JPH05285381A - 低比重リポタンパク質吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血液を直接潅流することによって血液の凝
固、血球成分の破壊、減少等の弊害を及ぼすことのない
血液適合性を有し、血中の低比重リポ蛋白質および（ま
たは）極低比重リポ蛋白質を選択的、簡便、かつ効果的
に吸着することのできる吸着能、吸着特性を備えた低比
重リポ蛋白質吸着材を提供する。 【構成】 水不溶性固体表面に、Ｎ−スルホＰＥＩをス
ルファミノ基由来の酸含量が５０μｅｑ／ｍｌから２．
０ｍｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）となるよう固定し、これに
よって血中の低比重リポ蛋白質および（または）極低比
重リポ蛋白質を除去することを特徴とする低比重リポ蛋
白質吸着材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化、高脂血症の病
因物質である低比重リポタンパク質（以下ＬＤＬと略記
する）および（または）極低比重リポタンパク質（以下
ＶＬＤＬと略記する）を吸着除去し、疾病を治療するこ
とを目的とし、血液もしくは血液成分を接触させること
によって血中のＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを吸着
する低比重リポタンパク質吸着材に関するものである。
本発明において、Ｎ−スルホポリエチレンイミン（以下
Ｎ−スルホＰＥＩと略記する）とは、下記化１の構造を
有する化合物を指す。

【０００２】

【化１】 化１におけるＸは、ＨまたはＮａ等塩形成基である。

【０００３】また、本発明において、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ₃
Ｈ、−ＮＨＳＯ₃Ｈ、およびこれらの塩をいずれもスル
ファミノ基と呼ぶ。（ただしＲは、ポリエチレンイミン
残基を示す。）

【０００４】

【従来の技術】動脈硬化の原因となる高脂血症の治療に
は各種薬剤の使用が行われているが、一般に副作用の危
険性があり、使用量、使用期間などに細心の注意を払う
必要がある。また、正常値の数倍のＬＤＬおよび（また
は）ＶＬＤＬ値を示し、最も重篤な症状を招く危険性の
ある家族性高脂血症（ＦＨ）では薬剤の効果が充分に期
待できない場合も多い。

【０００５】他の治療方法としては血漿交換法が有効と
され、広く行われている。しかしながら、この療法では
血漿をすべて交換するため、（１）不要成分のみなら
ず、必要な成分までも除去されてしまうこと、（２）除
去した血漿に替えて体内に補充される血漿、あるいは血
漿製剤が不足しているため、大量かつ持続的な入手が困
難であること、（３）血清肝炎やアレルギー、さらには
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）感染の危険性がある
こと、など血漿交換法が内含する問題は多い。

【０００６】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輪注する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採るにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因物
質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及び
血液浄化療法が望まれていた。

【０００７】こういった状況を背景として、近年、ＬＤ
Ｌおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除去による療法が一
般的になってきた。このような方法は例えば、アガロー
スゲルにヘパリンを固定した吸着材（Ｓ．Ｍｏｏｒｊａ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，
７７（１９７７）２１−３０）などが知られているが、
この材料は吸着能力が充分でなく、機械的強度について
も充分とは言い難い。また、抗体等を固定した免疫吸着
体を利用してＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除
去を行う試みがなされているが、吸着選択性、吸着能力
の面では満足できるものの、抗体の入手が困難で高価で
あるという欠点がある。

【０００８】このような問題点を改善する目的で供せら
れた吸着材には、有害成分と親和性をもつ素材（シリカ
など）を多孔化したもの（特開昭５９−１３９９３５，
特開昭６３−１６０６６９など）、有害成分と親和性を
有する化合物（リガンド：スルホン酸基，カルボキシル
基など）を固定したものがある。後者はいわゆるアフィ
ニティー吸着材と呼ばれるもので、さらに次のふたつに
大別できる。 （１）不溶性担体にリガンドとしてポリアニオンを固定
したもの（特公昭６２−５９９７５，特開平１−１４５
０７１，リガンドをデキストラン硫酸に限定：特公平３
−５８２２，リガンドをヘパリンに限定：特開昭５９−
１３９９３７など） （２）不溶性担体にリガンドとしてスルホン酸基および
（または）カルボキシル基をもつ単量体を固定したもの
（特公平２−５１３４６，特開昭５８−２７５５９な
ど）

【０００９】アフィニティー吸着材に用いられるリガン
ドは比較的安価で、選択性、吸着能力も比較的満足でき
るレベルにあるが、これらの吸着材は血液適合性に乏し
いため、多量のヘパリンの添加が必要となり、出血傾向
等の副作用が生じる可能性を残している。このような点
から、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除去する
ことができ、また体液に対する悪影響の少ない浄化材が
望まれている。

