JPH05268964A

JPH05268964A - 糸状菌プロモーター

Info

Publication number: JPH05268964A
Application number: JP4074092A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Kusakabe; 宜宏日下部; Akira Murasugi; 章村杉
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1993-10-19

Abstract

(57)【要約】【構成】アスペルギルスニデュランスのｃＤＮＡラ
イブラリーより得られた高発現性糸状菌プロモーター。【効果】本発明のプロモーターを用いれば、安全性が
高く、高分泌能を有する糸状菌を宿主とし、高等動物由
来のものにより近いタンパク質を大量に発現させること
が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糸状菌を宿主として用い
て遺伝子工学的手法によりタンパク質を生産する上で有
用なプロモーターに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、タンパク質の大量生産において、
遺伝子工学的手法を利用した生産方法が広く用いられる
ようになってきた。これらの場合、宿主としては、大腸
菌、枯草菌などの細菌、下等真核生物である酵母から高
等真核生物の培養細胞まで、様々なものが用いられてい
る。しかしながら、これらの宿主によって生産される組
み換えタンパク質が天然のタンパク質と同等程度の生理
活性を有し、その生産に要する経費が商業ベースに見合
うまで低くおさえ得る、といった条件を完全に満たすも
のはほとんど存在しない。さらに、薬品もしくは食品と
しての機能性タンパク質を考えた場合、人体に対する安
全性が保障されなければならないという条件が付加され
る。

【０００３】一方、糸状菌の中には、古くから酒類、乳
製品などの発酵に広く利用されているものも多く、特
に、アスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｏｒｙｚａｅ）に代表される麺かびは、わが国にお
いても清酒、大豆製品の生産に広く利用されてきた。こ
れらの経験より、アメリカでは、米国食品薬品局（ＦＤ
Ａ）がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅおよびア
スペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ
ｇｅｒ）を安全な宿主（ｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｇａ
ｒｄｅｄａｓｓａｆｅ；ＧＲＡＳ）として認めてお
り、世界保健機構（ＷＨＯ）も同様の見解を示している
ことから、物質生産における宿主としてのＡｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ属の有用性はかなり高いと考えられる。

【０００４】これまで、物質生産における宿主として糸
状菌が脚光を浴びなかった理由としては、かびの遺伝学
的背景がしっかりしていなかったことに加えて、分子遺
伝学的手法の導入が遅れたこと、特に、形質転換系が開
発されなかったことや、多核細胞であるがゆえに、モノ
クローナルな系統の単離、維持にかなりの困難が予想さ
れたことなどが挙げられる。しかし１９８３年にアスペ
ルギルスニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎ
ｉｄｕｌａｎｓ；以下Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓという）の
形質転換系が報告されて以来、まだ多くの問題が残され
ているものの徐々に研究が進められてきた。これらの研
究結果より考え得る異種タンパク質生産系におけるＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の利点は、上述のように宿主とし
ての安全性が法的に認められつつあることに加えて、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の有する潜在的タンパク質分泌
能が非常に高いことである（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓｎｉｇｅｒの分泌するグルコアミラーゼは、培
地中に最高数十ｇ／１の濃度で分泌される）。当然、こ
の分泌能の高さはプロテアーゼに代表される多くの加水
分解酵素の分泌にも反映されており、プロテアーゼに限
っても十種類以上の未知のプロテアーゼが分泌されてい
ると予想されている。これらの分泌物が目的のタンパク
質の安定性などに悪影響を与える可能性は否定できない
が、培地中に高濃度に分泌されることからもたらされる
精製の容易さ、それに伴う経費の軽減は十分に魅力があ
る。また、分泌タンパク質であることからもたらされる
もう一つの利点は、合成されたタンパク質が宿主の細胞
にとって毒性を示すものであったり、細胞内在性のプロ
テアーゼに対して高い感受性を示す場合など、非分泌系
では生産不可能なタンパク質に対しても有効な可能性が
あることである。また、分泌されたタンパク質の質的な
差異による利点もある。すなわち、高等真核生物由来の
タンパク質を発現させる場合、大腸菌では、ＳＨ基の掛
け違いなどにより高次構造が異常であったり、糖鎖、脂
質の付加がなされず生理活性が非常に低いことがあり、
また逆に、酵母では、過剰の糖鎖が付加されるなどやは
り修飾基が天然のタンパク質と異なるという報告もあ
る。この点、糸状菌では、分泌生産されたタンパク質が
高等真核生物から精製したタンパク質により近く、大腸
菌や酵母などで生産されたものより質的に優れている可
能性が大きい。一方、高等真核生物由来の培養細胞では
このような問題は少ない反面、薬品など高付加価値製品
以外の工業レベルでの大量生産には、経費的にあまり向
いていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上の如く、糸状菌を
宿主に用いた異種タンパク質発現系には多くの利点が考
えられるが、現在まで成功例は少なく、そのタンパク質
生産量は極めて少ない。従って、本発明の目的は、糸状
菌を宿主に用いたタンパク質発現系を開発することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは糸
状菌の中からタンパク質発現に有用なプロモーターを分
離、同定すべく鋭意研究してきた結果、コウジカビであ
るＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｃＤＮＡライブラリーより高
発現性プロモーターのクローニングに成功し、本発明を
完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は後記配列番号２で示さ
れる塩基配列又はこの部分配列であって糸状菌において
プロモーターとしての機能を有する塩基配列を含むこと
を特徴とする糸状菌プロモーターを提供するものであ
る。

