JPH05255111A - 模擬ウイルスによるワクチン - Google Patents

模擬ウイルスによるワクチン

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JPH05255111A JP3178805A JP17880591A JPH05255111A JP H05255111 A JPH05255111 A JP H05255111A JP 3178805 A JP3178805 A JP 3178805A JP 17880591 A JP17880591 A JP 17880591A JP H05255111 A JPH05255111 A JP H05255111A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 直径が約10〜200nmのコア粒子と、前記コア
粒子が免疫学的活性を有する蛋白質またはペプチドと結
合するのを可能にする皮膜と、前記皮膜を介して前記コ
ア粒子と結合してこれに免疫学的反応性を付与する前記
免疫学的活性を有する蛋白質またはペプチドと、上記に
よって形成される模擬ウイルスの製薬上許容可能な担体
とからなる模擬ウイルスによるワクチン。 【効果】 生物学的活性化合物の安定化をその活性配座
を保ちつつ促進するようにして、生物学的活性を有する
ペプチド、蛋白質、または薬剤を付着させ得る、生体外
および生体内の双方の用途に用いられる粒子を担体とし
ているため、非常に用途が広く、これを用いた模擬ウイ
ルスによるワクチンは、本来のウイルスに付随する危険
性その他の問題点を大幅に克服する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には、微粒子状
コアを有する合成生体活性組成物に関する。より特定的
には、微結晶コア粒子に付着させた、少なくとも１種類
の生体活性を有するペプチド、蛋白質、または薬剤を成
分とする、合成生体活性組成物に関する。更に、本発明
は、上記の合成組成物を、個々の生体活性部分の性状に
応じて、ワクチン、免疫学的診断薬、あるいは医薬とし
て用いる方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】生体活性を有する蛋白質、ペプチド、ま
たは薬剤を各種の担体粒子に付着させることは、集中的
研究の対象となっている。このような複合生体系によっ
て、生体活性物質の毒性の軽減、効率の増大、およびコ
ストの削減が高い確度で期待されている。その結果、異
なる多くの担体モデルを現在文献中に見出すことが可能
である[バルガ(J.M. Varga)およびアサト(N. Asato)：
ゴールドバーグ(E.P. Goldberg)編、「生物学および医学
における重合体(Polymers in Biology and Medicin
e)」、第２巻(1983年)73〜88ページ、米国ニューヨーク
州ニューヨーク所在、ジョン・ワイリー・アンド・サン
ズ(John Wiley & Sons)社発行；ラニー(D.F. Ranny)お
よびハフェイカー(H.H. Huffaker)：ジュリアーノ(R.L.
Juliano)編、「薬剤の送達に対する生物学的アプローチ
(Biological Approaches to the Deliveryof Drugs)」、
アナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ
・サイエンセズ(Ann. N.Y. Acad. Sci.)、第507巻(1987
年)104〜119ページ]。微結晶であって、粒子径が数ミク
ロン程度の無機物を基質とするのが最も一般的な担体で
あり、蛋白質が複合作用因として最も一般的である。例
えば、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、あるいは走査型
電子顕微鏡、並びに免疫ブロット法などにおける免疫標
識の用途には、わずか５nmという微細な金／蛋白質(主
として免疫グロブリン)複合体が用いられている[フォー
ク(W. Faulk)およびテイラー(G. Taylor)：イミュノケ
ミストリー(Immunochemistry)、第８巻(1971年)1,081〜
1,083ページ；ハインフェルト(J.F. Hainfeld)：ネイチ
ャー(Nature)、第333巻(1988年)281〜282ページ]。
【０００３】粒子径が一般に500〜1,500nmのシラン化酸
化鉄／蛋白質(やはり主として抗体)複合体は、各種の生
体外系での用途に有用なことが知られ、この場合は、常
磁性体特性を好都合に利用することができる[リサーチ
・プロダクツ・カタログ(Research Products Catalo
g)、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在アドバン
スト・マグネチックス社(Advanced Magnetics, Inc.)19
88〜1989年版]。ウーゲルスタッドらはγ態の酸化鉄を
コアとしてポリスチレン薄膜で被覆したものを製作した
[ヌスタッド(K. Nustad)、ヨハンセン(L. Johansen)、
シュミット(R. Schmid)、ウーゲルスタッド(J. Ugelsta
d)、エレングセン(T. Ellengsen)、およびベルゲ(A. Be
rge)：「単分散粒子との蛋白質の共有結合：固相第二抗
体の調製(Covalent coupling of proteins to monodisp
erse particles: Preparation of solid phase second
antibody)」、エージェンツ・アンド・アクションズ(Age
nts andActions)、第９巻(1982年)207〜212ページ(認識
番号第60号)]。得られた4,500nmのビーズは、ポリスチ
レンラテックスビーズの吸着能とともに、常磁性による
比較的新規な利点をも示した。
【０００４】生体内系での用途に設定された担体系は、
無機物および有機物のいずれをもコアとして製作されて
いる。例えば、デービスおよびイラムは、ポリスチレン
のコアをポロキサマー(poloxamer)なるポリオキシエチ
レンとポリオキシプロピレンとのブロック共重合体で被
覆した60nmの系を開発したが、その外側皮膜は、ラット
肝および脾マクロファージを迂回させる顕著な性能を示
した[デービス(S.S. Davis)およびイラム(L. Illum):バ
イオマテリアルズ(Biomaterials)、第９巻(1988年)111
〜115ページ]。これらの粒子を用いた薬剤送達に関して
は明らかにされていない。前出ラニーおよびハフェイカ
ーは、酸化鉄／アルブミンによる薬剤系が350〜1,600nm
の常磁性薬剤担体となることを記載している[前出ラニ
ーおよびハフェイカー：ジュリアーノ編、「薬剤の送達
に対する生物学的アプローチ」、アナルス・オブ・ザ・
ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンセズ、第50
7巻(1987年)104〜119ページ]。ポズナスキーは、生成物
の生体劣化に対する感受性を低下させる一方で、内在酵
素の見かけの抗原性を隠蔽すると思われる酵素／アルブ
ミン複合体系を開発した[ポズナスキー(M.J. Poznask
y)：「酵素／アルブミン複合体の標的化：魔法の弾丸の
検証(Targeting enzyme albumin conjugates: Examinin
g the magic bullet)」：前出ジュリアーノ編、「薬剤の
送達に対する生物学的アプローチ」、アナルス・オブ・
ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンセズ、
第507巻(1987年)211〜219ページ]。
【０００５】ショウらは、リポ蛋白質／薬剤複合体を調
製し、その特性を記述している[ショウ(J.M. Shaw)、シ
ョウ(K.V. Shaw)、ヤノビッチ(M. Yanovich)、イワニク
