JPH05268985A - モノクローナル抗体の精製法 - Google Patents

モノクローナル抗体の精製法

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JPH05268985A
JPH05268985A JP3061503A JP6150391A JPH05268985A JP H05268985 A JPH05268985 A JP H05268985A JP 3061503 A JP3061503 A JP 3061503A JP 6150391 A JP6150391 A JP 6150391A JP H05268985 A JPH05268985 A JP H05268985A
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monoclonal antibody
protein
substrate
bound
column
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JP3061503A
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Edward M Croze
エドワード・エム・クロウズ
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ER Squibb and Sons LLC
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ER Squibb and Sons LLC
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 プロテインＧを利用したモノクローナル抗体
の精製法の改良法を提供する。 【構成】 (ａ)モノクローナル抗体を含有する調製物
を、該調製物から汚染物質を取り除く吸収剤に適用し、
(ｂ)該吸収剤から該モノクローナル抗体を溶離し、(ｃ)
基体に結合したプロテインＧに該モノクローナル抗体を
吸収させ、(ｄ)該基体に結合したプロテインＧからアル
カリｐＨの溶液を用いて該モノクローナル抗体を溶離
し、ついで(ｅ)精製モノクローナル抗体を回収すること
を特徴とするモノクローナル抗体の精製法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体の改
良精製法に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】１９
７５年にケーラー(Kohler)とミルシュタイン(Milstein)
によって行われたマウス骨髄腫細胞と免疫マウスからの
脾臓細胞との融合により、均質な(いわゆる「モノクロー
ナル」)抗体を産生する連続細胞株を得ることが可能にな
ることが初めて示された。この独創的な仕事以来、モノ
クローナル抗体の精製法が必要とされている。この目的
のため、種々の細菌株によって発現された種々の細胞表
面タンパク質が用いられている。
【０００２】たとえば、スタフィロコッカス・アウレウ
ス(Staphylococcus aureus)から単離されたタンパク質
であり免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するプロテイン
Ａ、Ｇ群レンサ球菌から単離された免疫グロブリンに結
合する細菌細胞壁タンパク質であるプロテインＧが、モ
ノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を精
製するのに用いられている。プロテインＧは、種々の動
物およびヒト抗体、たとえば、ウシ、ニワトリ、ヤギ、
マウス、ウサギおよびラットポリクローナルＩｇＧ、あ
る種のマウスモノクローナル抗体、およびヒトＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、並びに種々の
採取源から得たアルブミンなどに結合することが示され
ている。
【０００３】上記知見にもかかわらず、プロテインＧを
利用したモノクローナル抗体の精製法の改良法が必要と
されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体の精製法の改良に関する。とりわけ、本発明は、
基体に結合したプロテインＧを用いたモノクローナル抗
体の精製法において、粒子に結合したプロテインＧから
アルカリｐＨの緩衝溶液を用いてモノクローナル抗体を
溶離することを特徴とする方法に関する。本発明の方法
は、サブクラスＩｇＧ１のモノクローナル抗体を精製す
るのに特に適している。
【０００５】すでに記載したように、本発明はモノクロ
