JPH0851982A

JPH0851982A - ヒト血清アルブミンをコードする改変された遺伝子

Info

Publication number: JPH0851982A
Application number: JP6209369A
Authority: JP
Inventors: Hideki Higashida; 英毅東田; Kimiko Murakami; 喜美子村上; Yuko Hama; 祐子浜; Yoko Tsukamoto; 洋子塚本; Atsushi Isoai; 敦礒合; Hiromichi Kumagai; 博道熊谷
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 1996-02-27

Abstract

(57)【要約】【目的】生理活性を有するペプチドと、キャリアとし
てのヒト血清アルブミンとを遺伝子工学的に結合して融
合タンパク質を製造する際に、該ペプチドとの結合をし
やすく改変した、改変ヒト血清アルブミン遺伝子を提供
する。【構成】天然型のヒト血清アルブミンをコードし、少
なくとも１つ以上の所望の位置に、特にはヒト血清アル
ブミンのポリペプチド鎖のアミノ末端、カルボキシル末
端、第１〜２ドメイン間あるいは第２〜３ドメイン間
に、制限酵素切断部位を導入してなる、ヒト血清アルブ
ミンをコードする改変された遺伝子、並びに、該遺伝子
を用いて遺伝子組換え手法によって製造された生理活性
を有する融合タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術によ
る新規融合タンパク質を作製する際に最適な、改変ヒト
血清アルブミン遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】生理活性を有するペプチドを医薬品など
の目的で使用する際、そのペプチドのみを単独で投与し
た場合、目的とする生理活性を十分に示さないことがし
ばしば起こる。これは主に分解酵素による不安定化や臓
器への吸着が原因である。この問題を解決するために、
通常、生理活性ペプチドと生体高分子との融合体を作製
し、その融合体を投与する方法が取られている。用いる
ことのできる生体高分子の例は数多くあるが、体内、特
に血中に多量に存在するため副作用が最も少ないと予想
される、血清アルブミンを用いることが好適に用いられ
る。

【０００３】生理活性ペプチドと血清アルブミンの融合
体を作製するには、化学的に結合する方法が常法とされ
ている。例えば、癌転移阻害活性を有することが確認さ
れているペプチドであるＩＩＦ−２（特開平３−３４９
９３号公報、Isoai et al.,Jpn. J. Cancer Res., 81,
909-914 (1992) および Isoai et al., Cancer Res., 5
2, 1422-1426 (1992)）を用いる場合、該ペプチドと血
清アルブミンを水溶性カルボジイミドで結合させて新規
融合タンパク質を作製し、使用することによって、単独
の該ペプチドと比較してより強い癌細胞浸潤阻害活性並
びに癌転移抑制活性を示すことが本願発明者らにより確
認されている（特開平４−２５４０００号、同４−３０
０８９９号、同４−３００９００号公報およびBiochem.
Biophys. Res. Commun., 192, 7ー14 (1993)）。すなわ
ち、該ペプチドを単独で用いる場合に比べ、１／５０〜
１／６０の低濃度で、ヒトおよびマウス由来高転移性癌
細胞の細胞外基底膜への浸潤を強く抑制した。さらに、
癌細胞をマウスの尾静脈より注入し肺や肝臓などの主要
臓器に転移させるいわゆる「実験的転移モデル」系にお
いて、該ペプチドと血清アルブミンよりなる新規融合タ
ンパク質は、該ペプチド単独で用いる場合に比べ、１／
１０以下の低用量で同等以上の転移阻害活性を示した。

【０００４】上記の癌転移阻害ペプチドと血清アルブミ
ンの融合体の場合のように、融合タンパク質を構成する
生理活性ペプチドと生体高分子の両者が、どちらもタン
パク質性アミノ酸の直鎖状結合によって構成される場
合、遺伝子工学的に目的融合タンパク質が作製可能であ
ることは、容易に推測できる。すなわち目的とする融合
タンパク質をコードする遺伝子を作製し、大腸菌や酵母
を宿主とする異種タンパク質生産システムに導入して作
製すればよい。遺伝子工学的に作製することによって、
化学的に結合する方法では作製することのできない融合
タンパク質の作製が可能である。例えば、生体高分子の
特定の位置に生理活性ペプチドを導入することや、融合
タンパク質中の生理活性ペプチドと生体高分子の個数の
比を制御することが容易になる。

【０００５】したがって、遺伝子操作技術を用いて生理
活性ペプチドを結合させる際に、キャリアとして用いる
生体高分子を、いかに目的の生理活性ペプチドを組込み
やすいものを選択するか、あるいはいかに組込みやすく
改変するかが問題であった。それと同時に、どのような
タイプの生理活性ペプチドでも結合できるような構造を
持っていることが必要である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる事情に
鑑みてなされたもので、融合タンパク質を作製するキャ
リアとして最適な血清アルブミン遺伝子を提供するもの
である。そして、これを用いて遺伝子組換え技術により
効率的かつ大量に融合タンパク質を生産せしめることが
可能となる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意研究を重ね、生理活性ペプチドを
容易に組込むことができるヒト血清アルブミン遺伝子を
考案設計し、遺伝子組換え技術を用いて作製するととも
に、実際に生理活性ペプチドと結合させた新規融合タン
パク質を作製することによって、この融合タンパク質が
目的とする生理活性を示すことを確認した。