(M.Iwanik)、フッチ(W.S. Futch)、ロゾフスキー(A. Ro
sowsky)、およびショーク(L.B. Schook)：「リポ蛋白質
を用いた親油性薬剤の送達(Delivery of lipophilicdru
gs using lipoproteins)」：前出ジュリアーノ編、「薬剤
の送達に対する生物学的アプローチ」、アナルス・オブ
・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンセ
ズ、第507巻(1987年)252〜271ページ]。上記担体中で
は、親油性薬剤は比較的安定で、かつ細胞との相互作用
も確かに生起するが、その詳細はあまり知られていな
い。
【０００６】いかなる複合生体組成物であれ、厄介な免
疫学的応答を触発することなしに、吸着された蛋白質そ
の他の生体物質の立体配座上の統合性と生体活性とが保
存されることが重要である。空間的配向および構造的配
座は、多くのペプチド、蛋白質、および薬剤の生体活性
を決定するのに一定の役割を果たすことが知られてい
る。これらの化合物の立体配座の変化は、生体活性を有
する化合物または薬剤の周囲の環境を変化させることで
生起されることもある。例えば、生体外で活性を示す薬
剤が、生体内では活性を示さないことがあるが、これは
生体外での環境によって部分的には決定されていた分子
的配座が失われたことによるのである。更に、組成物を
生体内で用いようとする場合、担体粒子の大きさと、そ
れに付随する、食作用による捕捉を最小化できる可能性
とは、最も重要な関心事である。担体粒子を調製する場
合は、これらの要因をすべて考慮しなければならない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】担体粒子としては、種
々多数のものが開発されているが、生体活性化合物の安
定化をその活性配座を保ちつつ促進するようにして、生
体活性を有するペプチド、蛋白質、または薬剤を付着さ
せ得る、生体外および生体内の双方の用途に用いられる
担体粒子の開発に対しては、持続的な要請が存在する。
本発明は、このような要請に応える粒子および組成物の
提供を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、生体活
性を有するペプチド、蛋白質、または薬剤を一定のコア
粒子に付着させることによって、非常に変化に富んだ生
体活性組成物が提供される。本発明は、極めて微細な粒
子(微結晶粒子)の表面を表面被覆によって変性させ、生
体活性を有する部分を付着させて、前記部分の天然に存
在する構造的環境が前記生体活性が保存されるのに充分
なだけ模倣されるように、組成物を形成することが可能
であるとの発見に基づく。本発明による微結晶粒子に生
体活性部分を付着させることができる皮膜は、基本的な
糖、修飾された糖、あるいはオリゴヌクレオチドからこ
れを組成することができる。基本的な糖、またはオリゴ
ヌクレオチドで微結晶粒子を被覆することによって、表
面エネルギーその他の表面特性に変化が生じ、これが粒
子を生体活性部分の付着に充分適合させるのである。
【０００９】本発明の一実施例では、微結晶粒子を用い
て、ウイルスのDNAまたはRNAのコアが微粒子と置換され
た模擬ウイルスが調製される。微粒子はウイルスコアと
同じ粒子径となるように選択されるため、これを囲む蛋
白質皮膜の配座は、本来のウイルスを正確に模倣するこ
とになる。得られる模擬ウイルスは、感染性の挙動は不
可能であるが、同時に免疫応答を発動させることは充分
可能であり、あるいは抗原として生体に対する反応性が
ある。
【００１０】本実施例では、DNAまたはRNAのコアを模倣
するため、直径が約1,000nmに満たない極めて微細な粒
子が選択されている。コアを囲む皮膜に付着させるウイ
ルスペプチドは、本来のウイルスの少なくとも一部を模
倣する構造を有している。活性を維持するのに微結晶粒
子の足掛かり、すなわちコアを必要とする薬剤その他の
生体活性化合物に対応して、微粒子コアの粒子径もま
た、このような足場を保持するのに充分適合する。
【００１１】本発明に用いるのに適した微結晶粒子は、
金属、セラミック、あるいは重合体を用いてこれを製造
することができる。適切な材料としては、クロム、ルビ
ジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、白金、
二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化ルテニウム、酸
化スズ、およびポリスチレンが挙げられる。
【００１２】本発明による生体活性を有する微粒子に
は、微粒子コアに付着させる生体活性化合物の形態に応
じて、広範な用途がある。ウイルス蛋白質を微粒子コア
に付着させた場合に得られるのが模擬ウイルスであっ
て、ワクチン、診断手段、あるいは抗体を発現させる抗
原性試薬として用いることができる。非ウイルス性の蛋
白質または抗原による皮膜は、特異的抗体の発現用に、
あるいは診断手段としての用途に向けて、これを選択か
つ構築することができる。更に、薬理活性を有する化合
物をコア粒子に付着させる場合は、微粒子を薬剤として
機能させることも可能である。
【００１３】本発明によれば、その周囲にウイルス蛋白
質を付着させたコア微粒子の利用によって、本来のウイ
ルスの遺伝物質の存在に付随するいかなる問題および危
険性も完全に排除しながらも、このウイルスの抗原とし
ての反応性は正確に模倣するための効果的な方法が提供
される。加えて、このコア微粒子には、前記化合物の活
性を維持または増進するために、他の蛋白質、ペプチ
ド、あるいは薬剤を付着させることもできる。
【００１４】以下、更に詳細な説明を加えることによっ
て、本発明の、上記に考察の特徴、およびその他の多数
の特徴並びに付帯する利点の理解を促すことにする。
【００１５】本発明には、抗原性の物体、あるいは他の
生体活性を有する部分が利用される免疫学的操作および
方法に広範囲な用途がある。この方面の用途としては、
予防接種用薬剤、抗体を発現させた後に診断するのに用
いられる抗原性薬剤、および診断手段として用いられる
抗原性化合物が挙げられる。本発明の組成物もまた、生
体に対する反応性の維持または増進を旨として、蛋白
質、ペプチド、または薬理活性作用因をコア粒子に係留
することが必要な、その他非常に多様な用途に用いるこ
とが可能である。
【００１６】本発明の組成物は、微結晶のコア粒子(直
径1,000nm未満)と、これを被覆する、前記粒子との蛋白
質、ペプチド、あるいは薬剤の結合を促進する表面エネ
ルギー変化層とからなる。この皮膜は、微結晶コア粒子
の表面エネルギーを変化させることから、非常に多様な
免疫原性の蛋白質、ペプチド、および薬剤がその抗原活
性の重大な損失、または変性を招くことなくコア粒子に
付着できるようになる。その結果、生物学的には不活性
なコアを内包する生体活性組成物が得られる。本発明の
最終用途は、被覆されたコア粒子に付着した個々の蛋白
質、ペプチド、あるいは薬剤による。例えば、抗原活性
を有する蛋白質またはペプチドを付着させると、免疫学
的診断手段に有用な組成物が得られる。抗原活性を有す
るウイルスの断片または蛋白質を皮膜とすれば、ワクチ
ンが得られる。また、薬剤を付着させると、疾病の治療
に有用な組成物が得られる。
【００１７】ワクチンを用途とする模擬ウイルスを調製
するには、直径が約10〜200nmの粒子が、この大きさの
範囲の粒子の方がウイルスに典型的に認められるDNAま
たはRNAコアの直径に近似することから、好適である。
【００１８】コア粒子は、金属、セラミック等非常に多
様な無機物を用いてこれを製造することができる。好適
な金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレ
ン、ニッケル、金、銀、および白金が挙げられる。好適
なセラミックとしては、二酸化ケイ素、二酸化チタン、
酸化アルミニウム、酸化ルテニウム、および酸化スズが
挙げられる。単体の炭素(ダイアモンド)を含めた有機物