【００１０】ＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ以外の物
質を吸着する吸着材に目を向けてみると、例えば、特開
平１−１５８９７０という特許にはこのような概念に基
づいて開発された血液浄化材について開示されている。
この特許によって開示されている血液浄化材は、重合度
１〜９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペ
ーサーを介して、リガンドとなる低分子有機化合物を水
不溶性多孔質固体表面に固定し、これに直接血液を潅流
して免疫グロブリンを吸着することを特徴としている。

【００１１】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でないタンパク質の付着を防止することであ
る。親水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。
このため吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血
球成分の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水
の層を形成するスペーサーが運動することにより、さら
に血球成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱
離しやすくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制
されるといった利点を有する。

【００１２】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質とリガンド
の接近が困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやすく、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。

【００１３】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているが、このスペーサーの持つ効果は本
質的にエチレンオキサイド骨格を有する物質に限られた
ものではない。スペーサーが長鎖の親水性化合物であれ
ば、排除体積効果等による血液適合性の向上は期待でき
る。

【００１４】さらに、重合度が９０までのエチレンオキ
サイド骨格を有する親水性スペーサーを導入しただけで
は、充分な血液適合性を実現するのは困難であり、特開
平１−１５８９７０においても血液適合性向上のためア
クリル酸誘導体のコーティングを行っている。このよう
な操作は煩雑であるばかりでなく、毒性をもった物質の
溶出を招く可能性も存在する。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、リガンドの効果を充分に引き出して、
良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等の煩雑
な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った血液浄
化吸着材を提供することにより、副作用がなく、自己の
血液からＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを充分且つ選
択的に除去することのできる効果的な吸着材を提供しよ
うとしたものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明の低比重リポタン
パク質吸着材は、水不溶性固体にＮ−スルホＰＥＩをス
ルファミノ基由来の酸含量が５０μｅｑ／ｍｌ（湿潤状
態）〜２．０ｍｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）となるよう固定
し、これによって血中の低比重リポタンパク質および
（または）極低比重リポタンパク質を除去することを特
徴とするものである。本発明の血液浄化吸着材は、水不
溶性固体がポリスチレン、架橋ポリビニルアルコール、
ポリメタクリル酸およびその誘導体或いはこれらの共重
合体などの合成有機高分子化合物、セルロース、キチ
ン、キトサン等の天然有機高分子化合物、またはアシル
セルロース、アシルキチン等の改質天然有機高分子化合
物であることが好ましい。これらの高分子化合物のう
ち、機械的強度、リガンド導入の容易さを考慮すると、
適度に架橋したポリスチレン、ポリメタクリル酸および
その誘導体或いはこれらの共重合体、セルロースが望ま
しく、さらに好ましくはセルロースが望ましい。

【００１７】本発明に用いられる以下Ｎ−スルホＰＥＩ
は分子量１００〜３０００００が望ましく、好ましくは
３００〜１０００００が望ましい。これよりも分子量が
小さいと血液適合性、吸着性能とも充分に得られず、こ
れよりも大きいと導入率が低下する傾向にあり、性能の
向上は望めない。

【００１８】本発明でのＮ−スルホＰＥＩ導入は、ポリ
エチレンイミン（以下ＰＥＩと略記する）を水不溶性固
体に導入した後アミノ基、イミノ基をスルホン化する方
法、あらかじめアミノ基、イミノ基をスルホン化したＰ
ＥＩを水不溶性固体に導入する方法、いずれも用いられ
得る。前者を採用する場合、Ｎ−スルホＰＥＩに含まれ
るアミノ基、イミノ基のスルホン化率は３０％以上、好
ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上が望
ましい。後者を採用する場合、ＰＥＩのスルホン化率は
３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは
７０％以上が望ましいが、ＰＥＩのアミノ基、イミノ基
が全てスルホン化されてしまうと（スルホン化率１００
％）、残存のアミノ基、イミノ基を利用して水不溶性固
体に化学結合により導入することが不可能になるので好
ましくない。しかしながら、残存アミノ基、イミノ基が
大量に存在するとＬＤＬ吸着に好ましくない影響を与え
る可能性があるので、水不溶性固体への固定が終了した
時点で残存アミノ基、イミノ基が全体の１０％以下であ
ることが望ましい。これを超える量の残存アミノ基、イ
ミノ基が存在する場合、無水酢酸、無水コハク酸、１，
３−プロパンスルトンなどによってブロックすることが
推奨される。本発明でのＰＥＩのＮ−スルホン化にはク
ロロスルホン酸、濃硫酸、発煙硫酸、三酸化硫黄／ジメ
チルホルムアミド錯体、三酸化硫黄／ピリジン錯体など
が用いられ得るが、このなかで、三酸化硫黄／ピリジン
錯体が好ましい。なお、上記スルホン化率は、スルホン
化前後のＰＥＩに含まれるアミノ基、イミノ基を滴定す
る方法、もしくは元素分析で窒素と硫黄の含量を定量す
ることによって測定することができる。

