JPH05255398A - 新規なタンパク質 - Google Patents
新規なタンパク質Info
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- JPH05255398A JPH05255398A JP4208034A JP20803492A JPH05255398A JP H05255398 A JPH05255398 A JP H05255398A JP 4208034 A JP4208034 A JP 4208034A JP 20803492 A JP20803492 A JP 20803492A JP H05255398 A JPH05255398 A JP H05255398A
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- JP
- Japan
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- protein
- amino acid
- sequence
- seq
- chondromodulin
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 牛胎児軟骨からＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が約１６，０００ドルトンの
蛋白質を単離しアミノ酸配列を決定した。このタンパク
質は単独またはＦＧＦ共存下で軟骨細胞を増殖させ、ま
た、軟骨細胞の分化機能を促進させる活性を有する。 【効果】 本願タンパク質は骨折や各種軟骨疾患等の治
療薬として有用である。
ゲル電気泳動による分子量が約１６，０００ドルトンの
蛋白質を単離しアミノ酸配列を決定した。このタンパク
質は単独またはＦＧＦ共存下で軟骨細胞を増殖させ、ま
た、軟骨細胞の分化機能を促進させる活性を有する。 【効果】 本願タンパク質は骨折や各種軟骨疾患等の治
療薬として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なタンパク質に関
し、詳細には軟骨細胞の増殖及び分化機能の誘導を促す
作用を有する新規なタンパク質コンドロモデュリン−II
に関する。
し、詳細には軟骨細胞の増殖及び分化機能の誘導を促す
作用を有する新規なタンパク質コンドロモデュリン−II
に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】哺乳
類の大部分の骨（頭蓋骨などの平板な骨は除く）は胎児
期にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分
化、プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン
などの軟骨原基の産生を経て、毛細血管の進入とともに
軟骨原基が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始
まり、最後は骨に置換する、いわゆる“内軟骨性骨化”
という仕組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の
形成、特に長軸方向への伸長において非常に重要な役割
を演じている。
類の大部分の骨（頭蓋骨などの平板な骨は除く）は胎児
期にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分
化、プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン
などの軟骨原基の産生を経て、毛細血管の進入とともに
軟骨原基が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始
まり、最後は骨に置換する、いわゆる“内軟骨性骨化”
という仕組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の
形成、特に長軸方向への伸長において非常に重要な役割
を演じている。
【０００３】この一連の過程において種々のホルモンや
成長因子が関与している。このなかにはインスリン様増
殖因子（ＩＧＦ１，ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）、成長ホルモン、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ−
β）などが含まれる。これらは軟骨細胞を増殖させる働
きを持つが、この働き以外にさらに軟骨細胞の分化機能
の促進作用も合わせ持つ因子が軟骨中に存在することが
知られていた。
成長因子が関与している。このなかにはインスリン様増
殖因子（ＩＧＦ１，ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）、成長ホルモン、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ−
β）などが含まれる。これらは軟骨細胞を増殖させる働
きを持つが、この働き以外にさらに軟骨細胞の分化機能
の促進作用も合わせ持つ因子が軟骨中に存在することが
知られていた。
【０００４】Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｎｅａｍｅらは、牛軟骨
より、軟骨内に存在する構成タンパク質を同定する目的
で分子量約１８ＫＤの糖蛋白質を精製し、そのアミノ酸
配列を決定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６
５，NO.１７，９６２８−９６３３，１９９０）。しか
し彼らは、この蛋白質の生物学的機能の解明には至って
いない。
より、軟骨内に存在する構成タンパク質を同定する目的
で分子量約１８ＫＤの糖蛋白質を精製し、そのアミノ酸
配列を決定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６
５，NO.１７，９６２８−９６３３，１９９０）。しか
し彼らは、この蛋白質の生物学的機能の解明には至って
いない。
【０００５】一方、骨折の治癒、各種軟骨疾患の治癒過
程においては、軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要
である。骨折治癒過程においては、骨折部位における炎
症反応、骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、
増殖し、軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨
