JPH0579311B2 - - Google Patents
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- JPH0579311B2 JPH0579311B2 JP59225906A JP22590684A JPH0579311B2 JP H0579311 B2 JPH0579311 B2 JP H0579311B2 JP 59225906 A JP59225906 A JP 59225906A JP 22590684 A JP22590684 A JP 22590684A JP H0579311 B2 JPH0579311 B2 JP H0579311B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12P13/227—Tryptophan
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
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Description
本発明はトリプトフアンシンターゼの生合成を
司る遺伝子を含むDNA断片を有する新規なプラ
スミドに関し、さらに詳しくは、宿主内に安定に
維持することのできる、ソリプトフアンシンター
ゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例え
ばトリプトフアンオペロンを有するプラスミドに
関する。 トリプトフアンオペロンのクローニングについ
ては従来からいろいろと研究されているが、例え
ばJournal of General Microbiology、Vel.118、
253（1980）に記載されているように、宿主内での
安定性に問題があり、トリプトフアンの工業的製
造に応用するには多くの困難があると考えられて
いる。 一方、プラスミドの宿主内での安定性におい
て、応用的に最も重要な要素は一般に宿主の継代
培養におけるプラスミドの脱落現象である。その
ため、従来よりプラスミドの脱落を防止するため
に種々の試みがなされており、例えば、エシエリ
ヒア属のストレプトマイシンに依存しないという
性質を司る染色体遺伝子DNAフラグメントが組
み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のスト
レプトマイシン依存性変異株に含有せしめて、プ
ラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭55−156591号公報）。
しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組
み込む必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラ
スミドが安定に娘細胞に分配され難いことが予想
され、工業的に応用するにはかなりの問題があ
る。 そこで、本発明者らは、トリプトフアンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例
えばトリプトフアンオペロンを、親細胞から娘細
胞へと継代的に安定に分配することを可能にする
機能をもつプラスミドについて鋭意研究を行な
い、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系
を司る遺伝子を含む画分がプラスミドの安定化に
大きく寄与していることに着目し、先に、トリプ
トフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配
系を司る遺伝子を含有DNA断片とを有すること
を特徴とする新規なプラスミド、殊に本発明者ら
がプラスミドpMTY−１と称するプラスミドを
創製し提案した（特開昭60−2189号公報参照）。
しかし、この新規なプラスミドpMTY−１は菌
体内で不安定な遺伝子の産物を産生させるには有
用であるが、コピー数が１〜２個と少なく、菌体
内で遺伝子産物を著量産生させる場合には効率が
低いという難点がある。 従つて、形質転換された微生物菌体内でのコピ
ー数が多く、形質発現効率が高く、しかも安定で
脱落が少なく親細胞から娘細胞へと継代的に確実
に分配されるプラスミドを開発することが望まれ
る。 そこで、本発明者らはエシエリヒア・コリの
ColE1系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個
のコピー数を有することに着目し、今回、ColE1
系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、上
記のトリプトンフアンシンターゼの生合成を司る
遺伝子を含むDNA断片とを組合せることにより、
コピー数が多くしかも継代的に安定に分配可能な
プラスミドを創製することに成功し、本発明を完
成するに至つた。 しかして、本発明によれば、トリプトフアンオ
ペロンに由来するトリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含むDNA断片と、Ｆ因子プ
ラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む
DNA断片と、ColE1系プラスミドの自律増殖能
を司る遺伝子を含むDNA断片を有することを特
徴とする、エシエリヒア・コリの細胞内で自律増
殖可能な新規なプラスミドが提供される。 本発明のプラスミドを構成する「トリプトフア
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA
断片（以下「Ｔ画分」と略称することがある）と
は、インドールとＬ−又はDL−セリンからＬ−
トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリ
プトフアンオペロン又はトリプトフアンオペロン
を含むもつと大きなDNA断片、或いは、トリプ