【０００８】本発明の糸状菌プロモーターは、例えば
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓに属する菌のｃＤＮＡライブラリ
ーより高発現ｃＤＮＡ断片をクローニングし、そのｃＤ
ＮＡ断片をプローブとしてＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノム
ライブラリーより高発現プロモーターをクローニングす
ることにより製造することができる。

【０００９】ｃＤＮＡライブラリーの構築に用いられる
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓに属する菌としては、特に限定さ
れないが例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓＦＧＳＣＮ
ｏ．Ａ８９株が挙げられる。このＦＧＳＣＮｏ．Ａ８
９株の菌学的性質を以下に示す。

【００１０】菌学的性質（１）各培地における生育状態：麦芽寒天培地鈍黄緑色、多量の子嚢果を形成。ツアペック寒天培地淡オリーブ色〜オリーブ緑色、裏面は暗紫褐色、多量の
分生子構造を形成、子嚢果の形成良好、基底菌糸層は密
生。（２）最適生育温度：３０〜３７℃ （３）形状：子嚢果が表在性で暗赤紫色を呈し、ほぼ球
形で直径約２００μｍ、子嚢は８胞子でほぼ球形で直径
約１０μｍ、子嚢胞子は赤紫色でレンズ形、分生子頭は
短円柱形、分生子柄は滑面で波状に屈曲しており淡黄褐
色、分生子は黄緑色で球形、不規則に粗面。

【００１１】上記の菌学的性質より、本菌株はＡ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓに属する新規菌株と判断し、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２７８３号（ＦＥ
ＲＭＰ−１２７８３）として寄託した。

【００１２】ｃＤＮＡライブラリーの構築は、常法、す
なわちＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓより全ＲＮＡを抽出し、こ
れよりｍＲＮＡ分画を採取し、次いで市販のｃＤＮＡ合
成キットを用いてｃＤＮＡを合成した後ファージベクタ
ー等に挿入し、当該ベクターを大腸菌等に感染させるこ
とにより行なわれる。

【００１３】ｃＤＮＡライブラリーより高発現ｃＤＮＡ
を単離するには、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ全ｍＲＮＡを逆
転写し、標識したプローブを用いたプラークハイブリダ
イゼーションにより最も強くハイブリダイズするクロー
ンを選択することにより行なわれる。得られた高発現ｃ
ＤＮＡ断片をプローブとしてプラークハイブリダイゼー
ションすることにより、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムラ
イブラリーより、目的とするプロモーターを単離するこ
とができる。

【００１４】かくして得られる本発明プロモーターの全
塩基配列は配列番号２で示されるが、その部分配列であ
っても糸状菌におけるプロモーターとしての機能を有す
る限り本発明に含まれる。その部分配列の例としては、
例えば配列番号２で示される塩基配列のＡｃｃIII−Ａ
ｃｃIII断片（７４０ｂｐ）等が挙げられる。

