JPH0527381B2 - - Google Patents
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- JPH0527381B2 JPH0527381B2 JP60007450A JP745085A JPH0527381B2 JP H0527381 B2 JPH0527381 B2 JP H0527381B2 JP 60007450 A JP60007450 A JP 60007450A JP 745085 A JP745085 A JP 745085A JP H0527381 B2 JPH0527381 B2 JP H0527381B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna fragment
- dna
- tryptophan
- fragment
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はトリプトフアンシンターゼの生合成を
司る遺伝子を含むDNA断片を含有する新規なプ
ラスミドに関し、更に詳しくは、コピー数が多
く、宿主内での安定保持性に優れており、細胞増
殖に際して脱落することなく親細胞から娘細胞に
確実に受け継がれる、トリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例えば
少なくともtrpA及びtrpB並びにこれら両遺伝子
を発現させうるプロモーター機能をもつDNA断
片を含むDNA断片を含有するプラスミドに関す
る。
司る遺伝子を含むDNA断片を含有する新規なプ
ラスミドに関し、更に詳しくは、コピー数が多
く、宿主内での安定保持性に優れており、細胞増
殖に際して脱落することなく親細胞から娘細胞に
確実に受け継がれる、トリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例えば
少なくともtrpA及びtrpB並びにこれら両遺伝子
を発現させうるプロモーター機能をもつDNA断
片を含むDNA断片を含有するプラスミドに関す
る。
トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝
子を含むDNA断片のクローニングについては従
来からいろいろと研究されているが、例えば
Journal of General Microbiology、Vol.118、
253（1980）に記載されているように、宿主内での
安定保持性に問題があり、トリプトフアンの工業
的製造に応用するには多くの困難があると考えら
れている。
子を含むDNA断片のクローニングについては従
来からいろいろと研究されているが、例えば
Journal of General Microbiology、Vol.118、
253（1980）に記載されているように、宿主内での
安定保持性に問題があり、トリプトフアンの工業
的製造に応用するには多くの困難があると考えら
れている。
一方、プラスミドの宿主内での安定保持性にお
いて、応用的に最も重要な問題は一般に宿主の継
代培養におけるプラスミドの脱落現象である。そ
のため、従来よりプラスミドの脱落を防止するた
めに種々の試みがなされており、例えば、エシエ
リヒア族のストレプトマイシンに依存しないとい
う性質を司る染色体遺伝子を含むDNA断片が組
み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のスト
レプトマイシン依存性変異株に含有せしめて、プ
ラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭55−156591号公報）。
しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組
み込む必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラ
スミドが安定に娘細胞に分配され難いことが予想
され、工業的に応用するにはかなりの問題があ
る。
いて、応用的に最も重要な問題は一般に宿主の継
代培養におけるプラスミドの脱落現象である。そ
のため、従来よりプラスミドの脱落を防止するた
めに種々の試みがなされており、例えば、エシエ
リヒア族のストレプトマイシンに依存しないとい
う性質を司る染色体遺伝子を含むDNA断片が組
み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のスト
レプトマイシン依存性変異株に含有せしめて、プ
ラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭55−156591号公報）。
しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組
み込む必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラ
スミドが安定に娘細胞に分配され難いことが予想
され、工業的に応用するにはかなりの問題があ
る。
そこで、本発明者らは、トリプトフアンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片とし
て、先ずトリプトフアンオペロンを含むDNA断
片を、親細胞から娘細胞へと継代的に安定に分配
することを可能にする機能をもつプラスミドにつ
いて研究を行ない、トリプトフアンオペロンを含
むDNA断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分
配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、ColE1系
プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含む
DNA断片を有する新規なプラスミドpMTY−２
を創製し提案した（特願昭59−225906号出願明細
書参照）。
ーゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片とし
て、先ずトリプトフアンオペロンを含むDNA断
片を、親細胞から娘細胞へと継代的に安定に分配
することを可能にする機能をもつプラスミドにつ
いて研究を行ない、トリプトフアンオペロンを含
むDNA断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分
配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、ColE1系
プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含む
DNA断片を有する新規なプラスミドpMTY−２
を創製し提案した（特願昭59−225906号出願明細
書参照）。
このプラスミドpMTY−２を保持する大腸菌
を用いれば、いわゆる発酵法によるトリプトフア
ンの製造が経済的に可能となるが、トリプトフア
ンオペロン由来のトリプトフアンシンターゼ作用
のみを利用し、原料としてインドールとＬ−セリ
ン（但し、実際の反応系への添加はDL−セリン
でもよい。何故ならば、Ｌ−セリンのみが、選択
的に反応するからである）からトリプトフアンを
製造する方法においては、トリプトフアンオペロ
ンには、トリプトフアンシンターゼ以外に、さら
に３種の酵素も併産する機能を担つており、トリ
プトフアンシンターゼの作用のみを目的とする場
合は、それだけ効率が低下することになる。
を用いれば、いわゆる発酵法によるトリプトフア
ンの製造が経済的に可能となるが、トリプトフア