【０００８】すなわち本発明によれば、天然型のヒト血
清アルブミンをコードする遺伝子の少なくとも１つ以上
の所望の位置に制限酵素切断部位を導入してなる、ヒト
血清アルブミンをコードする改変された遺伝子が提供さ
れる。

【０００９】ここで、前記制限酵素切断部位の導入位置
が、ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末
端、カルボキシル末端、第１〜２ドメイン間あるいは第
２〜３ドメイン間のうちのいずれか１箇所若しくはこれ
らの任意の組み合わせの位置であるのが好ましい。

【００１０】また本発明によれば、上記いずれかの遺伝
子の制限酵素切断部位に生理活性を有するペプチドをコ
ードする遺伝子を導入することによって作製した融合タ
ンパク質が提供される。

【００１１】さらに本発明によれば、上記融合タンパク
質をコードする遺伝子が提供される。

【００１２】以下、本発明について詳述する。

【００１３】本発明の改変ヒト血清アルブミン遺伝子
は、生理活性を有するペプチドとの結合を容易ならしめ
るために、天然型のヒト血清アルブミンをコードする遺
伝子に新たに制限酵素切断部位を導入して作製される。

【００１４】改変ヒト血清アルブミン遺伝子の作製のた
めに用いる天然のヒト血清アルブミン遺伝子は、例え
ば、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりプラスミドｐＩ
ＬＭＡＬＢ５（国立予防衛生研究所遺伝子バンク）の制
限酵素ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプローブとし
てクローニングすること等により得ることができる。な
お、ヒト血清アルブミン遺伝子には、そのアミノ酸配列
が互いに若干異なっているという多型が報告されてお
り、上記の方法でクローニングしたヒト血清アルブミン
遺伝子もその範疇に入るものである。本発明における
「ヒト血清アルブミン」とは、これらすべての多型のも
のを含み得る。

【００１５】次に、このヒト血清アルブミン遺伝子の所
定位置に制限酵素切断部位をもつ断片を導入し、改変ヒ
ト血清アルブミン遺伝子を作製する。この制限酵素切断
部位の導入は、後に生理活性を有するペプチド遺伝子
（例えば、癌転移阻害遺伝子など）の結合を容易ならし
めるためのもので、癌転移阻害遺伝子結合の際にはこの
部位を制限酵素にて切断し、この切断部に癌転移阻害遺
伝子を結合させるためである。

【００１６】改変の対象である制限酵素切断部位を導入
する位置は、ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖中に
任意の位置に設定することが可能であるが、活性を十分
に発揮させることを考慮すると、タンパク質の表面に位
置しており、かつ立体構造を破壊することのない位置で
あることが好ましい。例えば、アミノ末端（Ｎ末端）あ
るいはカルボキシル末端（Ｃ末端）など、ヒト血清アル
ブミンの立体構造の形成に影響を及ぼさないと考えられ
る位置が望ましい。また、ヒト血清アルブミンの立体構
造は、Ｘ線結晶解析よって詳細に検討されており（Xia
o, M,H.,and Carter, D.C. Nature, 358:209-215, 1992
）、３個あるドメインの間、すなわち第１〜２ドメイ
ン間あるいは第２〜３ドメイン間も、導入部位の候補と
なり得る。導入する制限酵素切断部位の個数は、必要に
応じて、単一の位置、ないしは複数の位置に、単数ある
いは複数個導入し得る。

【００１７】導入する制限酵素切断部位は、既知の制限
酵素によって認識されるものであればよい。望ましく
は、ヒト血清アルブミン中にほとんど存在しない切断部
位であり、かつ切断酵素が容易に入手できるものが望ま
しい。特に６塩基認識でかつ消化後に粘着末端を形成す
るものがライゲーションを行ううえで好ましい。また、
当然に天然のアミノ酸配列を一切変更しないことと同時
に、塩基配列もできるだけ変更しないことが望ましい。
以上の点を鑑みて、アミノ末端およびカルボキシル末端
に制限酵素ＡｆｌＩＩＩ切断部位を、第１〜２ドメイン
間に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、第２〜３ドメ
イン間に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を導入するのが最
も好ましい。なお、制限酵素切断部位導入法としては任
意の方法を用い得るが、当業分野で常用されているＰＣ
Ｒを用いた変異導入法等が好適に用いられる。

【００１８】さらに本発明では、生理活性を有するペプ
チドをコードする遺伝子を作製し、これを上記改変ヒト
血清アルブミン遺伝子の制限酵素切断部位に結合させ
て、生理活性を有する融合タンパク質遺伝子を作製す
る。次いで、この遺伝子を発現ベクターに導入し、さら
にこのベクターを用いて宿主細胞で該遺伝子を発現さ
せ、宿主細胞内より抽出、精製することによって、生理
活性融合タンパク質を製造する。

