JPH05268953A

JPH05268953A - グルコシルトランスフェラーゼ活性の少ないグルコアミラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH05268953A
Application number: JP10176192A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Uozumi; 武司魚住; Haruhiko Masaki; 春彦正木; Akira Nakamura; 顕中村; Ikuko Nishimura; 郁子西村
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1993-10-19

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子組換え技術を用いてグルコシルトランス
フェラーゼ活性の少ないグルコアミラーゼを生産するこ
とを目的とする。【構成】Ｎ末端及びＣ末端の欠失したグルコシルトラン
スフェラーゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡを組み込んだ
組換え体ＤＮＡを導入した、グルコアミラーゼ生産能を
有するアスペルギルス・ニガーを栄養培地で培養し、培
養物中にグルコアミラーゼを生産せしめた後、該培養物
よりグルコアミラーゼを採取するグルコシルトランスフ
ェラーゼ活性の少ないグルコアミラーゼの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮ末端及びＣ末端の欠失
したグルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴａｓｅ
という。）構造遺伝子を含有するＤＮＡを組み込んだ組
換え体ＤＮＡを導入したアスペルギルス・ニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）によるグルコアミラ
ーゼ（以下ＧＡａｓｅという。）の製造法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】ＧＡａｓｅは、澱粉糖のα−１，４グル
コシド鎖を非還元末端から加水分解し、グルコースを生
成させる作用を触媒する酵素であり、酵素番号ＥＣ
３．２．１．３に分類される。この酵素は、澱粉工業で
利用される。従来、ＧＡａｓｅは、アスペルギルス・ニ
ガー等の微生物を培養して製造されてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アスペルギルス・ニガ
ーによってＧＡａｓｅを生産する際には、同時にＧＴａ
ｓｅが生産されてしまい、且つ一旦生成したＧＴａｓｅ
は、精製工程でも除去することが困難であることが知ら
れている。それ故、澱粉工業においてアスペルギルス・
ニガーのＧＡａｓｅを用いて澱粉からグルコースを製造
する場合に、副生するオリゴ糖と混在するＧＴａｓｅと
によって異性化糖が生成し、そのためにグルコースの収
量及び純度が低下してしまうという問題点が存在してい
た。また、従来行われてきた種々の人工突然変異手段に
よるＧＴａｓｅの低減のための改良方法は、変異がラン
ダムに起こるため、必ずしも高頻度で目的にかなった菌
株が取得できるとは限らないこと、更には、変異処理に
おいて生育や分生子着性能が劣化するという問題点を有
していた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、遺
伝子組換えによる手段を用いてＧＡａｓｅ高生産性を維
持しつつ、そのＧＴａｓｅ活性のみが低減された改良菌
株を取得することを検討した。そして、ＧＴａｓｅ構造
遺伝子のＮ末端及びＣ末端を欠失させた遺伝子を含むプ
ラスミドを作製し、この遺伝子のほぼ中央部に位置する
ＳｎａＢＩサイトで切断したうえでプロトプラストに導
入し、相同的組換えを起こさせることにより、高ＧＡａ
ｓｅ活性生産能を有し且つＧＴａｓｅ活性の低減した形
質転換株を得ることに成功したものである。

【０００５】即ち、本発明は、アスペルギルス属に属す
る微生物に由来し、図１の（ｂ）の制限酵素地図で規定
される、Ｎ末端及びＣ末端の欠失したＧＴａｓｅ構造遺
伝子及び該ＧＴａｓｅ構造遺伝子を含有するＤＮＡを組
み込んだ組換え体ＤＮＡを導入した、ＧＡａｓｅ生産能
を有するアスペルギルス・ニガーを栄養培地で培養し、
培養物中にＧＡａｓｅを生産せしめた後、該培養物より
ＧＡａｓｅを採取することを特徴とするＧＴａｓｅ活性
の少ないＧＡａｓｅの製造法である。

【０００６】以下に本発明について詳細に説明するＧＡ
ａｓｅの生産菌としては、アスペルギルス属菌、リゾプ
ス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌等が挙げられる。本発明の
ＧＴａｓｅ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの給源としては上
記のようなＧＡａｓｅ生産菌が使用される。例えば、ア
スペルギルス・ニガーＮｏ．４９９等が挙げられる。

【０００７】本菌株の菌学的性質は以下の通りである。（１）各培地における生育状態（ａ）麦芽エキス寒天培地３７℃で生育は良好。基底菌糸層は比較的密。コロニー
表面はビロード状。コロニーの色は最初は白色で分生子
が多数形成されると褐色〜黒色になる。コロニーの裏面
は初めは無色で、後に淡黄色になる。（ｂ）ツアペック寒天培地３７℃で生育は良好。基底菌糸層は比較的薄く平坦。コ
ロニー表面はビロード状〜羊毛状。コロニーの色は最初
は白色で分生子が多数形成されると褐色〜黒色になる。
コロニーの裏面は初めは無色で、後に黄色になる。

【０００８】（２）各生理的、生態的性質（ａ）最適生育条件（麦芽エキス培地使用）ｐＨ：４〜７温度：２５〜３５℃ （ｂ）生育の範囲（麦芽エキス培地使用）ｐＨ：３〜８温度：１０〜４５℃

【０００９】（３）形態学的性質分生子頭：２００〜５００μ、黒色。分生子柄：長さ５００μ〜３ｍｍ、直径１５〜２０
μ。基底菌糸ないし気生菌糸から分枝して立ち上がる。
滑面無色。頂のう：直径５０〜７０μ、球形。メトレ：約２５×５．３μ フイアライド：約１１×３μ。分生子：直径３．０〜４．５μ、球形、粗面、集塊
は黒色。

【００１０】以上の菌学的性質から、本菌株はアスペル
ギルス属に属する。また、メトレをもった分生子頭が混
在し、分生子頭は球形、古くなると裂け、分生子柄は頂
のう直下でくびれない、分生子頭は黒色、分生子柄は滑
面、縦に裂けることより本菌株はアスペルギルス・ニガ
ーと同定した。尚、本菌株は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１１３１６号（FERM P-11316）と
して寄託されている。

