JPH05260997A

JPH05260997A - 測定用試薬とその測定方法

Info

Publication number: JPH05260997A
Application number: JP6074292A
Authority: JP
Inventors: Mayumi Hirano; 真弓平野; Takanari Shiraishi; 登業白石; Tadao Suzuki; 直生鈴木
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1992-03-17
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1993-10-12

Abstract

(57)【要約】【構成】ヘキソキナーゼまたはグルコキシナーゼ、お
よびグルコース−６−リン酸脱水素酵素とともに、抗ア
デニレートキナーゼ抗体を含有してなることを特徴とす
る測定用試薬と、これを用いた測定方法。【効果】生体液中のアデニレートキナーゼ活性の影響
を除去して、グルコース、ＡＴＰ、クレアチンキナー
ゼ、その他の各種ホスホトランスフェラーゼ、各種グリ
コシダーゼなどを正確に測定することができ、各種臨床
検査等におる診断精度が向上する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、測定用試薬とその測
定方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、各種生体成分等の分析に有用な測定用試薬と、それ
を用いた測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、たとえば生体液中のグルコー
ス、ＡＴＰ、ホスホトランスフェラーゼ、グリコシター
ゼ等の活性を分析、定量するためには、種々の測定方法
とそのための測定用試薬が用いられているが、なかでも
ヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと略記する）またはグルコ
キナーゼ（以下、Ｇｌｃｋと略記する）と、グルコース
−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記す
る）を用いた測定方法（以下、ＨＫ（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６
ＰＤＨ法と記載する）は、原理的に最も優れ、検体の検
出感度および再現性が良好であることから、広く用いら
れている。とくに臨床検査分野においては、この測定法
を用いたホスホトランスフェラーゼの一種であるクレア
チンキナーゼ（以下、ＣＫと略記する）活性の測定は、
筋疾患、神経性疾患、中枢神経系疾患、精神病、心疾患
等の診断に日常的に行なわれている重要な検査項目の一
つである。

【０００３】たとえば、このＨＫ（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６Ｐ
ＤＨ法の測定原理としてその反応式を示すと次の通りと
なる。

【０００４】

【化１】

【０００５】

【化２】

【０００６】

【化３】

【０００７】（これらの各反応式において、ＣＰはクレ
アチンリン酸、Ｃはクレアチン、ＡＤＰはアデノシン−
５′−二リン酸、ＡＴＰはアデノシン−５′−三リン
酸、ＮＡＤＰはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸、ＮＡＤＰＨは環元型β−ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸、６−ＰＧＡは６−ホスホ
グルコン酸である。）上記の反応式１、２および３を触媒する酵素が、各々、
ＣＫ、ＨＫ（Ｇｌｃｋ）、Ｇ６ＰＤＨである。

【０００８】ところで、このような測定方法がその分析
の対象とする生体内の細胞には、アデニレートキナーゼ
（以下、ＡｄＫと略記する）という酵素が広く分布して
いる。このＡｄＫは、以下にその反応式を示すように、
Ｍｇ²⁺の存在下で３つのヌクレオシド間のリン酸を可塑
的に転移する活性を有し、しかもその活性は、平衡がほ
ぼ１と極めて高く、血清中に存在してＣＫの測定に誤差
を生じる原因となっている。

【０００９】

【化４】

【００１０】このため、このような検体中のＡｄＫ活性
によってＡＤＰからＡＴＰが生成するのを抑制するた
め、従来は、測定試薬中にＡｐ₅ＡやＡＭＰを添加する
ようにしていた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＨＫ
（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６ＰＤＨ法によって測定する血液を溶
血した場合には、血清中に多量のＡｄＫが含まれるた
め、従来のＡｐ₅ＡやＡＭＰを用いた方法ではＡｄＫ活
性を十分に抑制することができず、グルコースやＣＫ等
を正確に測定することができなかった。このため、この
ような測定誤差の発生は、明らかに臨床検査における精
度管理上の大きな問題となっていた。

【００１２】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、従来のＨＫ（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６ＰＤ
Ｈ共役酵素系による測定法の欠点を解消し、生体液中の
ＡｄＫに影響されることなく、そのグルコースやＣＫ等
の成分を正確に測定することのできる方法と、そのため
の測定用試薬を提供することを目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ＨＫまたはＧｌｃｋ、およびＧ
６ＰＤＨとともに、抗ＡｄＫ抗体を含有してなることを
特徴とする生体活性測定用試薬を提供する。また、この
発明は、上記測定用試薬を用いることを特徴とする測定
方法をも提供する。

【００１４】すなわち、この発明の発明者らは、生体液
中のＡｄＫを特異的に認識する抗ＡｄＫ抗体あるいはそ
のＡｄＫ活性を阻害する抗ＡｄＫ抗体を新たに作製し、
これをＨＫ（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６ＰＤＨ共役酵素系に含有
させることによって、ＡｄＫ活性の影響を受けることな
く、各種の生体成分を正確に測定することのできる測定
用試薬とこれを用いる測定方法を確立した。