【００１９】本発明のＮ−スルホＰＥＩはＬＤＬおよび
（または）ＶＬＤＬとの親和性によってこれを吸着除去
するリガンドとしてだけではなく、上記の特開平１−１
５８９７０で開示されている親水性スペーサーとしての
働きをも有している。水不溶性固体表面との結合点近傍
のＮ−スルホＰＥＩ鎖は主に親水性スペーサーとして血
液適合性の向上およびリガンドの運動性向上に貢献し、
水不溶性固体表面から比較的遠距離にあるＮ−スルホＰ
ＥＩはリガンドとしてＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ
の吸着除去の役割を有する。しかしながら、リガンドの
運動性を向上させ、より良好なＬＤＬおよび（または）
ＶＬＤＬの吸着能、血液適合性を実現させるために、ス
ペーサーを介してＮ−スルホＰＥＩを水不溶性固体に固
定することも、本発明において制限を受けるものではな
い。

【００２０】また、Ｎ−スルホＰＥＩは抗凝血剤として
よく知られているヘパリンの機能を示す類似物（ヘパリ
ノイド）としての働きも有する。ヘパリンの基本骨格は
Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸であり、このアミ
ノ基と一部の水酸基がスルホン化された構造を持ってい
る。これらの構造のなかで、特にスルファミノ基が抗凝
血性に大きく寄与している。従って、スルファミノ基を
多数分子内に有するＮ−スルホＰＥＩはヘパリノイドと
して大きな効果が期待できる。したがって、特開平１−
１５８９７０ではいまだ不十分であった血液適合性の実
現が可能となる。

【００２１】このようなヘパリノイドの抗凝血性を議論
する際に忘れてならないのが、毒性であるが、本発明に
おいてはＮ−スルホＰＥＩを水不溶性固体表面に固定し
ているため、抗凝血剤として直接投与する場合に比べて
その危険性は極端に減少する。また、毒性はＮ−スルホ
ＰＥＩの鎖長、分子量にも大きく影響を受ける。前に記
載したような範囲の分子量のＮ−スルホＰＥＩを水不溶
性固体表面上に固定した場合、万一Ｎ−スルホＰＥＩが
脱離して血中に遊離しても、重篤な副作用を招く恐れは
小さい。

【００２２】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の減少、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、さらに調製の容易さか
ら、球状であることが望ましい。同じ理由から、繊維状
担体の繊維直径は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは
０．３μｍから２５μｍが望ましく、さらに好ましくは
０．５μｍから１５μｍが望ましい。

【００２３】担体表面には有効表面積を拡大するため微
小孔が存在することが好ましい。その平均孔径は粒子状
担体の場合、２０Åから２００００Å、好ましくは１０
０Åから１５０００Å、更に好ましくは１０００Åから
１２０００Å、繊維状担体の場合２０Åから３０００
Å、好ましくは１００Åから２０００Åである。これよ
り平均孔径が小さいと被吸着物質が微小孔内部まで到達
できず、これより大きいと有効表面積を拡大する効果が
不十分であり、また担体の強度低下を招く恐れがある。

【００２４】本発明に使用される水不溶性固体へのＮ−
スルホＰＥＩの導入の方法は共有結合、電子線照射によ
るグラフト化など、特に制限されないが、［セルロー
ス］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］を得る場合、以下のような
方法が好ましい。 セルロースにＰＥＩを導入した後、このＰＥＩのアミ
ノ基、イミノ基をスルホン化する方法 （１）セルロースの改質 過沃素酸ナトリウムを０．１規定から５．０規定好まし
くは０．５規定から１．５規定の硫酸に溶解した溶液
に、平均粒径２０μｍから２００μｍ、好ましくは３０
μｍから７０μｍ、平均孔径５００Åから１００００
Å、好ましくは１０００Åから８０００Åの粒状多孔質
セルロースを添加し、１０℃から５０℃、好ましくは２
０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１
０時間から２４時間反応させる。上記過沃素酸ナトリウ
ム−硫酸溶液の過沃素酸ナトリウム濃度は１重量％から
１５重量％、好ましくは３重量％から１０重量％であ
る。また、上記粒状多孔質セルロースの過沃素酸ナトリ
ウム溶液への浴比は１０容量％から３０容量％、好まし
くは１５容量％から２５容量％である。この反応混合物
を濾過して生成物を回収し、充分に水洗して、膨潤状態
でアルデヒド含量０．０５０ｍｅｑ／ｇから２．００ｍ
ｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．１０ｍｅｑ／ｇから１．５
０ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセルロースを得る。このア
ルデヒドセルロースは下記化２にその要部構造を示すよ
うに、一部のグルコースユニットが開環した構造をして
いる。