ンオペロン由来のトリプトフアンシンターゼ作用
のみを利用し、原料としてインドールとＬ−セリ
ン（但し、実際の反応系への添加はDL−セリン
でもよい。何故ならば、Ｌ−セリンのみが、選択
的に反応するからである）からトリプトフアンを
製造する方法においては、トリプトフアンオペロ
ンには、トリプトフアンシンターゼ以外に、さら
に３種の酵素も併産する機能を担つており、トリ
プトフアンシンターゼの作用のみを目的とする場
合は、それだけ効率が低下することになる。
そこで、本発明者らは、トリプトフアンオペロ
ン中のトリプトフアンシンターゼの生合成の効率
化を図るために、この目的に適つたプラスミドを
得るべく鋭意研究を行なつた。その結果、トリプ
トフアンオペロン中のトリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子であるtrpA及びtrpB断片
に、これら両遺伝子を発現させうるプロモーター
機能をもつDNA断片及びさらに場合によりこの
プロモーター機能を制御しうるオペレーター機能
をもつDNA断片を結合させたDNA断片を、Ｆ因
子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むDNA断片と、ColE1系プラ
スミド由来のプラスミドの自律増殖能を司る遺伝
子を含むDNA断片とを組合わせたプラスミドが、
トリプトフアンシンターゼの産生効率を著るしく
向上させることを見い出し、本発明を完成した。
ン中のトリプトフアンシンターゼの生合成の効率
化を図るために、この目的に適つたプラスミドを
得るべく鋭意研究を行なつた。その結果、トリプ
トフアンオペロン中のトリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子であるtrpA及びtrpB断片
に、これら両遺伝子を発現させうるプロモーター
機能をもつDNA断片及びさらに場合によりこの
プロモーター機能を制御しうるオペレーター機能
をもつDNA断片を結合させたDNA断片を、Ｆ因
子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むDNA断片と、ColE1系プラ
スミド由来のプラスミドの自律増殖能を司る遺伝
子を含むDNA断片とを組合わせたプラスミドが、
トリプトフアンシンターゼの産生効率を著るしく
向上させることを見い出し、本発明を完成した。
しかして、本発明によれば、エシエリヒア・コ
リ由来のトリプトフアンオペロン中の少なくとも
trpA及びtrpB遺伝子を含むDNA断片並びにこれ
らの両遺伝子を発現させうるプロモーター機能を
もつDNA断片及びこのプロモーター機能を制御
しうるオペレーター機能をもつDNA断片が結合
したDNA断片と、Ｆ因子プラスミド由来の増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むmini−Ｆ断片と、
ColE1系プラスミド由来の自律増殖能を司る遺伝
子を含むDNA断片とを含有することを特徴とす
る組換えプラスミドおよび該組換えプラスミドで
形質転換されたエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−12系微生物が提供され
る。
リ由来のトリプトフアンオペロン中の少なくとも
trpA及びtrpB遺伝子を含むDNA断片並びにこれ
らの両遺伝子を発現させうるプロモーター機能を
もつDNA断片及びこのプロモーター機能を制御
しうるオペレーター機能をもつDNA断片が結合
したDNA断片と、Ｆ因子プラスミド由来の増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むmini−Ｆ断片と、
ColE1系プラスミド由来の自律増殖能を司る遺伝
子を含むDNA断片とを含有することを特徴とす
る組換えプラスミドおよび該組換えプラスミドで
形質転換されたエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−12系微生物が提供され
る。
本発明のプラスミドを構成する「トリプトフア
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA
断片」（以下「Ｔ断片」と略称することがある）
とは、インドールとＬ−又はDL−セリンからＬ
−トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片を意味し、本発明で用いるＴ断片には、
殊に、トリプトフアンオペロン中のトリプトフア
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子であるtrpA
及びtrpBに、これら両遺伝子を発現させうるプ
ロモーター機能をもつDNA断片（以下「トリプ
トフアンプロモーター」ということがある）及び
さらに必要に応じてこのプロモーター機能を制限
しうるオペレーター機能をもつDNA断片（以下
「トリプトフアンオペレーター」ということがあ
る）を結合したDNA断片が包含される。かかる
Ｔ断片としては実用的には大腸菌由来のものが好
適に使用される。このＴ断片の供給源としては特
に制限はないが、エシエリヒア・コリ
ATCC23282、エシエリヒア・コリATCC23437、
エシエリヒア・コリATCC23461等が有利に使用
される。
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA
断片」（以下「Ｔ断片」と略称することがある）
とは、インドールとＬ−又はDL−セリンからＬ
−トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片を意味し、本発明で用いるＴ断片には、
殊に、トリプトフアンオペロン中のトリプトフア
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子であるtrpA
及びtrpBに、これら両遺伝子を発現させうるプ
ロモーター機能をもつDNA断片（以下「トリプ
トフアンプロモーター」ということがある）及び
さらに必要に応じてこのプロモーター機能を制限
しうるオペレーター機能をもつDNA断片（以下
「トリプトフアンオペレーター」ということがあ
る）を結合したDNA断片が包含される。かかる
Ｔ断片としては実用的には大腸菌由来のものが好
適に使用される。このＴ断片の供給源としては特
に制限はないが、エシエリヒア・コリ
ATCC23282、エシエリヒア・コリATCC23437、
エシエリヒア・コリATCC23461等が有利に使用
される。
これら供給源微生物から本発明の目的に適う
trpA及びtrpB断片とトリプトフアンプロモータ
ー及びトリプトフアンオペレーターとが結合した
DNA断片を調製するための詳細な方法は後記実
施例１の(B)に示すが、基本操作としては、染色体
遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大腸菌
にフアージφ80を感染させた後誘発し、フアージ
DNA中にトリプトフアンオペロンを取り込んだ
フアージを大量に調製する。次に、フアージ
DNAを抽出し、制限酵素BamH、EcoR等
を用いてトリプトフアンオペロンDNA断片を切
り出し、このDNA断片をさらに制限酵素Hinc
で部分切断を行い、trpA及びtrpB遺伝子を含む
DNA断片が得られる。また、トリプトフアンオ
ペロンDNA断片を制限酵素Pruで処理すると、
プロモーター及びオペレーターを含むDNA断片
が得られる。得られる両DNA断片をDNA連結酵
素で結合させることにより、trpA及びtrpB断片
とトリプトフアンプロモーター及びトリプトフア