【００１５】以下、この発明の構成およびその好ましい
態様について詳しく説明する。この発明に使用する抗Ａ
ｄＫ抗体は、測定試薬中の各種触媒酵素のうち、ＡｄＫ
にのみ特異的に反応してその活性を阻害し、他の酵素活
性には影響を及ぼさないことを特徴とし、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体のいずれもが使用しう
る。

【００１６】このような抗ＡｄＫ抗体を作製する場合の
抗原としては、全ての種に由来するＡｄＫを使用するこ
とができるが、臨床化学的には、その抗血清がヒトのＡ
ｄＫと交差する哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ブタ、
ウシ等の由来で、かつ被免疫動物とは異なる種から得る
のが好ましい。このようなＡｄＫは、Ｎｏｄａ、Ｋｕｂ
ｙ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２６，５４１−５４
９（１９５７））の方法に従って単離、精製することが
できる。

【００１７】抗ＡｄＫポリクローナル抗体を得るには、
例えばMonoclonal Antibodies:Principles and Practic
e Second Edition, ２８１頁〜２９３頁記載の方法に従
って、ＡｄＫを哺乳動物好ましくはウサギに免疫し、血
清を集めて、血清中の抗体をｐＨ７．４でプロテインＡ
に結合させ、ｐＨ４．０で溶出させて抗体を得ることが
できる。

【００１８】一方、抗ＡｄＫモノクローナル抗体を得る
には、まず、抗ＡｄＫ活性阻害モノクローナル産生能を
有するハイブリドーマ細胞株を得る。このようなハイブ
リドーマ細胞株を得るには、例えばMonoclonal Antibod
ies:Principles and Practice Second, ５９頁〜１０３
頁記載の方法に従えばよい。抗体を産出しているハイブ
リドーマの検索方法としては、培養上清の阻害活性を知
ることによって行うことができる。例えば、その上澄液
をＡｄＫ活性測定用試薬系に添加して、一定量のＡｄＫ
活性を測定し、対照の上澄液無添加時の活性に比較し
て、低い値を示した上澄液の穴の株を選択すればよい。
次にこのようなハイブリドーマを培養して、その培養液
等から、たとえばプロテインＡを用いたアフィニティク
ロマトグラフィーを用いて抗体を得る。得られた抗体は
そのままでも、あるいはペプシン、パパインなどのタン
パク分解酵素で処理して、Ｆａb 、Ｆａｂ′、Ｆ（ａ
ｂ′） ₂のフラグメントの形で用いることもできる。

【００１９】このようにして得た抗ＡｄＫ抗体を含有す
るこの発明のＨＫ（Ｇｌｃｋ）／Ｇ６ＰＤＨ共役酵素系
測定用試薬は、例えばグルコース、ＡＴＰ、ＣＫ、その
他の各種ホスホトランスフェラーゼ、各種グリコシダー
ゼ、その他の生体成分の測定に応用することができる。
したがて、測定用試薬の他の構成成分は、これらの目的
とする測定物の種類により適宜選んで配合すればよい。
組成物中の各成分の濃度は公知技術を適応すればよい
が、一般には次のような濃度が好ましい。例えばＡＴＰ
またはホスホトランスフェラーゼにより生成したＡＴＰ
を測定する場合には、ＨＫ（Ｇｌｃｋ）を０．１〜２０
ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを０．１〜２０ユニット／
ｍｌ、測定すべきホスホトランスフェラーゼの基質（リ
ン酸供与体）を０〜４０ｍＭ、抗ＡｄＫ抗体を０．００
１〜５ｍｇ／ｍｌ、ＡＤＰを０．１〜２０ｍＭ、グルコ
ースを０．１〜４０ｍＭ、ＮＡＤあるいはＮＡＤＰを
０．１〜１０ｍＭ、マグネシウムを含む塩を１〜１０ｍ
Ｍ、カリウムイオンまたはアンモニウムイオンを０．１
ｍＭ〜２ｍＭ、各々、１０〜５００ｍＭのトリス一塩
酸、イミダゾール酢酸などの緩衝液（ｐＨ５〜１０）に
溶解させればよい。また、グルコースやグルコシダーゼ
により生成したグルコースを測定する場合には、ＨＫ
（Ｇｌｃｋ）を０．１〜２０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤ
Ｈを０．１〜２０ユニット／ｍｌ、測定すべきグリコシ
ダーゼの基質を０〜４０ｍＭ、抗ＡｄＫ抗体を０．００
１〜５ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＰを０．１〜２０ｍＭ、ＮＡＤ
あるいはＮＡＤＰを０．１〜１０ｍＭ、マグネシウムを
含む塩を１〜１０ｍＭ、さらにカリウムイオンまたはア
ンモニウムイオンを０．１〜２ｍＭとなるように、各
々、１０〜５００ｍＭのトリス−塩酸、イミダゾール酢
酸などの緩衝液（ｐＨ５〜１０）に溶解させればよい。