【００２５】

【化２】

【００２６】（２）ＰＥＩの導入 分子量１００〜２０００００、好ましくは３００〜１０
００００のＰＥＩをｐＨ９．５の緩衝液に溶解させてお
き、これに上記（１）で得たアルデヒドセルロースを添
加して撹拌しながら１０℃から５０℃好ましくは２０℃
から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０時
間から２４時間反応させる。上記ＰＥＩ-緩衝液の濃度
は０．２重量％から５．０重量％、好ましくは０．４重
量％から３．０重量％、この溶液へのアルデヒドセルロ
ースの浴比は３容量％から２０容量％、好ましくは５容
量％から１５容量％である。この反応混合物を濾過して
生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分
散させ、水素化ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から
５０℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０
時間、好ましくは１０時間から２４時間反応させてシッ
フ塩基の水素添加を行う。含シッフ塩基［セルロース］
−［ＰＥＩ］の緩衝液への浴比は３容量％から２０容量
％、好ましくは５容量％から１５容量％、含シッフ塩基
［セルロース］−［ＰＥＩ］と水素化ホウ素ナトリウム
の仕込比は２０／１から３／２、好ましくは１５／１か
ら３／１（いずれも容量／重量比）である。こうしてア
ミノ基含量０．０１０から２．５０ｍｅｑ／ｍｌ、好ま
しくは０．０５０から１．５０ｍｅｑ／ｍｌの［セルロ
ース］−［ＰＥＩ］を得る。

【００２７】（３）ＰＥＩのＮ-スルホン化 上記（２）で得た［セルロース］−［ＰＥＩ］に水を１
／３から１／１２好ましくは１／５から１／１０の容量
比となるよう加えて分散させ、これに濃度が１０重量％
から５０重量％、好ましくは２０重量％から４０重量％
の水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応溶液のｐＨを９
〜１０に調整し、さらに三酸化硫黄／ピリジン錯体を少
量ずつ加えてゆき、前記の水酸化ナトリウム水溶液を少
しずつ添加してｐＨを９〜１０に保ち、１０℃から５０
℃好ましくは２０℃から３０℃で、０．５時間から１２
時間、好ましくは１時間から８時間反応させる。反応混
合物から生成物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで
充分に洗浄して［セルロース］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］
を得る。［セルロース］−［ＰＥＩ］／水懸濁液と、こ
れに加える水酸化ナトリウム水溶液との容量比は３／１
から２０／１、好ましくは７／１から１５／１、［セル
ロース］−［ＰＥＩ］／水懸濁液と三酸化硫黄／ピリジ
ン錯体の仕込比は５／１から３０／１、好ましくは１０
／１から２５／１（いずれも容量／重量比）である。

【００２８】あらかじめアミノ基、イミノ基をスルホ
ン化したＰＥＩを水不溶性固体表面に導入する方法 （１）ＰＥＩのＮ−スルホン化 分子量１００〜２０００００、好ましくは３００〜１０
００００のＰＥＩに水を１／３から１／１２好ましくは
１／５から１／１０の重量比となるよう加えて溶解さ
せ、これに濃度が１０重量％から５０重量％、好ましく
は２０重量％から４０重量％の水酸化ナトリウム水溶液
を加えて反応溶液のｐＨを９〜１０に調整し、さらに三
酸化硫黄／ピリジン錯体を少量ずつ加えてゆき、前記の
水酸化ナトリウム水溶液を少しずつ添加してｐＨを９〜
１０に保ち、１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３
０℃で、０．５時間から１２時間、好ましくは１時間か
ら８時間反応させる。こうして得られたＮ−スルホＰＥ
Ｉのスルホン化率は３０％から９９％、好ましくは５０
％から９５％、さらに好ましくは７０％から９５％であ
る。この反応混合物はそのままセルロースへの導入反応
に使用できるが、充分な精製を要する場合は、反応混合
物を約１／３の容量に濃縮した後、セルロース半透膜に
入れて蒸留水で透析することにより低分子量の不純物を
除去し、これを濃縮乾固させればよい。ＰＥＩ水溶液
と、これに加える水酸化ナトリウム水溶液との重量比は
３／１から２０／１、好ましくは７／１から１５／１、
キトサンと三酸化硫黄／ピリジン錯体の仕込比は１／３
から１０／１、好ましくは２／３から５／１（いずれも
重量比）である。