トフアンオペロン中のトリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子であるTrpAとTrpBにプ
ロモーター及びオペレーターを結合したDNA断
片、又はTrpAとTrpBにTrpC、TrpD及びTrpE
の少なくとも１種とプロモーター及びオペレータ
ーを結合したDNA断片（例えば、TrpA、
TrpB、TrpC、TrpD及びTrpEにプロモーター
及びオペレーターが結合したDNA断片）等が包
含される。これらのＴ画分としては実用的には大
腸菌（エシエリヒア・コリ）由来のものが好適に
使用される。このＴ画分の供給源としては特に制
限はないが、エシエリヒア・コリATCC23282、
エシエリヒア・コリATCC23437、エシエリヒ
ア・コリATCC23461等が有利に使用される。 本発明は前述したように、上記のＴ画分を、Ｆ
因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むDNA断片と組合わせる点に１つの
特徴を有する。Ｆ因子プラスミドＦは例えば「蛋
白質 核酸 酵素」第27巻第１号（1982）の98頁
の図１の遺伝子地図及びEcoRによる物理的地
図に示される如き構造をもつ、分子量が94.5Kb
（62×106dolton）の既知のプラスミドであり、大
腸菌などの腸内細菌中に通常１細胞染色体当り１
〜２個のコピー数で存在し、従つて染色体が細胞
当り２個あるとすればＦ因子プラスミドとしては
２〜４個しか担われていない。このプラスミドは
細胞分裂時にちようど倍化してそれぞれの娘細胞
に正確に伝達されるような機構を備えている（こ
のように、コピー数を低いレベルに保ちつつ、正
確に宿主の増殖とペースを合わせて増やす仕組み
をstringentな増殖の制御と呼んでいる）。Ｆ因子
プラスミドにおけるこのようなstringentな増殖
の制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる分子量が
9.1Kbの自律増殖できる断片に担われていること
も既に究明されており、このmini−ＦがＦ因子
プラスミドより制御酵素EcoRにより切り出し
可能であることも知られている。 本発明はこのmini−Ｆに担われている増殖制
御分配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因
子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むDNA断片」（以下Ｆ画分と略称するこ
とがある）とは、上述したようなＦ因子プラスミ
ドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子
DNAを意味し、そのようなＦ画分の代表例とし
ては約9.1Kbの分子量を有するmini−Ｆ断片が挙
げられる。 さらに、本発明において上記Ｔ画分及びＦ画分
と組合わせて使用される「CalE1系プラスミドの
自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断片」（以下
「Ｓ画分」という）は、コピー数が１細胞染色体
当り20〜30個であるColE1系プラスミドの自律増
殖を司る遺伝子を含むDNA断片を意味し、その
ようなＳ画分の代表例としては約4.3Kbの長さを
有するプラスミドpBRS22のＳ画分が挙げられ、
その他にプラスミドpBR325等のＳ画分がある。 本発明により提供されるプラスミドは、以上に
述べたＴ画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの必須の
遺伝子画分を有する限り、他の遺伝子画分、例え
ば抗生物質耐性マーカーであるアンピシリン耐性
を含むDNA断片、カナマイシン耐性を含むDNA
断片等 をさらに含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ
画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの画分から実質的
になり、分子量が約13.7メガダルトン（約
20.8Kb）のプラスミドで、本発明者らが「プラ
スミドpMTY−２」と命名したものである。な
お、本明細書において、プラスミドの分子量はア
ガロースゲル電気泳動法により測定した値であ
る。 以下、このプラスミドPMTY−２についてさ
らに詳細に説明する。 プラスミドpMTY−２の下記の制限酵素の感
受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解
断片の長さ（Kb）は下記の表に示すとおりであ
る。
司る遺伝子を含むDNA断片を有する新規なプラ
スミドに関し、さらに詳しくは、宿主内に安定に
維持することのできる、ソリプトフアンシンター
ゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例え
ばトリプトフアンオペロンを有するプラスミドに
関する。 トリプトフアンオペロンのクローニングについ
ては従来からいろいろと研究されているが、例え
ばJournal of General Microbiology、Vel.118、
253（1980）に記載されているように、宿主内での
安定性に問題があり、トリプトフアンの工業的製
造に応用するには多くの困難があると考えられて
いる。 一方、プラスミドの宿主内での安定性におい
て、応用的に最も重要な要素は一般に宿主の継代
培養におけるプラスミドの脱落現象である。その
ため、従来よりプラスミドの脱落を防止するため
に種々の試みがなされており、例えば、エシエリ
ヒア属のストレプトマイシンに依存しないという
性質を司る染色体遺伝子DNAフラグメントが組
み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のスト
レプトマイシン依存性変異株に含有せしめて、プ
ラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭55−156591号公報）。
しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組
み込む必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラ
スミドが安定に娘細胞に分配され難いことが予想
され、工業的に応用するにはかなりの問題があ
る。 そこで、本発明者らは、トリプトフアンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA断片、例
えばトリプトフアンオペロンを、親細胞から娘細
胞へと継代的に安定に分配することを可能にする
機能をもつプラスミドについて鋭意研究を行な
い、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系
を司る遺伝子を含む画分がプラスミドの安定化に
大きく寄与していることに着目し、先に、トリプ
トフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配
系を司る遺伝子を含有DNA断片とを有すること
を特徴とする新規なプラスミド、殊に本発明者ら
がプラスミドpMTY−１と称するプラスミドを
創製し提案した（特開昭60−2189号公報参照）。
しかし、この新規なプラスミドpMTY−１は菌
体内で不安定な遺伝子の産物を産生させるには有
用であるが、コピー数が１〜２個と少なく、菌体
内で遺伝子産物を著量産生させる場合には効率が
低いという難点がある。 従つて、形質転換された微生物菌体内でのコピ
ー数が多く、形質発現効率が高く、しかも安定で
脱落が少なく親細胞から娘細胞へと継代的に確実
に分配されるプラスミドを開発することが望まれ
る。 そこで、本発明者らはエシエリヒア・コリの
ColE1系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個
のコピー数を有することに着目し、今回、ColE1
系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、上
記のトリプトンフアンシンターゼの生合成を司る
遺伝子を含むDNA断片とを組合せることにより、
コピー数が多くしかも継代的に安定に分配可能な
プラスミドを創製することに成功し、本発明を完
成するに至つた。 しかして、本発明によれば、トリプトフアンオ
ペロンに由来するトリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含むDNA断片と、Ｆ因子プ
ラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含む
DNA断片と、ColE1系プラスミドの自律増殖能
を司る遺伝子を含むDNA断片を有することを特
徴とする、エシエリヒア・コリの細胞内で自律増
殖可能な新規なプラスミドが提供される。 本発明のプラスミドを構成する「トリプトフア
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA
断片（以下「Ｔ画分」と略称することがある）と
は、インドールとＬ−又はDL−セリンからＬ−
トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリ
プトフアンオペロン又はトリプトフアンオペロン
を含むもつと大きなDNA断片、或いは、トリプ
トフアンオペロン中のトリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子であるTrpAとTrpBにプ
ロモーター及びオペレーターを結合したDNA断
片、又はTrpAとTrpBにTrpC、TrpD及びTrpE
の少なくとも１種とプロモーター及びオペレータ
ーを結合したDNA断片（例えば、TrpA、
TrpB、TrpC、TrpD及びTrpEにプロモーター
及びオペレーターが結合したDNA断片）等が包
含される。これらのＴ画分としては実用的には大
腸菌（エシエリヒア・コリ）由来のものが好適に
使用される。このＴ画分の供給源としては特に制
限はないが、エシエリヒア・コリATCC23282、
エシエリヒア・コリATCC23437、エシエリヒ
ア・コリATCC23461等が有利に使用される。 本発明は前述したように、上記のＴ画分を、Ｆ
因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むDNA断片と組合わせる点に１つの
特徴を有する。Ｆ因子プラスミドＦは例えば「蛋
白質 核酸 酵素」第27巻第１号（1982）の98頁
の図１の遺伝子地図及びEcoRによる物理的地
図に示される如き構造をもつ、分子量が94.5Kb
（62×106dolton）の既知のプラスミドであり、大
腸菌などの腸内細菌中に通常１細胞染色体当り１
〜２個のコピー数で存在し、従つて染色体が細胞
当り２個あるとすればＦ因子プラスミドとしては
２〜４個しか担われていない。このプラスミドは
細胞分裂時にちようど倍化してそれぞれの娘細胞
に正確に伝達されるような機構を備えている（こ
のように、コピー数を低いレベルに保ちつつ、正
確に宿主の増殖とペースを合わせて増やす仕組み
をstringentな増殖の制御と呼んでいる）。Ｆ因子
プラスミドにおけるこのようなstringentな増殖
の制御機能が、mini−Ｆと呼ばれる分子量が
9.1Kbの自律増殖できる断片に担われていること
も既に究明されており、このmini−ＦがＦ因子
プラスミドより制御酵素EcoRにより切り出し
可能であることも知られている。 本発明はこのmini−Ｆに担われている増殖制
御分配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因
子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むDNA断片」（以下Ｆ画分と略称するこ