ーナル抗体の改良された精製法に関する。とりわけ、本
発明は、基体に結合したプロテインＧを用いたモノクロ
ーナル抗体の改良された精製法に関し、該方法は、アル
カリｐＨの緩衝液を用いて基体結合プロテインＧからモ
ノクローナル抗体を溶離することを特徴とする。
【０００６】本発明はさらに、(ａ)モノクローナル抗体
を含有する調製物を、該調製物から汚染物質を取り除く
吸収剤に適用し、(ｂ)該吸収剤から該モノクローナル抗
体を溶離し、(ｃ)基体に結合したプロテインＧに該モノ
クローナル抗体を吸収させ、(ｄ)該基体に結合したプロ
テインＧからアルカリｐＨの溶液を用いて該モノクロー
ナル抗体を溶離し、ついで(ｅ)精製モノクローナル抗体
を回収することを特徴とするモノクローナル抗体の精製
法に関する。
【０００７】本発明の方法を用いて種々のモノクローナ
ル抗体を精製することができる。好ましいモノクローナ
ル抗体は、マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合
することによって形成されるハイブリドーマにより産生
されるＩｇＧクラスのモノクローナル抗体である。特に
好ましいのは、マウスハイブリドーマにより産生される
ＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体である。
【０００８】本発明の方法は、種々の抗体含有調製物中
に存在するモノクローナル抗体を精製するために用いる
ことができる。たとえば、ハイブリドーマ細胞をインビ
ボで同系哺乳動物(たとえば、マウス)の腹腔内にて増殖
させることにより産生させた同系哺乳動物の腹水中に存
在するモノクローナル抗体、またはハイブリドーマ細胞
(たとえば、マウスハイブリドーマ)をインビトロで培養
することにより産生させた細胞培養の上澄み液中に存在
するモノクローナル抗体を本発明の方法により精製する
ことができる。
【０００９】本発明の方法は、基体に結合したプロテイ
ンＧへのモノクローナル抗体の吸収を包含する。種々の
形態のプロテインＧを用いることができ、その際の唯一
の条件は、精製しようとする免疫グロブリンへの結合能
をプロテインＧ分子が有していることである。たとえ
ば、天然から単離したプロテインＧ、組換えＤＮＡ法に
より製造したプロテインＧ、修飾した形態のプロテイン
Ｇ、または免疫グロブリン結合能を保持したこれら物質
の断片などを用いることができる。好ましいプロテイン
Ｇは、ザイムド・ラボラトリーズ(Zymed Laboratories)
(サウスサンフランシスコ、ＣＡ)からＲＥＣ−ＰＲＯＴ
ＥＩＮの商品名で販売されている、組換えにより製造さ
れた修飾形態のプロテインＧである。
【００１０】プロテインＧを結合させるのに種々の基体
を用いることができる。たとえば、セファロース４Ｂ
(ファルマシア(ピスカタウエイ、ＮＪ)から入手可能)な
どのビーズ状アガロース粒子を用いることができる。セ
ファロース４Ｂに結合させた組換え製造した修飾形態の
プロテインＧ(ＲＥＣ−ＰＲＯＴＥＩＮ Ｇ ＳＥＰＨ
ＡＲＯＳＥ)はザイムド・ラボラトリーズから入手する
ことができる。
【００１１】プロテインＧを基体に結合させるには、当
該技術分野で知られた種々の手順を用いることができ
る。たとえば、セファロース４Ｂなどのビーズ状のアガ
ロース粒子を基体として用いる場合は、この粒子を臭化
シアンで活性化し、活性化した粒子にプロテインＧを結
合させることができる。
【００１２】基体に結合したプロテインＧは種々の仕方
で利用することができる。たとえば、基体に結合したプ
ロテインＧをカラム中に充填し、カラム法を用いる。別
法としては、バッチ法を用いることもできる。
【００１３】基体に結合したプロテインＧにモノクロー
ナル抗体を吸収させるには種々の方法を用いることがで
きる。たとえば、カラム法を用いる場合は、適当な緩衝
液、たとえばリン酸緩衝液、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳ
などを用いて調製した適当な緩衝溶液を用いてモノクロ
ーナル抗体をカラムに吸収させる。緩衝溶液のｐＨは約
５.０〜約６.０の範囲であってよく、一方、イオン強度
は約０.０５Ｍ〜約０.１Ｍであってよい。好ましくは、
緩衝溶液は０.１Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ５.５)であ
る。
【００１４】モノクローナル抗体は、基体に結合したプ
ロテインＧから種々の方法で溶離することができる。た
とえば、カラム法を用いる場合は、適当なアルカリ緩衝
液を用いて調製した緩衝溶液を用いてカラムから溶離す
ることによりモノクローナル抗体を回収することができ
る。適当なアルカリ緩衝液としては、たとえば、グリシ