組織に置換されて骨折治癒が完成する。すなわち骨折部
位での軟骨組織の形成は、骨折修復時の骨組織の基礎で
ある。また軟骨破壊、損傷を伴う軟骨疾患からの回復過
程においては、軟骨細胞の増殖が重要であることは明白
である。しかしこれら疾患に対する軟骨細胞増殖作用を
有する有効な薬剤は現在に至ってまだ存在しない。
程においては、軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要
である。骨折治癒過程においては、骨折部位における炎
症反応、骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、
増殖し、軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨
組織に置換されて骨折治癒が完成する。すなわち骨折部
位での軟骨組織の形成は、骨折修復時の骨組織の基礎で
ある。また軟骨破壊、損傷を伴う軟骨疾患からの回復過
程においては、軟骨細胞の増殖が重要であることは明白
である。しかしこれら疾患に対する軟骨細胞増殖作用を
有する有効な薬剤は現在に至ってまだ存在しない。
【０００６】本発明者らの一部は、先に牛胎児軟骨から
軟骨細胞の増殖能を有する約２６ＫＤの糖蛋白質（コン
ドロモデュリン−Ｉ）を初めて分離精製し、報告した
（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，Ｖｏｌ．１７５，NO.３，９７１
−９７７，１９９１；欧州特許公開第０４７３０８０号
公報）。更に本発明者らは、軟骨細胞の増殖能を有する
他の因子を得るべく鋭意検討を重ねた結果、分子量が約
１６ＫＤの新規な軟骨細胞増殖能を有する蛋白質を見い
出すに至り、本発明を完成するに至った。
軟骨細胞の増殖能を有する約２６ＫＤの糖蛋白質（コン
ドロモデュリン−Ｉ）を初めて分離精製し、報告した
（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，Ｖｏｌ．１７５，NO.３，９７１
−９７７，１９９１；欧州特許公開第０４７３０８０号
公報）。更に本発明者らは、軟骨細胞の増殖能を有する
他の因子を得るべく鋭意検討を重ねた結果、分子量が約
１６ＫＤの新規な軟骨細胞増殖能を有する蛋白質を見い
出すに至り、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、下記の
理化学的性質を有することを特徴とする新規なタンパク
質コンドロモデュリン−IIおよびその用途に存する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約１６，０００ドルトンである。
理化学的性質を有することを特徴とする新規なタンパク
質コンドロモデュリン−IIおよびその用途に存する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約１６，０００ドルトンである。
【０００８】軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増殖
因子共存下で増殖させる活性を有する。 軟骨細胞の分化機能を促進させる活性を有する。 本発明をさらに詳細に説明するに、本発明の軟骨細胞の
増殖及び分化機能の誘導を促す作用を有する新規なタン
パク質（以下「コンドロモデュリンタンパク質−II」ま
たは「コンドロモデュリン−II」と称することがあ
る。）は、例えば後述の実施例に詳述するように、牛胎
児軟骨を破砕し、これを遠心分離した上清を限外濾過膜
により分画、濃縮したものを、Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ
２００カラム（ファルマシア社製）等による分子ふるい
クロマトグラフィーによりさらに分画したのち、ヘパリ
ン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌアフィニティーカラム（トーソ
ー社製）に吸着させ、例えば０．５ＭＮａＣｌを含む緩
衝液で溶出し、次いで、ＹＭＣｐａｃｋ Ｃ８カラムク
ロマトグラフィー（ワイエムシー社製）等により溶出条
件を変えて繰り返し精製することによって得られる。精
製された本発明の蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が約１６，０００ドルトンで
あり、軟骨細胞を単独または繊維芽細胞増殖因子共存下
で増殖させる活性及び軟骨細胞の分化機能を促進する活
性を有する。
因子共存下で増殖させる活性を有する。 軟骨細胞の分化機能を促進させる活性を有する。 本発明をさらに詳細に説明するに、本発明の軟骨細胞の
増殖及び分化機能の誘導を促す作用を有する新規なタン
パク質（以下「コンドロモデュリンタンパク質−II」ま
たは「コンドロモデュリン−II」と称することがあ
る。）は、例えば後述の実施例に詳述するように、牛胎
児軟骨を破砕し、これを遠心分離した上清を限外濾過膜
により分画、濃縮したものを、Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ
２００カラム（ファルマシア社製）等による分子ふるい
クロマトグラフィーによりさらに分画したのち、ヘパリ
ン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌアフィニティーカラム（トーソ
ー社製）に吸着させ、例えば０．５ＭＮａＣｌを含む緩
衝液で溶出し、次いで、ＹＭＣｐａｃｋ Ｃ８カラムク
ロマトグラフィー（ワイエムシー社製）等により溶出条
件を変えて繰り返し精製することによって得られる。精
製された本発明の蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が約１６，０００ドルトンで
あり、軟骨細胞を単独または繊維芽細胞増殖因子共存下
で増殖させる活性及び軟骨細胞の分化機能を促進する活
性を有する。
【０００９】また本発明のコンドロモデュリンタンパク
質−IIは、配列表の配列番号：１に示すようなＮ末端ア
ミノ酸配列及び配列表の配列番号：２、３及び４に示す
ような部分アミノ酸配列を含む。より好ましくは、さら
に部分アミノ酸配列として配列表の配列番号：５から１
４に記載のアミノ酸配列で含むものが挙げられる。な
お、軟骨細胞の増殖活性及び分化機能の促進活性を損な
わない範囲でかかるアミノ酸の一部を除去、置換、修飾
または追加するなどの改変を行ったものも本発明のタン
パク質に含まれる。
質−IIは、配列表の配列番号：１に示すようなＮ末端ア
ミノ酸配列及び配列表の配列番号：２、３及び４に示す