【００１１】上記菌株を通常の培養方法で培養し、培養
物を得、該培養物から常法、例えば、ろ過、遠心分離な
どの処理で培養液を得る。上記で得られたアスペルギル
ス・ニガーの培養液から常法、例えば、硫安塩析、遠心
分離、脱塩及び各種のクロマトグラフィーを用いてＧＴ
ａｓｅを精製する。

【００１２】精製ＧＴａｓｅをトリプシンなどで限定分
解し、該限定分解ペプチドをＨＰＬＣなどで分離し、分
離したペプチドのＮ末端アミノ酸配列を例えば公知文献
［Eur. J. Biochem.，１巻，80〜91頁（1967）］に記載
の方法を応用した自動アミノ酸シークエンサーを用いて
決定する。このアミノ酸配列に対応する塩基配列を持つ
ＤＮＡを合成する。合成ＤＮＡは例えば自動ＤＮＡ合成
機を使用すれば作ることができる。合成ＤＮＡの標識
は、例えば公知文献［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A.，74巻，560〜564頁（1977）］に記載の方法に従いＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端をγ−³²
Ｐ−ＡＴＰでリン酸化することで行うことができる。こ
の様にしてプローブを調製する。

【００１３】別に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）を培養し、菌体をホモジ
ナイザー等で破砕した後、常法に従って染色体ＤＮＡを
得る。ついで、公知文献［Molecular Cloning（2nd Edi
tion），発行所Cold SpringHarbor Laboratory Press
（1989）9.34〜9.58］に記載の方法に従い、上記染色体
ＤＮＡを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動に
より断片長に応じた分離を与えた後、上記のプローブを
用いてサザン・ハイブリダイゼーションを行う。即ち、
ニトロセルロースフィルターへＤＮＡを吸着させて標識
化合成ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、オートラ
ジオグラムを撮る。使用する制限酵素としてはＳｐｈＩ
などが挙げられる。

【００１４】次いで、プローブがハイブリダイズする染
色体ＤＮＡ断片を含む一定の長さのＤＮＡ断片集合体を
例えば公知文献［Anal. Biochem.，101巻，339〜341頁
（1980）］に記載のアガロースゲルからのＤＮＡ抽出法
に従って回収することができる。

【００１５】次にコロニー・ハイブリダイゼーションを
行うために、上記回収ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込
んで組換えＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベクター
ＤＮＡへの組み込みは、公知文献［J. Mol. Biol.，96
巻，171〜184頁（1975）］に記載の方法に従い染色体Ｄ
ＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素で切断し、次いでリ
ガーゼを用いて結合することにより行うことができる。
ベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミドＤＮＡが挙
げられ、特に、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９が好ましい。
リガーゼとしては、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼが挙げら
れる。

【００１６】組換えＤＮＡの大腸菌への導入は、例えば
公知文献［Molecular Cloning（2ndEdition），発行所C
old Spring Harbor Laboratory Press（1989）1.82〜1.
84］に記載の方法により行うことができる。尚、使用す
る大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株が好ましい。ＧＴ
ａｓｅ遺伝子を含んだ組換えＤＮＡを含有する菌株の選
択は、例えば公知文献［Molecular Cloning（2nd Editi
on），発行所Cold Spring Harbor Laboratory Press（1
989）1.90〜1.104］に記載の方法に従って、前記合成Ｄ
ＮＡをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーショ
ンにより行うことができる。即ち、組換えＤＮＡを導入
された大腸菌をアンピシリンを含むＬ−ブロス寒天培地
にまき、一晩培養後、ニトロセルロースフィルターにレ
プリカして更に２〜３時間アンピシリンを含むＬ−ブロ
ス寒天培地上で培養し、溶菌及びＤＮＡの固定を行って
合成ＤＮＡがハイブリダイズする陽性コロニーを検出す
る。

【００１７】次に、陽性菌株から、例えば公知文献［Mo
lecular Cloning（2nd Edition），発行所Cold Spring
Harbor Laboratory Press（1989）1.25〜1.28］に記載
の方法によってプラスミドを抽出・精製し各種制限酵素
による分解を行い、制限酵素地図を作成すると共に、再
びサザン・ハイブリダイゼーションによって合成ＤＮＡ
プローブがハイブリダイズすることを確認する。

【００１８】次に、ＧＴａｓｅ遺伝子であることの確認
をＧＴａｓｅの塩基配列決定及び発現により行う。形質
転換株には、ＧＡａｓｅの高生産株であるアスペルギル
ス・ニガーが好ましい。

【００１９】形質転換ベクターとしてｐＤＨ２５が使用
できる。ｐＤＨ２５は、アスペルギルス・ニガー中で発
現するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺
伝子ｈｐｈを持っている。このものとＮ末端及びＣ末端
の欠失したＧＴａｓｅ構造遺伝子を挿入したプラスミド
とを同時にco-transfomation法にてアスペルギルス・ニ
ガーに導入し、ハイグロマイシン耐性の形質転換株を得
る。この形質転換株を培養し、培養物中にＧＴａｓｅ活
性の少ないＧＡａｓｅを産生させ、該培養物からＧＡａ
ｓｅを採取する。

【００２０】

【実施例】

実施例（１）ＧＴａｓｅの精製及び部分アミノ酸配列の決定アスペルギルス・ニガーＮｏ．499（微工研菌寄第11316
号）の胞子スラント１／３本分を１ＬのＣＭ−ＣＳＬ培
地（コーンミールをアミラーゼで液化し、その２％溶液
にコーンスティープリカーを終濃度５％になるように加
え、121℃、30分のオートクレーブにより殺菌したも
の）に植菌し、30℃、５〜６日振盪培養する。菌体を３
ＭＭろ紙（ワットマン社製）を用いたろ過により除き、
培養液に対して硫酸アンモニウムを50％飽和になるよう
に添加する。次に生じた沈澱を10,000rpm、30分の遠心
により除き、更に上清に硫酸アンモニウムを90％飽和に
なるように添加する。次に沈澱画分を10,000rpm、30分
の遠心により集め、10ｍＭ酢酸塩緩衝液（pH6.0）に溶
解させる。不溶物を15,000rpm、30分の遠心によって取
り除いた後、上清を0.45μmのフィルターによりろ過
し、トヨパールHW-40Cを用いたゲルろ過により、脱塩及
び10mM酢酸塩緩衝液（pH6.0）への平衡化を行った。