からコア粒子を製造することもできる。好適な重合体と
しては、ポリスチレン、ナイロン、およびニトロセルロ
ースが挙げられる。二酸化スズ、二酸化チタン、あるい
は炭素(ダイアモンド)を用いて製造した粒子が特に好適
である。
【００１９】上記の材料を用いて製造された直径が1,00
0nm未満の粒子は、市販にて入手可能であるが、溶液中
での漸進的核形成(コロイド反応)、あるいは各種の物理
的または化学的気相析出法、例えばスパッタデポジショ
ン法を用いて製造することもできる[ハヤシ(C. Hayash
i)：ジャーナル・オブ・バキュアム・サイエンス・アン
ド・テクノロジー(J. Vacuum Sci. Technol.)、第Ａ５
巻(1987年７・８月号)1.375〜1.384ページ；前出ハヤ
シ：フィジックス・ツデー(Physics Today)、1987年12
月号44〜60ページ；エム・アール・エス・ブレティン(M
RS Bul.)、1990年１月号16〜47ページ]。分散した(水中
に)凝集粒子で粒子径が約140nmの酸化物が真空冶金工業
(日本国所在)社より市販にて入手可能である。その他所
望の組成および範囲の粒子径の市販にて入手可能な粒子
がアドバンスト・レフラクトリー・テクノロジーズ社(A
dvanced Refractory Technologies, Inc.：米国ニュー
ヨーク州バッファロー所在)より入手可能である。
【００２０】プラズマ援用化学気相析出法(PACVD)は、
適切な微粒子の製造に用い得る多数の手法のうちの一つ
である。PACVDは比較的高い気圧(ほぼ１トル以上)の下
で操作され、直径1,000nm以下の粒子の形成に有用であ
る。例えば、Al(CH3)3およびNH3を反応物として用いたP
ACVDによれば、直径1,000nm未満の窒化アルミニウム粒
子を合成することができる。PACVD方式は、水平に設置
された石英管、およびそれに付随する空気圧送・給気装
置系で構成されるのが一般的である。石英管の中央には
サセプタ(Susceptor)を置き、60kHzの無線周波電源を用
いて加熱する。合成された窒化アルミニウムの粒子は石
英管の管壁から回収される。窒素ガスはAl(CH3)3の担体
として用いられる。反応室内でのAl(CH3)3：NH3の比
は、Al(CH3)3を担った窒素およびNH3ガスの反応室内へ
の流速を変えることによって制御される。極めて微細な
微結晶窒化アルミニウム粒子を析出および成長させるた
めに、反応室内では10トルという一定の気圧が全般的に
維持される。PACVDは、他の適切な各種微結晶粒子を調
製するためにも用いることができる。
【００２１】粒子には、過度に緊密となって、生物学的
関与の部位が変性するようなことのない結合を生起させ
るのに充分な最小の表面エネルギーを粒子に与える物質
を用いて被覆が施される。被覆は、表面変性剤を分散さ
せた溶液中に粒子を懸濁させることによって、これを実
行するのが好ましい。被覆によって、粒子の表面が蛋白
質またはペプチドの付着に一層なじむようになることが
必要である。本発明における適切な被覆物質としては、
セロビオース、それに関連する基本的な糖、および修飾
された糖、例えばニトロセルロースが挙げられる。オリ
ゴヌクレオチドを用いることもできる。適切なオリゴヌ
クレオチドとしては、ポリアデノシン(ポリＡ)が挙げら
れる。セロビオースが被覆材料として好適である。コア
粒子を懸濁させる被覆液には、例えば１〜30重量／容積
％の被覆材料を含ませる。溶質は二回蒸留水であるのが
好ましい。被覆液内に懸濁させるコア粒子の量は、粒子
の形態および粒子径に応じて、広範囲にこれを変えるこ
とになる。典型的には、0.1〜10重量／容積％の懸濁液
とするのが適切である。粒子が約１重量／容積％の懸濁
液が好適である。
【００２２】コア粒子は、粒子に均一な皮膜が形成され
るのに充分な時間、これを被覆液に懸濁させておく。懸
濁液を保つには、超音波処理が好適な方法である。一般
的には、懸濁させる時間を室温にて30分ないし数時間の
範囲とすれば、粒子を適切に被覆するのに充分である。
皮膜の厚さは５nm未満であるのが好適である。皮膜の厚
さは、最終的なコア粒子に、その表面のほぼ全域にわた
る均一な皮膜が形成される限りで、これを変えることが
できる。
【００２３】被覆を施した後は、粒子を懸濁液から分離
し、後日の使用に備えて貯蔵し、あるいは、粒子に付着
させようとする蛋白質またはペプチドを含有する溶液に
再懸濁することができる。このようにせずに、所望の蛋
白質またはペプチドの付着を含むそれ以後の処理を目的
として、被覆粒子を懸濁液に放置しても良い。
【００２４】被覆粒子に塗布する蛋白質またはペプチド
は、非常に多様な蛋白質またはペプチドから選択され得
る。ワクチンが要求される場合は、抗原性を有するもの
が好適である。蛋白質は、目的とするウイルスの外被蛋
白質またはその免疫原部分であることが可能である。ウ
イルスの外被蛋白質の分離は、ウイルス蛋白質の単離お
よび分離のための公知の操作に従ってこれを行う。ウイ
ルスの外被が好適なのは、それがウイルスの抗原活性の
位置する部位であることが公知だからである。一般的に
は、ウイルスを消化または溶解して、ウイルス蛋白質の
混合物を形成させる。次いで、液体クロマトグラフィー
その他の慣用の方法を用いて、ウイルス蛋白質を分離し
て、それぞれの蛋白質粒子を分画化し、これを透析して
不純物を除去する。
【００２５】ウイルス蛋白質粒子を分離かつ単離できる
適切なウイルスとしては、エプスタイン-バーウイル
ス、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、ヒト乳頭腫ウイル
ス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げ
られる。非常に多種類の抗原性蛋白質材料の標品が、業
者、例えばマイクロジーン・システムズ社(Microgene S
ystems, Inc.：米国コネチカット州ウェストヘブン、フ
ロンテージロード400番地ジップコード06516)、アムジ
ェン・コーポレーション社(Amgen Corporation：米国カ
リフォルニア州サウザンドオークス、オークテラスレー
ン1900番地ジップコード91320-1789)、シータス・コー
ポレーション社(Cetus Corporation：米国カリフォルニ
ア州エメリービル、53番街1400番地ジップコード94608)
などから市販にて購入することもできる。天然に産する
ウイルス粒子に対応する合成ペプチドまたは蛋白質を利
用することもできる。
【００２６】付着が可能なその他の生体活性蛋白質及び
ペプチドとしては、酵素、ホルモン、輸送蛋白質、およ
び保護蛋白質が挙げられる。ヒト血清トランスフェリ
ン、プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、更に
は薬剤としてのアンホテリシンおよびインシュリンなど
がその例である。
【００２７】抗原その他の蛋白質をコア粒子の外皮に付
着させる方法には、被覆したコア粒子を前記抗原が含ま
れる水溶液に懸濁させることが必要である。粒子表面に
優先的に付着し得る物質が溶液中に存在することが、し
ばしば不都合なことがある。例えば、溶液中に分散剤が
存在すると、懸濁させた粒子に蛋白質の付着の前に望ま
しくない皮膜を形成することがある。そのため、水と混
和可能な溶媒、例えばメタノール、あるいはエタノール
を用いることもできる。被覆微粒子の水性溶液を充分に
震盪すると、粒子の均一な懸濁液を形成することが可能
である。溶液中の粒子の量を溶液１mlあたり約0.5〜５m
gとするのが一般的である。超音波処理が、被覆粒子を
溶液に均一に懸濁させる好適な方法である。
【００２８】蛋白質の付着および集合を生起させるに
は、被覆粒子および抗原の懸濁液の諸元が特定の範囲内
でなければならない。粒子懸濁液の温度は、１〜45℃と
すべきである。特定の蛋白質および薬剤を蒸留水中で被
覆粒子と結合させることができる。蒸留水中では不安定
であり、あるいは容易に分散しない蛋白質その他の薬剤