ような部分アミノ酸配列を含む。より好ましくは、さら
に部分アミノ酸配列として配列表の配列番号：５から１
４に記載のアミノ酸配列で含むものが挙げられる。な
お、軟骨細胞の増殖活性及び分化機能の促進活性を損な
わない範囲でかかるアミノ酸の一部を除去、置換、修飾
または追加するなどの改変を行ったものも本発明のタン
パク質に含まれる。
【００１０】コンドロモデュリンタンパク質−IIの生理
活性は、例えば次のようにして測定される。軟骨細胞増
殖活性の評価のための細胞の取得、培養および評価方法
は、鈴木らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１４６，３１３−３２０，１９８７）に従
って行う。すなわちウサギより肋骨成長軟骨を分離し、
初代軟骨細胞を９６穴プレートを用いて培養した。細胞
がコンフルエントに達した後、０．０６〜２０ｎｇ／ｍ
ｌのコンドロモデュリンタンパク質−IIおよび０．０４
ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を加え、
［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定する。
活性は、例えば次のようにして測定される。軟骨細胞増
殖活性の評価のための細胞の取得、培養および評価方法
は、鈴木らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１４６，３１３−３２０，１９８７）に従
って行う。すなわちウサギより肋骨成長軟骨を分離し、
初代軟骨細胞を９６穴プレートを用いて培養した。細胞
がコンフルエントに達した後、０．０６〜２０ｎｇ／ｍ
ｌのコンドロモデュリンタンパク質−IIおよび０．０４
ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を加え、
［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定する。
【００１１】このコンドロモデュリンタンパク質−II
は、１ｎｇ〜１００μｇを骨折部位、軟骨疾患部位にコ
ラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン
酸、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、骨セメント、
ハイドロキシアパタイト、セラミックス、炭素繊維、フ
ィブリン糊等の外科手術用生体接着剤等の生体適合性担
体に混合、含浸、塗布することにより、局所的に外科手
術によって投与または注入する。また、静脈中、皮下へ
投与することにより骨折、各種軟骨疾患の治療薬として
も利用が可能である。
は、１ｎｇ〜１００μｇを骨折部位、軟骨疾患部位にコ
ラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン
酸、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、骨セメント、
ハイドロキシアパタイト、セラミックス、炭素繊維、フ
ィブリン糊等の外科手術用生体接着剤等の生体適合性担
体に混合、含浸、塗布することにより、局所的に外科手
術によって投与または注入する。また、静脈中、皮下へ
投与することにより骨折、各種軟骨疾患の治療薬として
も利用が可能である。
【００１２】
【発明の効果】本発明に係わるコンドロモデュリンタン
パク質−IIは、骨折や各種の軟骨疾患等の治療薬として
の有用性が期待される。
パク質−IIは、骨折や各種の軟骨疾患等の治療薬として
の有用性が期待される。
【００１３】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り以
下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１．（コンドロモデュリンタンパク質−IIの精
製） 数ｍｍ角に破砕した牛胎児軟骨５ｋｇを１０倍量（体積
／重量）の緩衝液Ａ（１Ｍグアニジン塩酸、０．１Ｍ６
−アミノ−ｎ−カプロン酸、０．０２Ｍ２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．０）にポリトロン
を用いてホモゲナイズした。このホモゲネートを４℃で
４８時間攪拌して抽出を行ったのち、１０，０００×g
、２０分間遠心分離して上清を回収した。この上清に
冷アセトンを終濃度４５％になるようにゆっくりと加
え、生じた沈澱を４，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の
遠心分離で除去した。この上清に終濃度６５％になるよ
うに冷アセトンをゆっくりと加え、生じた沈澱を４，０
００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心分離により回収し
た。このアセトン４５〜６５％画分のペレットを６ｌ
（リットル）の緩衝液Ｂ（４Ｍグアニジン塩酸、０．１
Ｍ６−アミノ−ｎ−カプロン酸、１ＭＮａＣｌ、０．０
２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０）に４℃で溶解した。１
０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心により不溶物
を沈澱させて除去し、上清をアミコンＸＭ３００限外濾
過膜（アミコン社製）により分画した。限外濾過膜通過
画分を次にアミコンＸＭ５０限外濾過膜（アミコン社
製）にて分画し、通過画分をさらにアミコンＹＭ１０限
外濾過膜（アミコン社製）にて５００ｍｌまで濃縮し
た。
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り以
下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１．（コンドロモデュリンタンパク質−IIの精
製） 数ｍｍ角に破砕した牛胎児軟骨５ｋｇを１０倍量（体積
／重量）の緩衝液Ａ（１Ｍグアニジン塩酸、０．１Ｍ６
−アミノ−ｎ−カプロン酸、０．０２Ｍ２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．０）にポリトロン
を用いてホモゲナイズした。このホモゲネートを４℃で
４８時間攪拌して抽出を行ったのち、１０，０００×g
、２０分間遠心分離して上清を回収した。この上清に
冷アセトンを終濃度４５％になるようにゆっくりと加
え、生じた沈澱を４，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の