とがある）とは、上述したようなＦ因子プラスミ
ドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子
DNAを意味し、そのようなＦ画分の代表例とし
ては約9.1Kbの分子量を有するmini−Ｆ断片が挙
げられる。 さらに、本発明において上記Ｔ画分及びＦ画分
と組合わせて使用される「CalE1系プラスミドの
自律増殖を司る遺伝子を含むDNA断片」（以下
「Ｓ画分」という）は、コピー数が１細胞染色体
当り20〜30個であるColE1系プラスミドの自律増
殖を司る遺伝子を含むDNA断片を意味し、その
ようなＳ画分の代表例としては約4.3Kbの長さを
有するプラスミドpBRS22のＳ画分が挙げられ、
その他にプラスミドpBR325等のＳ画分がある。 本発明により提供されるプラスミドは、以上に
述べたＴ画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの必須の
遺伝子画分を有する限り、他の遺伝子画分、例え
ば抗生物質耐性マーカーであるアンピシリン耐性
を含むDNA断片、カナマイシン耐性を含むDNA
断片等 をさらに含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ
画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの画分から実質的
になり、分子量が約13.7メガダルトン（約
20.8Kb）のプラスミドで、本発明者らが「プラ
スミドpMTY−２」と命名したものである。な
お、本明細書において、プラスミドの分子量はア
ガロースゲル電気泳動法により測定した値であ
る。 以下、このプラスミドPMTY−２についてさ
らに詳細に説明する。 プラスミドpMTY−２の下記の制限酵素の感
受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解
断片の長さ（Kb）は下記の表に示すとおりであ
る。
【表】
以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミ
ドpMTY−２は、例えば次のようにして製造す
ることができる。 まず、トリプトフアンオペロンを含むDNA断
片（Ｔを含むDNA断片）の調製は、例えば、染
色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大
腸菌、例えば、Escherichiacoli Ｋ−12
（IFO3301、ATCC10798、ATCC e23562）など
に、フアージ、例えばフアージφ80
（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及
び誘発現象を利用して、フアージDNA中にトリ
プトフアンオペロンを取り込んだフアージを大量
に調製し〔R.M.Denney、C.Yanofsky；J.
Bacterior.、118、505（1974）参照〕、それから常
法〔E.F.Fritsch、Sambrook、
“Molecularcloning”（1982）p.164〜165、Cold
Spin Harbor Laboratory参照〕に従つてフアー
ジDNAを抽出し、制限酵素、例えばRamH、
EcoR等を用いてトリプトフアンオペロンを含
むDNA断片を切り出すことにより行なうことが
できる。 他方、miniF断片の調製は、例えば、Ｆ因子プ
ラスミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（E.
coli）Ｋ−12株（ATCC15153、ATCC e23589、
ATCC e23590）等からそれ自体公知の方法で、
例えばP.Cuerry、D.L.LeBlanc、S.Falkow；J.
Bact.、116、1064（1973）等の文献に記載の方法
でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵
素EcoRを用いて分子量が約9.1Kbのmini Ｆ断
片を切り出すことにより調製することができる。 他方、Col E1プラスミドの自立増殖を司る遺
伝子を含むDNA断片の供給源としては、Col E1
プラスミドとして代表的なプラスミドpBR322を
使用するのが便利である。 上記の如くして調製されたトリプトフアンオペ
ロンを含むDNA断片（Ｔ画分）を、まず、この
Ｔ画分の切り出しに用いたと同じ制限酵素で処理
したプラスミドpBR322と一緒にし、T4フアージ
由来のリガーゼのようなリガーゼを作用させて、
プラスミドpBR322に上記Ｔ画分が組み込まれた
プラスミドを作成する。次いで、このプラスミド
を制限酵素Eco Ｒで開裂させ、上記のように
して調製されたmini Ｆ断片と一緒にし、リガー
ゼを作用させて結合させることにより、目的とす
るプラスミドpMTY−２を得ることができる。 なお、プラスミドpMTY−２の具体的調製法
については後記実施例１で詳細に説明する。 このようにして調製される本発明のプラスミド
は、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際して娘
細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安
定であるという優れた特性を有する。 従つて、本発明のプラスミドはトリプトフアン
の製造において工業的に応用することが大いに期
待される。トリプトンフアンの製造に際しては、
本発明のプラスミドで宿主が形質転換される。こ
の形質転換に利用できる宿主菌としては、例え
ば、大腸菌、枯草菌、サツカロマイセス等が考え
られるが、これらの中でも大腸菌（エシエリヒ
ア・コリ）が好ましい。更に、これらの宿主菌を
トリプトフアン要求性変異株としたものが特に好
ましいものである。 また、これらの宿主菌に対する本発明のプラス
ミドの導入はそれ自体公知の方法、例えばM.