【００１９】この生理活性を有するペプチドとしては、
例えば、配列番号６のアミノ酸配列で表される癌転移阻
害活性を有するペプチド（癌転移阻害ペプチド；特開平
３−３４９９３号公報）等が挙げられる。この癌転移阻
害ペプチドをコードする遺伝子としては理論的には幾通
りもの数多くの配列が考えられ得るが、望ましくは遺伝
子組換えに用いる宿主細胞のコドン使用頻度に合わせた
ものがよく、最も多頻度で使用されるコドンを用いて設
計するのがよい。

【００２０】ここで、用いる宿主細胞としては特に限定
されるものではないが、望ましくは培養方法が容易で、
低コストで培養できる微生物がよく、例えば大腸菌（Es
cherichia coli）、各種酵母類、枯草菌、糸状菌等、当
業分野で常用されている宿主細胞等が挙げられる。原核
生物を宿主細胞として用いる形質転換方法では必ずしも
全てのポリペプチドに対して有効ではなく、真核生物由
来のタンパク質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同
じ立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。ま
た特有のエンドトキシンが存在する場合は、最終製品の
夾雑物になる可能性があり、好ましくない。このため好
ましくは、エンドトキシンを含まず、培養方法も確立し
ており、従来より醗酵並びに食品工業で用いられてお
り、人体に関する安全性も確立されている各種酵母類が
よい。このなかでも特に、遺伝学的並びに分子生物学的
に動物細胞に近い性質をもつとされ、より天然体に近い
遺伝子産物が得られることが期待される分裂酵母シゾサ
ッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）
が最も好ましい。このシゾサッカロミセス・ポンベの菌
株としては、例えば寄託番号ＡＴＣＣ３８３９９（leu-
32h^-）やＡＴＣＣ３８４３６（ura4-294h^-）等としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に寄託されているものが挙げられ、入手可能であ
る。

【００２１】したがって本発明においては、配列番号６
で表される癌転移阻害ペプチドをコードする遺伝子は、
シゾサッカロミセス・ポンベでの高発現に至適なコドン
を用いて設計し、合成したものであるのが最も好まし
い。シゾサッカロミセス・ポンベの最適コドン使用頻度
は、例えば A. Nasim et al.: Molecular Biology oft
he Fission Yeast, p.263, Academic Press (1983) 等
から知ることができる。本発明者らは種々研究を重ねた
結果、配列番号７の塩基配列で表される遺伝子が最も好
適であるとの結論を得、設計、合成した（ただし配列番
号７の塩基配列は、翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）および
翻訳終了シグナル（ＴＡＡ）を付加している）。なお、
遺伝子の作製（合成）は、トリエステル法（Nuc. Acid.
Res. 10,p.6553,(1982) ）やホスホアミダイト法（Tet
rahedron Letters 22, p.1859,(1981) ）などの種々の
方法がすでに開発されており、いずれの方法を用いても
よい。またＤＮＡ合成機器（ＤＮＡシンセサイザー）等
が市販されているので、それらを用いてもよい。

【００２２】次に、上記のようにして作製した新規の癌
転移阻害融合タンパク質遺伝子をベクターに組み込んで
組換えベクターを作製する。用いるベクターは特に限定
されるものではないが、宿主細胞内で自律的に複製可能
であって、癌転移阻害融合タンパク質合成遺伝子（外来
遺伝子）を組み込み得る挿入部位をもち、さらにこの組
み込んだ合成遺伝子を宿主細胞内で発現せしめることを
可能とする領域を有する必要がある。このようなベクタ
ーとして、例えば本発明者らがすでに創出に成功してい
るシゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする外来遺伝子
発現ベクターｐＴＬ２Ｍ（特願平５−２４９３１０号明
細書）等を有利に用いることができ、これらのベクター
に上記合成遺伝子を容易に組み込み得る。

【００２３】次いで上記組換えベクターを宿主細胞内に
導入し、形質転換体を得る。組換えベクターの宿主細胞
内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法によ
り行うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラス
ト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーショ
ン法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合
法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙げられる
が、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得
る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場合は、
例えば酢酸リチウム法（K. Okazaki et al., Nucleic A
cids Res., 18, 6485-6489(1990)）等によって効率よく
形質転換体を得ることができる。

【００２４】このようにして得られた形質転換体を培養
することにより、培養物中に癌転移阻害融合タンパク質
が産生される。これを公知の方法で単離し、場合により
精製することにより、目的とする癌転移阻害融合タンパ
ク質が得られる。

【００２５】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地などの栄養培地（M. D. Rose et al.,
"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor L
abolatory Press(1990)r）や、ＭＢ培地などの最少培地
（K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-
6489(1990)）等を用いることができる。形質転換体の培
養は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、
８〜１６８時間、好ましくは２４〜７２時間行う。振盪
培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて
攪拌や通気を加えてもよい。

【００２６】培養物中に産生した融合タンパク質の単離
・精製法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶
解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電
気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィ
ニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用す
る方法、逆相高速液体フロマトグラフィー等の疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を
利用する方法等が挙げられる。