ンオペレーターとが結合したDNA断片を調製す
ることができる。
trpA及びtrpB断片とトリプトフアンプロモータ
ー及びトリプトフアンオペレーターとが結合した
DNA断片を調製するための詳細な方法は後記実
施例１の(B)に示すが、基本操作としては、染色体
遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大腸菌
にフアージφ80を感染させた後誘発し、フアージ
DNA中にトリプトフアンオペロンを取り込んだ
フアージを大量に調製する。次に、フアージ
DNAを抽出し、制限酵素BamH、EcoR等
を用いてトリプトフアンオペロンDNA断片を切
り出し、このDNA断片をさらに制限酵素Hinc
で部分切断を行い、trpA及びtrpB遺伝子を含む
DNA断片が得られる。また、トリプトフアンオ
ペロンDNA断片を制限酵素Pruで処理すると、
プロモーター及びオペレーターを含むDNA断片
が得られる。得られる両DNA断片をDNA連結酵
素で結合させることにより、trpA及びtrpB断片
とトリプトフアンプロモーター及びトリプトフア
ンオペレーターとが結合したDNA断片を調製す
ることができる。
本発明は前述したように、上記のＴ断片を、Ｆ
因子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配
系を司る遺伝子を含むDNA断片と組合わせる点
に１つの特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例え
ば「蛋白質 核酸 酵素」第27巻第１号（1982）
の98頁の図１の遺伝子地図及びEco Ｒによる
物理地図に示される如き構造をもつ、分子量が
94.5kb（62×106ダルトン）の既知のプラスミドで
あり、大腸菌などの腸内細菌中に通常細胞染色体
当り１〜２個のコピー数で存在し、このプラスミ
ドは細胞分裂後にそれぞれの娘細胞中に正確に伝
達されるような機構を備えている（このように、
コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の
増殖とペースを合わせて増やす仕組みを
stringentな増殖の制御と呼んでいる）。Ｆ因子プ
ラスミドにおけるこのようなstringentな増殖の
制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる分子量が9.1kb
の自律増殖できる断片に担われていることも既に
究明されており、このmini−ＦがＦ因子プラス
ミドより制御酵素EcoRにより切り出し可能で
あることも知られている。
因子プラスミド由来のプラスミドの増殖制御分配
系を司る遺伝子を含むDNA断片と組合わせる点
に１つの特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例え
ば「蛋白質 核酸 酵素」第27巻第１号（1982）
の98頁の図１の遺伝子地図及びEco Ｒによる
物理地図に示される如き構造をもつ、分子量が
94.5kb（62×106ダルトン）の既知のプラスミドで
あり、大腸菌などの腸内細菌中に通常細胞染色体
当り１〜２個のコピー数で存在し、このプラスミ
ドは細胞分裂後にそれぞれの娘細胞中に正確に伝
達されるような機構を備えている（このように、
コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の
増殖とペースを合わせて増やす仕組みを
stringentな増殖の制御と呼んでいる）。Ｆ因子プ
ラスミドにおけるこのようなstringentな増殖の
制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる分子量が9.1kb
の自律増殖できる断片に担われていることも既に
究明されており、このmini−ＦがＦ因子プラス
ミドより制御酵素EcoRにより切り出し可能で
あることも知られている。
本発明はこのmini−Ｆに担われている増殖制
御分配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因
子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子
を含むDNA断片」（以下「Ｆ断片」と略称するこ
とがある）とは、上述したようなＦ因子プラスミ
ドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子
画分を意味し、そのようなＦ断片の代表例として
は約9.1kbの分子量を有するmini−Ｆ断片が挙げ
られる。
御分配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因
子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子
を含むDNA断片」（以下「Ｆ断片」と略称するこ
とがある）とは、上述したようなＦ因子プラスミ
ドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子
画分を意味し、そのようなＦ断片の代表例として
は約9.1kbの分子量を有するmini−Ｆ断片が挙げ
られる。
さらに、本発明において上記Ｔ断片及びＦ断片
と組合わせて使用される「ColE1系プラスミド由
来の自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断片」（以
下「Ｓ断片」と略称することがある）は、コピー
数が１細胞染色体当り20〜30個であるColE1系プ
ラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断
片を意味し、そのようなＳ断片の代表例としては
約4.3kbの長さを有するプラスミドpBR322由来
のＳ断片が挙げられ、その他にプラスミド
pBR325等由来のＳ断片がある。
と組合わせて使用される「ColE1系プラスミド由
来の自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断片」（以
下「Ｓ断片」と略称することがある）は、コピー
数が１細胞染色体当り20〜30個であるColE1系プ
ラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断
片を意味し、そのようなＳ断片の代表例としては
約4.3kbの長さを有するプラスミドpBR322由来
のＳ断片が挙げられ、その他にプラスミド
pBR325等由来のＳ断片がある。
本発明により提供されるプラスミドは、以上に
述べたＴ断片、Ｆ断片及びＳ断片の３つの必須の
DNA断片を有する限り、他の遺伝情報を担う
DNA断片、例えば抗生物質耐性マーカーである
アンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片、カナ
マイシン耐性遺伝子を含むDNA断片等をさらに
含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ断片、Ｆ
断片及びＳ断片の３つのDNA断片から実質的に
なり、分子量が約9.0メガダルトン（約13.6kb）
のプラスミドで、本発明者らが「プラスミド
pMTY−３」と命名したものである。なお、本
明細書において、プラスミドの分子量はアガロー
スゲル電気泳動法により測定した値である。
述べたＴ断片、Ｆ断片及びＳ断片の３つの必須の
DNA断片を有する限り、他の遺伝情報を担う
DNA断片、例えば抗生物質耐性マーカーである
アンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片、カナ