ンおよび炭酸ナトリウムなどを挙げることができる。緩
衝溶液のｐＨは約９.５〜約１０.０の範囲であってよ
く、一方、イオン強度は約０.１Ｍ〜約０.５Ｍの範囲で
あってよい。好ましくは、緩衝溶液は、０.１Ｍグリシ
ン(ｐＨ９.５)である。
【００１５】場合により、プロテインＧの精製工程の前
かまたは後に吸収剤を用いて抗体含有調製物中に存在す
る汚染物質を除去することができる。たとえば、ＤＥＡ
Ｅセファロース(ファルマシア)などのイオン交換樹脂、
または汚染物質結合残基を含む架橋アガロースゲルなど
を用いることができる。特に好ましいのは、バイオ−ラ
ド・ラボラトリーズ(リッチモンド、カリフォルニア)か
ら入手可能なＣＭアフィ−ゲルブルー(Affi−Gel Blue)
であり、このものはシバクロンブルーＦ３ＧＡ染料を含
有するビーズ状の架橋アガロースゲルであり、アルブミ
ンおよび血清プロテアーゼに対するリガンド特異性を有
している。
【００１６】抗体含有調製物中に存在する汚染物質を除
去するために使用する吸収剤は、種々の仕方で利用する
ことができる。たとえば、吸収剤をカラムに充填し、カ
ラム法を用いることができる。別法として、バッチ法を
用いることもできる。
【００１７】抗体含有調製物から汚染物質を除去するた
めに用いた吸収剤にモノクローナル抗体を適用し、また
該吸収剤からモノクローナル抗体を溶離するには種々の
方法を用いることができる。たとえば、カラム法を用い
た場合には、適当な緩衝溶液を用いて、モノクローナル
抗体をカラムに適用し、またカラムから溶離することが
できる。緩衝液の種類、および緩衝溶液のｐＨおよびイ
オン強度は、吸収剤の性質により異なる。適当な緩衝液
としては、たとえば、リン酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝
液などが挙げられる。緩衝溶液のｐＨは、一般に約６.
５〜約７.５の範囲であり、イオン強度は一般に約０.１
５Ｍ〜約０.２Ｍの範囲である。適用緩衝溶液と溶離緩
衝溶液とを同じものにする、たとえば、リン酸緩衝食塩
水(ＰＢＳ)(５５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.３、１
５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有)を用いるのが好ましい。
【００１８】モノクローナル含有調製物から汚染物質を
除去した吸収剤か、または基体に結合したプロテインＧ
からのモノクローナル抗体の溶離は、当業者によく知ら
れた種々の方法によりモニターすることができる。たと
えば、カラム法を用いた場合は、カラムから分画を回収
し、該分画の２８０ｎｍの波長における吸光度を測定す
ることによりタンパク質の存在を決定する。特異性のわ
かっているモノクローナル抗体を精製した場合には、カ
ラムから回収した分画中のモノクローナル抗体の存在
は、イムノアッセイ法、たとえばラジオイムノアッセイ
(ＲＩＡ)法または酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)法により
測定することができる。
【００１９】本発明の方法では、精製したモノクローナ
ル抗体を実質的に減成したり、または基体に結合したプ
ロテインＧもしくは汚染物質除去吸収剤に悪影響を与え
ることのない限り、あらゆる都合のよい温度を採用する
ことができる。約４°Ｃ〜約２５°Ｃの温度を採用する
ことができる。温度は室温であるのが好ましい。
【００２０】プロテインＧカラムから溶離したモノクロ
ーナル抗体は、当該技術分野で知られた種々の方法を用
いて回収することができる。たとえば、カラム分画をプ
ールし、濃縮し、透析して過剰の塩を除く。短期間の貯
蔵のためには、得られた抗体溶液をついでリン酸緩衝し
た０.０５％アジ化ナトリウム中に４°Ｃで冷蔵する。
長期間の貯蔵のためには、得られる抗体溶液を凍結し、
−２０°Ｃで貯蔵するか、または凍結乾固し、得られる
抗体調製物を−２０°Ｃで貯蔵する。
【００２１】本発明の方法は、モノクローナル抗体の精
製に特に適したものであるが、他の抗体、たとえば、ポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくはポリク
ローナル抗体の断片の精製に用いることもできる。
【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。
【００２２】実施例 モノクローナル抗体の精製：クラスＩｇＧ、サブクラス
ＩｇＧ１のマウスモノクローナル抗体(「ＭＣＴＸＩ」と
称する)を分泌するハイブリドーマをプリスチン(pristi
ne)処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに接種して腹水を産生