と被覆粒子を反応させるには、塩類を加えても良い。一
般に、塩類溶液は、イオンの比率(ミリモルを単位とし
て)が、Ｋ＝300〜500、Na＝30〜70、Cl＝40〜150、Ca＝
0.0003〜0.001、Mg＝0.0003〜0.001を超えないようにこ
れを処方する。溶液の酸素含量は、初めにヘリウムを散
布し、次いでヘリウム、窒素、および二酸化炭素を通気
した溶液中で10％未満とするのが好都合である。溶液の
pHは、やや酸性(血液と比較して)なのが好都合であり、
その値は6.8〜7.2とするのが好ましい。被覆微粒子の分
散、および蛋白質の付着に適した溶液の一例は、１リッ
トルあたり、0.0360mgのMgSO4、0.0609mgのMgCl2・6H
2O、0.0441mgのCaCl2・2H2O、22.823mgのK2HPO4、13.609
ｇのKH2PO4、7.455ｇのKCl、および4.101ｇの酢酸ナト
リウムであり、この溶液のpHを6.8に調整する。
【００２９】次に、蛋白質を付着させて被覆した粒子の
コアをイオン性成長媒体から分離し、その後の使用に備
えて貯蔵する。被覆粒子の貯蔵には、抗原性化合物また
は抗体の貯蔵に代表的に用いられる慣用の方法のいずれ
を用いることもできる。例えば、被覆粒子を凍結乾燥さ
せ、あるいは宥和し得る溶液に懸濁液として貯蔵するこ
とができる。ワクチンとして用いる場合は、ウイルス蛋
白質の皮膜で被覆した粒子を慣用の操作に従って対象者
に注射し、あるいは他の方法で投与する。被覆粒子を投
与する際は、製薬上許容可能ないかなる担体溶液または
他の化合物を用いることもできる。生体外での診断の目
的に用いる場合は、蛋白質で被覆した粒子を溶液に懸濁
させ、他の抗原性化合物に対すると同様に用いる。蛋白
質で被覆した粒子を抗体の発現に用いる場合も同じであ
る。本発明の蛋白質被覆粒子を通常用いられる抗原性化
合物と置き換えて用いる場合もまた、抗原に用いて抗体
を産生させるのに用いるのと同じ、充分公知の次第およ
び手順を用いることができる。
【００３０】
【実施例】以下、非制約的実施例を用いて、本発明の特
定の側面を更に詳細に説明する。
【００３１】実施例１．微結晶酸化スズ微粒子の調製 1.5〜2.5mgの極微(微結晶)金属粉末を、1.5mlの二回蒸
留水とともに1.7ml入りネジ蓋付き微量遠心分離器に投
入する。洗浄した0.45ミクロンのフィルタによる滅菌装
置、あるいはアクロディスク(acrodisc)[ジェルマン・
サイエンティフィク(Gelman Scientific)社製]を用いて
二回蒸留水を濾過する。金属粉末は、平均粒子径が(光
子相関分光分析によれば)140nmの酸化スズである。混合
物を30秒間攪拌し、水中超音波処理槽に一晩放置する。
超音波処理槽の温度は60℃に保つ。24時間の超音波処理
の後、試料を再度30秒間攪拌し、得られた分散液に約1
6,000rpmの微量遠心分離を15秒間施して、これを清澄化
する。粒子径の測定には、コールター(Coulter)N4MD型
なるミクロン下粒子分析装置を用いる。
【００３２】次いで、セロビオースの原液に粒子を懸濁
させて、酸化スズ粒子に被覆を施す。セロビオースの原
液は、1,000ｇのセロビオースを9.00mlの二回蒸留水に
溶解させて得られる292ミリモルの溶液である。迅速な
溶解を促進するため、約70℃にて溶解を実施した。得ら
れたセロビオース溶液を、洗浄した0.45ミクロンフィル
タを通して滅菌し、最終液量を10.00mlに調整する。
【００３３】150μlの極微酸化スズ分散液に、酸化スズ
の最終濃度が1.00％(W/V)、または29.2ミリモルとなる
よう充分量のセロビオース原液を加える。調製に用いら
れる代表的な量は、2.0mlであって、ミクロピペットを
操作してこれを４〜５回混合する。混合後、分散液を２
時間で平衡に到達させる。コールターDELSA 440型ドッ
プラーエネルギー光散乱測定器における粒子(被覆した
ものとしないもの)の移動度を測定することによって、
粒子の被覆の首尾を検証する。被覆した酸化スズ粒子
は、被覆しない酸化スズ粒子よりも低い移動度を示す。
塩類のあれこれの希釈濃度について測定を行い、移動度
に関する測定が人為的要素と無縁なことを確認する。こ
の試験によって、粒子はセロビオースで被覆されたこと
が証明される。
【００３４】次いで、被覆粒子を抗原性蛋白質、ペプチ
ド、または薬剤を付着させるのに用いて、生体に対する
反応性を有する粒子を調製する。
【００３５】実施例２．微結晶酸化ルテニウム粒子の調
製 実施例１と同じ要領で操作を行うが、酸化スズ粒子に代
えて酸化ルテニウム微粒子を用いる。酸化ルテニウム粒
子は、真空冶金工業社(日本国)より入手した。
【００３６】実施例３．微結晶二酸化ケイ素および酸化
スズ粒子の調製 微結晶二酸化ケイ素は、前出アドバンスト・リフラクト
リー・テクノロジー社より市販にて購入し、酸化スズは
前出真空冶金工業社より市販にて購入した。酸化スズに
ついては、アルゴン酸素混合気中での反応性蒸着による
調製、および冷却した基質上での回収も行なった。ま
た、直流反応性マグネトロンスパッタリング(倒立陰極)
を用いて、微結晶酸化スズの合成も行なった。高純度ス
ズの直径約76.2mm(３インチ)の標的に、アルゴンと酸素
の高圧混合気中でスパッタリングを施す。気相中に形成
された極微粒子を、液体窒素流で77°Kに冷却した銅管
に析出させて回収する。材料となる物質すべてについ
て、Ｘ線回折結晶学、透過型電子顕微鏡、光子相関分光
分析、およびドップラー電気泳動光散乱分析を用いて特
性を調べた。Ｘ線回折用試料については、粉末を両面ス
コッチテープを用いてスライドグラスに搭載し、プレパ
ラートを作成した。ノレルコ(Norelco)回折計を取り付
け、CuKα照射を用いた。得られたスペクトルは、酸化
スズに関するASTM規格データと比較した[パウダー・デ
ィフラクション・ファイル(Powder Diffraction Fil
e)、カード番号第21-1250号：米国フィラデルフィア所
在、アメリカ材料試験協会(ASTM)粉末回折規格に関する
合同委員会(Joint Committee on PowderDiffraction St
andards)1976年版]。透過型電子顕微鏡に用いる標本
は、22-プロパノールに対する極微粒子の分散液に浸漬
することによって、標準径３mm炭素被覆銅メッシュ上で
回収した。試料の検査は、加速電圧を60〜80kVとして、
JEOL-STEM 100 CXなる機種を用いて、これを実施した。
【００３７】これらの金属酸化物の作業分散液を調製す
るため、無塵ネジ頭微量遠心分離管[サーステッド(Sars
ted)社製]中で、1.5〜3.0mgの金属酸化物の粉末を1.5ml
の二回蒸留水に加え、30秒間攪拌する。次いで、混合液
に16〜24時間の超音波処理を施し、更に第２回目の攪拌
を30秒間行う。次に、16,000xｇの微量遠心分離を15秒
間実施して粗大粒状物質をペレット化することによっ
て、ミクロン下分画を単離する。次いで、約1.3mlの上
清を取り出し、別の無塵ネジ頭微量遠心分離管に移す。
50〜100μlの分散液を取り出してポリスチレン製キュベ
ットに入れ、二回蒸留水を用いて最終液量が1.00mlとな
るよう希釈することによって、光子相関分光分析(コー
ルターN4MD型による)、およびドップラー電気泳動光散
乱分析(コールターDELSA 440型)用の試料を調製する。2
4時間にわたる順次測定によって、分散液の安定性を測
定したところ、安定であることが判明した。溶媒の漸増
塩分(伝導度の増大)に関して、被覆分散液の安定性を同
様に測定した。溶媒の塩分の漸増とともに安定性が増大
した。
【００３８】予洗した、カットオフ点が分子量５x105の
Ｆ型膜[スペクトラ(Spectra)社製]を装着した容量15.0m
lの限外濾過攪拌セル(スペクトラ社製)中で、1.00mlの
分散液を8.00mlの二回蒸留水、および1.00mlの29.2ミリ
モルのセロビオース原液と混合し、攪拌する。更に、試
料を15分間攪拌し続ける。その後、蠕動ポンプを用い、