【００２７】単離・精製した融合タンパク質の確認方法
としては、公知のウエスタンブロッティング法や活性測
定法等が挙げられる。また、精製された融合タンパク質
は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析など
によりその構造を明らかにすることができる。

【００２８】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明する。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術
範囲が限定されるものではない。また実施例中の各操作
については、特に記載したもの以外は、当業界で常用さ
れている方法（例えば J.Sambrook et al.: Molecular
Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Y
ork, USA, 1989.）に従った。

【００２９】［実施例１］配列番号１の改変ヒト血清ア
ルブミン遺伝子の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９（宝酒造
（株）製）上にクローニングしたヒト血清アルブミンｃ
ＤＮＡを鋳型として、配列番号１２および１３の塩基配
列で表されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、
次いで制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造（株）製）およびＨｉ
ｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）によって末端調節（部分
消化）を行なった。フェノール抽出、エタノール沈澱に
よる精製の後、アガロースゲル電気泳動し、約１８００
塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰ
（旭硝子）を用いたガラスビーズ法で精製し、挿入断片
とした。

【００３０】さらにこれとは別に、シゾサッカロミセス
・ポンベ発現ベクターｐＴＬ２Ｍを用意した。このベク
ターｐＴＬ２Ｍは、本願発明者らがすでに構築したもの
である（特願平５−２４９３１０号明細書）。以下にそ
の作製方法を述べる。

【００３１】［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］まず、公知
の方法で調製されたｐｃＤ４ＣＡＴをＢａｍＨＩで切断
し、ＣＡＴ遺伝子を除去後ライゲーションし、ｐｃＤ４
を作製した。ｐｃＤ４をＢａｍＨＩで部分切断し、平滑
末端化した後ライゲーションしてｐｃＤ４Ｂを作製した
（特開平５−１５３８０号公報）。

【００３２】このプラスミドｐｃＤ４Ｂを制限酵素Ｓａ
ｃＩで消化後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さらに
アガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によって約
４５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３３】一方、これとは別に、ヒト線維芽細胞由来
の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリー（ｐｃＤベクタ
ー）を公知の方法により調製した。さらに、既に知られ
ているヒトリポコルチンＩの遺伝子配列（Nature, 320,
77,(1986)）のうち、タンパク質のＮ末端側アミノ酸配
列をコードする５０塩基の遺伝子配列をＤＮＡプローブ
として上述のライブラリーからリポコルチンＩの遺伝子
をコロニーハイブリダイゼーション法により取得し、塩
基配列を決定することにより、リポコルチンＩタンパク
質全長をコードするものであることを確認した。取得し
たクローンをｐｃＤｌｉｐｏＩと名づけた。（特開平５
−１５３８０号公報）。そしてこのヒトリポコルチンＩ
遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃＤｌｉｐｏＩを
制限酵素ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さ
らにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によっ
て約１３００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３４】両ＤＮＡをライゲーションした後、これを
大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入して形質転換
した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的
とするベクターｐＲＬ２Ｌ（図５）を持った形質転換体
をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限
酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認し
た。

【００３５】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後、アガロース
ゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバンド
を切り出し、ガラスビーズ法で精製した。これとは別
に、公知のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り約６０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから
抽出精製した。

【００３６】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＲ
Ｌ２Ｍ（図６）をスクリーニングした。部分塩基配列の
確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであ
ることを確認した。

【００３７】［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］上記ｐＲＬ
２Ｍを鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-
TTGACTAGTTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌ
クレオチド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-
3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用
いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐ
ｅＩおよびＥｃｏＲＩで末端調節し、フェノール抽出、
エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約
６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。

【００３８】一方、これとは別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵
素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約４５００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベ
クターｐＴＬ２Ｍ（図７）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。

【００３９】このようにして作製したｐＴＬ２Ｍを制限
酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、
約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４０】そして上記挿入断片とこの発現ベクターｐ
ＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計２本
を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を
用いてライゲーションした。これを大腸菌ＤＨ５株（東
洋紡（株）製）に導入して形質転換した後、目的のプラ
スミドｐＴＬ２Ｂｍａを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従
ってｐＴＬ２Ｂｍａを大量調製し、制限酵素地図の作製
および塩基配列決定によって、配列番号１の配列を持っ
たプラスミドであることを確認した。

【００４１】［実施例２］配列番号２の改変ヒト血清ア
ルブミン遺伝子の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１４の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を行なっ
た。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、
アガロースゲル電気泳動し、約５５０塩基対に相当する
バンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビー
ズ法で精製し、挿入断片１とした。

【００４２】一方、これとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型
として、配列番号１５および１３の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩによって末端調節を行なった。フェノール抽
出、エタノール沈澱による精製の後、アガロースゲル電
気泳動し、約１３５０塩基対に相当するバンドを切出
し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製
し、挿入断片２とした。