【００１５】本発明のプロモーターを用い、糸状菌を宿
主としてタンパク質を生産するには、常法に従いプラス
ミドベクターに本発明プロモーター、目的タンパク質を
コードする遺伝子及びターミネーター等を順に組み込
み、得られた組換えプラスミドを用いて糸状菌を形質転
換し、その形質転換体を培養することにより行なわれ
る。

【００１６】

【発明の効果】本発明のプロモーターを用いれば、安全
性が高く、高分泌能を有する糸状菌を宿主とし、高等動
物由来のものにより近いタンパク質を大量に発現させる
ことが可能となる。

【００１７】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１８】実施例１（ｃＤＮＡライブラリーの構築）まず、ｃＤＮＡライブ
ラリーを構築するために、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓＦＧ
ＳＣＮｏ．Ａ８９株よりＣｓＴＦＡ法によって全ＲＮ
Ａを抽出した。即ち、ＦＧＳＣＮｏ．Ａ８９株をＤＰ
Ｙ培地（２％ｄｅｘｔｒｉｎ、１％ｐｅｐｔｏｎ
ｅ、０．５％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．５％
ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄）で３０℃、４
８時間培養した後、培養物をガラス濾過フィルター３Ｇ
−１で濾過し菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で
２回洗浄した後、液体窒素中で擦り潰し、グアニジウム
抽出液（５．５Ｍグアニジウムチオシアネート、２５
mM クエン酸ナトリウム、０．５％ラウリルザルコシ
ル、０．２Ｍ２−メルカプトエタノール、pH７．０）
に溶解した。次に高分子ＤＮＡを煎断するために、この
溶解液を１８Ｇ注射針に１０回通した後、３，０００rp
mにて１０分間遠心した。その上層を回収し、ＣｓＴＦ
Ａ溶液（５．７ＭＣｓＴＦＡ、０．１ＭＥＤＴＡ）
に重層し、３２，０００rpm、１８時間遠心した後、滅
菌水に溶解し、エタノール沈澱を行い、７０％エタノー
ルで洗浄し、乾燥した後、ＴＥ溶液（１０mM トリス−
塩酸（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ）に溶解した。回収
した全ＲＮＡに２倍量の結合溶液（２０mM トリス−塩
酸（pH７．６）、０．５ＭＮａＣｌ、１mM ＥＤＴ
Ａ）を加え、６５℃、５分間加熱した後、オリゴｄＴカ
ラムに添加した。カラムを結合溶液及び洗浄溶液（２０
mM トリス（pH７．６））、０．１ＭＮａＣｌ、１mM
ＥＤＴＡ）で洗浄した後、溶出溶液（１０mM トリス
（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ）にて溶出した。溶出し
たｍＲＮＡ分画をエタノール沈澱、洗浄、乾燥し、以下
の実験に供した。ｃＤＮＡの合成は、Ａｍｅｒｓｈａｍ
社のｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。上述のｍＲＮ
ＡにオリゴｄＴプライマーをアニーリングし、逆転写酵
素を用いて第１鎖を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮ
ａｓｅＨを用いて第２鎖を合成した。合成したｃＤＮＡ
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカーを結
合し、λファージベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩクロ
ーニングサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。得られたファージＤＮＡをｉｎｖｉｔｒｏパッケ
ージングキットを用いてパッケージングした後、大腸菌
Ｃ６００Ｈｆｌ株に感染させ、ｃＤＮＡライブラリーと
した。

【００１９】（高発現ｃＤＮＡの単離）まず、Ａ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ中で高頻度に発現されているｍＲＮＡを同
定、単離するために、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓから抽出し
たｍＲＮＡより、オリゴｄＴをプライマーに逆転写酵素
を用いて放射能標識し、プローブを作製した。このプロ
ーブを用いて上記で得られたｃＤＮＡライブラリーか
ら、プラークハイブリダイゼーションにより高発現ｃＤ
ＮＡのスクリーニングを行い、プローブと最も強くハイ
ブリダイズする０．７８ｋｂｐのクローン、ｃ４２４を
単離した。得られたｃ４２４をｐＵＣ１１８にサブクロ
ーニングし、１本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒ法に
より塩基配列の決定を行った。配列番号１にその配列を
示す。