毎分10.0mlを超えない流量で250mlの二回蒸留水をセル
室に通すことによって、過剰なセロビオースを除去す
る。洗浄後、加圧窒素ガスを用いて、濾液を約1.0mlに
濃縮する。500μlの処理した分散液をN4MD型測定器にか
けて、特性を判定した。この段階で、分散液の平均粒度
を再度判定する。24時間にわたる順次的測定によって、
被覆分散液の安定性を測定した。溶媒の漸増塩分(伝導
度の増大)に関して、分散液の安定性を同様に測定し
た。
【００３９】得られた被覆微結晶粒子は、各種の蛋白
質、ペプチド、または薬剤の付着に適する。
【００４０】実施例４．ヒト血清トランスフェリンなる
蛋白質の調製、単離、および表面吸着 直流反応性マグネトロンスパッタリング(倒立陰極)を用
いて、微結晶酸化スズを合成する。高純度スズの直径約
76.2mm(３インチ)の標的に、アルゴンと酸素の高圧混合
気中でスパッタリングを施す。気相中に形成された極微
粒子を、液体窒素流で77°Kに冷却した銅管に析出させ
て回収する。材料となる物質すべてについて、Ｘ線回折
結晶学、選択部域電子線回折、透過型電子顕微鏡、光子
相関分光分析、およびエネルギー分散Ｘ線分光分析を用
いて特性を調べた。Ｘ線回折用試料については、粉末を
両面スコッチテープを用いてスライドグラスに搭載し
た。ノレルコ回折計を取り付け、CuKα照射を用いた。
得られたスペクトルを酸化スズに関するASTM規格データ
と比較した。透過型電子顕微鏡、および選択部域電子線
回折に用いる標本は、2-プロパノールに対する極微粒子
の分散液に浸漬することによって、標準径３mm炭素被覆
銅メッシュ上で回収した。試料の検査は、加速電圧を60
〜80kVとして、JEOL-STEM 100 CXなる機種を用いて、こ
れを実施した。粒子の2-プロパノール懸濁液について
も、コールターN4MD型測定器を用い、温度22.5℃、実行
時間を600秒として、光子相関分光分析によって、特性
を調べた。エネルギー分散Ｘ線分光分析は、ケベックス
(Kevex)社のクァンテックス(Quantex)Ｖなるソフトウェ
アを用い、JEOL JSM-T330Aなる走査型電子顕微鏡によっ
てこれを実行した。
【００４１】本発明の組成物の合成に用いられるこれら
金属酸化物の作業分散液を調製するため、無塵のネジ頭
ガラスバイアル中で、0.5mgの金属酸化物の粉末を1.0ml
の29.2ミリモルのセロビオース-リン酸緩衝食塩水に加
え、22.5〜35℃にて20分間の超音波処理を施す。次に、
16,000xｇの微量遠心分離を30秒間実施して粗大粒状物
質をペレット化することによって、ミクロン下分画を単
離する。次いで、約900μlの上清を取り出し、無塵のネ
ジ頭微量遠心分離管に移す。光相関分光分析(コールタ
ーN4MD型機)およびドップラー電気泳動光散乱分析(コー
ルターDELSA 440型機)用にアリコートを取る。被覆分散
液の経時的安定性、および溶媒の漸増塩分(伝導度を増
大させることから)の安定性の特性記述のためにも、ア
リコートを取り出す。
【００４２】蛋白質を、セロビオースで被覆した金属酸
化物の微結晶コアに吸着させるには、コア試料を、Ca++
およびMg++を含まぬ10.0mlのリン酸緩衝食塩水[ギブコ
(Gibco)社]で希釈する。精製ヒト血清トランスフェリン
については、ELISA法を用いてその抗原性を確認し、次
に、その40.0μg(４μg/μl：ギプコ社)を10ml入り攪拌
セル[スペクトラ(Spectra)社]に加える。次いで、試料
を、発泡せぬよう充分注意して、緩やかに30分間攪拌し
続ける。添加時間の経過後、Ca++およびMg++を含まぬ15
mlのリン酸緩衝食塩水(ギブコ社)を用い、約144ｇ/cm
2(２psi)の窒素ガスで加圧しつつセルを洗浄する。洗浄
後、加圧窒素ガスを用いて、再度試料を1.0mlに濃縮
し、光相関分光分析、ドップラー電気泳動光散乱分析、
および透過型電子顕微鏡用に、500μlの試料を取る。そ
の詳細を下記に説明する。
【００４３】結合蛋白質に保持された抗原性の測定によ
って、立体配座上の完全性を判定する。試料セル中で、
ELISA法を用いてその抗原性を確認したウサギ抗ヒトト
ランスフェリン多クローン抗体[デイコ(Dako)社]50.0μ
lを、濃縮した反応生成物1.0mlに37.5℃にて静かに攪拌
しつつ加える。これを30分間温置した後、Ca++およびMg
++を含まぬ15mlのリン酸緩衝食塩水(ギブコ社)を用い、
約144ｇ/cm2の窒素ガスで加圧しつつセルを洗浄し、再
度反応液の体積を1.0mlに減じる。
【００４４】遮断剤のアリコートとして、２価イオンを
含まぬ食塩水に溶かした１W/V％のウシ血清アルブミン2
00μlを加えて、10分間の平衡期間を置く。次いで、二
次抗体として、30nm径金複合ヤギ抗ウサギ多クローンIg
G[ザイメド(Zymed)社]を加え、反応混液を30分間温置す
る。試料を取り出し、透過型電子顕微鏡のグリッド上に
細断し、真空乾燥させる。２価イオンを含まぬ15mlの食
塩水を用い、窒素ガスで加圧しつつ混合物を洗浄し、次
いでグルタルアルデヒドで固定する。次に、３％固形ウ
シコラーゲン[コラーゲン・コーポレーション(Collagen
Corp.)社]１mlを混合物に加え、この混成体に106xｇで
30分間の超遠心分離を施して、ペレットを形成させ、次
いで透過型電子顕微鏡用生体標本として定型処理を施
す。厚さ10nmの切片をツァイス(Zeiss)社製透過型電子
顕微鏡で観察する。上記の要領で、ただしセロビオース
の中間結合層を形成せずに対照標本を作成する。
【００４５】透過型電子顕微鏡による観察から、直流反
応性マグネトロンスパッタリングによる酸化スズは、直
径20〜25nmの個々の粒子が凝集した、直径80〜120nmの
クラスターで構成されていることが判明した。光子相関
分光分析によれば、この同じ粒子が蒸留水中に分散する
と、直径154±55nmの集団を形成する。酸化スズ粒子は
充分に結晶をなしていることが、電子線およびＸ線の回
折特性から示される。エネルギー分散Ｘ線分光分析から
は、不純物として認められる他の要素は皆無であった。
【００４６】ドップラー電気泳動光散乱分析によれば、
酸化スズは、10.8〜20.3マイクロモルの範囲のNaCl水溶
液中で、2.177±0.215μm-cm/V-sの平均移動度を示し
た。１％溶液中でセロビオースの表面被覆を施すと、酸
化スズは、0.0〜21.0マイクロモルの範囲のNaCl水溶液
中で、1.544±0.241μm-cm/V-sの平均移動度を示した。
40.0マイクロモルを超える塩濃度において、またセロビ
オースの濃度を上昇させた溶液においては、酸化スズは
集団を形成した。
【００４７】結合の伝達後は、粗製酸化スズ／セロビオ
ース／蛋白質複合体は、光子相関分光分析、および透過
型電子顕微鏡によれば、その粒子径が350±84nmと測定
された。低濃度の金抗体とともに滴下させた真空乾燥試
料は、35〜50nmと測定された。セロビオースとの結合層
がない場合、真空乾燥させた切片は、400ないし1,000nm
未満と測定された。抗体の結合は時折り認められた。高
濃度の免疫金標識および濾過を施した後では、セロビオ
ースで処理した標本の薄層切片は、50〜100nmと測定さ
れた。適切に被覆された試料の約20％に明らかな金結合
が特定されたのに対し、負の対照(上記の要領で作成し
たが、ウサギの一次抗体を欠く)では、約１％に非特異
的な結合を認めたに過ぎない。
【００４８】上記の実施例から理解され得るとおり、糖
質処理の微結晶金属酸化物の粒子表面においては、吸収
された蛋白質の生物学的活性が保存される。
【００４９】実施例５．模擬エプスタイン-バーウイル
スの調製および特性記述 実施例１に記載の要領で、直流反応性マグネトロンスパ
ッタリング法を用いて、微結晶酸化スズ粒子を合成す
る。
【００５０】B95-8なる細胞系から得られ、清浄ショ糖
で勾配精製したエプスタイン-バーウイルス(EBV)を、米
国メリーランド州コロンビア所在、アドバンスト・バイ
オテクノロジーズ社(Advanced Biotechnologies, Inc.)