【００４３】さらにこれとは別に、実施例１の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセス・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４４】そして上記挿入断片２本とこの発現ベクタ
ーｐＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計３
本を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーシ
ョンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換し
た後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｂを得た。アルカ
リ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｂを大量調製し、制
限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番
号２の配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００４５】［実施例３］配列番号３の改変ヒト血清ア
ルブミン遺伝子の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１６の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）によって末
端調節を行なった。フェノール抽出、エタノール沈澱に
よる精製の後、アガロースゲル電気泳動し、約１１００
塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを
用いたガラスビーズ法で精製し、挿入断片１とした。

【００４６】一方、これとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型
として、配列番号１７および１３の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を
行なった。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製
の後、アガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対に相
当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラ
スビーズ法で精製し、挿入断片２とした。

【００４７】さらにこれとは別に、実施例１の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセス・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４８】そして上記挿入断片２本とこの発現ベクタ
ーｐＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計３
本を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーシ
ョンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換し
た後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｃを得た。アルカ
リ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｃを大量調製し、制
限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番
号３の配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００４９】［実施例４］配列番号４の改変ヒト血清ア
ルブミン遺伝子の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１８の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＡｆｌＩＩＩによって末端調節を行なっ
た。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、
アガロースゲル電気泳動し、約１８００塩基対に相当す
るバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビ
ーズ法で精製し、挿入断片とした。

【００５０】一方、これとは別に、実施例１の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセス・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００５１】そして上記挿入断片とこの発現ベクターｐ
ＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計２本
を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーショ
ンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換した
後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｄを得た。アルカリ
−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｄを大量調製し、制限
酵素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番号
４の配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００５２】［実施例５］配列番号５の改変ヒト血清ア
ルブミン遺伝子の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１４の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を行なっ
た。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、
アガロースゲル電気泳動し、約５５０塩基対に相当する
バンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビー
ズ法で精製し、挿入断片１とした。

【００５３】これとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１５および１６の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって末端調節を行な
った。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の
後、アガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対に相当
するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラス
ビーズ法で精製し、挿入断片２とした。

【００５４】またこれとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型と
して、配列番号１７および１８の塩基配列で表されるプ
ライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＡｆｌＩＩＩによって末端調節を行な
った。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の
後、アガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対に相当
するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラス
ビーズ法で精製し、挿入断片３とした。

【００５５】さらにこれとは別に、実施例１の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセス・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００５６】そして上記挿入断片とこのｐＴＬ２Ｍの上
記制限酵素による二重消化物との計４本を、ＤＮＡライ
ゲーションキットを用いてライゲーションした。これを
大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換した後、目的のプラ
スミドｐＴＬ２Ｂｍｅを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従
ってｐＴＬ２Ｂｍｅを大量調製し、制限酵素地図の作製
および塩基配列決定によって、配列番号５の配列を持っ
たプラスミドであることを確認した。

【００５７】［実施例６］癌転移阻害ペプチドをコード
する配列番号７の塩基配列で表される遺伝子の作製配列番号６のアミノ酸配列をもとに、シゾサッカロミセ
ス・ポンベのコドン使用頻度（Nasim, A. et al: Molec
ular Biology of the Fission Yeast, Academic Press,
1989, p263.）に合せて、配列番号１０および１１の塩
基配列で表される２本の一本鎖オリゴＤＮＡを、ＤＮＡ
自動合成装置（Applied Biosystems）を用いて合成し
た。なお、配列番号１０の塩基配列は、５’末端に制限
酵素ＢａｍＨＩへの挿入部位と開始コドンＡＴＧを、
３’末端に終始コドンＴＡＡと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
への挿入部位を導入した遺伝子のセンス鎖であり、配列
番号１１の塩基配列はそのアンチセンス鎖である。脱保
護、精製後、これら２本を７０℃でアニーリングした。

【００５８】一方、これとは別にプラスミドｐＵＣ１９
を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）およびＨｉ
ｎｄＩＩＩで二重消化し、フェノール抽出、エタノール
沈澱による精製の後、アガロースゲル電気泳動し、約２
６００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲ
ＥＰを用いたガラスビーズ法で精製した。

【００５９】これら両者の断片を、ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いてライゲーションした。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株（宝酒造（株）製）に導入して形質転換した
後、アンピシリン耐性を持ち、かつ X-gal プレート上
で白コロニーを提示するポジティブクローンをスクリー
ニングし、目的のプラスミドすなわち制限酵素ＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化時に約７０塩基対の切
断断片を示すｐＩ２Ａを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従
ってｐＩ２Ａを大量調製し、制限酵素地図の作製および
塩基配列決定によって、目的の配列を持ったプラスミド
であることを確認した。

【００６０】［実施例７］癌転移阻害ペプチド遺伝子を
含有する発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの作製プラスミドｐＩ２Ａを制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩの二重消化で末端を調節し、アクリルアミドゲル
電気泳動により約７０塩基対に相当するバンドを切出
し、ゲルから溶出して癌転移阻害ペプチド遺伝子挿入断
片とした。