マイシン耐性遺伝子を含むDNA断片等をさらに
含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ断片、Ｆ
断片及びＳ断片の３つのDNA断片から実質的に
なり、分子量が約9.0メガダルトン（約13.6kb）
のプラスミドで、本発明者らが「プラスミド
pMTY−３」と命名したものである。なお、本
明細書において、プラスミドの分子量はアガロー
スゲル電気泳動法により測定した値である。
以下、このプラスミドpMTY−３についてさ
らに詳細に説明する。
らに詳細に説明する。
プラスミドpMTY−３の下記の制限酵素の感
受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解
断片の長さ（kb）は下記の表に示すとおりであ
る。
受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解
断片の長さ（kb）は下記の表に示すとおりであ
る。
認識部制限酵素
位の数 分解断片の中さ（kb）
EcoR ２ 10.7、2.9
BamH ２ 6.9、6.7
Sal ３ 10.6、2.9、0.1
Pst ５ 5.9、4.0、1.8、1.5、0.4
Ava １ 13.6
以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミ
ドpMTY−３は、例えば次のようにして製造す
ることができる。
ドpMTY−３は、例えば次のようにして製造す
ることができる。
まず、trpA及びtrpB断片に、トリプトフアン
プロモーター及びトリプトフアンオペレーターを
結合したDNA断片（Ｔ断片）の調製は、例えば、
染色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ
大腸菌、例えば、Escherichia coli Ｋ−12
（IFO3301、ATCC10798、ATCCe23562）など
に、フアージ、例えばフアージφ80
（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及
び誘発現象を利用して、フアージDNA中にトリ
プトフアンオペロンを取り込んだフアージを大量
に調製し［R.M.Denney、C.Yanofsky；J.
Bacteriol.、118、505（1974）参照］、それから常
法（E.F.Fritsch、Sambrook、
“Molecularcloning”（1982）p.164〜165、Cold
Spring Harbor Laboratory参照］に従つてフア
ージDNAを抽出し、制限酵素、例えばBamH
、EcoR等を用いてトリプトフアンオペロン
DNA断片を切り出し、このDNA断片をさらに制
御酵素Hincで部分切断を行い、trpA及びtrpB
遺伝子を含むDNA断片が得られ、またトリプト
フアンオペロンDNA断片を制限酵素Pvuで処
理するとプロモーターおよびオペレーターを含む
DNA断片が得られる。次に得られた両DNA断片
をT4フアージ由来のT4DNAリガーゼで結合し、
さらにEcoRリンカーを混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結させるとtrpA及びtrpB断片にプロモ
ーター及びオペレーターを含むDNA断片が結合
し、両末端にEcoR部位をもつＴ断片が得られ
る。
プロモーター及びトリプトフアンオペレーターを
結合したDNA断片（Ｔ断片）の調製は、例えば、
染色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ
大腸菌、例えば、Escherichia coli Ｋ−12
（IFO3301、ATCC10798、ATCCe23562）など
に、フアージ、例えばフアージφ80
（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及
び誘発現象を利用して、フアージDNA中にトリ
プトフアンオペロンを取り込んだフアージを大量
に調製し［R.M.Denney、C.Yanofsky；J.
Bacteriol.、118、505（1974）参照］、それから常
法（E.F.Fritsch、Sambrook、
“Molecularcloning”（1982）p.164〜165、Cold
Spring Harbor Laboratory参照］に従つてフア
ージDNAを抽出し、制限酵素、例えばBamH
、EcoR等を用いてトリプトフアンオペロン
DNA断片を切り出し、このDNA断片をさらに制
御酵素Hincで部分切断を行い、trpA及びtrpB
遺伝子を含むDNA断片が得られ、またトリプト
フアンオペロンDNA断片を制限酵素Pvuで処
理するとプロモーターおよびオペレーターを含む
DNA断片が得られる。次に得られた両DNA断片
をT4フアージ由来のT4DNAリガーゼで結合し、
さらにEcoRリンカーを混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結させるとtrpA及びtrpB断片にプロモ
ーター及びオペレーターを含むDNA断片が結合
し、両末端にEcoR部位をもつＴ断片が得られ
る。
一方、mini−Ｆ断片の調製は、例えば、Ｆ因
子プラスミドを保有する微生物、例えば、大腸菌
（E.coli）Ｋ−12株（ATCC15153、
ATCCe23589、ATCCe23590）等からそれ自体公
知の方法で、例えばP.Guerry、DL。Le Blanc、
S.Falkow；J.Bact.、116、、1064（1973）等の文
献に記載の方法でＦ因子プラスミドを取り出し、
それから制限酵素EcoRを用いて分子量が約
9.1kbのmini−Ｆ断片を切り出すことにより調製
することができる。
子プラスミドを保有する微生物、例えば、大腸菌
（E.coli）Ｋ−12株（ATCC15153、
ATCCe23589、ATCCe23590）等からそれ自体公
知の方法で、例えばP.Guerry、DL。Le Blanc、
S.Falkow；J.Bact.、116、、1064（1973）等の文
献に記載の方法でＦ因子プラスミドを取り出し、
それから制限酵素EcoRを用いて分子量が約
9.1kbのmini−Ｆ断片を切り出すことにより調製
することができる。
他方、Col E1プラスミドの自律増殖を司る遺
伝子を含むDNA断片の供給源としては、ColE1
プラスミドとしての代表的なプラスミドpBR322
を使用するのが便利である。
伝子を含むDNA断片の供給源としては、ColE1
プラスミドとしての代表的なプラスミドpBR322
を使用するのが便利である。
上記の如くして調製されたmini−Ｆ断片を制
限酵素EcoR、BamHで処理し、同じ制限酵
素で処理したプラスミドpBR322と一緒にし、
T4DNAリガーゼを作用させて、プラスミド
pBR322に上記mini−Ｆ断片が組み込まれたプラ
スミドを作成する。次いで、このプラスミドを
EcoRで開裂させ、上記のようにして調製され
たＴ断片と一緒にし、T4DNAリガーゼを作用さ
せて結合させることにより、目的とするプラスミ
ドpMTY−３を得ることができる。
限酵素EcoR、BamHで処理し、同じ制限酵
素で処理したプラスミドpBR322と一緒にし、
T4DNAリガーゼを作用させて、プラスミド
pBR322に上記mini−Ｆ断片が組み込まれたプラ
スミドを作成する。次いで、このプラスミドを
EcoRで開裂させ、上記のようにして調製され
たＴ断片と一緒にし、T4DNAリガーゼを作用さ
せて結合させることにより、目的とするプラスミ
ドpMTY−３を得ることができる。
なお、プラスミドpMTY−３の具体的調製法