遠心分離で除去した。この上清に終濃度６５％になるよ
うに冷アセトンをゆっくりと加え、生じた沈澱を４，０
００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心分離により回収し
た。このアセトン４５〜６５％画分のペレットを６ｌ
（リットル）の緩衝液Ｂ（４Ｍグアニジン塩酸、０．１
Ｍ６−アミノ−ｎ−カプロン酸、１ＭＮａＣｌ、０．０
２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０）に４℃で溶解した。１
０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心により不溶物
を沈澱させて除去し、上清をアミコンＸＭ３００限外濾
過膜（アミコン社製）により分画した。限外濾過膜通過
画分を次にアミコンＸＭ５０限外濾過膜（アミコン社
製）にて分画し、通過画分をさらにアミコンＹＭ１０限
外濾過膜（アミコン社製）にて５００ｍｌまで濃縮し
た。
【００１４】この濃縮液３０ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙ１
Ｓ２００カラム（直径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）
を使い、溶出液に緩衝液Ｂを用いて分子篩クロマトグラ
フィーを行い分画した。溶出液２３０ｍｌから３１０ｍ
ｌの間の活性画分を集め、蒸留水に対して４℃で２日間
透析した。透析終了した液を緩衝液Ｃ（０．１５ＭＮａ
Ｃｌ、０．０３％ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、０．０２
５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４）で平衡化したヘパリ
ン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにて分画した。すなわ
ち、緩衝液Ｃにてカラムを十分洗浄した後、０．５ＭＮ
ａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出した。この０．５Ｍ溶出画
分を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む３０％
アセトニトリル／イソプロピルアルコール（６．５／
３．５、体積／体積）で平衡化したＹＭＣｐａｃｋＣ８
カラム（ＡＰ−８０２ Ｓ−５ ３００Ａ Ｃ８、０．
４６×１５ｃｍ）に添加し、同有機溶媒濃度３０％から
４５％まで３０分間、４５％から８０％まで１０分間の
濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。紫外吸収測
定（２１５nm）による溶出パターンを図１に示した。こ
のうち１８．５分に溶出した画分を真空状態で乾燥し
た。この標品を用いてアミノ酸配列の解析を行った。
Ｓ２００カラム（直径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）
を使い、溶出液に緩衝液Ｂを用いて分子篩クロマトグラ
フィーを行い分画した。溶出液２３０ｍｌから３１０ｍ
ｌの間の活性画分を集め、蒸留水に対して４℃で２日間
透析した。透析終了した液を緩衝液Ｃ（０．１５ＭＮａ
Ｃｌ、０．０３％ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、０．０２
５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４）で平衡化したヘパリ
ン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにて分画した。すなわ
ち、緩衝液Ｃにてカラムを十分洗浄した後、０．５ＭＮ
ａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出した。この０．５Ｍ溶出画
分を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む３０％
アセトニトリル／イソプロピルアルコール（６．５／
３．５、体積／体積）で平衡化したＹＭＣｐａｃｋＣ８
カラム（ＡＰ−８０２ Ｓ−５ ３００Ａ Ｃ８、０．
４６×１５ｃｍ）に添加し、同有機溶媒濃度３０％から
４５％まで３０分間、４５％から８０％まで１０分間の
濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。紫外吸収測
定（２１５nm）による溶出パターンを図１に示した。こ
のうち１８．５分に溶出した画分を真空状態で乾燥し
た。この標品を用いてアミノ酸配列の解析を行った。
【００１５】尚、上記の各精製工程において、後述の実
施例６に記載の方法で軟骨細胞へのチミジン取込み活性
を指標としてコンドロモデュリンタンパク質−IIを分画
精製した。 実施例２．（コンドロモデュリンタンパク質−IIのアミ
ノ酸配列解析） 実施例１で精製したコンドロモデュリンタンパク質−II
を６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミン
４酢酸塩、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５中で、２−メルカ
プトエタノールにより４０℃、２時間還元した後、等濃
度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス下、室温、遮光下
で１時間反応させカルボキシメチル化を行った。反応後
１％酢酸に対して暗所で十分透析した後、真空状態で乾
燥後、５０％ＴＦＡ６０μｌに溶解し、ポリブレン処理
したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーでエドマ
ン分解し、Ｎ末端域のアミノ酸配列を決定した。フェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は三菱化
成社製“ＭＣＩｇｅｌＯＤＳ１ＨＵ”（０．４６×１５
ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液
ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセトニトリ
ル）による単一溶媒溶出法を、流速１．２ｍｌ／分、温
度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍの
吸光度で行った。
施例６に記載の方法で軟骨細胞へのチミジン取込み活性