【００６１】この遺伝子断片と実施例４で作製したｐＴ
Ｌ２Ｂｍｄの制限酵素ＡｆｌＩＩＩ消化物（部分消化
後、約７０００塩基対に相当するバンドをＤＮＡ−ＰＲ
ＥＰを用いて精製）との計２本を、ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５
株を形質転換した後、第１図に示す、目的のプラスミド
ｐＴＬ２ＢｍＩを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従ってｐ
ＴＬ２ＢｍＩを大量調製し、制限酵素地図の作製および
塩基配列決定によって、配列番号７の配列を持ったプラ
スミドであることを確認した。

【００６２】［実施例８］発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ
を用いたシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換シゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求性株、ｈ^-
ｌｅｕ１−３２（ＡＴＣＣ３８３９９）をロイシン含有
最少培地ＭＢ−ｌｅｕで１０⁷ 細胞数／ｍｌになるまで
生育させた。遠心集菌、水による洗菌後１０⁹ 細胞数／
ｍｌになるように１００ｍＭ酢酸リチウム（ｐＨ５．
０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。
その後、上記懸濁液１００μｌに、制限酵素ＰｓｔＩで
消化したｐＡＬ７（K. Okazaki et al.: Nucl. Acids R
es. 18, 6485-6489 (1990)）１μｇおよび２μｇの発現
ベクターｐＴＬ２ＢｍＩを１０μｌのＴＥバッファーに
溶かした溶液を加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０μ
ｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
遠心分離によりＰＥＧ４０００を除去し、１ｍｌの培養
液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕに懸濁した。

【００６３】この懸濁液から１００μｌを分取し、さら
に９００μｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕで希釈し
て、３２℃３０分間インキュベートした後、３００μｌ
を最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日
間インキュベートし、得られた形質転換体をＧ４１８を
２５μｇ／ｍｌ含むＹＥＡ培地に移し、さらに３２℃で
５日間培養し、得られたクローンを目的とする各形質転
換体とした。

【００６４】一方、これとは別に、癌転移阻害ペプチド
遺伝子を持たないプラスミドｐＴＬ２Ｍ（既述）および
ｐＴＬ２Ｂｍ（特願平５−２４９３１０号明細書）につ
いても、同じ方法で形質転換体を作製し、ネガティブコ
ントロールとした。なお、プラスミドｐＴＬ２Ｂｍは以
下のようにして作製した。

【００６５】［プラスミドｐＴＬ２Ｂｍの作製］国立予
防衛生研究所遺伝子バンクより供与を受けた、ヒト血清
アルブミンｃＤＮＡを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５を
鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCA
TGGATGCACACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プ
ライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素ＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで末端調節し、フェノール抽出、エタノー
ル沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。

【００６６】これとは別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆ
ｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約５０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。

【００６７】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＴ
Ｌ２Ｂｍ（図８）をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。

【００６８】［実施例９］形質転換体の培養および無細
胞抽出液の調製抗生物質Ｇ４１８（GIBCO BRL ）を２００μｇ／ｍｌの
濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ培地［（２％グルコース
（和光純薬（株）製）、１％バクトイーストエキス（Di
fco ）、２％バクトペプトン（Difco ）］に、実施例８
で作製した形質転換体を植菌し、３２℃で５日間培養し
た。その培養液から１０⁸ 個の菌体を集菌し、洗菌後、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５) で懸濁し、超
音波破砕を行った。終濃度が１％になるように１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、８０℃で１５分間加熱した。遠心分離
によって無細胞抽出液（上清）を得た。

【００６９】これとは別に、癌転移阻害ペプチド遺伝子
を持たない上記ｐＴＬ２ＭおよびｐＴＬ２Ｂｍを導入し
た形質転換体についても、同様の方法で無細胞抽出液を
作製し、ネガティブコントロールとした。

【００７０】［実施例１０］ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による癌転移阻害融合タンパク質の発現
解析ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、実施例９で作製した各形質
転換体由来の無細胞抽出液について発現解析を行なっ
た。結果を図２に示す。同図から明らかなように、ｐＴ
Ｌ２ｍＢＩによる形質転換体では、コントロールである
ｐＴＬ２Ｂｍによる形質転換体に比較して、分子量６
９，０００のバンド（同図中、＊で示す）が、癌転移阻
害融合タンパク質を産生していることによって、分子量
７１，０００の位置（同図中、＊＊で示す）に移動して
いることが検出できた。デンシトメータによって測定し
たところ、癌転移阻害融合タンパク質の産生量は、全菌
体タンパク質の３０％程度であった。

【００７１】［実施例１１］ウエスタンブロッティング
による癌転移阻害融合タンパク質の確認実施例９で作製した各形質転換体由来の無細胞抽出液に
ついて実施例１０と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行な
った。得られたゲルをＰＶＤＦ膜（Bio-Rad ）に転写
し、癌転移阻害ペプチドに特異的な抗体（A. Isoai et
al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 7-14 (199
3)）を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ
（アマシャム（株）製）によって検出した。結果を図３
に示す。同図から明らかなように、該融合タンパク質を
含む配列に相当する分子量７１, ０００附近の位置に唯
一の明瞭なバンドが得られることから、該融合タンパク
質に特異的なアミノ酸配列が含まれている融合タンパク
質が産生していることが確認された。