【００２０】このようにして調製した測定用試薬は、た
とえば特開平１−２５７２６６号公報または特公昭５８
−２５２４９公報に記載の方法に従って、上記の各生体
液成分の測定に共することができる。次に、実施例を示
してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、こ
の発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００２１】

【実施例】参考例１抗ＡｄＫ抗体の作成精製ＡｄＫ１００μｇをウサギに初回免疫した後、各々
３〜６週間の間隔をおいて２回の追加免疫を行ない、５
〜７日後にその血液２００ｍｌを採血した。

【００２２】血清を集めて５０％飽和の硫安により塩析
を行い、沈澱をグリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
９）に溶解し、透析して、プロテインＡカラムに吸着さ
せ、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）により溶
出して精製抗ＡｄＫ抗体を得た。実施例１ＣＫ活性の測定（１）測定用試薬および試料の調製各々、以下の組成からなる試薬および試料を調製した。

【００２３】第１試料：バチルス・ステアロサーモフィラス由来Ｇｌｃｋ（生化学工業社製）１．４Ｕ／ｍｌロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨ（オリエンタル酵母工業社製）１．２ｍＭＮＡＤＰ０．７５ｍＭグルコース２５ｍＭＮ−アセチルシステイン１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム１２．５ｍＭアジ化ナトリウム１０ｍＭＥＤＴＡ２．５ｍＭイソダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）１５０ｍＭ第２試薬：ＣＰ１００ｍＭアジ化ナトリウム１０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．５）２５ｍＭ試料：市販のウサギ筋肉由来のＣＫ約２０００Ｕ／ｌ
を蒸留水にて約２５０Ｕ／ｌに希釈した溶液を使用。（２）試験方法まず参考例１で得た抗ＡｄＫ抗体を溶液化し、これを
０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で透析
し、１００μｇ／ｍｌに調製して試験管の壁面に吸着さ
せた。ついで、この試験管に第１試薬０．５ｍｌおよび
ＣＫ溶液を加え、光路長１ｃｍのセル内で３７℃、３分
間保温した後、第２試薬０．１２５ｍｌを添加し、セル
内を同じく３７℃に保温した分光光度計を用いて、３４
０ｎｍにおける吸光度変化を測定し、ＣＫの活性（Ｕ／
ｍｌ）を求めた。

【００２４】なお、対照として、各々以下の条件を組み
合わせて上記の測定を行なった。抗ＡｄＫ抗体未固定の試験管を使用。Ａｐ₅Ａ１２．５μＭおよびＡＭＰ６．２５ｍＭを
含有する第１試薬を使用。ＡｄＫ存在下におけるＣＫ活性を測定。

【００２５】なお、ＡｄＫとしては、市販のブタ筋肉由
来ＡｄＫ約２０００Ｕ／ｌを蒸留水にて約２５０Ｕ／ｌ
に希釈した溶液を使用し、ＣＫ溶液とともに試験管内に
添加した。（３）結果以上の各条件において測定したＣＫ活性は表１に示した
通りである。この表１から明らかなように、抗ＡｄＫ抗
体固定化試験管を用いた場合には、第１試薬中のＡｐ₅
ＡおよびＡＭＰの有無にかかわらず、ＡｄＫの添加時お
よび無添加時においてほぼ同等のＣＫ活性値が得られ
た。これに対して、抗ＡｄＫ抗体未固定試験管の場合に
は、ＡｄＫ存在下におけるＣＫ活性値が有意に増加し
た。

【００２６】これらのことから、抗ＡｄＫ抗体は、Ａｐ
₅ＡおよびＡＭＰに比べてはるかにすぐれたＡｄＫ活性
阻害作用を有し、この抗体ＡｄＫ抗体を用いる測定法に
よって、正確な測定値が得られることが実証された。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の抗
ＡｄＫ抗体を含有する測定用試薬、およびそれを用いた
測定方法は、生体液中のＡｄＫ活性の影響を除去して、
グルコース、ＡＴＰ、ＣＫ、その他の各種ホスホトラン
スフェラーゼ、各種グリコシダーゼなどを正確に測定す
ることができ、各種臨床検査等における診断精度が向上
する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、
およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素とともに、抗
アデニレートキナーゼ抗体を含有してなることを特徴と
する測定用試薬。
【請求項２】抗アデニレートキナーゼ抗体がアデニレ
ートキナーゼ活性の阻害作用を有する請求項１の測定用
試薬。
【請求項３】請求項１または２の測定用試薬を用いる
ことを特徴とする生体活性測定方法。