を指標としてコンドロモデュリンタンパク質−IIを分画
精製した。 実施例２．（コンドロモデュリンタンパク質−IIのアミ
ノ酸配列解析） 実施例１で精製したコンドロモデュリンタンパク質−II
を６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミン
４酢酸塩、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５中で、２−メルカ
プトエタノールにより４０℃、２時間還元した後、等濃
度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス下、室温、遮光下
で１時間反応させカルボキシメチル化を行った。反応後
１％酢酸に対して暗所で十分透析した後、真空状態で乾
燥後、５０％ＴＦＡ６０μｌに溶解し、ポリブレン処理
したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーでエドマ
ン分解し、Ｎ末端域のアミノ酸配列を決定した。フェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は三菱化
成社製“ＭＣＩｇｅｌＯＤＳ１ＨＵ”（０．４６×１５
ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液
ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセトニトリ
ル）による単一溶媒溶出法を、流速１．２ｍｌ／分、温
度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍの
吸光度で行った。
【００１６】また、カルボキシメチル化したコンドロモ
デュリンタンパク質−IIを、５Ｍ尿素を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解し、リジルエンドペプ
チダーゼ（和光純薬製）により、酵素：基質＝１：２０
０で、３７℃、６時間作用させた後、０．１％ＴＦＡで
平衡化したＢａｋｅｒｂｏｕｄ Ｃ８カラム（Ｂａｋｅ
ｒｂｏｎｄTM ＷＰ Ｏｃｔｙｌ、０．４６×２５ｃ
ｍ）に添加し、アセトニトリル濃度０％から６０％まで
６０分間の濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。
２１５ｎｍの吸光度による溶出パターンを図２に示す。
このうち３１分、３３分、３６．５分に溶出したピーク
を真空状態で乾燥した後、同様にシークエンサーにより
エドマン分解した。
デュリンタンパク質−IIを、５Ｍ尿素を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解し、リジルエンドペプ
チダーゼ（和光純薬製）により、酵素：基質＝１：２０
０で、３７℃、６時間作用させた後、０．１％ＴＦＡで
平衡化したＢａｋｅｒｂｏｕｄ Ｃ８カラム（Ｂａｋｅ
ｒｂｏｎｄTM ＷＰ Ｏｃｔｙｌ、０．４６×２５ｃ
ｍ）に添加し、アセトニトリル濃度０％から６０％まで
６０分間の濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。
２１５ｎｍの吸光度による溶出パターンを図２に示す。
このうち３１分、３３分、３６．５分に溶出したピーク
を真空状態で乾燥した後、同様にシークエンサーにより
エドマン分解した。
【００１７】この結果、このタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列は配列表の配列番号：１に示す通りであり、ま
た、３１分、３３分及び３６．５分に溶出した内部部分
配列は、夫々配列表の配列番号：２、３及び４に示す通
りであることが明らかとなった。また、この精製したコ
ンドロモデュリンタンパク質−IIを１２．５％ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により解析したところ、
コンドロモデュリンタンパク質−IIの分子量は約１６，
０００ドルトンであることが明らかとなった。 実施例３．上記実施例２において、さらに１８分、３０
分及び３２．５分に溶出した画分をシークエンサーによ
りエドマン分解したところ、これらの内部部分配列は、
夫々配列表の配列番号：５、６及び７に示す通りである
ことが明らかとなった。 実施例４．カルボキシメチル化したコンドロモデュリン
タンパク質−IIを、７０％ギ酸に溶解し、蛋白中のメチ
オニン残基の１００倍モル量の臭化シアンにより、３０
℃、１５時間切断した後、０．１％ＴＦＡで平衡化した
Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ
TM ＷＰ Ｏｃｔｙｌ ０．４６×２５ｃｍ）に添加
し、アセトニトリル濃度０％から６０％まで４０分間の
濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。２１５ｎｍ
の吸光度による溶出パターンを、図３に示す。
酸配列は配列表の配列番号：１に示す通りであり、ま
た、３１分、３３分及び３６．５分に溶出した内部部分
配列は、夫々配列表の配列番号：２、３及び４に示す通
りであることが明らかとなった。また、この精製したコ
ンドロモデュリンタンパク質−IIを１２．５％ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により解析したところ、
コンドロモデュリンタンパク質−IIの分子量は約１６，
０００ドルトンであることが明らかとなった。 実施例３．上記実施例２において、さらに１８分、３０
分及び３２．５分に溶出した画分をシークエンサーによ
りエドマン分解したところ、これらの内部部分配列は、
夫々配列表の配列番号：５、６及び７に示す通りである
ことが明らかとなった。 実施例４．カルボキシメチル化したコンドロモデュリン
タンパク質−IIを、７０％ギ酸に溶解し、蛋白中のメチ
オニン残基の１００倍モル量の臭化シアンにより、３０
℃、１５時間切断した後、０．１％ＴＦＡで平衡化した
Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ
TM ＷＰ Ｏｃｔｙｌ ０．４６×２５ｃｍ）に添加
し、アセトニトリル濃度０％から６０％まで４０分間の
濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。２１５ｎｍ
の吸光度による溶出パターンを、図３に示す。
【００１８】この内、２９分に溶出したピークを真空状
態で乾燥した後、２Ｍ尿素を含む０．１％炭酸水素アン
モニウム溶液に溶解し、スタフィロコッカス Ｖ８ プ