【００２０】（ｃ４２４をコードするゲノム遺伝子の単
離）ｃ４２４を転写しているプロモーターを同定、単離
するためにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムライブラリーを
作製し、ｃ４２４をプローブとしてｃ４２４遺伝子の単
離を行った。ゲノムライブラリーの作製には、ＤＰＹ培
地にて３０℃、４８時間培養したＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
菌体を上記の方法で回収し、プロトプラスト調製溶液
（０．８ＭＮａＣｌ、１０mM リン酸緩衝液、０．５
％Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４、０．５％Ｃｅｌｌｕｌ
ａｓｅＲ−１０）中で３０℃、３時間振とうし、プロ
トプラスト化した。プロトプラストを０．８ＭＮａＣ
ｌで２回洗浄し、ＤＮＡ抽出溶液（１０mM トリス（pH
８．０）、０．１ＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）に
溶解し、プロテアーゼＫ処理及びＲＮａｓｅ処理を行
い、フェノール処理を２回、次いでフェノール：クロロ
ホルム：イソアミルアルコール処理、更にクロロホル
ム：イソアミルアルコール処理を行った後、エタノール
沈澱を行った。得られた沈澱を７０％エタノールで洗浄
した後、乾燥させ、滅菌水に溶解してゲノムＤＮＡ溶液
とした。このゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部
分分解した後、庶糖糖密度勾配遠心にかけて１０〜２０
ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む画分を回収し、これをλファ
ージベクターＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位にＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて挿入した。得られたファージＤＮＡを
ｉｎｖｉｔｒｏパッケージングキットを用いてパッケ
ージングした後、大腸菌ＮＭ５３９株に感染させてこれ
をＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムライブラリーとした。ｃ
４２４を放射能標識したものをプローブとして、この
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムライブラリーから、プラー
クハイブリダイゼーション法によってｃ４２４ゲノム遺
伝子を含むクローンを単離した。得られたクローン（以
下４２４プロモーターという）をｐＵＣ１１８にサブク
ローニングし、１本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒ法
により８４０ｂｐからなる塩基配列の決定を行った。配
列番号２にその配列を示す。

【００２１】実施例２（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来、ＴｒｐＣのターミネータ
ーのクローニング）上記の方法で抽出したｃ４２４ゲノ
ムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃ
ｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ・チェーン
・リアクション）法により、自体公知のＴｒｐＣ（トリ
プトファン要求性を相補する遺伝子）のターミネーター
及びポリＡ付加シグナルを含む６０４ｂｐの断片（配列
番号３）を増幅し、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ−ＢａｍＨ
Ｉサイトにサブクローニングした。なおプライマーに用
いたのは以下の配列を持つ合成オリゴＤＮＡである。 5'＞GGGGGCCCATGTCAACAAGAATA＜3' ：5'側プライマー 5'＞CTCCACATCTCCACTCGGATCCGG＜3' ：3'側プライマー

【００２２】（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓにおける発現ベク
ターの構築）Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓを形質転換するため
のベクターはｐＳａｌＩプラスミドを用いた。このプラ
スミドは大腸菌中での複製を可能にするためのｐＢＲ３
２２プラスミド由来のｏｒｉ（大腸菌の複製起点）及び
Ａｍｐ^r（アンピシリン耐性遺伝子）断片、及び、Ａ．
ｎｉｄｕｌａｎｓのアルギニン要求性突然変異株におけ
る形質転換株の選択を容易にするためのＡ．ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ由来のＡｒｇＢ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅｃａｒｂ
ａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子）を有してい
る。このｐＳａｌＩプラスミドに、外来遺伝子をＡ．ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ中で発現させるためのカセットを挿入し
た（ｐＳａｌ４２４；図１）。このカセットは、前記で
得られた４２４プロモーターのＡｃｃIII−ＡｃｃIII断
片（７４０ｂｐ）の両ＡｃｃIIIサイトをＥｃｏＲＩサ
イトに変換した後、その下流に前記のＴｒｐＣのターミ
ネーターのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片を連結したもので
ある。上記ｐＳａｌＩプラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩサイトにこのカセットを挿入した後、５’上流のＥ
ｃｏＲＩサイトを破壊し、下流のＥｃｏＲＩサイトに目
的のｃＤＮＡを挿入できるようにしたものである。