Mandel、A.Higa；J.Mol.Biol.53、159（1970）
等の文献に記載の方法で行なうことができる。 このようにして形質転換された宿主菌はそれ自
体公知の方法で培養することにより、トリプトフ
アンシンターゼを菌体内に十分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はDL−セリンとからＬ
−トリプトフアンを製造する際の酵素反応に利用
することができる。培養された菌体を該酵素反応
に利用する場合、該菌体はそのままで使用するこ
とができるが、該菌体を超音波処理等で破砕した
破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した
抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理し
て酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用する
こともでき、さらに、該菌体又はこれら処理物は
必要により固定化して用いることもできる。 該菌体又はその処理物の存在下でのインドール
とＬ−又はDL−セリンとの反応は、通常の酵素
反応と同様に例えば0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0〜
9.0）あるいは水（PH7.0〜9.0）の等の溶媒中で、
約20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃の温度で
通常約10〜約72時間行なわれる。 インドールとＬ−又はDL−セリンの反応時の
使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれ
を0.1〜20％（wt／vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。また、該菌体又はその処理物の使
用量も特に制限されるものではないが、一般に１
〜10％（wt／vol）の濃度で使用することができ
る。 なお、上記形質転換された菌の培養は宿主菌の
種類によつて異なるが、一般には、通常用いられ
る合成或いは天然培地を用い行なうことができ
る。しかして炭素源としては、グルコース、グリ
セロール、フラクトース、シユクロース、糖密等
の種々の炭水化物が使用できる。また、窒素源と
しては、トリプトン、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。 培養は、振盪培養或いは通気撹拌深部培養など
の好気的条件下に行うことができる。培養温度は
一般に20〜50℃であり、培地中の培地のPHは中性
または微アルカリ性附近に維持することが望まし
い。培養期間は、通常１〜５日である。 上記のような培養方法によつて得られた菌体又
はその処理物を用いてインドールとＬ−、又は
DL−セリンを反応せしめて得られる、反応液中
に生成したＬ−トリプトフアンの分離・精製は、
イオン交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理
等の公知の方法により行うことができる。 また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主
菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも
利用することができる。すなわち、本発明のプラ
スミドで形質転換した宿主をインドールを含む培
地で培養すれば、培地中にＬ−トリプトフアンが
生産蓄積し、これを採取することによりＬ−トリ
プトフアンを製造することができる。 実施例 １ プラスミドpMTY−２の造成 (A) mini Ｆ断片の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12菌株（ATCC15153）
を１のＬ培地（Bactoトリプトン10ｇ、酵母
エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース１ｇ、水
１；PH7.2）に接種し、約37℃で約４時間振盪
培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行
ない且つドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添
加して溶菌させた。この溶菌液を32000×ｇで
40分間遠心分離処理し、上清を分画し、次いで
塩化セシウム−エチジウムプロマイド平衡密度
勾配遠心分離処理を行なつた後、透析処理によ
り、Ｆ因子プラスミドを含む溶液を分取した。
この溶液にエタノール沈殿を行ない、最終的に
約20μｇのＦ因子プラスミドを採取した。 次に、miniF断片の調製に際して、上記のＦ
因子プラスミドを5μｇとり、制限酵素である
Eco Ｒを37℃、１時間作用させて該Ｆ因子
プラスミドDNA鎖を切断し、約9.1KbのminiF
断片を含むDNA溶液を調製した。 (B) フアージφ80ptの調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を100
mlのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、37
℃で約４時間振盪した培養物の0.2mlと、フア
ージφ80（ATCC11456a−B1）水溶液（105ケ／