【００２１】このようにして得られた粗酵素液をFPLCシ
ステム（ファルマシア社製）及びMono Q HR 10/10 カラ
ムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分
離した。溶出は、10mM酢酸塩緩衝液（pH6.0）中で０〜5
00mMのNaCl直線グラジエントを形成することにより行っ
た。更に、ＧＴａｓｅ活性を有する画分からSuperose12
カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー〔100mM
酢酸塩緩衝液（pH6.0）、２００mM NaCl〕によりＧＴ
ａｓｅを精製した。

【００２２】次に得られた精製ＧＴａｓｅ５mgに対し
てトリプシンを100μg添加し、100mM Tris-HCl（pH8.
5）、0.001％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で37
℃、５時間作用させ、ＧＴａｓｅの限定分解を行った。
更にその反応液をC-18カラム（VP-318-2251、センシュ
ー科学（株）製）にかけ、ＧＴａｓｅの限定分解ペプチ
ドを 0.1％トリフルオロ酢酸存在下高速液体クロマト
グラフィーによる０〜80％アセトニトリル直線グラジエ
ントにより分取した。分取したペプチドのいくつかのＮ
末端をmodel 470A型（アプライド・バイオシステムズ社
製）アミノ酸シークエンサーを用いたエドマン分解法に
よって決定した。決定したアミノ酸配列は配列番号：１
及び配列番号：２に示すとおりである。

【００２３】（２）ＧＴａｓｅ遺伝子の同定ＧＴａｓｅのアミノ酸配列のうち、ＤＮＡ塩基配列に変
換したときに特異性が高くなると思われる部分を検索し
て、配列番号：１のＡ部及びＢ部に対応する配列を持っ
た合成ＤＮＡ２本を380B型（アプライド・バイオシステ
ムズ社製）ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成した配
列を以下に示す。Ａ：ＧＡＲＴＡＹＡＴＭＴＧＧＡＣＮＧＡＢ：ＧＡＹＴＡＹＡＴＧＣＡＹＧＧＮＴＡ（但しＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＭはＡ、Ｃ又は
Ｔ、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを示す。）

【００２４】合成ＤＮＡ溶液は保護基をはずすため65
℃、12時間処理した後にＮ−１型ロータリーエバポレー
ター（東京理科（株）製）により100μｌ程度まで濃縮
し、３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.8）10μｌ及びエタノー
ル250μｌを加えて-80℃、30分静置してから遠心するこ
とによりエタノール沈澱を行った。このようにして得ら
れたＤＮＡ 0.5μgを50mM Tris-HCl（pH7.6）、10mM
MgCl₂、10mM ２−メルカプトエタノールを含む溶液
中でＴ４ＤＮＡキナーゼ10単位、(γ−³²Ｐ−）ATP1.85
MBq（アマシャム社製ＰＢ１０２１８）と37℃、30
分インキュベートすることにより５’末端をラベルし、
プローブとした。

【００２５】次にアスペルギルス・ニガーＮｏ．４９９
をＹＰＤ培地（２％グルコース、１％ペプトン、0.5％
イースト抽出物）中で30℃、30時間培養した後、ガーゼ
でろ過して菌体を集め、液体窒素で凍結させた。凍結菌
体はホモジナイザー（日本精機製作所製、AM-8型）で1
8,000rpm、15分処理することにより破砕した。次に50mM
EDTA（pH 8.0）、0.5％ SDS、0.1mg／mlプロティナー
ゼＫ（ぞれぞれ終濃度）を加え、50℃、４時間インキュ
ベートした。更にその溶液にＴＥ（10mM Tris-HCl、１
mM EDTA、pH8.0）飽和フェノールを等量加え、緩やか
に攪拌した後、15,000rpm、30分遠心し水相を分取し
た。

【００２６】同様の処理をもう一度行った後、ＴＥ飽和
フェノールの代わりにＴＥ飽和フェノールとクロロホル
ムを１：１で混合したもの、次いでクロロホルムを用い
て同様の処理を２回ずつ行った。このようにして得られ
た核酸粗抽出液に50％ポリエチレングリコール＃6000を
１／４量加え、０℃、２時間インキュベートした。3,00
0rpm、３分の遠心により沈澱画分を回収した後、８mlの
ＴＥＳ緩衝液（20mMTris-HCl、５mM EDTA、100mM NaC
l、pH7.5）に再溶解し、8.7ｇのCsClを加え、更に５mg
の臭化ethidiumを加えて44,500rpm、16時間のCsCl−臭
化ethidium平衡密度勾配遠心にかけた。この遠心により
形成されるＤＮＡのバンドを回収し、１−ブタノールを
用いて臭化ethidiumを除いてＴＥに対して透析を行っ
た。この方法により100ｇの湿菌体より4.5mgの染色体Ｄ
ＮＡを取得した。

【００２７】以上のようにして得られたアスペルギルス
・ニガーＮｏ．４９９染色体ＤＮＡ10μgに対して制限
酵素SphＩ 30単位を３７℃、３時間作用させることによ
り完全分解を行った。その反応液を１％アガロースゲル
電気泳動し、上記のプローブを用いてサザンハイブリダ
イゼーションを行った。