させ、この腹水をＭＣＴＸＩを単離するための出発物質
として用いた。４匹の異なるマウスから腹水を回収し、
腹水中に存在するＭＣＴＸＩの量をＲＩＡにより滴定し
た。４匹のマウスのいずれにおいても、抗体含有媒体中
に認められるよりも有意に大きい濃度でＭＣＴＸＩを含
有する腹水を産生した。４匹のすべての被験動物からの
腹水をプールし、ＭＣＴＸＩを単離するための出発物質
として用いた。
【００２３】モノクローナル抗体ＭＣＴＸＩを含有する
腹水を２×ＰＢＳで１：１に希釈し、ＰＢＳで前以て平
衡化した１.５×１００ｃｍのＣＭアフィ−ゲルブルー
カラムに適用した。分画(２.０ｍｌ)を０.５ｍｌ／分の
流速で回収し、各試料について２８０ｎｍでの吸光度を
測定することにより、カラムから溶出するタンパク質を
モニターした。カラムからのＭＣＴＸＩの溶離はＲＩＡ
によりモニターした。ＣＭアフィ−ゲルブルークロマト
グラフィーによりアルブミン、補体タンパク質、および
血清プロテアーゼが試料から除かれ、このことにより分
画はＭＣＴＸＩに富むようになった。これら血清タンパ
ク質はカラムに結合するが、免疫グロブリンは結合しな
い。それゆえ、ＭＣＴＸＩはボイドボリュームの後に溶
出する。タンパク質は、分画１０に始まって分画２０ま
で検出された。タンパク質およびＭＣＴＸＩの両方とも
同時にカラムから溶出し始めた。しかしながら、ＭＣＴ
ＸＩは、ＵＶ吸光スペクトルによりタンパク質がもはや
検出されなくなってからもカラムから溶出し続けた。
【００２４】ＭＣＴＸＩを含有するＣＭアフィ−ゲルブ
ルーカラム分画１４〜２４を回収し、プールし、５５ｍ
Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)に対して４°Ｃで一夜
透析し、アクアシド(Aquacide)ＩＩ[カルバイオケム(Ca
lbiochem)]を用いて濃縮した。得られた試料を０.１Ｍ
グリシン(ｐＨ３.５)を用いてｐＨ５.５に調節し、０.
１Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ５.５)で前以て平衡化した
１.５ｃｍ×８.０ｃｍの組換えプロテインＧ−セファロ
ース４Ｂカラム(ザイムド・ラボラトリーズ)に適用し
た。ついで、０.１Ｍリン酸ナトリウム(５０ｍｌ、ｐＨ
５.５)で流速０.５ｍｌ／分にて洗浄した。結合したＭ
ＣＴＸＩは、カラムを０.１Ｍグリシン(１５ｍｌ、ｐＨ
９.５)で流速０.５ｍｌ／分にて洗浄することによりカ
ラムから溶離した。１００μｌの１.０Ｍトリス緩衝液
(ｐＨ７.０；得られた試料を中性にする)を入れた試験
管中に各分画(１.０ｍｌ)を回収した。タンパク質濃度
は、免疫グロブリンの吸光係数(ε＝１.４１ｃｍ2／ｍ
ｇ)を用いて計算した。ＭＣＴＸＩを特異的ＲＩＡによ
り検出し、放射性リガンドの結合％として表した。
【００２５】組換え形態のプロテインＧは、ＩｇＧ免疫
グロブリンのＦｃ領域に低ｐＨ(ｐＨ５.５)で結合す
る。本願出願人は、この結合を高ｐＨ(ｐＨ９.５〜１
０)で元に戻すことができ、それゆえ免疫グロブリンを
アフィニティー精製する便利な方法が得られることを見
いだした。大部分のタンパク質は、ボイドボリュームの
直後にプロテインＧアフィニティーカラムから溶出し
た。しかしながら、ＭＣＴＸＩは、０.１Ｍグリシン(ｐ
Ｈ９.５)でカラムを洗浄することにより溶出した。最初
のタンパク質ピークとともに少量のＭＣＴＸＩが溶出し
たことは、Ｆｃ領域の変化したＭＣＴＸＩが存在する
か、またはプロテインＧアフィニティーカラムの結合能
に限界があることを反映している。アルカリ緩衝液で洗
浄した後にアフィニティーカラムから溶出した分画のみ
を回収した(図１に示すように、アフィニティー精製し
たＭＣＴＸＩは、アルカリ緩衝液(ｐＨ９.５)でカラム
を洗浄した後に溶出する)。この形態のＭＣＴＸＩを含
有する分画をプールし、濃縮し、ＰＢＳに対して透析し
た。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＣＴＸＩに富む腹水をプロテインＧアフィ
ニティークロマトグラフィーに供した場合の溶離を示す
グラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (ａ)モノクローナル抗体を含有する調製
    物を、該調製物から汚染物質を取り除く吸収剤に適用
    し、(ｂ)該吸収剤から該モノクローナル抗体を溶離し、
    (ｃ)基体に結合したプロテインＧに該モノクローナル抗
    体を吸収させ、(ｄ)該基体に結合したプロテインＧから
    アルカリｐＨの溶液を用いて該モノクローナル抗体を溶
    離し、ついで(ｅ)精製モノクローナル抗体を回収するこ