ml）の0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒
天沫）中に混合したのち、Ｌ培養寒天プレート
上に重層する。該ブレートを37℃にて約５時間
培養するとブラーク（溶菌斑）を生じ、さらに
２〜３日間37℃にて培養を継続すると、プラー
ク中にフアージφ80溶原菌の生育コロニーを生
ずる。該溶原菌をＬ培地にて37℃で４時間培養
画、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗沫し
たのち、紫外線照射（400〜800ergs／mm2、10〜
20秒）による溶原フアージの誘発によりフアー
ジφ80pt（トリプトフアンオペロンを含むフア
ージDNA）を調製する。 (C) トリプトフアンオペロンを含むDNA断片の
調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１
の培地（組成は前記と同じ）に接種し、約37
℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に25％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液10mlと上記で調製し
たフアージφ80pt溶液を1011ケ／mlの濃度で添
加し（moi 20）、５時間振盪を継続後常法通り
ロロホルムの添加により、フアージφ80ptを大
量に調製した〔T.Maniatis、E.F.Fritsch、
Sambrook；”Molecularcloning”（1982）
p.76〜80Cold Spring Harbor Laboratory参
照〕。 次に取得したフアージφ80pt溶液をトリス緩
衝液（PH7.8）にて透析後、フエノール法によ
り、DNA抽出法〔上記“Molecular Cloning”
p.85参照〕によつてフアージDNAを抽出精製
し、これに制限酵素BamHを与え30℃で30
分間反応させ、トリプトフアンオペロンを含む
DNA断片を得た。 (D) プラスミドpMTY−２の造成 前記(C)で得たトリプトフアンオペロンを含む
DNA断片に制限酵素Sal、Xhoを37℃にて
１時間反応させ、次いで65℃で５分間熱処理し
て制限酵素Sal、Xhoを失活させた後、同
様に制限酵素Salで処理したプラスミド
pBR322を添加混合し、ATP（アデノシントリ
フオスフエート）およびDTT（ジネオスレイト
ール）を加え、さらにT4フアージ由来のDNA
リガーゼ（DNA結合作用を有する；宝酒造(株)
製「T4DNAリガーゼ」）を添加した後、12℃
で24時間反応を行つた。次いで65℃で５分間熱
処理して、DNAリガーゼを失活させた後、こ
の反応液を用いてエシエリヒア・コリＫ−12系
株（トリプトフアン要求性変異体）を常法（S.
N.Cohen：Proc、Natl.Acad.Soi69、2110−
2114、1972）に従い形質転換させ、形質転換株
〔Trp要求性の消失、すなわちプラスミド上の
トリプトフアンオペロンにより生合成可能とな
り、最少培地（K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、
MgSO4・7H2O0.1ｇ、（NH4）2SO41ｇ、グルコ
ース２ｇ、純水１）上にて生育可能となつた
菌株〕を得た。この菌株を常法に従い液体培養
し、培養液よりプラスミドを精製分離した。 次に、このトリプトフアンオペロンを含むプ
ラスミドに制限酵素EcoRを37℃にて１時間
反応させ、次いで65℃で５分間加熱処理して
EcoRを失活させた後、前記(A)で得たmini−
Ｆ断片を添加混合し、ATPおよびDTTを加え
さらにDNAリガーゼを添加した後、12℃で24
時間反応を行なつた。次いで65℃で５分間熱処
理してDNAリガーゼを失活させた後、この反
応液を用いてエシエリヒア・コリＫ−12系株
（トリプトフアン要求性変異株）を常法に従い
形質転換させ、アンピシリンが50μｇ／mlの割
合で添加してあるＬ培地（Bacto−トリプトン
10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース
１ｇ、水１：PH7.2）に接種し、37℃にて18
時間振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を
洗浄後、最少培地（組成は前記と同じ）に塗抹
して形質転換株を得た。この菌株を常法に従い
液体培養し、培養液よりプラスミドを精製分離
した。 得られたプラスミドpMTY−２は添付の第
１図に示した制限地図を有する。プラスミド
pMTY−２のこの制限地図は、罫線酵素EcoR
、BamH、Sal等を単独もしくは組み合
わせて用いて処理した後、アガロースゲル電気
泳動にて確認した。このプラスミドpMTY−
２を保持する形質転換株は、エシエリヒア・コ
リK12 YK2004として、茨城県つくば市東１丁
目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、昭和59年９月７日付で受託番号：微工研
菌寄第7838号にて寄託されている（昭和63年２
月15日付でブタペスト条約に基く国際寄託に移
管；受託番号：FERM BP−1732）。 実施例 ２ 形質転換株の安定性 前記の最少培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実
施例１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて24時