【００２８】６×SSC（１×SSCは150mM NaCl、15mM t
risodium citrateを含む）、0.1％SDS、0.2％牛血清ア
ルブミン、0.2％ Ficoll 400、0.2％ポリビニルピロ
リドン中でフィルターを65℃、８時間インキュベートし
てプレハイブリダイゼーションを行った後、上記プロー
ブを加えて40℃、一夜静置してハイブリダイゼーション
を行った。次にフィルターを６×SSC、0.1％ＳＤＳ中
で52℃で30分洗浄し、オートラジオグラフィーにより分
析した。その結果２種のプローブが共に4.3Kbの位置に
ハイブリダイズすることが観察された。

【００２９】（３）ＧＴａｓｅ遺伝子のクローニングアスペルギルス・ニガーＮｏ．４９９染色体ＤＮＡ５μ
ｇをSphＩ 10単位により完全分解した後、１％アガロー
スゲル電気泳動し、臭化ｅthidiumによって染色し約4.3
Kbに当たる位置のゲルを切取り、そのゲル片に対して３
倍容量の８ＮNaClO₄を加え、37℃、10分インキュベート
してアガロースを溶解させる。次にその溶液中のＤＮＡ
を６mm径のＧＦ／Ｃ（ワットマン社製）グラスフィルタ
ーに吸着させ、フィルターを１mlのＴＥに溶解した６Ｎ
NaClO₄の溶液、続いて１mlの95％エタノールで洗浄
し、乾燥させた。

【００３０】このフィルターにＴＥを30μｌ加え、37
℃、30分インキュベートした。その後に15,000rpm、２
分の遠心により水相を回収した。このようにしてアガロ
ースゲルからアスペルギルス・ニガーＮｏ．４９９染色
体ＤＮＡ由来の4.3Kb付近のSphＩ片を回収した。

【００３１】また別にベクタープラスミドｐＢＲ３２２
0.1μgをSphＩ５単位で37℃、２時間処理し、更に１
Ｍ Tris-HCl（pH9.0）をその反応液に対して５分の１
量、アルカリ性ホスファターゼを0.5単位加え、65℃、3
0分インキュベートした。この反応液をアガロースゲル
電気泳動し、臭化ethidium染色した後でｐＢＲ３２２の
分子量に相当するバンドを切出し、回収した。

【００３２】上記２種のＤＮＡを混合し、66mM Tris-H
Cl（pH 7.6）、6.6mM MgCl₂、10mMジチオスレイトー
ル、１mM ATP（それぞれ終濃度）で300単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加えて４℃、一夜インキュベートしてライ
ゲーション反応を行った。次に大腸菌ＨＢ１０１株のコ
ンピテントセルを調製し、上のライゲーション反応物を
用いて形質転換した。形質転換株はアンピシリン50μg
／ml、1.2％寒天を含むＬＢ培地〔１％ Bacto Trypton
e（ディフコ社製）、0.5％酵母エキス、0.5％NaCl〕
上で選択した後にニトロセルロースフィルター上に移し
てプローブＢを用いたコロニーハイブリダイゼーション
を行った。

【００３３】但し、ハイブリダイゼーション及び洗浄の
条件はサザンハイブリダイゼーションの場合と同様に行
った。オートラジオグラフィーによる分析を行った結
果、約1000株の形質転換株中24株の陽性クローンが得ら
れた。これらの形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製
し、それぞれ0.1μｇに対してBamHI，EcoRI，PvuII，Sn
aBI，SphI等の制限酵素各５単位を37℃、２時間作用さ
せ、アガロースゲル電気泳動法を用いて解析したとこ
ろ、全てのプラスミドが4.3KbのＤＮＡ断片をｐＢＲ３
２２のSphI部位に含んでいた。このプラスミドをｐＧＴ
Ｙ０２と命名した。

【００３４】（４） 4.3kb断片の塩基配列の決定プラスミドｐＧＴＹ０２を各種制限酵素で切断して得ら
れたＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９にサブ
クローニングした。このようにして得られたプラスミド
をCsCl−エチジウムブロマイド密度勾配遠心で精製した
後、Henikoff等の方法〔Gene，28巻，351−359（198
4）〕にしたがってデリーション・シリーズを作製し
た。調製したデリーションシリーズでE.coli MW1184株
を形質転換し、いろいろな長さのＤＮＡを持つプラスミ
ドを保持している形質転換体を得た。

【００３５】次に、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地
で培養し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を感染させる
ことによって一本鎖ＤＮＡを得、これを精製して塩基配
列の決定に用いた。

【００３６】塩基配列の決定は、Sangerラノdideoxy法〔P
roc. Nat. Acad. Sci. USA.，74巻，5463−5467（197
7）〕によって行った。伸長反応には、おもにAmpli Taq
（宝酒造）を用いた。部分的に縮重が起こる場合には、
Sequenase（東洋紡）を使用し、dGTPの代わりにdITPを
用いることによって解消した。なお、ＧＴａｓｅ構造遺
伝子のコードするアミノ酸配列については、千葉らによ
ってＧＴａｓｅ蛋白質の全アミノ酸配列が報告されてい
るので〔日本農芸化学会誌，64巻，510頁（1990）及び
生化学，63巻，787頁（1991）〕それを参考にして決定
した。その結果は配列番号：３に示される。配列番号：
３中で下線部は、イントロンの存在を示すものであり、
アミノ酸配列部分は、ＧＴａｓｅ蛋白質の一次構造を示
すものである。

【００３７】（５）高ＧＡａｓｅ活性アスペルギルス
・ニガー生産株を用いたＧＴａｓｅ活性低下株の取得法先ず、形質転換に使用するプラスミドとして、ＧＴａｓ
ｅ構造遺伝子のＮ末端及びＣ末端が欠失したPvuIIーEcoR
I断片をpUC19のHincII-EcoRIサイトに挿入したものを作
成し、このプラスミドをｐＧＴＩＤ１と命名し、図１に
示した。