【００７２】［実施例１２］癌転移阻害融合タンパク質
の精製ｐＴＬ２ＢｍＩにより形質転換された形質転換体を、Ｇ
４１８を２５μｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ
培地で３２℃、１日間前培養した後、Ｇ４１８を２００
μｇ／ｍｌ含む１リットルのＹＰＤ培地に１×１０⁸ ／
ｍｌの割合で植菌してさらに４日間培養した。集菌後の
菌体の４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）［１２μＭのＡＰＭＳＦ（和光純薬（株）製）、２
５μＭロイペプチン（和光純薬（株）製）、２ｍＭのＥ
ＤＴＡを含む］に懸濁し等量のガラスビーズ（ビードビ
ーター）を用いて０℃で破砕した。１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した沈澱を同じ緩衝液で洗浄した
後、６Ｍグアニジン塩酸と１０ｍＭのジチオスレイトー
ルを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て５０℃１時間で可溶化した後、１２，０００rpm 、２
０分間遠心分離した上清を０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型
グルタチオンを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で１００倍（ｖ／ｖ）に４℃で徐々に希釈し
た。１晩４℃で放置後、限外濾過膜（アミコン）にて濃
縮しスーパーロース１２カラムにてゲル濾過し、各画分
についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析し分子量７１，００
０の位置に唯一のバンドが見られた画分を集め精製癌転
移阻害融合タンパク質とした。

【００７３】［実施例１３］精製癌転移阻害融合タンパ
ク質の癌細胞浸潤阻害活性の測定実施例１２で精製した癌転移阻害融合タンパク質につい
て、癌細胞の浸潤抑制効果を調べた。評価方法は Albin
i らの方法（Albini et al.: Cancer Res. 47,3239-324
5 (1987) ）に従って行った。８μｍのポアサイズを持
つポリカーボネートフィルターにより、上層と下層に分
けられたケモタキセル（クラボウ（株）製）のフィルタ
ー上面に１０μｇのマトリゲル（コラボレーティブ
（株）製）を塗布し、室温で一晩乾燥させた。使用直前
に培養液で膨潤させ、２４穴のカルチャープレートにセ
ットした。癌細胞はＢ１６メラノーマ由来の高転移性ク
ローンＢ１６ＦＥ７を使用した。

【００７４】細胞を１．８５ｋＢｑ／ｍｌの［¹²⁵ Ｉ］
ＩＵｄＲ（アマシャム（株）製）存在下で２日間培養し
た。使用直前にトリプシン溶液で細胞を回収した後、
０．１％の牛血清アルブミンを含む培養液に懸濁し細胞
数と、取り込まれた［¹²⁵ Ｉ］ＩＵｄＲの放射能を計測
した。ケモタキセルの下層には２０μｇ／ｍｌのヒトフ
ィブロネクチンを入れ、上層には５×１０⁴ 個の細胞を
種々の濃度の癌転移阻害融合タンパク質と共に入れ、炭
酸ガスインキュベータ中で２０時間培養した。

【００７５】培養終了後、フィルターの上面に残ってい
る細胞を綿棒でかきとり、フィルターをティッシュソル
ビライザー（アマシャム（株）製）で下面に移動した細
胞と富みに溶解した後、放射能を計測した。結果を図４
に示す。同図から明らかなように、本癌転移阻害融合タ
ンパク質により、癌細胞の浸潤が有意に阻害されること
が示された。

【００７６】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明による改変
ヒト血清アルブミン遺伝子を用いることによって、どの
様な形の生理活性ペプチドであっても、ヒト血清アルブ
ミンの特定の位置に、遺伝子工学的に容易に組込むこと
が可能になった。したがって、本発明を用いて新規な生
理活性融合タンパク質を容易に作製することが可能にな
ったといえる。