ロテアーゼにより酵素：基質＝１：５０で、３７℃、１
５時間作用させた後、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラム
により上記条件にて６０分間の溶出を行い、各ピークを
分取した。このときの溶出パターンを、図４に示す。
態で乾燥した後、２Ｍ尿素を含む０．１％炭酸水素アン
モニウム溶液に溶解し、スタフィロコッカス Ｖ８ プ
ロテアーゼにより酵素：基質＝１：５０で、３７℃、１
５時間作用させた後、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラム
により上記条件にて６０分間の溶出を行い、各ピークを
分取した。このときの溶出パターンを、図４に示す。
【００１９】この内、２８．５分、３３．５分、３７分
及び３９分に溶出した画分を真空状態で乾燥した後、シ
ークエンサーによりエドマン分解したところ、これらの
内部部分配列は、夫々配列表の配列番号：８、９、１０
及び１１に示す通りであることが明らかとなった。 実施例５．カルボキシメチル化したコンドロモデュリン
タンパク質−IIを、１Ｍ Ｎ−エチルモルホリン／酢酸
緩衝液に溶解し、３μｌ無水酢酸を１５分毎に２回、室
温にて加えた後、真空状態で乾燥させ、水１００μｌを
加えた後さらに真空状態で乾燥させる。
及び３９分に溶出した画分を真空状態で乾燥した後、シ
ークエンサーによりエドマン分解したところ、これらの
内部部分配列は、夫々配列表の配列番号：８、９、１０
及び１１に示す通りであることが明らかとなった。 実施例５．カルボキシメチル化したコンドロモデュリン
タンパク質−IIを、１Ｍ Ｎ−エチルモルホリン／酢酸
緩衝液に溶解し、３μｌ無水酢酸を１５分毎に２回、室
温にて加えた後、真空状態で乾燥させ、水１００μｌを
加えた後さらに真空状態で乾燥させる。
【００２０】乾燥したタンパク質を、２Ｍ尿素を含む
０．１％炭酸水素アンモニウム溶液に溶解し、ＴＰＣＫ
−トリプシンにより、酵素：基質＝１：５０で、３７
℃、１５時間作用させた後、キモトリプシンにより酵
素：基質＝１：５０で、３７℃、１５時間作用させる。
この後実施例２と同様の条件により溶出を行い、各ピー
クに対応する画分を分取した。その溶出パターンを、図
５に示す。
０．１％炭酸水素アンモニウム溶液に溶解し、ＴＰＣＫ
−トリプシンにより、酵素：基質＝１：５０で、３７
℃、１５時間作用させた後、キモトリプシンにより酵
素：基質＝１：５０で、３７℃、１５時間作用させる。
この後実施例２と同様の条件により溶出を行い、各ピー
クに対応する画分を分取した。その溶出パターンを、図
５に示す。
【００２１】この内、２９分、３９分及び４２．５分に
溶出した画分を真空状態で乾燥した後、シークエンサー
によりエドマン分解したところ、これらの内部部分配列
は、夫々配列表の配列番号：１２、１３及び１４に示す
通りであることが明らかとなった。以上の実施例から明
らかになったＮ末端配列及び配列表の配列番号：２から
１４の部分配列を並べ合わせると、完全長のコンドロモ
デュリンタンパク質−IIのアミノ酸配列は、配列表の配
列番号：１５で表される。 実施例６．（コンドロモデュリンタンパク質−IIの活性
の評価） 評価のための細胞の取得、培養、及び評価方法は鈴木ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４７，３１３−３２０、１９８７年）に従って行
った。すなわち４００〜６００g の若いニュージーラン
ド兎より肋骨成長軟骨を分離し、分離した細胞をＨａ
ｍ’ｓＦ−１２培地とダルベッコ修飾培地の１：１混合
培養液（以下ＦＡＤ培養液と称す）に、１０％牛胎児血
清を加えたものに対し、１０5 細胞／ｍｌとなるよう懸
濁した。この細胞懸濁物０．１ｍｌを、タイプＩコラー
ゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ）で一夜コートし、ＦＡＤ培
養液で一度洗浄した９６穴培養プレートに蒔き、５％二
酸化炭素を含む空気存在下に３７℃で培養した。培地は
一日置きに交換した。
溶出した画分を真空状態で乾燥した後、シークエンサー
によりエドマン分解したところ、これらの内部部分配列
は、夫々配列表の配列番号：１２、１３及び１４に示す
通りであることが明らかとなった。以上の実施例から明
らかになったＮ末端配列及び配列表の配列番号：２から
１４の部分配列を並べ合わせると、完全長のコンドロモ
デュリンタンパク質−IIのアミノ酸配列は、配列表の配
列番号：１５で表される。 実施例６．（コンドロモデュリンタンパク質−IIの活性
の評価） 評価のための細胞の取得、培養、及び評価方法は鈴木ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４７，３１３−３２０、１９８７年）に従って行
った。すなわち４００〜６００g の若いニュージーラン
ド兎より肋骨成長軟骨を分離し、分離した細胞をＨａ
ｍ’ｓＦ−１２培地とダルベッコ修飾培地の１：１混合
培養液（以下ＦＡＤ培養液と称す）に、１０％牛胎児血
清を加えたものに対し、１０5 細胞／ｍｌとなるよう懸
濁した。この細胞懸濁物０．１ｍｌを、タイプＩコラー
ゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ）で一夜コートし、ＦＡＤ培
養液で一度洗浄した９６穴培養プレートに蒔き、５％二
酸化炭素を含む空気存在下に３７℃で培養した。培地は
一日置きに交換した。
【００２２】ＤＮＡ合成のアッセイは以下のごとく行っ
た。すなわち上記細胞が９６穴プレート中でコンフルエ
ントに達した後、細胞を０．３％牛胎児血清を含むＦＡ
Ｄ培養液で２４時間培養した。次に培養液を０．０６〜
２０ｎｇ／ｍｌコンドロモデュリンタンパク質−II、
０．０４ｎｇＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、０．３％
牛胎児血清を含むＦＡＤ培養液０．１ｍｌを加え２２時
間培養した。さらに１０μｌの［3Ｈ］チミジン（１３
０μＣｉ／ｍｌ）を加え、４時間培養した後、細胞を氷
冷した燐酸緩衝食塩水（２０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で３回洗った。これを
５％トリクロロ酢酸で抽出し、さらにエタノール：エー
テル＝３：１（体積比）で抽出した。抽出後の沈澱を
０．３Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し、これを１／２０容
の６Ｍ塩酸で中和したものをシンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