【００３８】次に、ｐＧＤＩＤ１及び対照となるプラス
ミドｐＵＣ１９（各20μg）とハイグロマイシンＢホス
ホトランスフェラーゼ要求性相補遺伝子hphを持つプラ
スミドｐＤＨ２５（10μg）とを用い、co-transformati
on法によりアスペルギルス・ニガーに導入し、形質転換
を行った。その結果、ハイグロマイシンＢ 100μg／ml
を含む培地でも良好に生育し、胞子を着生する形質転換
株即ちｐＧＴＩＤ１由来のＴＲＤ１−２４（目的株）及
び対照となるｐＵＣ１９由来のＴＲ１９−１株を得た。

【００３９】それらのＧＡａｓｅ及びＧＴａｓｅ生産の
経時変化（即ち、培養上清１ml当たりのＧＡａｓｅ及び
ＧＴａｓｅ活性の変化を示す。）を図１及び図２に示
す。図１及び図２から明らかなように得られた形質転換
株のうち目的株の方は、対照株に対してＧＡａｓｅ活性
は変わらないが、ＧＴａｓｅ活性のみが１／３に低下し
ていることがわかった。

【００４０】尚、ＧＡａｓｅ、ＧＴａｓｅ活性の測定
は、以下の方法で行った。（１）酵素液の調製培養液10mlをサンプリングし、15000rpmで10分遠心した
後の上清を0.45μmのフィルターで濾過し、この濾過液
２mlを100μｌ以下迄濃縮し、これを50mM酢酸ソーダで
計500μｌになるように希釈し、これを酵素液とした。

【００４１】（２）ＧＡａｓｅ活性測定５％澱粉0.1ml，0.25M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）
0.1ml、水0.25mlとからなる基質を37℃、５分間予熱
し、（１）の酵素液0.05mlを加え、37℃、30分間反応し
た後、反応液を0.02ml取り、グルコースＣＩＩ−テスト
ワコー（和光純薬工業社製品）の発色試薬を加える。37
℃、５分間加温し、波長505nmの吸光度を測定し。反応
によって生成したグルコース量を酵素活性とした。酵素
活性の単位は、１分間に１μmolのグルコースを遊離さ
せる酵素量を１単位とした。

【００４２】（３）ＧＴａｓｅ活性測定岩野等の方法に基づいて行った〔J. Brew. Soc. Japa
n，72巻，517−520（1977）〕。即ち、50mMの酢酸ナト
リウム緩衝液（pH5.0）に４％メチル−α−グルコシド
を溶解したもの0.5mlを40℃、５分間予熱し、（１）の
酵素液0.1mlを加える。40℃、30分間反応した後、ＤＮ
Ｓ溶液１mlを加え、100℃、５分間煮沸後、氷水中で急
冷し、4.5mlの水を加えて希釈し波長525nmで吸光度を測
定し、反応によって生成したグルコース量を酵素活性量
とした。酵素活性の単位は、１分間に１μmolのグルコ
ースを遊離させる酵素量を１単位とした。

【００４３】

【発明の効果】本発明によれば、本発明のＮ末端及びＣ
末端の欠失したＧＴａｓｅ構造遺伝子の組み込まれた組
換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・ニガーを培地に培
養することにより、ＧＴａｓｅ活性の少ないＧＡａｓｅ
を得ることができ、澱粉工業界に寄与するところ大であ
る。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸配列 Phe Glu Ile Pro Leu Glu Tyr Ile Trp Thr Asp Ile Asp Tyr Met 15 ＡＢ His Gly Tyr Arg 19

【００４５】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸配列 Leu Ｘ Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Val Pro Ile Val Asp Ala Ala 15 Leu Tyr Ile Pro Asn 20 （Ｘは決定できなかったアミノ酸を示す。）