については後記実施例１でさらに詳細に説明す
る。
については後記実施例１でさらに詳細に説明す
る。
このようにして調製される本発明のプラスミド
は、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際して娘
細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安
定であるという優れた特性を有する。
は、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際して娘
細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安
定であるという優れた特性を有する。
従つて、本発明のプラスミドはトリプトフアン
の製造において工業的に応用することが大いに期
待される。トリプトフアンの製造に際しては、本
発明のプラスミドで宿主が形質転換される。この
形質転換に利用できる宿主菌としては、大腸菌が
好ましく、更に、宿主菌をトリプトフアナーゼ欠
損変異株としたものが特に好ましい。
の製造において工業的に応用することが大いに期
待される。トリプトフアンの製造に際しては、本
発明のプラスミドで宿主が形質転換される。この
形質転換に利用できる宿主菌としては、大腸菌が
好ましく、更に、宿主菌をトリプトフアナーゼ欠
損変異株としたものが特に好ましい。
また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミ
ドの導入はそれ自体公知の方法、例えばM.
Mandel、A.Higa；J.Mol.Biol.53、159（1970）
等の文献に記載の方法で行なうことができる。
ドの導入はそれ自体公知の方法、例えばM.
Mandel、A.Higa；J.Mol.Biol.53、159（1970）
等の文献に記載の方法で行なうことができる。
このようにして形質転換された宿主菌はそれ自
体公知の方法で培養することにより、トリプトフ
アンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はDL−セリンとからＬ
−トリプトフアンを製造する際の酵素反応に利用
することができる。
体公知の方法で培養することにより、トリプトフ
アンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はDL−セリンとからＬ
−トリプトフアンを製造する際の酵素反応に利用
することができる。
培養された菌体を該酵素反応に利用する場合、
該菌体はそのままで使用することができるが、該
菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又はその
破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該
抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈澱
させた粗精製物の形で使用することもでき、さら
に、該菌体又はこれら処理物は必要により固定化
して用いることもできる。
該菌体はそのままで使用することができるが、該
菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、又はその
破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは該
抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈澱
させた粗精製物の形で使用することもでき、さら
に、該菌体又はこれら処理物は必要により固定化
して用いることもできる。
該菌体又はその処理物の存在下でのインドール
とＬ−又はDL−セリンとの反応は、通常の酵素
反応と同様に例えば0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0〜
9.0）あるいは水（PH7.0〜9.0）等の溶媒中で、約
20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃の温度で通
常約10〜約72時間行なわれる。
とＬ−又はDL−セリンとの反応は、通常の酵素
反応と同様に例えば0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0〜
9.0）あるいは水（PH7.0〜9.0）等の溶媒中で、約
20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃の温度で通
常約10〜約72時間行なわれる。
インドールとＬ−又はDL−セリンの反応時の
使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれ
を0.1〜20％（wt／vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。また、該菌体又はその処理物の使
用量にも特に制限されるものではないが、一般に
１〜10％（wt／vol）の濃度で使用することがで
きる。
使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれ
を0.1〜20％（wt／vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。また、該菌体又はその処理物の使
用量にも特に制限されるものではないが、一般に
１〜10％（wt／vol）の濃度で使用することがで
きる。
なお、上記形質転換された菌の培養は宿主菌の
種類によつて異なるが、一般には、通常用いられ
る合成或いは天然培地を用いて行なうことができ
る。しかして炭素源としては、グルコース、グリ
セロール、フラクトース、シユクロース、糖密等
の種々の炭水化物が使用できる。また、窒素源と
しては、トリプトン、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。
種類によつて異なるが、一般には、通常用いられ
る合成或いは天然培地を用いて行なうことができ
る。しかして炭素源としては、グルコース、グリ
セロール、フラクトース、シユクロース、糖密等
の種々の炭水化物が使用できる。また、窒素源と
しては、トリプトン、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。
培養は、振盪培養あるいは通気撹拌深部培養な
どの好気的条件下に行うことができる。培養温度
は一般に20〜50℃であり、培地中の培地のPHは中
性または微アルカリ性附近に維持することが望ま
しい。培養期間は、通常１〜５日である。
どの好気的条件下に行うことができる。培養温度
は一般に20〜50℃であり、培地中の培地のPHは中
性または微アルカリ性附近に維持することが望ま
しい。培養期間は、通常１〜５日である。
上記のような培養方法によつて得られた菌体又
はその処理物を用いてインドールとＬ−、又は
DL−セリンを反応せしめて得られる、反応液中
に生成したＬ−トリプトフアンの分離・精製は、
イオン交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理
等の公知の方法により行うことができる。
はその処理物を用いてインドールとＬ−、又は
DL−セリンを反応せしめて得られる、反応液中
に生成したＬ−トリプトフアンの分離・精製は、
イオン交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理
等の公知の方法により行うことができる。