【００２３】（ｉｎｖｉｖｏにおける４２４プロモー
ター活性の検定）上記において、ｐＳａｌ４２４プラス
ミドに挿入した４２４プロモーターのＡｃｃIII−Ａｃ
ｃIIIがｉｎｖｉｖｏでのプロモーター活性の発現に
十分なものであるか否かを検定するために、ｐＳａｌ４
２４プラスミドのＥｃｏＲＩサイトにヒト胆汁酸活性化
リパーゼ（Ｂｉｌｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＬｉｐａｓ
ｅ；以下ＢＡＬという）のｃＤＮＡ（国際公開ＷＯ９
１／１５２３４）を挿入した組換えベクターｐＳＡＬ４
２４−ＢＡＬ（図２）を作成した。これをＡ．ｎｉｄｕ
ｌａｎｓＦＧＳＣＮｏ．Ａ８９株に導入し、ＢＡＬ
ｍＲＮＡの発現量、およびＢＡＬタンパク質量を解析し
た。特に、本実験においては、ＢＡＬタンパク質を培養
液中に分泌させるために、ＢＡＬの分泌シグナルをＡ．
ｎｉｄｕｌａｎｓ中で分泌シグナルとして機能すると予
想される自体公知の酵母のｓｕｃ２分泌シグナルに置換
したものを用いた。また、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓの形質
転換は、以下のように行った。まず前記の方法で調製し
たプロトプラストをガラス濾過フィルター３Ｇ−３で濾
過することにより、残存する菌糸を除去した。次に、こ
のプロトプラスト５×１０⁷個を溶液１（５０mM トリ
ス塩酸（pH７．５）、１０mM ＣａＣｌ₂、０．８Ｍ
ＮａＣｌ）２００μｌに懸濁し、ｐＳａｌ４２４ＤＮ
Ａ１０μｌを加え氷中に３０分放置した後、１mlのＰ
ＥＧ溶液（７０％ＰＥＧ４０００、１０mM ＣａＣ
ｌ ₂、５０mM トリス塩酸（pH７．５））を添加し、室
温に２０分放置した。このプロトプラストを溶液１で洗
浄後、ＭＭ培地（３％シュークロース、０．３％ＮａＮ
Ｏ₃、０．１％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄、
０．２％ＫＣｌ、０．０００２％ＣｕＳＯ₄、０．０
００１％ＦｅＳＯ₄、０．００００１％ＺｎＳＯ₄、
０．００００１％ＭｎＳＯ₄、０．００００１％Ａ
ｌＣｌ₃、０．８ＭＮａＣｌ、１ppmビオチン）に塗布
し、０．７５％寒天を含むＭＭ培地を重層し、３０℃に
て培養し、約５０個の形質転換体を得た。これらのうち
から４つの形質転換体（クローン２、３、４及び５）を
適当に選びＢＡＬｃＤＮＡを放射能標識したものをプロ
ーブに用い、サザンブロット法によりゲノム中に組み込
まれたベクターのコピー数を解析した（図３）。この図
において約１５ｋｄの位置がベクターに相当し、コピー
数はクローン２（レーン１）、クローン５（レーン
４）、クローン４（レーン３）、クローン３（レーン
２）の順であった。次にＢＡＬｍＲＮＡ量を指標にし
て、得られた形質転換体中での４２４プロモーターの活
性を、プローブとしてＢＡＬｃＤＮＡを用いてノーザン
ブロット法により測定した（図４）。この図からＢＡＬ
ｍＲＮＡの量は、クローン２、クローン５、クローン
４、クローン３の順であった。さらに、ＢＡＬタンパク
質量は、抗ＢＡＬ抗体を用いたウエスタンブロット法に
より測定した（図５）。この図からＢＡＬタンパク質の
量も、クローン２、クローン５、クローン４、クローン
３の順であった。これらの結果より、今回クローニング
した４２４プロモーターには、ｉｎｖｉｖｏでの活性
があり、４２４プロモーターを用いた発現系において
は、ゲノム中に組み込まれたベクターのコピー数とｍＲ
ＮＡ量、およびタンパク質量にかなりの相関があること
が確認された。