【００４６】配列番号：３配列の長さ：４３００配列の型：核酸配列 GCATGCCATG AGTTGTTGGG CCGGCCTGAA GGATCCATCA TTGGGACCAA GGGCATCATC 60 CATGCGCTAC GGAGTACTTT CGGAGAATCA GCACCCCTGC ACAAAGCATT GTCAATGTGT 120 TTTCTTATGT CAAAAGCTGA CAGAGTCTGA GGCTCGCTGA CGATGGGATT CATGCTAATG 180 ACGGTCCGAA AGAGCTTTCA CGTAACACTG GTGAACATCC CACTCGGGAA GCCGAGACTT 240 GTGACCTACT TAGTCAAATG AGATGATTAT CAAAGCCATT AAATGCCTCG CTGTCAGGGG 300 CCCTGGTAAG TGTCTTCATT AATCGAAACC CATCTTCATT CGTCCCCGCC TTCAGTGCTC 360 ATCATTTTAG GTTTAGAAGC AAGATTGAGT GCCACCTGCT TTACAAACCA GCATGGGTAG 420 TCTGCTGTTG AAATTCTTCA CCGGGAGCAT TCTGGGGAAG GTGCAAAAGG CGGCGCGAAG 480 TGGTCGGGTC GCGATTGTAG TCTGGATTGG AGCACAAGAA TCGTCAGAGC CGAAGCCCGA 540 ACTGAGGGGG TCTCGGTCAT TTATCGGGAT GAGAGCCAAT CAGCGTGCGC TCATCATCTG 600 ATCGTCTGGC TGCCAGGCCC CTCAGGCATC AATACGGTAC TCGGCAGTAT CCACTCCCGT 660 TTCTCCGGTG CAACAAATCA TCGTTGGAGA ATCCCCAGCT CCCCCGCCAA CTGGGGTCGA 720 TGCTTCTCCA GTTGTCCTGG TTTCTCCCAT GAACTCGCTT ACGATAAGCT GCTGTACCAG 780 CCCACCAGCA CAACAATATC TTCAATCAGG TAGGTGCTTG TTCGTTACCT GCCCCATCCT 840 CTCCTCTTCT TCGGTCATTA TGAACTCAAT TCGGTCGCTA GCTTTGCCGA TTCTCCGCAG 900 TCCATAAAAA TATATCTGCA TTTGCCCCTT ACACGTCGGG AATTCACCGG CGCAATGAGC 960 CTTCGGGTAT GGTCGCACAG CGTCATGTCA ATAGGAGGCT GCTCCTAGTG GTGATCTACT 1020 AGTCGCCTCA ACACAGCAAT ATATAAATAA CAAGAGCATT CCTTGAGCAC ATCTGGGTAA 1080 TAGCTGTTCC ATTCTCATCA AGGATTACGC GACCGTGCCT CGAGCCTCCT TAAGCGAGCC 1140 ATG GTG AAG TTG ACG CAT CTC CTT GCC AGA GCA TGG CTT GTC CCT CTG 1188 Met Val Lys Leu Thr His Leu Leu Ala Arg Ala Trp Leu Val Pro Leu GCT TAT GGA GCG AGC CAG TCA CTC TTA TCC ACC ACT GCC CCT TCG CAG 1236 Ala Tyr Gly Ala Ser Gln Ser Leu Leu Ser Thr Thr Ala Pro Ser Gln CCG CAG TTT ACC ATT CCT GCT TCC GCA GAT GTC GGT GCG CAG CTG ATT 1284 Pro Gln Phe Thr Ile Pro Ala Ser Ala Asp Val Gly Ala Gln Leu Ile GCC AAC ATC GAT GAT CCT CAG GCT GCC GAC GCG CAG TCG GTT TGT CCG 1332 Ala Asn Ile Asp Asp Pro Gln Ala Ala Asp Ala Gln Ser Val Cys Pro GGC TAC AAG GCT TCA AAA GTG CAG CAC AAT TCA CGT GGA TTC ACT GCC 1380 Gly Tyr Lys Ala Ser Lys Val Gln His Asn Ser Arg Gly Phe Thr Ala AGT CTT CAG CTC GCG GGC AGG CCA TGT AAC GTA TAC GGC ACA GAT GTT 1428 Ser Leu Gln Leu Ala Gly Arg Pro Cys Asn Val Tyr Gly Thr Asp Val GAG TCC TTG ACA CTG TCT GTG GAG TAC CAG GAT TCG GAT CGA CTG AAT 1476 Glu Ser Leu Thr Leu Ser Val Glu Tyr Gln Asp Ser Asp Arg Leu Asn ATT CAG ATT CTC CCC ACT CAT GTT GAC TCC ACA AAC GCT TCT TGG TAC 1524 Ile Gln Ile Leu Pro Thr His Val Asp Ser Thr Asn Ala Ser Trp Tyr TTT CTT TCG GAA AAC CTG GTC CCC AGA CCC AAG GCT TCC CTC AAT GCA 1572 Phe Leu Ser Glu Asn Leu Val Pro Arg Pro Lys Ala Ser Leu Asn Ala TCT GTA TCC CAG AGC GAC CTT TTT GTG TCA TGG TCA AAT GAG CCG TCG 1620 Ser Val Ser Gln Ser Asp Leu Phe Val Ser Trp Ser Asn Glu Pro Ser TTC AAT TTC AAG GTG ATC CGA AAG GCT ACA GGC GAC GCG CTT TTC AGT 1668 Phe Asn Phe Lys Val Ile Arg Lys Ala Thr Gly Asp Ala Leu Phe Ser ACA GAA GGC ACT GTG CTC GTA TAT GAG AAT CAG TTC ATC GAA TTT GTG 1716 Thr Glu Gly Thr Val Leu Val Tyr Glu Asn Gln Phe Ile Glu Phe Val ACC GCG CTC CCT GAA GAA TAT AAC TTG TAT GGC CTT GGG GAG CAT ATC 1764 Thr Ala Leu Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Tyr Gly Leu Gly Glu His Ile ACG CAA TTC CGC CTC CAG AGA AAT GCT AAT CTG ACC ATA TAT CCT TCG 1812 Thr Gln Phe Arg Leu Gln Arg Asn Ala Asn Leu Thr Ile Tyr Pro Ser GAT GAT GGA ACA CCT ATT GAC CAG TGAGTACTGA TATCCCGCCC GTATCTTCTG 1866 Asp Asp Gly Thr Pro Ile Asp Gln GTTCTACTCT TGAAACTTAC TCGTCCTAG A AAC CTC TAC GGC 1908 Asn Leu Tyr Gly CAA CAT CCC TTC TAT CTG GAT ACA AGA TAT TAC AAA GGA GAT AGG CAG 1956 Gln His Pro Phe Tyr Leu Asp Thr Arg Tyr Tyr Lys Gly Asp Arg Gln AAT GGG TCT TAT ATT CCC GTC AAA AGC AGC GAG GCT GAT GCC TCG CAA 2004 Asn Gly Ser Tyr Ile Pro Val Lys Ser Ser Glu Ala Asp Ala Ser Gln GAT TAT ATC TCC CTC TCT CAT GGC GTG TTT CTG AGG AAC TCT CAT GGA 2052 Asp Tyr Ile Ser Leu Ser His Gly Val Phe Leu Arg Asn Ser His Gly CTT GAG ATA CTC CTC CGG TCT CAA AAA TTG ATC TGG CGG ACC CTA GGT 2100 Leu Glu Ile Leu Leu Arg Ser Gln Lys Leu Ile Trp Arg Thr Leu Gly GGA GGA ATC GAT CTC ACC TTC TAC TCA GGC CCC GCC CCG GCC GAT GTT 2148 Gly Gly Ile Asp Leu Thr Phe Tyr Ser Gly Pro Ala Pro Ala Asp Val ACC AGG CAA TAT CTT ACC AGC ACT GTG GGA TTA CCG GCC ATG CAG CAA 2196 Thr Arg Gln Tyr Leu Thr Ser Thr Val Gly Leu Pro Ala Met Gln Gln TAC AAC ACT CTT GGA TTC CAC CAA TGT CGT TGG GGC TAC AAC AAC TGG 2244 Tyr Asn Thr Leu Gly Phe His Gln Cys Arg Trp Gly Tyr Asn Asn Trp TCG GAT CTG GCG GAC GTT GTT GCG AAC TTT GAG AAG TTT GAG ATC CCG 2292 Ser Asp Leu Ala Asp Val Val Ala Asn Phe Glu Lys Phe Glu Ile Pro TTG GAA TAT ATC TGG TGCGTATTGT ACTGGTTTAT GGTATCTCAA AACAGTCTAA 2347 Leu Glu Tyr Ile Trp CAGGCACTT AG G ACC GAT ATT GAC TAC ATG CAC GGA TAT CGC AAC TTT 2395 Thr Asp Ile Asp Tyr Met His Gly Tyr Arg Asn Phe GAC AAC GAT CAA CAT CGC TTT TCC TAC AGT GAG GGC GAT GAA TTT CTC 2443 Asp Asn Asp Gln His Arg Phe Ser Tyr Ser Glu Gly Asp Glu Phe Leu AGC AAG CTA CAT GAG AGT GGA CGC TAC TAT GTA CCC ATT GTT GAT GCG 2491 Ser Lys Leu His Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Val