    とを特徴とするモノクローナル抗体の精製法。
  2. 【請求項２】 工程(ａ)における吸収剤がＣＭアフィ−
    ゲルブルーである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＣＭアフィ−ゲルブルーがカラム中に含
    まれている、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 モノクローナル抗体を含有する調製物が
    腹水である、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 モノクローナル抗体を含有する調製物が
    細胞培養上澄み液である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 基体に結合したプロテインＧを用いてモ
    ノクローナル抗体を精製する方法において、該基体に結
    合したプロテインＧからアルカリｐＨの溶液を用いて該
    モノクローナル抗体を溶離することを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 基体がビーズ状アガロース粒子である、
    請求項１または６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 プロテインＧが組換えプロテインＧであ
    る、請求項１または６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 基体に結合したプロテインＧがカラム中
    に含まれている、請求項１または６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 基体に結合したプロテインＧからモノ
    クローナル抗体を溶離するのに用いる溶離液がグリシン
    溶液である、請求項１または６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 グリシン溶液の濃度が約０.１Ｍ〜約
    ０.５Ｍの範囲である、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 グリシン溶液の濃度が約０.１Ｍであ
    る請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 基体に結合したプロテインＧからモノ
    クローナル抗体を溶離するのに用いる溶離液のｐＨが約
    ９.５〜約１０.０の範囲である、請求項１または６に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 基体に結合したプロテインＧからモノ
    クローナル抗体を溶離するのに用いる溶離液のｐＨが約
    ９.５である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 モノクローナル抗体がサブクラスＩｇ
    Ｇ１に属するものである、請求項１または６に記載の方
    法。
JP3061503A 1990-03-26 1991-03-26 モノクローナル抗体の精製法 Pending JPH05268985A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

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US07/500,340 US5151504A (en) 1989-11-17 1990-03-26 Method for purification of monoclonal antibodies
US500,340 1990-03-26

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ID=23988982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3061503A Pending JPH05268985A (ja) 1990-03-26 1991-03-26 モノクローナル抗体の精製法

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US (1) US5151504A (ja)
EP (1) EP0453767B1 (ja)
JP (1) JPH05268985A (ja)
CA (1) CA2037204A1 (ja)
DE (1) DE69116921T2 (ja)

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