【００２９】（２）セルロースへのＮ−スルホＰＥＩの
導入 上記（１）で得たＮ−スルホＰＥＩをｐＨ９．５の緩
衝液に溶解させておき、これに上記（１）の方法で得
たアルデヒドセルロースを添加して撹拌しながら１０℃
から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から
３０時間、好ましくは１０時間から２４時間反応させ
る。上記Ｎ−スルホＰＥＩ−緩衝液の濃度は０．２重量
％から５．０重量％、好ましくは０．４重量から３．０
重量％、この溶液へのアルデヒドセルロースの浴比は３
容量％から２０容量％、好ましくは５容量％から１５重
量％である。この反応混合物を濾過して生成物を回収、
水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０℃好ましく
は２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましく
は１０時間から２４時間反応させてシッフ塩基の水素添
加を行う。含シッフ塩基［セルロース］−［Ｎ-スルホ
ＰＥＩ］の緩衝液への浴比は３から２０容量％、好まし
くは５から１５容量％、含シッフ塩基［セルロース］−
［Ｎ−スルホＰＥＩ］と水素化ホウ素ナトリウムの仕込
比は１０／１から３／２、好ましくは７／１から３／１
（いずれも容量／重量比）である。この反応混合物から
生成物を回収し、水で充分洗浄して［セルロース］−
［Ｎ−スルホＰＥＩ］を得る。

【００３０】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の［水不溶性固体］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］を得
た後、これを適当な容器に充填することによって本発明
の血液浄化吸着材が得られる。容器の材質はガラス、ス
テンレス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボ
ネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等、
特に制限されないが、滅菌等の取扱いを考慮すると、ポ
リプロピレンやポリカーボネイトが好ましい。容器の形
態についても特に制限されないが、粒子状担体の場合は
両端を血液流入部、血液流出部とした円筒のカラム型、
繊維状担体の場合は粒子状担体の場合と同様のカラム
型、或いはシート状に成形した後、これを挟み込むよう
な形態にしたものが適当であろう。

【００３１】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は、特に注釈を加えない場合は重量部を意味
する。 〈実施例１〉 粒状多孔質セルロース（平均粒径５０μｍ、平均孔径５
０００Å）１０００部（容量）を、過沃素酸ナトリウム
１２５部を１規定−硫酸４０００部に溶解した溶液に添
加し、２５℃で１８時間反応させた後、濾別、水洗し、
アルデヒド含量０．９８ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセル
ロース（ＣＡ−１）を得た。アルデヒドの定量はオキシ
ム法によって行った。すなわち、ＣＡ−１約１．０ｍｌ
を正確に秤量し（この量をＶ₁ｍｌとする）、これに
０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液（塩酸ヒドロキ
シルアミン３５ｇを水１６０ｍｌに溶かし、９５％エタ
ノールで希釈して１ｌとしたもの）１０ｍｌ、ピリジン
ブロムフェノールブルー溶液（４％ブロムフェノールブ
ルー０．２５ｍｌとピリジン２０ｍｌの混合液を９５％
エタノールに希釈して１ｌとしたもの）３５ｍｌを加え
た。この懸濁液（以下サンプルと呼ぶ）を、ＣＡ-１を
入れずに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液１０ｍ
ｌとピリジンブロムフェノールブルー溶液３５ｍｌを加
えたもの（以下ブランクと呼ぶ）と併せて超音波洗浄器
内に１５分間放置した。サンプルとブランクを取り出
し、サンプルの呈する色がブランクと同じになるまで
０．１規定水酸化ナトリウム−メタノール溶液を滴下し
た。この際滴下した水酸化ナトリウム量をＷ₁ｍｌ、力
価をＦ₁とすると、アルデヒド含量Ｘ₁ｍｅｑ／ｇは次式
によって得られる。 Ｘ₁＝（０．１×Ｆ₁×Ｗ₁）／Ｖ₁

