法で評価した。結果は表４、図１に示した。

【００６７】表１〜４、および図１から明らかなよう
に、本発明の生理活性物質固定化担体は生理活性物質の
持つ活性を充分に保持したまま簡便に固定化することが
可能であることがわかった。これは親水性スペーサーに
よってもたらされる効果が大きいと考えることができ
る。生理活性物質固定化担体が主として水系溶媒中で使
用されることに着目し、生理活性物質の溶媒中における
モービリティー向上を実現するために親水性スペーサー
を導入したことが妥当であったと考えられる。特に血液
処理の分野に本発明の生理活性物質固定化担体を用いた
場合、親水性スペーサーの排除体積効果によってアルブ
ミン、血小板等の吸着が抑制され、良好な血液適合性が
実現された。

【００６８】

【発明の効果】本発明の生理活性物質固定化担体は、両
末端にトシル酸エステルを有する親水性スペーサーを介
して生理活性物質を固定化しているため、水系溶媒中に
おける生理活性物質のモービリティーが増し、生理活性
物質の持つ活性が充分に発揮される。特に、本発明の生
理活性物質固定化担体を血液処理の分野に応用した場
合、親水性スペーサーの排除体積効果によって良好な血
液適合性をも実現される。また、本発明の生理活性物質
固定化担体は共有結合によって生理活性物質を固定化し
ているため、吸着法や包括法でしばしば見られる生理活
性物質の遊離もない。さらに、本発明ではカルボジイミ
ドなどの縮合剤を使用しないので、こういった縮合剤に
よる生理活性物質の変性を招くこともない。また、活性
の大きいトシル酸エステルによって固定化を行っている
ので、固定化率の向上を期待できる。このようなことか
ら、本発明により簡便な操作で効果的に生理活性物質固
定化担体を得ることができ、化学反応触媒、分離精製用
特異的吸着材、臨床検査材料、医療用材料など広範な分
野への応用が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例、比較例での固定化担体のＰＨ１０での
活性と経過時間との関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 求核性を有する置換基を分子内に含有す
   る水不溶性固体表面に、両末端がp-トルエンスルホン酸
   エステルとなった親水性スペーサーを作用させて、該親
   水性スペーサーの末端にあるp-トルエンスルホン酸エス
   テルと求核性置換基の反応により親水性スペーサーを固
   定し、さらに該親水性スペーサーの他端にあるp-トルエ
   ンスルホン酸エステルを、生理活性物質に含まれる求核
   性置換基と同様の反応を行わせて固定化することを特徴
   とする生理活性物質固定化担体の製造法。
2. 【請求項２】 両末端がp-トルエンスルホン酸エステル
   となった親水性スペーサーが下記の化１の構造を有する
   化合物であることを特徴とする請求項１記載の生理活性
   物質固定化担体の製造法。 【化１】 化１において、 Ｔs＝p-ＣＨ₃(Ｃ₆Ｈ₄)ＳＯ₂− ｎ＝０〜１０の整数 ｍ＝５〜３００の整数 ｌ＝１ま
   たは２ Ｒ¹、Ｒ²は水素原子またはメチル基で、それぞれ同じも
   しくは異なってもよいことを示す。