【００２４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：957 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AATCATCTAA GTATCAACTC AAGAACATAA CAAAGCCAAC AATCCGGAAC CACAACACAA 60 ACACTTCACT TCTTAATACT ATCACA ATG TCT CTG TTC AGA ACC ATT CCT ACC 113 Met Ser Leu Phe Arg Thr Ile Pro Thr 1 5 CCC GGA GAC TTT GCT CCT CTC TTC CGT CTC CTG GAT GAC TAC GAC AAC 161 Pro Gly Asp Phe Ala Pro Leu Phe Arg Leu Leu Asp Asp Tyr Asp Asn 10 15 20 25 CAC CGC TCC GCC CGC GGT CAC GCC TCA GTG CAG TCT TTT GCG CCT CGC 209 His Arg Ser Ala Arg Gly His Ala Ser Val Gln Ser Phe Ala Pro Arg 30 35 40 TTC GAC GTC CGC GAA TCC AAC GAG GCC TAC CAT CTT GAC GGC GAA CTC 257 Phe Asp Val Arg Glu Ser Asn Glu Ala Tyr His Leu Asp Gly Glu Leu 45 50 55 CCT GGT ATT CCT CAG AGC AAT ATC GAC ATT GAG TTC ACC GAC CCA CAG 305 Pro Gly Ile Pro Gln Ser Asn Ile Asp Ile Glu Phe Thr Asp Pro Gln 60 65 70 ACC CTG GTG ATC AAG GGC CGC TCC GAG CGC GAG TAC CAC TCC TCC AGC 353 Thr Leu Val Ile Lys Gly Arg Ser Glu Arg Glu Tyr His Ser Ser Ser 75 80 85 GAC GAC AAC AAA AAT GAT CAG GCC GAT ACA GAG AAC CAG GCC CGG GGT 401 Asp Asp Asn Lys Asn Asp Gln Ala Asp Thr Glu Asn Gln Ala Arg Gly 90 95 100 105 GAA AGC AGC GAA GTT GCA AAG ACC GGC GAG AAG CAG GTA TCC ACC AAG 449 Glu Ser Ser Glu Val Ala Lys Thr Gly Glu Lys Gln Val Ser Thr Lys 110 115 120 AAG GCT GCC AAC AAG TCT CGC TAC TGG GTC AGC GAG CGC TCT GTC GGC 497 Lys Ala Ala Asn Lys Ser Arg Tyr Trp Val Ser Glu Arg Ser Val Gly 125 130 135 GAA TTC CAG CGC ACC TTC ACC TTC CCA ACT CGA GTC AAT CAG GAC GAT 545 Glu Phe Gln Arg Thr Phe Thr Phe Pro Thr Arg Val Asn Gln Asp Asp 140 145 150 GTG AAG GCC AGC TTA AAG GAC GGT ATT CTT TCT CTT GTG GTG CCC AAG 593 Val Lys Ala Ser Leu Lys Asp Gly Ile Leu Ser Leu Val Val Pro Lys 155 160 165 GCT GTG CCT CCG ACT GCT AAA AAG ATC ACC ATT CAG TAAGGTGGTT 639 Ala Val Pro Pro Thr Ala Lys Lys Ile Thr Ile Gln 170 175 180 TGAATGCAGC ACGAGCCGAC CACAGGCCGT CCTGAGCTGA ACAATCAACA CGATTGTCTG 699 ATACGACGTT ACGACTTTCC GACTTTTTCG CCGACCTTTT TTCGCCTTTC GATCTGGATG 759 TCTAGGCTAT TCCGAACATT CAACAATCCA ACTTTCCAAC TTTCACTGAG TTGCAATGAT 819 AGCATAGTTC ATGGGGATTT GCTGTTCGAA CTTTTACCTT TCTGTCTCTA CTGTGCTGAA 879 GTCTCTAATA TCTGCACTGT CCCTACCTTG TGTACATTAG TACAATAATG AATGATAAAG 939 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 957