より購入した。ウイルスのアリコートの各々には、10ミ
リモルトリス-150ミリモルNaClのpH7.5の緩衝液に懸濁
された約5.00 x 1010個のウイルス粒子が含まれていた
(蛋白質１mlあたり約0.94mg)。ビリオンを0.75％(v/v)
のトリトンＸ100に可溶化し、次いで、150,000xｇにて6
0分間の超遠心分離を施して、ウェルズの方法[ウェルズ
(A. Wells)、コイデ(N. Koide)、およびクライン(G. Kl
ein)：「ビリオン外皮の２種類の巨大糖蛋白質がEBVの受
容体陽性細胞との結合に介在する(Two large virion en
velopeglycoproteins mediate EBV binding to recepto
r-positive cells)」、ジャーナル・オブ・ビロロジー
(J. Vorol.)、第41巻(1982年)286〜297ページ]を改良し
て用いて、DNAコアをペレット化する。透析後、上清のE
BV抽出物について、SDS-PAGE(変性する)[バイオラッド
(Biorad)社ミニゲルII型を使用、ゲルの勾配は４〜20
％、200Vにて45分間、および銀染色]、およびサイズ排
除HPLC(変性せず)[ウォーターズ(Waters)社のWISP自動
インジェクタおよび720号フォトダイオードアレーデテ
クタを備えたウォーターズ620号システム、100ミリモル
NaCl-20ミリモルトリスのpH9.4の勾配可動相を用いたウ
ォーターズSW300なるGFCカラムで毎分0.5ml]の双方を用
いて特性を測定した。
【００５１】対照(非EBV)蛋白質は、上記と同じ方法を
用いて、ラムダファージウイルス[ファルマシア(Pharma
cia)社、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー所在]の
アリコートから抽出した。
【００５２】まず、重量が約1.5mgの酸化スズ粉末のア
リコートを、無塵ガラスバイアル中で自由攪拌により
[ボルテックス・ジェニー(Vortex Genie)を使用：サイ
エンティフィック・インダストリーズ(Scientific Indu
stries)社、米国ニューヨーク州ボヘミア所在]、3.0ml
の29.2ミリモルのセロビオース溶液に懸濁させる。次い
で、得られた褐色雲状懸濁液に、25℃にて約20kHzの周
波数で10分間、175Ｗの超音波処理を施す[ブランゾン(B
ranson)２インチカップホーン(Cup Horn)を使用：ブラ
ンゾン・ウルトラソニックス・コーポレーション(Brans
on Ultrasonics Corp.)、米国コネチカット州ダンベリ
ー所在]。16,000xｇ、15秒間の微量遠心分離によって、
懸濁液を清澄化する。次いで、上清を残して、残存ペレ
ットを棄却する。37.5℃にて約540ｇ/cm2の窒素ガスで
加圧しつつ、公称10キロダルトンの分子フィルターを備
えた攪拌セル(ファルマシア社)中で、25ミリモルのリン
酸反応緩衝液(pH7.40、25ミリモルHPO4 2-/H2PO4 1-)20ml
を用いた限外濾過によって、未吸着のセロビオースを除
去する。中間生成物のアリコートについて、光子相関分
光分析および、下記の透析後に実施のドップラー電気泳
動光散乱分析を用いて特性を調べた。
【００５３】ウイルス蛋白質を吸着させる工程は、EBV
抽出物のアリコート250μlから、４℃にて公称10キロダ
ルトンの分子フィルターを備えた攪拌セル中で、25mlの
リン酸反応緩衝液を用いた限外濾過によって、弱いトリ
トン界面活性剤を除去し、次いでこれを1.0μg/μlの濃
度、あるいは約1.0mlの最終体積に調製することから開
始する。次に、このトリトンを除去したEBV抽出物500μ
lを、表面処理した酸化スズの37.5℃に予熱した分散液
2.0mlとともに、公称１メガダルトンの分子フィルター
を備えた攪拌セルに速やかに注入する。次いで、混合液
を緩やかに攪拌しつつ、37.5℃にて２時間温置する。そ
の後、25mlのリン酸反応緩衝液を用いた限外濾過を用い
て、未吸着のEBV抽出物を除去する。
【００５４】上記と同じ工程を通じて、ラムダファージ
のウイルス蛋白質抽出物を用いた対照(非EBV)模擬ウイ
ルスを合成する。
【００５５】中間的構成要素、最終的に組立てられた模
擬ウイルス、および完全なEBVビリオンについて、ドッ
プラー電気泳動光散乱分析[DELSA 440型機種を使用：コ
ールター・エレクトロニクス社(Coulter Electronics I
nc.)米国フロリダ州ハイアリー所在]を用いて特性を調
べ、これらの流動相における電気泳動移動度(表面電荷)
を測定した。25℃にてpHが4.59〜9.06の範囲の、かつこ
れに対応して伝導度が2.290■4.720mS/cmの範囲の９種
類のリン酸緩衝液を調製する。未加工の酸化スズ、表面
を変性させ、セロビオースで被覆した酸化スズ、合成模
擬EBV、および完全なEBVのアリコートを、９種類の溶液
の各々に対して透析し、次いで、場の強度をそれぞれ4.
0、5.5、5.5、および8.0mAとして、分散液中の粒状物質
の移動度を測定した。装置の四辺形をなす検出器から同
時に得られた移動度の測定値を平均し、それぞれの分散
液につき３回の測定の平均値を記録した。
【００５６】合成された模擬EBV、および対照模擬EBVに
ついて、免疫凝集光子相関分光分析を用いて特性を調
べ、それらの表面の抗体との反応性を測定した。15％乳
糖、0.9％NaCl、10ミリモルHEPES緩衝液、および0.2％N
aN3[デュポン(DuPont)社、米国デラウェア州ウィルミン
トン所在]に溶かしたマウス抗EBV単クローン抗体(それ
ぞれ１μgの抗EBV-VCA、抗EBV EA-R、抗EBV MA、および
抗EBV EA-D)の反応混液とともに模擬EBVを37.5℃にて60
分間温置して、陽性の反応性を判定した。模擬EBVを不
適合マウスIgG1とともに温置することによって、背景レ
ベルの反応性を判定した。特異性については、ラムダフ
ァージの模擬ウイルスをマウス抗EBV単クローン抗体と
反応させることによって判定した。凝集については、90
°の角度における光子相関分光分析[コールター社のN4M
D型機種]を用いて測定した。
【００５７】抗体親和性の強さは、上記に列挙の粒状物
質および抗体を用い、次いで30nmの金で標識した抗マウ
ス二次抗体を加えた免疫金透過型電子顕微鏡によって、
これを判定した[フォーク(W. Faulk)およびテイラー(G.