Pro Ile Val Asp Ala GCG CTC TAC ATT CCT AAT CCC GAA AAT GCC TCT GAT GCG TAAGTGTCTA 2540 Ala Leu Tyr Ile Pro Asn Pro Glu Asn Ala Ser Asp Ala GTGACAAATT ATATTACTGC CTGTATGCTA ATTAGCGATA CAG A TAC GCT ACG TAT 2596 Tyr Ala Thr Tyr GAC AGA GGA GCT GCG GAC GAC GTC TTC CTC AAG AAT CCC GAT GGT AGC 2644 Asp Arg Gly Ala Ala Asp Asp Val Phe Leu Lys Asn Pro Asp Gly Ser CTC TAT ATT GGA GCC GTT TGG CCA GGA TAT ACA GTC TTC CCC GAT TGG 2692 Leu Tyr Ile Gly Ala Val Trp Pro Gly Tyr Thr Val Phe Pro Asp Trp CAT CAT CCC AAG GCA GTT GAC TTC TGG GCT AAC GAG CTT GTT ATC TGG 2740 His His Pro Lys Ala Val Asp Phe Trp Ala Asn Glu Leu Val Ile Trp TCG AAG AAA GTG GCG TTC GAT GGT GTG TGG TAC GAC ATG TCT GAA GTT 2788 Ser Lys Lys Val Ala Phe Asp Gly Val Trp Tyr Asp Met Ser Glu Val TCA TCC TTC TGT GTC GGG AGC TGT GGC ACA GGT AAC CTG ACT CTG AAC 2836 Ser Ser Phe Cys Val Gly Ser Cys Gly Thr Gly Asn Leu Thr Leu Asn CCG GCA CAC CCA TCG TTT CTT CTC CCC GGT GAG CCT GGT GAT ATC ATA 2884 Pro Ala His Pro Ser Phe Leu Leu Pro Gly Glu Pro Gly Asp Ile Ile TAT GAT TAC CCA GAG GCT TTC AAT ATC ACC AAC GCT ACA GAG GCG GCG 2932 Tyr Asp Tyr Pro Glu Ala Phe Asn Ile Thr Asn Ala Thr Glu Ala Ala TCA GCT TCG GCG GGA GCT TCC AGT CAG GCT GCA GCA ACC GCG ACC ACC 2980 Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ser Gln Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr ACG TCG ACT TCG GTA TCA TAT CTG CGG ACA ACG CCC ACG CCT GGT GTC 3028 Thr Ser Thr Ser Val Ser Tyr Leu Arg Thr Thr Pro Thr Pro Gly Val CGC AAT GTT GAG CAC CCA CCC TAT GTG ATC AAC CAT GAC CAA GAA GGC 3076 Arg Asn Val Glu His Pro Pro Tyr Val Ile Asn His Asp Gln Glu Gly CAT GAT CTC AGT GTC CAT GCG GTG TCG CCG AAT GCA ACG CAT GTT GAT 3124 His Asp Leu Ser Val His Ala Val Ser Pro Asn Ala Thr His Val Asp GGT GTT GAG GAG TAT GAT GTG CAC GGT CTC TAC GGA CAT CAA GGA TTG 3172 Gly Val Glu Glu Tyr Asp Val His Gly Leu Tyr Gly His Gln Gly Leu AAC GCT ACC TAC CAA GGT CTG CTT GAG GTC TGG TCT CAT AAG CGG CGG 3220 Asn Ala Thr Tyr Gln Gly Leu Leu Glu Val Trp Ser His Lys Arg Arg CCA TTT ATT ATT GGC CGC TCA ACC TTC GCT GGC TCT GGC AAA TGG GCA 3268 Pro Phe Ile Ile Gly Arg Ser Thr Phe Ala Gly Ser Gly Lys Trp Ala GGC CAC TGG GGC GGC GAC AAC TAT TCC AAA TGG TGG TCC ATG TAC TAC 3316 Gly His Trp Gly Gly Asp Asn Tyr Ser Lys Trp Trp Ser Met Tyr Tyr TCC ATC TCG CAA GCC CTC TCC TTC TCA CTT TTC GGC ATT CCG ATG TTT 3364 Ser Ile Ser Gln Ala Leu Ser Phe Ser Leu Phe Gly Ile Pro Met Phe GGT GCG GAC ACC TGT GGG TTT AAC GGA AAC TCC GAT GAG GAG CTC TGC 3412 Gly Ala Asp Thr Cys Gly Phe Asn Gly Asn Ser Asp Glu Glu Leu Cys AAC CGA TGG ATG CAA CTG TCC GCA TTC TTC CCA TTC TAC CGA AAC CAC 3460 Asn Arg Trp Met Gln Leu Ser Ala Phe Phe Pro Phe Tyr Arg Asn His AAT GAG CTC TCC ACA ATC CCA CAG GAG CCT TAT CGG TGG GCT TCT GTT 3508 Asn Glu Leu Ser Thr Ile Pro Gln Glu Pro Tyr Arg Trp Ala Ser Val ATT GAA GCA ACC AAG TCC GCC ATG AGA ATT CGG TAC GCC ATC CTA CCT 3556 Ile Glu Ala Thr Lys Ser Ala Met Arg Ile Arg Tyr Ala Ile Leu Pro TAC TTT TAT ACG TTG TTT GAC CTG GCC CAC ACC ACG GGC TCC ACT GTA 3604 Tyr Phe Tyr Thr Leu Phe Asp Leu Ala His Thr Thr Gly Ser Thr Val ATG CGC GCA CTT TCC TGG GAA TTC CCT AAT GAC CCA ACA TTG GCT GCG 3652 Met Arg Ala Leu Ser Trp Glu Phe Pro Asn Asp Pro Thr Leu Ala Ala GTT GAG ACT CAA TTC ATG GTT GGG CCG GCC ATC ATG GTG GTC CCG GTA 3700 Val Glu Thr Gln Phe Met Val Gly Pro Ala Ile Met Val Val Pro Val TTG GAG CCT CTG GTC AAT ACG GTC AAG GGC GTA TTC CCA GGA GTT GGA 3748 Leu Glu Pro Leu Val Asn Thr Val Lys Gly Val Phe Pro Gly Val Gly CAT GGC GAA GTG TGG TAC GAT TGG TAC ACC CAG GCT GCA GTT GAT GCG 3796 His Gly Glu Val Trp Tyr Asp Trp Tyr Thr Gln Ala Ala Val Asp Ala AAG CCC GGG GTC AAC ACG ACC ATT TCG GCA CCA TTG GGC CAC ATC CCA 3844 Lys Pro Gly Val Asn Thr Thr Ile Ser Ala Pro Leu Gly His Ile Pro GTT TAT GTA CGA GGT GGA AAC ATC TTG CCG ATG CAA GAG CCG GCA TTG 3892 Val Tyr Val Arg Gly Gly Asn Ile Leu Pro Met Gln Glu Pro Ala Leu ACC ACT CGT GAA GCC CGG CAA ACC CCG TGG GCT TTG CTA GCT GCA CTA 3940 Thr Thr Arg Glu Ala Arg Gln Thr Pro Trp Ala Leu Leu Ala Ala Leu GGA AGC AAT GGA ACC GCG TCG GGG CAG CTC TAT CTC GAT GAT GGA GAG 3988 Gly Ser Asn Gly Thr Ala Ser Gly Gln Leu Tyr Leu Asp Asp Gly Glu AGC ATC TAC CCC AAT GCC ACC CTC CAT GTG GAC TTC ACG GCA TCG CGG 4036 Ser Ile Tyr Pro Asn Ala Thr Leu His Val Asp Phe Thr Ala Ser Arg TCA AGC CTG CGC TCG TCG GCT CAA GGA AGA TGG AAA GAG AGG AAC CCG 4084 Ser Ser Leu Arg Ser Ser Ala Gln Gly Arg Trp Lys Glu Arg Asn Pro CTT GCT AAT GTG ACG GTG CTC GGA GTG AAC AAG GAG CCC TCT GCG GTG 4132 Leu Ala Asn Val Thr Val Leu Gly Val Asn Lys Glu Pro Ser Ala Val ACC CTG AAT GGA CAG GCC GTA TTT CCC GGG TCT GTC ACG TAC AAT TCT 4180 Thr Leu Asn Gly Gln Ala Val Phe Pro Gly Ser Val Thr Tyr Asn Ser ACG TCC CAG GTT CTC TTT GTT GGG GGG CTG CAA AAC TTG ACG AAG GGC 4228 Thr Ser Gln Val Leu Phe Val Gly Gly Leu Gln Asn Leu Thr Lys Gly GGC GCA TGG GCG GAA AAC TGG GTA TTG GAA TGG TAGTGTCAGC CACAAGCCAG 4281 Gly Ala Trp Ala Glu Asn Trp Val Leu Glu Trp * GTGTGCGCGTACAGCATGC 4300