また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主
菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも
利用することができる。すなち、本発明のプラス
ミドで形質転換した宿主をインドールを含む培地
で培養すれば、培地中にＬ−トリプトフアンが生
産蓄積し、これを採取することによりＬ−トリプ
トフアンを製造することができる。
菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも
利用することができる。すなち、本発明のプラス
ミドで形質転換した宿主をインドールを含む培地
で培養すれば、培地中にＬ−トリプトフアンが生
産蓄積し、これを採取することによりＬ−トリプ
トフアンを製造することができる。
実施例 １
プラスミドpMTY−３の造成
(A) フアージφ80ptの調製
大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を100
mlのＬ培地（Bacto トリプトン10ｇ、酵母エ
キス５ｇ、NaCl5ｇ、グリコース１ｇ、水１
；PH7.2）に接種し、37℃で約４時間振盪し
た培養物の0.2mlと、フアージφ80
（ATCC11456a−B1）水溶液（105ケ／ml）の
0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒天沫）
中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上に重
層する。該プレートを37℃にて約５時間培養す
るとプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３
日間37℃にて培養を継続すると、プラーク中に
フアージφ80溶源菌の生育コロニーを生ずる。
該溶原菌をＬ培地にて37℃で４時間培養後、上
記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹したの
ち、紫外線照射（400〜800ergs／mm2、10〜20
秒）による溶原フアージの誘発によりフアージ
φ80pt（トリプトフアンオペロンを含むフアー
ジDNA）を調製する。
mlのＬ培地（Bacto トリプトン10ｇ、酵母エ
キス５ｇ、NaCl5ｇ、グリコース１ｇ、水１
；PH7.2）に接種し、37℃で約４時間振盪し
た培養物の0.2mlと、フアージφ80
（ATCC11456a−B1）水溶液（105ケ／ml）の
0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒天沫）
中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上に重
層する。該プレートを37℃にて約５時間培養す
るとプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３
日間37℃にて培養を継続すると、プラーク中に
フアージφ80溶源菌の生育コロニーを生ずる。
該溶原菌をＬ培地にて37℃で４時間培養後、上
記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹したの
ち、紫外線照射（400〜800ergs／mm2、10〜20
秒）による溶原フアージの誘発によりフアージ
φ80pt（トリプトフアンオペロンを含むフアー
ジDNA）を調製する。
(B) trpA及びtrpB断片にトリプトフアンプロモ
ーター及びオペレーターDNA断片を結合した
Ｔ断片の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１
のＬ培地（粗成は前記と同じ）に接種し、約
37℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に25％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液10mlと上記で調製し
たフアージφ80pt溶液を1011ケ／mlの濃度で添
加し（moi20）、５時間振盪を継続後常法通り
クロロホルムの添加により、フアージφ80ptを
大量に調製した［T.Maniatis、E.F.Fritsch、
Sambrook；“Molecular cloning”（1982）
p.76〜80Cold Spring Harbor Laboratory参
照］。
ーター及びオペレーターDNA断片を結合した
Ｔ断片の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１
のＬ培地（粗成は前記と同じ）に接種し、約
37℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に25％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液10mlと上記で調製し
たフアージφ80pt溶液を1011ケ／mlの濃度で添
加し（moi20）、５時間振盪を継続後常法通り
クロロホルムの添加により、フアージφ80ptを
大量に調製した［T.Maniatis、E.F.Fritsch、
Sambrook；“Molecular cloning”（1982）
p.76〜80Cold Spring Harbor Laboratory参
照］。
次に取得したフアージφ80pt溶液をトリス緩
衝液（PH7.8）にて透析後、フエノール法によ
り、DNA抽出法［上記“Molecular Cloning”
p.85参照］によつてフアージDNAを抽出精製
し、これに制限酵素BamHを与え30℃で30
分間反応させ、トリプトフアンオペロンDNA
断片を得た。
衝液（PH7.8）にて透析後、フエノール法によ
り、DNA抽出法［上記“Molecular Cloning”
p.85参照］によつてフアージDNAを抽出精製
し、これに制限酵素BamHを与え30℃で30
分間反応させ、トリプトフアンオペロンDNA
断片を得た。
次に、このトリプトフアンオペロンDNA断
片10μｇを制限酵素Hincを用い37℃で５分間
部分処理してtrpA及びtrpB遺伝子を含むDNA
断片2μｇを調製した。また、トリプトフアン
オペロンDNA断片20μｇを制限酵素Pvuを用
い37℃で１時間処理してプロモーター及びオペ
レーター遺伝子領域を含むDNA断片0.4μｇを
調製した。得られた両DNA断片を混合し
T4DNAリガーゼを用い12℃で24時間反応させ
て結合し、さらにEcoRリンカー0.5μｇを混
合し、T4DNAリガーゼを用い12℃で24時間反
応させて再結合した。さらに、この再結合物を
制限酵素EcoRを用い37℃で１時間処理し、
trpA及びtrpB断片にプロモーター及びオペレ
ーターDNA断片が結合し且つ両粘着末端が
EcoR部位であるＴ断片を調製した。
片10μｇを制限酵素Hincを用い37℃で５分間
部分処理してtrpA及びtrpB遺伝子を含むDNA
断片2μｇを調製した。また、トリプトフアン
オペロンDNA断片20μｇを制限酵素Pvuを用
い37℃で１時間処理してプロモーター及びオペ
レーター遺伝子領域を含むDNA断片0.4μｇを
調製した。得られた両DNA断片を混合し
T4DNAリガーゼを用い12℃で24時間反応させ
て結合し、さらにEcoRリンカー0.5μｇを混
合し、T4DNAリガーゼを用い12℃で24時間反
応させて再結合した。さらに、この再結合物を
制限酵素EcoRを用い37℃で１時間処理し、
trpA及びtrpB断片にプロモーター及びオペレ
ーターDNA断片が結合し且つ両粘着末端が