【００３２】上記で得たＣＡ−１を１００部（容量）取
ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２０００部（容量）に分散
させ、これに分子量１００００のＰＥＩ１２００部を加
えて撹拌しながら、２５℃で１８時間反応させた。この
反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗した後ｐＨ
８．０のモノエタノールアミン含有炭酸緩衝液を加えて
２５℃で３時間撹拌し、残存アルデヒド基をブロックし
た。この生成物を濾過して回収し、充分に洗浄してｐＨ
９．０の炭酸緩衝液２０００部（容量）に分散させ、水
素化ホウ素ナトリウム４０部を添加して２５℃で、１８
時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。生成物
を回収、イオン交換水で充分に洗浄してＰＥＩ由来のア
ミノ基含量１．８８ｍｅｑ／ｍｌ［セルロース］−［Ｐ
ＥＩ］（ＣＥ−１）を得た。アミノ基の定量は以下の方
法によって行った。ＣＥ−１約０．１ｍｌを正確に秤量
し（この量をＶ₂ｇとする）、０．１規定塩酸水溶液１
０ｍｌ（力価をＦ₂とする）を加え、この懸濁液をジオ
キサンで希釈して全量で４０ｍｌにする（この懸濁液を
以下サンプルと呼ぶ）。サンプルを約３０分撹拌した
後、自動滴定装置（平沼産業製ＣＯＭＴＩＴＥ１０１）
を用いて０．１規定水酸化ナトリウム水溶液（力価をＦ
₂'とする）で滴定を行う。サンプルを中和するまでに要
した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液の量をＷ₂ｍｌ
とすると、ＣＥ−１のアミノ基含量Ｘ₂ｍｅｑ／ｇは次
式によって得られる。 Ｖ₂×Ｘ₂＋０．１×Ｆ₂’×Ｗ₂＝０．１×Ｆ₂×１０

【００３３】上記で得たＣＥ-１を１００部（容量）取
ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液８５０部（容量）に分散さ
せ、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を少量ずつ添加
し、ｐＨを９〜１０に調整しながら三酸化硫黄／ピリジ
ン錯体５５部を２５℃で、少量ずつ４時間かけて加えて
ゆき、２５℃でさらに１時間撹拌した。ここで要した水
酸化ナトリウム水溶液は９０部（容量）であった。反応
混合物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分にイ
オン交換水で洗浄して、Ｎ−スルホＰＥＩに含まれるス
ルファミノ基由来の酸含量１．７６ｍｅｑ／ｍｌの［セ
ルロース］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］（ＣＳＥ−１）を得
た。酸含量の定量は以下の方法によって行った。サンプ
ルをＮ／１０過塩素酸水溶液で洗浄した後、イオン交換
水で洗浄水がｐＨ７．０になるまで充分に洗浄し、これ
を上記でＣＥ−１のアミノ基を定量したのと同様の方法
で、０．１規定塩酸水溶液を０．１規定水酸化ナトリウ
ム水溶液に、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液を０．
１規定過塩素酸−ジオキサン溶液にそれぞれ替えて測定
することによって定量した。

【００３４】上記で得たＣＳＥ-１を１００ｍｌのカラ
ムに充填し、１００Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生理食塩
液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生理
食塩液１００ｍｌでカラム内、および血液回路内を洗浄
した。一方、クエン酸加豚血１ｌをビーカーにとり、カ
ラムを通して再びこのビーカーに戻すよう血液回路を組
んだ。この装置を用いて血液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで潅
流実験を３時間連続して行い、カラム前後の血中ＬＤＬ
の量を測定した。また、潅流開始前後の全血液中のアル
ブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。ＬＤＬの定
量は和光純薬製β−リポ蛋白Ｃ−テストワコーを用いて
ヘパリン沈澱・比色法によって行った。アルブミン量は
ブロムクレゾールグリーン法、総蛋白量はビウレット
法、血小板量は自動血球算定装置を用いて定量した。結
果は表１、表２に示した。なお、ＬＤＬの量は実際の測
定値、アルブミン、総蛋白、血小板については残存率で
表示した。表１における単位ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬ（前）
はカラム流入直前の血中のＬＤＬ量、ＬＤＬ（後）はカ
ラム流出直後の血中ＬＤＬ量を示す。表２中の残存率
は、アルブミン総蛋白質については濃度で血小板につい
ては個数によって求めた。

【００３５】

【表１】

【００３６】

【表２】

【００３７】〈実施例２〉分子量１００００のＰＥＩ２
００部ｐＨ９．５の炭酸緩衝液６０００部（容量）に溶
解させておき、これに３０重量％の水酸化ナトリウム水
溶液を少量ずつ添加してｐＨを９〜１０に保ちながら、
三酸化硫黄／ピリジン錯体６５０部を２５℃で少量ずつ
５時間かけて加えてゆき、２５℃でさらに１時間撹拌し
た。ここで要した水酸化ナトリウム水溶液は２００部
（容量）であった。この反応混合物を容量が約１／３に
なるまで濃縮し、これを排除限界分子量１０００のセル
ロース製透析膜に入れ、イオン交換水を流しながら２４
時間透析を行った。この溶液を濃縮し、ｐＨ９．５の炭
酸緩衝液で再び希釈して濃度約２５０ｇ／ｌのＮ−スル
ホＰＥＩ（ＳＥ−２）溶液を得た。