【００７７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１７６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３．．１７６３特徴を決定した方法：Ｅ配列 CC ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 50 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 98 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 146 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 194 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 242 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 290 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 338 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 386 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 434 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 482 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 530 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 578 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 626 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 674 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 722 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 770 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 818 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 866 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 914 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 962 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1010 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1058 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1106 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1154 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1202 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1250 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1298 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1346 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1394 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1442 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1490 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1538 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1586 GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1634 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1682 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1730 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAA 1763 配列番号：２配列の長さ：１７６１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１７６１特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTT GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAA 1761 配列番号：３配列の長さ：１７６１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１７６１特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTC AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAA 1761 配列番号：４配列の長さ：１７６５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１７５８特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG T 1765 配列番号：５配列の長さ：１７６７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３．．１７６０特徴を決定した方法：Ｅ配列 CC ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 50 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 98 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 146 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 194 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 242 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 290 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 338 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 386 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 434 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 482 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 530 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTT GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 578 AGC TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 626 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 674 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 722 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 770 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 818 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 866 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 914 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 962 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1010 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1058 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1106 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTC AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1154 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1202 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1250 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1298 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1346 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1394 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1442 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1490 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1538 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1586 GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1634 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1682 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1730 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG T 1767 配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Glu Asp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Gly Asp Ala Lys 20 21 配列番号：７配列の長さ：７１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG 50 GGT GCC GGT GAC GCC AAG TAA 71 配列番号：８配列の長さ：６０９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu 20 25 30 Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr 35 40 45 Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp 50 55 60 Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr 65 70 75 80 Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu 85 90 95 Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn 100 105 110 Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe 115 120 125 His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala 130 135 140 Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala 165 170 175 Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala 180 185 190 Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly 195 200 205 Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe 210 215 220 Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr 225 230 235 240 Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp 245 250 255 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile 260 265 270 Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro 290 295 300 Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr 305 310 315 320 Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 325 330 335 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 340 345 350 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 355 360 365 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu 370 375 380 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 405 410 415 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 420 425 430 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 435 440 445 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 450 455 460 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 465 470 475 480 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 485 490 495 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 500 505 510 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 515 520 525 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 530 535 540 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 545 550 555 560 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 565 570 575 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Tyr Met Ala Glu Asp Gly 580 585 590 Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly Ala Gly Asp Ala 595 600 605 Lys 609 配列番号：９配列の長さ：１８３２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３．．１８３２特徴を決定した方法：Ｅ配列 CC ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 50 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 98 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 146 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 194 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 242 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 290 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 338 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 386 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 434 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 482 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 530 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 578 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 626 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 674 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 722 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 770 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 818 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 866 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 914 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 962 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1010 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1058 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1106 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1154 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1202 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1250 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1298 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1346 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1394 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1442 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1490 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1538 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1586 GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1634 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1682 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1730 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG GCC GAG GAC GGT 1778 GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG GGT GCC GGT GAC GCC 1826 AAG TAA 1832 配列番号：１０配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATCC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT 50 GAG GGT GCC GGT GAC GCC AAG TA 73 配列番号：１１配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列 AGCTTA CTT GGC GTC ACC GGC ACC CTC AGC CTT CTC AGC TTG GTC GGT CTT 51 GGC GTC ACC GTC CTC GGC CAT G 73 配列番号：１２配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGACCATGGA TGCACACAAG AGTGAGGT 28 配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AATAAGCTTT TGATCTTCAT 20 配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTT GGCAACAGGC 20 配列番号：１５配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTG ATGAACTTCG GGATGAAGG 29 配列番号：１６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGAATTCA TCGAACACTT TGGC 24 配列番号：１７配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGAATTCA AACCTCTTGT GGAAGAGCC 29 配列番号：１８配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAGAAGCTTG AATTCACATG TATAAGCCTA AGGCAGCTTG 40

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの構成図である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図である。

【図３】ウエスタンブロット観察図である。

【図４】癌細胞浸潤阻害活性測定結果を示すグラフであ
る。

【図５】発現ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図である。

【図６】発現ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図である。

【図７】発現ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図である。

【図８】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者塚本洋子神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者礒合敦神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者熊谷博道神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型のヒト血清アルブミンをコードす
る遺伝子の少なくとも１つ以上の所望の位置に制限酵素
切断部位を導入してなる、ヒト血清アルブミンをコード
する改変された遺伝子。
【請求項２】制限酵素切断部位の導入位置が、ヒト血
清アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末端、カルボキ
シル末端、第１〜２ドメイン間あるいは第２〜３ドメイ
ン間のうちのいずれか１箇所若しくはこれらの任意の組
み合わせの位置である、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】制限酵素切断部位の導入位置がヒト血清
アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末端である、配列
番号１の塩基配列で表される、請求項２に記載の遺伝
子。
【請求項４】制限酵素切断部位の導入位置がヒト血清
アルブミンのポリペプチド鎖の第１〜２ドメイン間であ
る、配列番号２の塩基配列で表される、請求項２に記載
の遺伝子。
【請求項５】制限酵素切断部位の導入位置がヒト血清
アルブミンのポリペプチド鎖の第２〜３ドメイン間であ
る、配列番号３の塩基配列で表される、請求項２に記載
の遺伝子。
【請求項６】制限酵素切断部位の導入位置がヒト血清
アルブミンのポリペプチド鎖のカルボキシル末端であ
る、配列番号４の塩基配列で表される、請求項２に記載
の遺伝子。
【請求項７】制限酵素切断部位の導入位置がヒト血清
アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末端、第１〜２ド
メイン間、第２〜３ドメイン間およびカルボキシル末端
である、配列番号５の塩基配列で表される、請求項２に
記載の遺伝子。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子
の制限酵素切断部位に生理活性を有するペプチドをコー
ドする遺伝子を導入することによって作製した融合タン
パク質。
【請求項９】請求項８に記載の融合タンパク質をコー
ドする遺伝子。
【請求項１０】生理活性を有するペプチドが配列番号
６のアミノ酸で表される、請求項８に記載の融合タンパ
ク質。
【請求項１１】生理活性を有するペプチドをコードす
る遺伝子が、配列番号７の塩基配列で表される、請求項
９に記載の遺伝子。
【請求項１２】配列番号８のアミノ酸配列で表され
る、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】配列番号９の塩基配列で表される、請
求項１２に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。