EcoR部位であるＴ断片を調製した。
(C) プラスミドpMTY−３の造成
本発明に従うプラスミドpMTY−３を造成
するために、添付の第１図に示すように、まず
pBR322−miniFプラスミドを造成する。
するために、添付の第１図に示すように、まず
pBR322−miniFプラスミドを造成する。
mini−Ｆ断片は常法［Mukai、Ｔ、
Matsubara、Ｋ、Takagi.Y：Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A、70 2884（1973）参照］に従
つて調製し、このmini−Ｆ断片1μｇに制限酵
素BamHを37℃で１時間作用させる。他方、
別に用意したAmpr（アンピシリン耐性）及び
Tcr（テトラサイクリン耐性）のプラスミド
pBR322DNA2μｇに制限酵素EcoR及び
BamHを37℃で１時間作用させる。しかる
後両処理物を混合し、T4DNAリガーゼを12℃
で24時間作用させて再結合させた。再結合後の
DNAを大腸菌C600株（ATCCe23738）に形質
転換し、Ampr及びTcs（テトラサイクリン感受
性）を併せもつ株を選択した。これらの株から
プラスミドDNAを分離精製し、アガロースゲ
ル電気泳動法によつて分子量を測定して、約
10.7kbのpBR322−miniFプラスミドを捕集し
た。
Matsubara、Ｋ、Takagi.Y：Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A、70 2884（1973）参照］に従
つて調製し、このmini−Ｆ断片1μｇに制限酵
素BamHを37℃で１時間作用させる。他方、
別に用意したAmpr（アンピシリン耐性）及び
Tcr（テトラサイクリン耐性）のプラスミド
pBR322DNA2μｇに制限酵素EcoR及び
BamHを37℃で１時間作用させる。しかる
後両処理物を混合し、T4DNAリガーゼを12℃
で24時間作用させて再結合させた。再結合後の
DNAを大腸菌C600株（ATCCe23738）に形質
転換し、Ampr及びTcs（テトラサイクリン感受
性）を併せもつ株を選択した。これらの株から
プラスミドDNAを分離精製し、アガロースゲ
ル電気泳動法によつて分子量を測定して、約
10.7kbのpBR322−miniFプラスミドを捕集し
た。
次に第２図に示すように、pBR322−miniF
プラスミドと上記(B)で調製したＴ断片を結合さ
せてpMTY−３を造成する。
プラスミドと上記(B)で調製したＴ断片を結合さ
せてpMTY−３を造成する。
すなわち、pBR322−miniFプラスミド
DNA2μｇに制限酵素EcoRを37℃で１時間
作用させた後、前記(B)で調製したtrpA及び
trpB断片にプローモーター及びオペレーター
DNA断片が結合したDNA断片1μｇを混合し、
T4DNAリガーゼを12℃で24時間作用させて再
結合させた。再結合後のDNAを用いてエシエ
リヒア・コリＫ−12株（トリプトフアン要求性
変異株、ATCC23718）を常法に従い形質転換
し、形質転換株［Trp要求性の消失；すなわち
プラスミド上のtrpA及びtrpB遺伝子によりト
リプトフアン生合成可能となり、最少培地
（K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、MgSO4・
7H2O0.1ｇ、（NH4）2SO41ｇ、グリコース２
ｇ、純水１）上にて生育可能となつた菌株］
を得た。この菌株を常法に従い液体培養し、培
養液より第２図に示す制限酵素地図をもつプラ
スミドpMTY−３を分離精製した。
DNA2μｇに制限酵素EcoRを37℃で１時間
作用させた後、前記(B)で調製したtrpA及び
trpB断片にプローモーター及びオペレーター
DNA断片が結合したDNA断片1μｇを混合し、
T4DNAリガーゼを12℃で24時間作用させて再
結合させた。再結合後のDNAを用いてエシエ
リヒア・コリＫ−12株（トリプトフアン要求性
変異株、ATCC23718）を常法に従い形質転換
し、形質転換株［Trp要求性の消失；すなわち
プラスミド上のtrpA及びtrpB遺伝子によりト
リプトフアン生合成可能となり、最少培地
（K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、MgSO4・
7H2O0.1ｇ、（NH4）2SO41ｇ、グリコース２
ｇ、純水１）上にて生育可能となつた菌株］
を得た。この菌株を常法に従い液体培養し、培
養液より第２図に示す制限酵素地図をもつプラ
スミドpMTY−３を分離精製した。
このプラスミドpMTY−３を保持する形質
転換株は、エシエリヒア・コリK12 YK2009と
して、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号
の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和59
年11月27日付で受託番号：微工研寄第7957号
（FERM Ｐ−7957）にて寄託されている［な
お、この微生物は平成３年１月28日付でブダペ
スト条約に基き微工研条寄第3244号（FERM
BP−3244）として国際寄託に移管されてい
る］。
転換株は、エシエリヒア・コリK12 YK2009と
して、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号
の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和59
年11月27日付で受託番号：微工研寄第7957号
（FERM Ｐ−7957）にて寄託されている［な
お、この微生物は平成３年１月28日付でブダペ
スト条約に基き微工研条寄第3244号（FERM
BP−3244）として国際寄託に移管されてい
る］。
実施例 ２
形質転換株の安定性
前記の最少培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実
施例１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて24時
間振盪培養を行なつた後、同様にして調製したＬ
培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃
で15分間滅菌したものに１ml当り50cellsの割合
になるように植継し、同じく37℃にて24時間振盪
培養を行なつた。次に遠心分離を用いて集菌し、
菌体を洗浄後、アンピシリンを50μｇ／mlの割合
で添加したＬ培地および無添加のＬ培地として調
製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１日培
養後生育コロニーをカウントする。
分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実
施例１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて24時
間振盪培養を行なつた後、同様にして調製したＬ
培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃
で15分間滅菌したものに１ml当り50cellsの割合
になるように植継し、同じく37℃にて24時間振盪
培養を行なつた。次に遠心分離を用いて集菌し、
菌体を洗浄後、アンピシリンを50μｇ／mlの割合
で添加したＬ培地および無添加のＬ培地として調
製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１日培
養後生育コロニーをカウントする。