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＧＴＩＤ１を示すものである。図
中（ａ）は、図１の４．３ｋｂＳｐｈＩ断片の全長を
示すものであり、図中の（ｂ）は、ｐＧＴＩＤ１の構造
を示すものである。なお、Ｓｐは、ＳｐｈＩを、Ｂは、
ＢａｍＨＩを、ＨｃはＨｉｎｃＩＩを、ＰｖはＰｖｕＩ
Ｉを、ＳＢはＳｎａＢＩを、ＥはＥｃｏＲＩを、Ｓｃは
ＳａｃＩをそれぞれ示すものである。

【図２】形質転換体のＧＴａｓｅ生産の経時変化を示す
ものである。図中黒三角は、ＴＲＤ１−２４を、四角
は、ＴＲ１９−１をそれぞれ示す。

【図３】形質転換体のＧＡａｓｅ生産の経時変化を示す
ものである。図中黒三角は、ＴＲＤ１−２４を、四角
は、ＴＲ１９−１をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:685） (72)発明者西村郁子東京都文京区西片２−18−15 メゾン・ド・イストワール 302号室

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属に属する微生物に由来するグルコシルトランスフ
ェラーゼ構造遺伝子のＮ末端及びＣ末端を任意の長さに
欠失させたＤＮＡ断片。
【請求項２】アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属に属する微生物に由来し、図１の（ｂ）の制限酵
素地図で規定される、Ｎ末端及びＣ末端の欠失したグル
コシルトランスフェラーゼ構造遺伝子。
【請求項３】請求項１又は請求項２記載のグルコシルト
ランスフェラーゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡを組み込
んだ組換え体ＤＮＡを導入した、グルコアミラーゼ生産
能を有するアスペルギルス・ニガーを栄養培地で培養
し、培養物中にグルコアミラーゼを生産せしめた後、該
培養物よりグルコアミラーゼを採取することを特徴とす
るグルコシルトランスフェラーゼ活性の少ないグルコア
ミラーゼの製造法。