Taylor)：「電子顕微鏡用免疫コロイド法(Immunocolloi
d method for electron microscopy)」、イミュノケミス
トリー(Immunochemistry)、第８巻(1971年)1,081〜1,08
3ページ]。
【００５８】模擬EBVの標識化(陽性反応)の実施は、公
称10キロダルトンの分子フィルターを備えた攪拌セル中
で、マウス単クローン抗体の混液(15％乳糖、0.9％NaC
l、10ミリモルHEPES緩衝液、および0.2％NaN3[デュポン
社]に溶かした１μgの抗EBV-VCAおよび１μgの抗EBV EA
-R)20μlを模擬EBVの新鮮試料0.5mlとともに37.5℃にて
30分間温置することによる。次いで、約360ｇ/cm2(5.0p
si)の窒素ガスで加圧下で、20mlのリン酸反応緩衝液を
用いた限外濾過を施して、未結合抗体を除去する。洗浄
後、公称１メガダルトンの分子フィルターを備えた攪拌
セル中で、30nmの金球体(１mlあたりの粒子数は106個)
[ザイメド・ラボラトリーズ(Zymed Laboratories)社、
米国カリフォルニア州サンフランシスコ所在]と共有結
合させた50μlのヤギ抗マウス抗体を200μlの標識され
た粒子とともに、37.5℃にて30分間温置する。未結合の
二次抗体は、10mlのリン酸反応緩衝液を用いた限外濾過
を施して、これを除去する。
【００５９】模擬EBVの標識化(陰性反応)の実施は、上
記の要領で、マウス単クローン非特異的IgG1(pH7.4の15
ミリモルNaCl１μlあたり１μg)[シグマ・ケミカル・コ
ーポレーション(Sigma Chemical Corp.)、米国ミズーリ
州セントルイス所在]2.5μlを模擬EBVの新鮮試料0.5ml
とともに温置し、次いで同様の洗浄および金標識化を行
う段階による。ラムダファージの対照模擬ウイルスの標
識化(陰性反応)の実施は、上記に詳述と同一の手順を用
いて、マウス抗EBV単クローン抗体の混液20μlをラムダ
ファージ模擬ウイルスとともに温置することによる。
【００６０】電子顕微鏡用の免疫標識化粒子を調製する
には２通りの方法がある。直接浸漬法は、炭素被覆の銅
のビューインググリッド[テッド・ペラ(Ted Pella)社、
米国カリフォルニア州レッディング所在]を試料中に約
５秒間沈め、次いで５％グルタルアルデヒド中で１分間
固定する方法で、迅速なスクリーニング法の一種とし
て、すべての反応に対して用いられる。より複雑な方法
は、反応液にグルタルアルデヒドを直接添加する段階
と、次いで、生成物を16,000xｇにて５分間で0.5mlの軟
寒天標本(水に溶かした0.7％のアガロース[シー・ケム
(Sea Kem)社、米国カリフォルニア州テメキューラ所
在])中にペレット化する段階とからなる。次いで、得ら
れた寒天プラグをプラスチックに包埋し、観察用に0.1
μmのシートへと薄切するのである。
【００６１】正および負の対照の双方に対する分析を実
施するには、標識化した反応生成物のペレット化した試
料を透過型電子顕微鏡で観察する。抗体の結合の相対的
強度は、金の球体と結合したと認められた酸化スズをベ
ースとする粒子を計数することによって算出され(陽性
％)、次いで、所定の粒子に結合した金球体の数を記録
する(強度、数／件)。
【００６２】極めて微細な酸化スズ粒子は、透過型電子
顕微鏡での測定によれば、直径が20〜25nmであり、直径
80〜120nmの凝集体を形成する。光子相関分光分析によ
れば、この同じ粒子が蒸留水中で分散した場合、154±5
5nmと測定される集団を形成した。電子およびＸ線回折
による特性検査によれば、酸化スズの粒子は完全に結晶
性である。エネルギー分散Ｘ線分光分析からは、他の不
純物として存在する要素は皆無である。
【００６３】SDS-PAGEによる特性検査から、EBV蛋白質
には２本の明確な蛋白質帯域が示される。第１は、各種
のグリコシル化を暗示する二量体として存在し、ほぼ35
0キロダルトンの分子量を示すが、これは、圧倒的に多
量なEBVの外皮糖蛋白質と一致する。第２は、血清アル
ブミンと一致するほぼ67キロダルトンの分子量を示す
が、これは、ウイルス表面に積極的に吸着するかの観が
ある。HPLCによれば、蛋白質と一致する280nmで分光測
光における最大吸収を示す、２本の明確な帯域の存在が
確認された。支配的ピークは、クロマトグラフィーにお
ける保持時間が10.30分であって、抗VCA単クローナル抗
体によって90％まで抑えることができた。第２の、かつ
比較的目立たぬピークは、クロマトグラフィーにおける
保持時間が15.75分であって、ウシ血清アルブミンの標
準曲線に類似している。
【００６４】前述のドップラー電気泳動による移動度の
測定は、4.5〜9.0のpHの範囲でこれを行い、３種類の明
確な形状が示された。第１は、模擬ウイルスおよび本来
のEBVの双方が保持する、pHの全範囲にわたって約−1.4
μm-cm/V-sの実質的に同一の移動度である。第２は、未
処理の酸化スズが示す、pH4.5で約−1.0μm-cm/V-sの移
動度で、これは次いで急激に上昇して、pH5.0以上の値
では−3.0μm-cm/V-sに達する。第３は、表面を変性さ
せてセロビオースで処理した酸化スズが保持する、ほぼ
−1.5μm-cm/V-sの移動度であって、pH7.5に至って−2.
5μm-cm/V-sまで急激に上昇する。
【００６５】前述の光子相関分光分析によれば、本来の
EBVの測定値は約102±32nmであって、合成された模擬EB
Vのそれは約154±52nmであることが示される。合成され
た模擬EBVは、抗EBV単クローナル抗体混液と反応させた
場合、凝集して1,534±394nmの団塊を形成するが、非特
異的なマウスIgGと反応させた場合は、直径230±76nmの
凝集を伴いつつ多少粒子径が増大するに過ぎない。模擬
ラムダファージは、抗EBV単クローナル抗体混液と反応
させた場合でも、直径170±35nmの凝集を伴いつつ多少
粒子径が増大するに過ぎない。
【００６６】前述の、抗EBV抗体で標識した模擬EBV粒子
の透過型電子顕微鏡での観察によれば、陽性の金染色の
頻度は23.51％±5.53で、平均染色強度は１件あたり金
標識が7.41であった。非特異的なマウスIgG抗体で標識
した模擬EBV粒子については、陽性の金染色頻度は5.53
％±2.04で、平均染色強度は１件あたり金標識が1.00で
あった。抗EBV抗体で標識した模擬ラムダファージ粒子
を調べたところ、陽性の金染色頻度は7.21％±1.26で、
平均染色強度は1件あたり金標識が1.06であった。
【００６７】実施例６．模擬エプスタイン-バーウイル
スによる生体内での抗体発現 ４種類の感作液を調製し、その250μlのアリコートを隔
週に１回ずつ３回、ほぼ８週齢のニュージーランド系ウ
サギに筋内注射にて投与する。第１群の４匹には、１回
の注射につきリン酸反応緩衝液に分散させたEBVの完全
なビリオン約109個(25μgのウシ血清アルブミンを標準
試薬とした分光測光で、280nmでの吸光度曲線の積分か
ら算定してgp350は約32μg)を投与する。第２群の４匹
には、同じ注射の手順明細に従って、１回あたり32μg
の単離精製したgp350を注射にて投与する。第３群に
は、１回あたり32μgのgp350を開始アリコートとして合
成した模擬EBV(実施例５)を注射にて投与する。最後に
第４群には、リン酸反応緩衝液に分散させた酸化スズに
被覆したセロビオースを投与する。注射はアジュバント
を用いずに実施する。３回の注射のそれぞれから２週間
後に、無菌手法の心穿刺によって全血を採集し、６週目
の最終心穿刺後は、致死量の鎮静剤を用いて動物を殺
す。全血に16xkgの微量遠心分離を１分間施して血清を
抽出し、次いで、分析開始まで−70℃にて凍結保存す
る。
【００６８】EBVの完全なビリオン(ABI)に対する免疫特
異的抗体について、ELISA法を用いて検定を行う。リン
酸反応緩衝液に分散させた約109/mlのビリオンを被覆用
緩衝液で１：10に希釈し、ポリカーボネート検定用プレ
ート[ファルコン(Falcon)社]中で１晩吸着させる。結合
したEBVビリオンに対するウサギ血清の親和性を、リン
酸p-ニトロフェニルを用いて発色させたヤギ抗ウサギIg
Gアルカリホスファターゼ[シグマ(Sigma)社]の比色反応
によって測定する。免疫特異的IgGの濃度は、非特異的
ウサギIgGを被吸着抗原として用いた較正曲線と比較