この結果、アンピシリン添加および無添加培地
に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ
培地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まな
い最少培地に生育すること、すなわち該プラスミ
ドの高度の安定性を確認した。
に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ
培地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まな
い最少培地に生育すること、すなわち該プラスミ
ドの高度の安定性を確認した。
実施例 ３
トリプトフアンシンターゼ活性の測定
最少培地100mlを500ml容三角フラスコに分注
し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実施例
１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて１日振盪
倍着後、同様にして調製したインドールアクリル
酸を100μｇ／mlの濃度で含有するＬ培地に20ml
接種し、同じく37℃にて６時間振盪培養した。該
培養液を遠心分離することにより菌体を集菌し、
100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）50mlにて洗浄し、
再び遠心分離を行い集菌後、湿菌体を200mg採取
し１mlの100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）に懸濁し
超音波処理を行なつた。処理後の菌体破砕物を適
当に100ｍＭトリス緩衝液で希釈して、常法［O.
H.Smith and C.Yanofsky：“Methods in
Enzymology”、Academic、NawYork（1962）、
vol5、p794〜806］に従い酵素反応を行なつた。
その結果、本発明のプラスミドpMTY−３を保
持する大腸菌（FERM BP−3244）を用いた場
合、約250units（1units＝0.1μmoleTrp／mg
protein／20minで示す）の活性値を示した。ま
た、対照としてプラスミドpMTY−２を用いて
上記方法で活性を調べたところ約100unitsの活性
値を示した。
し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実施例
１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて１日振盪
倍着後、同様にして調製したインドールアクリル
酸を100μｇ／mlの濃度で含有するＬ培地に20ml
接種し、同じく37℃にて６時間振盪培養した。該
培養液を遠心分離することにより菌体を集菌し、
100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）50mlにて洗浄し、
再び遠心分離を行い集菌後、湿菌体を200mg採取
し１mlの100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）に懸濁し
超音波処理を行なつた。処理後の菌体破砕物を適
当に100ｍＭトリス緩衝液で希釈して、常法［O.
H.Smith and C.Yanofsky：“Methods in
Enzymology”、Academic、NawYork（1962）、
vol5、p794〜806］に従い酵素反応を行なつた。
その結果、本発明のプラスミドpMTY−３を保
持する大腸菌（FERM BP−3244）を用いた場
合、約250units（1units＝0.1μmoleTrp／mg
protein／20minで示す）の活性値を示した。ま
た、対照としてプラスミドpMTY−２を用いて
上記方法で活性を調べたところ約100unitsの活性
値を示した。
第１図はプラスミドpBR322−miniFの造成工
程を示す図であり、第２図はプラスミドpMTY
−３の造成工程を示す図である。
程を示す図であり、第２図はプラスミドpMTY
−３の造成工程を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エシエリヒア・コリ由来のトリプトフアンオ
ペロン中の少なくともtrpAおよびtrpB遺伝子を
含むDNA断片並びにこれらの両遺伝子を発現さ
せうるプロモーター機能をもつDNA断片及びこ
のプロモーター機能を制御しうるオペレーター機
能をもつDNA断片が結合したDNA断片と、Ｆ因
子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子
を含むmini−Ｆ断片と、ColE1系プラスミド由来
の自律増殖能を司る遺伝子を含むDNA断片とを
含有することを特徴とする組換えプラスミド。 ２ エシエリヒア・コリ由来のトリプトフアンオ
ペロン中の少なくともtrpA及びtrpB遺伝子を含
むDNA断片並びにこれらの両遺伝子を発現させ
うるプロモーター機能をもつDNA断片及びこの
プロモーター機能を制御しうるオペレーター機能
をもつDNA断片が結合したDNA断片と、Ｆ因子
プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を
含むmini−Ｆ断片と、ColE1系プラスミド由来の
自律増殖能を司る遺伝子を含むDNA断片とを含
有する組換えプラスミドで形質転換されたエシエ
リヒア・コリＫ−12系微生物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60007450A JPS61170391A (ja) | 1985-01-21 | 1985-01-21 | 新規プラスミド |
| EP85113730A EP0180192B1 (en) | 1984-10-29 | 1985-10-29 | Novel plasmids |
| DE8585113730T DE3585357D1 (de) | 1984-10-29 | 1985-10-29 | Plasmide. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60007450A JPS61170391A (ja) | 1985-01-21 | 1985-01-21 | 新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61170391A JPS61170391A (ja) | 1986-08-01 |
| JPH0527381B2 true JPH0527381B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=11666167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60007450A Granted JPS61170391A (ja) | 1984-10-29 | 1985-01-21 | 新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61170391A (ja) |
-
1985
- 1985-01-21 JP JP60007450A patent/JPS61170391A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61170391A (ja) | 1986-08-01 |
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