【００３８】実施例１で得たＣＡ１１を１００部（容
量）取って、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液８００部（容量）
に分散させておき、これに上記で得たＳＥ−２溶液１２
００部（容量）を添加して撹拌し、２５℃で１８時間反
応させた。この反応混合物を濾過して生成物を回収、水
洗した後ｐＨ８．０のモノエタノールアミン含有炭酸緩
衝液を加えて２５℃で３時間撹拌し、残存アルデヒド基
をブロックした。

【００３９】上記の操作で得た生成物を濾過して回収
し、充分に洗浄して、これをｐＨ９．０の炭酸緩衝液に
分散させ、水素化ホウ素ナトリウム３０部を加えた。２
５℃で１８時間撹拌してシッフ塩基の水素添加を行っ
た。生成物を回収、イオン交換水で充分に洗浄して、ス
ルファミノ基由来の酸含量１．６５ｍｅｑ／ｍｌの［セ
ルロース］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］（ＣＳＥ−２）を得
た。酸含量の定量は実施例１でＣＳＥ−１のスルホン酸
含量を定量したのと同じ方法によって行った。

【００４０】上記［セルロース］−［Ｎ−スルホＰＥ
Ｉ］（ＣＳＥ−２）を用いて実施例１と同様に血液潅流
実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流開始前後
の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定
した。結果は表１、表２に示す。

【００４１】〈実施例３〉ジエチレントリアミン２７部
をｐＨ９．５の炭酸緩衝液２０００部（容量）に溶解さ
せておき、これに実施例１で得たＣＡ−１を１００部
（容量）添加して撹拌し、２５℃で１８時間反応させ
た。この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、
ｐＨ９．０の炭酸緩衝液２０００部に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウム３０部を添加して、２５℃で１８時間
反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。生成物を回
収、イオン交換水で充分に洗浄してアミノ基含量１．０
８ｍｅｑ／ｍｌのアミノ基導入セルロース（Ｃｅｎ−
３）を得た。アミノ基含量は実施例１と同様の方法で行
った。

【００４２】上記Ｃｅｎ−３を１００部取ってｐＨ９．
５の炭酸緩衝液２０００部（容量）に分散させておき、
これに６０％グルタルアルデヒド水溶液２５部を加え、
２５℃で１８時間撹拌して反応させた。この反応混合物
を濾過して回収、水洗し、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液８０
０部（容量）に分散させて、実施例２で得たＳＥ−２溶
液を１２００部加えた。２５℃で１８時間撹拌して反応
させた後、生成物を回収し、イオン交換水で洗浄した。
この生成物にｐＨ８．０のモノエタノールアミン含有炭
酸緩衝液を加えて２５℃で３時間撹拌し、残存アルデヒ
ド基をブロックした。

【００４３】上記操作で得た生成物をｐＨ９．０の炭酸
緩衝液２０００部に分散させ、水素化ホウ素ナトリウム
３０部を添加し、２５℃で１８時間反応させてシッフ塩
基の水素添加を行った。生成物を回収、イオン交換水で
充分に洗浄して、スルファミノ基由来の酸含量１．４２
ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］−［グルタルアルデヒ
ド］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］（ＣＧＳＥ−３）を得た。
酸含量の定量は実施例１と同様の方法で行った。

【００４４】上記［セルロース］−［グルタルアルデヒ
ド］−［Ｎ−スルホＰＥＩ］（ＣＧＳＥ−３）を用いて
実施例１と同様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血
中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、
総蛋白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示
す。

【００４５】〈比較例１〉分子量４０００のポリアクリ
ル酸６００部をｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２５００部
に溶解させ、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ'-（２−モルホリ
ノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホ
ン酸塩（以下ＣＭＥＣと略記する）６３部を添加し、０
℃で２０分撹拌した。これに実施例３で得たＣｅｎ−３
を１００部（容量）加えて、０℃から徐々に反応温度を
室温まで上昇させ、１８時間撹拌して反応させた。生成
物を濾過によって回収し、３％水酸化ナトリウム水溶
液、続いてイオン交換水で充分に洗浄し、ポリアクリル
酸のカルボキシル基由来の酸含量１．３６ｍｅｑ／ｍｌ
の［セルロース］−［ポリアクリル酸］（ＣＰＡ−４）
を得た。酸含量は実施例と同様の方法で定量した。