た。すなわち上記細胞が９６穴プレート中でコンフルエ
ントに達した後、細胞を０．３％牛胎児血清を含むＦＡ
Ｄ培養液で２４時間培養した。次に培養液を０．０６〜
２０ｎｇ／ｍｌコンドロモデュリンタンパク質−II、
０．０４ｎｇＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、０．３％
牛胎児血清を含むＦＡＤ培養液０．１ｍｌを加え２２時
間培養した。さらに１０μｌの［3Ｈ］チミジン（１３
０μＣｉ／ｍｌ）を加え、４時間培養した後、細胞を氷
冷した燐酸緩衝食塩水（２０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で３回洗った。これを
５％トリクロロ酢酸で抽出し、さらにエタノール：エー
テル＝３：１（体積比）で抽出した。抽出後の沈澱を
０．３Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し、これを１／２０容
の６Ｍ塩酸で中和したものをシンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
【００２３】図６にその結果を示す。１２００ｎｇ／ｍ
ｌのコンドロモデュリンタンパク質−IIを加えたとき
に、ＦＧＦ非添加時（４０６６±８６４ｄｐｍ／ｗｅｌ
ｌ）の約３．５倍、０．４ｎｇＦＧＦ添加時（１０６２
６±１３２７ｄｐｍ／ｗｅｌｌ）の約１．４倍の放射性
チミジンの取り込みが見られ、コンドロモデュリンタン
パク質−IIが強力な軟骨細胞の増殖促進効果を有してい
ることが明らかとなった。 ［配列表］
ｌのコンドロモデュリンタンパク質−IIを加えたとき
に、ＦＧＦ非添加時（４０６６±８６４ｄｐｍ／ｗｅｌ
ｌ）の約３．５倍、０．４ｎｇＦＧＦ添加時（１０６２
６±１３２７ｄｐｍ／ｗｅｌｌ）の約１．４倍の放射性
チミジンの取り込みが見られ、コンドロモデュリンタン
パク質−IIが強力な軟骨細胞の増殖促進効果を有してい
ることが明らかとなった。 ［配列表］
【００２４】配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys １０ Ser Ser Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Gly ２０ His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr Ala Gln Arg ３０ Asn Gln Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val ４０ Leu ４１
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Asn Ala Ile Asn Asn Gly Val Arg Ile ９
【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys Ser １０ Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe １９
【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His １０ Ile Glu Asn Cys Asp Leu Ser Asp １８
【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Ile Met Gly Gln Glu Lys ６
【００２９】配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Met Phe Tyr Ile Lys ５
【００３０】配列番号：７ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys ９
【００３１】配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Asn Cys Asp Leu Ser Asp Pro Thr Val Tyr １０ Leu １１
【００３２】配列番号：９ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Phe Tyr Ile Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly １０ Ser Ile Lys Lys １４
【００３３】配列番号：１０ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys １０ Val Tyr Pro Gly １４
【００３４】配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Lys Pro Tyr Lys Asn Lys Asn Ala Ile Asn １０ Asn Gly Val Arg Ile Ser Gly Gly １８
【００３５】配列番号：１２ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Ala Pro Phe Thr Gly Lys Ile Met Gly Gln １０ Glu Lys Pro Tyr Lys Asn Lys Asn Ala １９
【００３６】配列番号：１３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Ile Ser Gly Gly Gly Phe Cys Ile Lys Met １０ Phe １１
【００３７】配列番号：１４ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Lys Gly Ser Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu １０ Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys Val Tyr ２０ Pro Gly Ile Gln Ser His Ile ２７