【００２５】配列番号：2 配列の長さ：840 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 GAATTCAAGC CTTCGCTTCC GGATGACTCC TTGCCGCATA CGATTATTGA ACAACTGGCT 60 GGACATGTAC AGCCTACTGG AGGAGATGCG GAGGGAAACA GGTTTGAGGC CACCTGATGG 120 TGACATTCAA AACGACTGGC GAGCCCAGGC CTGGCTGATG TAGTTACATC AAGAATCTCT 180 ACTGCAGGCC GGCTTGTGGC ATCAGCACGC CTGGATCAGG CTATAGATTT CTGGTTTTTC 240 GAGCGATAGA CCAGTTTAGA AGTCTCTGCT ACTAACTGAG TAGGCGTCTT CATCTACGGA 300 TATGCACTTG GAGCTGGTGC TCAGCCAGAA CCTGCTTGCC TGGAAATGTT CATGCTTTTC 360 CATGCATGTG CCCAAATGTC AGAAAAACAT TGAAGTAATC ATTTGTTTAA TCATCAATGA 420 GGAGATCAGT GTTCATTTTC CTCATCCTTT CCCTATCCTT CGATCAGCTC TGTTGTGGCG 480 AGCTTCTTTG TTGTCACGTG ATTGGTCGAA GGACCCAGAA TTATCGGGAG CTTCCGAGAG 540 GCTTTATCTA TAGGCGTCTT GGCGCTTCTT GAAACATCAC GGTCCATCCA GAAGGTATCG 600 CCCTATATCG AGAACAACGA TATCTGGCGT CATCAAGACG TCTCTTATGC CACCCGAGGA 660 CATAAATTGC CCCTGGACTC CTCATCTAGC TCGACCATCA TCAAGCAGAG CAAGCAATCA 720 TCTAAGTATC AACTCAAGAA CATAACAAAG CCAACAATCC GGAACCACAA CACAAACACT 780 TCACTTCTTA ATACTATCAC AATGTCTCTG TTCAGAACCA TTCCTACCCC CGGAGACTTT 840

【００２６】配列番号：3 配列の長さ：600 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列 GGGCCCATGT CAACAAGAAT AAAACGCGTT TTCGGGTTTA CCTCTTCCAG ATACAGCTCA 60 TCTGCAATGC ATTAATGCAT TGACTGCAAC CTAGTAACGC CTTCAGGCTC CGGCGAAGAG 120 AAGAATAGCT TAGCAGAGCT ATTTTCATTT TCGGGAGACG AGATCAAGCA GATCAACGGT 180 CGTCAAGAGA CCTACGAGAC TGAGGAATCC GCTCTTGGCT CCACGCGACT ATATATTTGT 240 CTCTAATTGT ACTTTGACAT GCTCCTCTTC TTTACTCTGA TAGCTTGACT ATGAAAATTC 300 CGTCACCAGC CCTGGGTTCG CAAAGATAAT TGCATGTTTC TTCCTTGAAC TCTCAAGCCT 360 ACAGGACACA CATTCATCGT AGGTATAAAC CTCGAAATCA TTCCTACTAA GATCGTATAC 420 AATAGTAACC ATGGTTGCCT AGTGAATGCT CCGTAACACC CAATACGCCG GCCGAAACTT 480 TTTTACAACT CTCCTATGAG TCGTTTACCC AGAATGCACA GGTACACTTG TTTAGAGGTA 540 ATCCTTCTTT CTAGAAGTCC TCGTGTACTG TGTAAGCGCC CACTCCACAT CTCCACTCGG 600

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＳａｌ４２４プラスミドの説明図を示す。

【図２】ｐＳａｌ４２４−ＢＡＬプラスミドの説明図を
示す。

【図３】形質転換体ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析
を示す。

【図４】形質転換体ｍＲＮＡのノーザンブロット解析を
示す。

【図５】形質転換体におけるＢＡＬタンパク質の発現を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:66）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２で示される塩基配列又はこの
部分配列であって糸状菌においてプロモーターとしての
機能を有する塩基配列を含むことを特徴とする糸状菌プ
ロモーター。