【００４６】上記ＣＰＡ−３を用いて実施例１と同様に
血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流
開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板
量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００４７】〈比較例２〉実施例１で得たＣＡ−１を１
００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２０００
部（容量）に分散させておき、これにタウリン２６部を
添加して撹拌し、２５℃で１８時間反応させた。生成物
を濾過によって回収し、イオン交換水で洗浄した後これ
をｐＨ８．０のモノエタノールアミン含有炭酸緩衝液に
分散させ、２５℃で３時間撹拌して残存アルデヒド基を
ブロックした。この生成物を濾過によって回収し、イオ
ン交換水で洗浄した後ｐＨ９．０の炭酸緩衝液２０００
部（容量）に分散させ、水素化ホウ素ナトリウム３０部
を加えて撹拌し、２５℃で１８時間反応させてシッフ塩
基の水素添加を行った。生成物を回収、イオン交換水で
充分に洗浄して［セルロース］−［タウリン］（ＣＴ−
５）を得た。実施例と同様の方法で測定したところ、Ｃ
Ｔ−５のタウリン由来スルホン酸の含量は、０．９４ｍ
ｅｑ／ｍｌであった。

【００４８】上記［セルロース］−［タウリン］（ＣＴ
−５）を用いて実施例１と同様に血液潅流実験を行い、
カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中の
アルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。結果は
表１、表２に示す。

【００４９】〈比較例３〉粒状多孔質セルロース（平均
粒径５０μｍ、平均孔径５０００Å）１００部（容
量）、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液４０部（容
量）、ヘプタン１２０部（容量）、ゼラチン８部の混合
懸濁液を４０℃で２時間撹拌した後、エピクロルヒドリ
ン５０部を加えて４０℃でさらに２時間撹拌した。この
反応混合物から生成物を回収し、充分に洗浄してエポキ
シ化セルロース（ＣＥ−６）を得た。極限粘度０．０８
３ｄｌ／ｇ、平均重合度１４０、硫黄含量１９．２％重
量のデキストラン硫酸ナトリウム５部を水２０部（容
量）に溶解させておき、これに上記ＣＥ−５を２０部
（容量）を加えてｐＨを１２に調整して４０℃で１８時
間反応させた。未反応のグリシジル基をモノエタノール
アミンでブロックした後、生成物を回収し充分洗浄して
スルホン酸含量０．３０ｍｅｑ／ｍｌ［セルロース］−
［デキストラン硫酸ナトリウム（ＣＤＳ−６）を得た。

【００５０】上記［セルロース］−［デキストラン硫酸
ナトリウム］（ＣＤＳ−６）を用いて実施例１と同様に
血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流
開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板
量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００５１】上記の例から明らかなように、本発明の定
比重リポタンパク質吸着材は血中のＬＤＬを選択的かつ
簡便に除去できた。吸着能だけに注目した場合はデキス
トラン硫酸を固定した吸着材も本発明の吸着材と同レベ
ルであったが、アルブミン、血小板といった他の血中成
分に及ぼす影響を考えた場合、本発明の吸着材は極めて
優れていることがわかった。この理由は以下の通りであ
る。水不溶性固体上に固定したＮ−スルホＰＥＩ鎖が親
水性スペーサーとして働き、排除体積効果によって良好
な血液適合性が実現される。また、Ｎ−スルホＰＥＩは
ヘパリノイドとしての効果も現れ、これも血液適合性の
向上に貢献しているものと考えられる。リガンドとして
働くスルファミノ基は、固体表面から比較的遠距離にあ
るＮ−スルホＰＥＩに由来し、固体表面近傍のＮ−スル
ホＰＥＩ鎖は親水性スペーサーとして働くため、その流
動性によってリガンドのモービリティーが増し、吸着能
の向上が図られている。

【００５２】

【発明の効果】本発明の低比重リポ蛋白吸着材は、固体
表面近傍のＮ−スルホＰＥＩ鎖が親水性スペーサーとし
て働くための排除体積効果に加えて、ヘパリノイドとし
ての効果も発揮するために、良好な吸着能と血液適合性
を両立することができ、あらかじめ血液から血漿成分を
分離して潅流するという煩雑な方法をとらず直接血液を
潅流することによって充分な効果を期待することができ
る。このため、簡便な操作で低比重リポ蛋白の除去によ
る症状の改善、治療に利用され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水不溶性固体にＮ-スルホポリエチレン
   イミンを、スルフアミノ基由来の酸含量が５０μｅｑ／
   ｍｌ（湿潤状態）〜２．０ｍｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）と
   なるよう固定したことを特徴とする低比重リポタンパク
   質吸着材。