【００３８】配列番号：１５ 配列の長さ：１３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys １０ Ser Ser Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Gly ２０ His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr Ala Gln Arg ３０ Asn Gln Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val ４０ Leu Cys Ser Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala ５０ Pro Phe Thr Gly Lys Ile Met Gly Gln Glu ６０ Lys Pro Tyr Lys Asn Lys Asn Ala Ile Asn ７０ Asn Gly Val Arg Ile Ser Gly Gly Gly Phe ８０ Cys Ile Lys Met Phe Tyr Ile Lys Pro Ile ９０ Lys Tyr Lys Gly Ser Ile Lys Lys Gly Glu １００ Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys １１０ Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His １２０ Ile Glu Asn Cys Asp Leu Ser Asp Pro Thr １３０ Val Tyr Leu １３３
【図１】実施例１のＹＭＣｐａｃｋ Ｃ８カラムによる
溶出パターンを示す。
溶出パターンを示す。
【図２】実施例２のＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラムに
よる溶出パターンを示す。
よる溶出パターンを示す。
【図３】実施例４のＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラムに
よる溶出パターンを示す。
よる溶出パターンを示す。
【図４】実施例４のＢａｋｅｒｂｏｕｎｄ Ｃ８カラム
で２９分に溶出した画分を、さらにスタフィロコッカス
Ｖ８プロテアーゼ処理したＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８
カラムによる溶出パターンを示す。
で２９分に溶出した画分を、さらにスタフィロコッカス
Ｖ８プロテアーゼ処理したＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８
カラムによる溶出パターンを示す。
【図５】実施例５のＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ８カラムに
よる溶出パターンを示す。
よる溶出パターンを示す。
【図６】本願コンドロモデュリンタンパク質−IIのＤＮ
Ａ合成活性を示す。
Ａ合成活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ (72)発明者 上園 昭人 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 田中 秀穂 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 寺西 豊 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする新規なタンパク質コンドロモデュリン−II。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約１６，０００ドルトンである。 軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増殖因子共存下で
増殖させる活性を有する。 軟骨細胞の分化機能を促進させる活性を有する。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：１で表わされるＮ末
端アミノ酸配列及び配列表の配列番号：２、３及び４で
表わされる部分アミノ酸配列を有することを特徴とする
請求項１記載のタンパク質コンドロモデュリン−II。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：１で表わされるＮ末
端アミノ酸配列及び配列表の配列番号：２から１４で表
わされる部分アミノ酸配列を有することを特徴とする請
求項１記載のタンパク質コンドロモデュリン−II。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：１５に記載のアミノ
酸配列で表されることを特徴とする請求項１記載のタン
パク質コンドロモデュリン−II。 - 【請求項５】 請求項１に記載のタンパク質コンドロモ
デュリン−IIを有効成分とする医薬組成物。 - 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質コンドロモ
デュリン−IIを有効成分とする軟骨細胞増殖剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20803492A JP3232672B2 (ja) | 1991-08-05 | 1992-08-04 | 新規なタンパク質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-195495 | 1991-08-05 | ||
| JP19549591 | 1991-08-05 | ||
| JP20803492A JP3232672B2 (ja) | 1991-08-05 | 1992-08-04 | 新規なタンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05255398A true JPH05255398A (ja) | 1993-10-05 |
| JP3232672B2 JP3232672B2 (ja) | 2001-11-26 |
Family
ID=26509152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20803492A Expired - Lifetime JP3232672B2 (ja) | 1991-08-05 | 1992-08-04 | 新規なタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3232672B2 (ja) |
-
1992
- 1992-08-04 JP JP20803492A patent/JP3232672B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3232672B2 (ja) | 2001-11-26 |
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