し、酸化スズのみで刺激したウサギから得られた血清の
入ったウェルについて記録した基線値を減ずることによ
って、これを測定する。
【００６９】酸化スズで感作した４匹のウサギから採取
した血清は、３回の隔週試料採取期間のいずれにおいて
も、免疫前血清に対する抗EBV活性の増大を示さなかっ
た。残る３群では、この６週間にわたって抗EBV特異的I
gGの濃度が次第に上昇するのが認められた。精製したEB
V蛋白質のみで感作した動物では、抗EBVIgGの濃度が６
週目に約0.05μg/μlの最大値に達するのが認められ
た。これに対して、完全なEBVまたは模擬EBVのいずれか
で感作した動物は、抗EBVIgGの濃度は６週目に約0.20μ
g/μlという、４倍も強い統計的有意な応答を示した。
模擬EBVに対する免疫特異的応答と完全なEBVに対するそ
れとは実質的に同一である。
【００７０】実施例５および６から明らかなとおり、本
発明による合成模擬EBVは、本来のウイルスと同じ表面
電荷を保有し、単クローン抗体によって特異的に、かつ
強力に認識され、かつ完全なウイルスと同じ有効性で免
疫特異的抗体を誘起する。光子相関分光分析法を用いれ
ば、３種類の反応条件下で凝集した粒子の数を、凝集体
の直径の測定から算出することができる。この計算か
ら、抗EBV単クローン抗体は、平均して988.0の模擬EBV
粒子からなる凝集塊を形成することが判明する。非特異
的マウスIgG抗体は、平均して3.33の模擬EBV粒子からな
る凝集塊を形成し、一方、抗EBV単クローン抗体は、対
照としての模擬ラムダファージ粒子に対しては平均して
1.35のそれからなる凝集塊を形成するのみである。これ
らの測定結果から、本発明の模擬EBVで測定された凝集
能は、対照のそれよりもほとんど1,000倍程度も大き
い。免疫金による透過型電子顕微鏡での観察によれば、
金標識化抗体による抗EBV標識化模擬EBVの染色は、対照
よりも25〜30倍も多量であることが判明した。模擬EBV
を用いてウサギに発現させた抗EBVIgGの免疫特異性は、
ELISAなる分析法によれば、本来のウイルスを用いて発
現させた応答とほぼ等しく、単離精製した蛋白質を用い
て発現させた応答よりも４倍も強い。
【００７１】上記により本発明の実施例の説明を終える
に際して、当業界の技術の習熟者には、これらは単なる
例示に過ぎず、本発明の範囲内で他にも各種の代替策を
講じ、あるいは応用および変更を加え得ることが理解さ
れるものと思われる。したがって、本発明は、ここに記
載の特定の実施例に限定されることなく、所記の請求範
囲にのみ制約されるものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年９月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/275 8413−4Ｃ // Ｃ１２Ｎ 7/00 7236−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ (72)発明者 ニール コソヴスキー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90046−2107 ロサンゼルス カートニー テラス 1820 (72)発明者 ロインタン エフ バンシャー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90293 プラヤ・デル・レイ ジトラテラ ス 8138

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫応答を誘起して動物を治療するのに
    用いられる、模擬ウイルスを成分とするワクチンであっ
    て、前記模擬ウイルスが、 直径が約10〜200nmのコア粒子と、 前記コア粒子の少なくとも一部を被覆する物質であっ
    て、免疫学的活性を有する蛋白質またはペプチドとこれ
    らを変性させることなく結合させるに足る最小表面エネ
    ルギーを前記コア粒子に付与する物質よりなる皮膜と、 前記被覆されたコア粒子と結合して前記模擬ウイルスを
    形成する、少なくとも１種類の免疫学的反応性を有する
    ウイルス蛋白質またはペプチドと、 前記模擬ウイルスの製薬上許容可能な担体とからなるこ
    とを特徴とする模擬ウイルスによるワクチン。
  2. 【請求項２】 被覆する物質が、基本的な糖、修飾され
    た糖、あるいはオリゴヌクレオチドである請求項１記載
    の模擬ウイルスによるワクチン。
  3. 【請求項３】 皮膜がセロビオースである請求項２記載
    の模擬ウイルスによるワクチン。
  4. 【請求項４】 コア粒子が金属、セラミック、あるいは
    重合体を成分とする請求項１記載の模擬ウイルスによる
    ワクチン。
  5. 【請求項５】 金属が、クロム、ルビジウム、鉄、亜
    鉛、セレン、ニッケル、金、銀、および白金からなる一
    群から選択される請求項４記載の模擬ウイルスによるワ
    クチン。
  6. 【請求項６】 セラミックが、二酸化ケイ素、酸化アル
    ミニウム、酸化ルテニウム、炭素、および酸化スズから
    なる一群から選択される請求項４記載の模擬ウイルスに
    よるワクチン。
  7. 【請求項７】 重合体がポリスチレンである請求項４記
    載の模擬ウイルスによるワクチン。
  8. 【請求項８】 ウイルス蛋白質またはペプチドが、エプ
    スタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒ
    ト乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、あるいはポック
    スウイルスから単離されたものである請求項１記載の模
    擬ウイルスによるワクチン。
  9. 【請求項９】 ウイルス蛋白質またはペプチドが、エプ
    スタイン-バーウイルスから単離されたものである請求
    項８記載の模擬ウイルスによるワクチン。
  10. 【請求項10】 コア粒子が基本的に酸化スズで構成され
    る請求項６記載の模擬ウイルスによるワクチン。
  11. 【請求項11】 コア粒子が基本的にダイアモンドで構成
    される請求項６記載の模擬ウイルスによるワクチン。
  12. 【請求項12】 皮膜がセロビオースである請求項10記載
    の模擬ウイルスによるワクチン。
  13. 【請求項13】 ウイルス蛋白質またはペプチドが、エプ
    スタイン-バーウイルスから単離されたものである請求
    項12記載の模擬ウイルスによるワクチン。
  14. 【請求項14】 ウイルス性感染因に対する抗体を増幅す
    る免疫応答を誘起するのに充分な量の請求項１記載の模
    擬ウイルスを動物に投与する段階が含まれることを特徴
    とする、前記ウイルス性感染因に対する前記抗体を増幅
    するよう動物にワクチン接種を施す方法。
  15. 【請求項15】 ウイルス性感染因が、エプスタイン-バ
    ーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒト乳頭腫ウイ
    ルス、ヘルペスウイルス、あるいはポックスウイルスか
    らなる一群から選択される請求項14記載の動物にワクチ
    ン接種を施す方法。
  16. 【請求項16】 ウイルスがエプスタイン-バーウイルス
    である請求項15記載の動物にワクチン接種を施す方法。
  17. 【請求項17】 コア粒子が金属、セラミック、あるいは
    重合体を成分とする請求項14記載の動物にワクチン接種
    を施す方法。
  18. 【請求項18】 コア粒子が基本的に酸化スズで構成され
    る請求項16記載の動物にワクチン接種を施す方法。
  19. 【請求項19】 コア粒子が基本的にダイアモンドで構成
    される請求項17記載の動物にワクチン接種を施す方法。
  20. 【請求項20】 皮膜がセロビオースである請求項18記載
    の動物にワクチン接種を施す方法。
  21. 【請求項21】 ウイルス蛋白質またはペプチドが、エプ
    スタイン-バーウイルスから単離されたものである請求
    項20記載の動物にワクチン接種を施す方法。
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