間振盪培養を行なつた後、同様にして調製したＬ
培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃
で15分間滅菌したものに１ml当たり50cellsの割
合になるように植継し、同じく37℃にて24時間振
盪培養を行なつた。次に遠心分離を用いて集菌
し、菌体を洗浄後、アンピシリンを50μｇ／mlの
割合で添加したＬ培地および無添加のＬ培地とし
て調製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１
日培養後生育コロニー数をカウントする。 この結果、アンピシリン添加および無添加培地
に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ
培地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まな
い最少培地に生育すること、すなわち該プラスミ
ドの高度の安定性を確認した。 参考例 １ Ｌ−トリプトフアンの製造 最小培地100mlを500ml用三角フラスコに分注
し、120℃で15分間滅菌処理したものに形質転換
株エシエリヒア・コリK12YK2004を植菌し37℃
にて１日振盪培養後、同様にして調製したＬ培地
500mlを５容三角フラスコに分注し、120℃で５
分間滅菌処理したものに10ml接種し、同じく37℃
にて５時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体
を回収し、これをインドール25ｇ、DL−セリン
100ｇおよびピリドキサールリン酸５mg、を含む
100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）500mlに懸濁し振
盪しながら37℃、24時間反応を行なつた。反応終
了後、液を10mlとりメタノール10mlを加えて激し
く撹拌した後、遠心分離により得た上澄液につい
て高速液体クロマトグラフイーで生成したＬ−ト
リプトフアンの分析を行なつたところ、22mg／ml
の生成が認められた。 反応終了液500mlに苛性ソーダ水溶液を加えて
PH10にしたのち、アンモニア型強酸性イオン交換
樹脂（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカ
ラムを通してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析出
させたのち、これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ
−トリプトフアンの結晶を7.7ｇを得た。 参考例 ２ 最小培地100mlを500ml容三角フラスコに分注
し、120℃で15分間滅菌処理したものに形質転換
株をエシエリヒア・コリK12YK2004を植菌し、
37℃にて１日振盪培養後、インドールアクリル酸
を100μｇ／mlの濃度で含有するＬ培地の500mlに
実施例３と同様、前培養物の10mlを接種し、37℃
にて５時間振盪培養した。遠心分離にて菌体を回
収したのち、参考例１と同様の操作にて反応を行
い、生成したＬ−トリプトフアンの分析を行つた
ところ、40mg／mlの生成が認められた。 反応終了液500mlから実施例３と同様の操作に
てＬ−トリプトフアンを精製回収したところ、結
晶として13.6ｇのＬ−トリプトフアンを得た。
ドpMTY−２は、例えば次のようにして製造す
ることができる。 まず、トリプトフアンオペロンを含むDNA断
片（Ｔを含むDNA断片）の調製は、例えば、染
色体遺伝子中にトリプトフアンオペロンをもつ大
腸菌、例えば、Escherichiacoli Ｋ−12
（IFO3301、ATCC10798、ATCC e23562）など
に、フアージ、例えばフアージφ80
（ATCC11456a−B1）などを感染させ、溶源化及
び誘発現象を利用して、フアージDNA中にトリ
プトフアンオペロンを取り込んだフアージを大量
に調製し〔R.M.Denney、C.Yanofsky；J.
Bacterior.、118、505（1974）参照〕、それから常
法〔E.F.Fritsch、Sambrook、
“Molecularcloning”（1982）p.164〜165、Cold
Spin Harbor Laboratory参照〕に従つてフアー
ジDNAを抽出し、制限酵素、例えばRamH、
EcoR等を用いてトリプトフアンオペロンを含
むDNA断片を切り出すことにより行なうことが
できる。 他方、miniF断片の調製は、例えば、Ｆ因子プ
ラスミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（E.
coli）Ｋ−12株（ATCC15153、ATCC e23589、
ATCC e23590）等からそれ自体公知の方法で、
例えばP.Cuerry、D.L.LeBlanc、S.Falkow；J.
Bact.、116、1064（1973）等の文献に記載の方法
でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵
素EcoRを用いて分子量が約9.1Kbのmini Ｆ断
片を切り出すことにより調製することができる。 他方、Col E1プラスミドの自立増殖を司る遺
伝子を含むDNA断片の供給源としては、Col E1
プラスミドとして代表的なプラスミドpBR322を
使用するのが便利である。 上記の如くして調製されたトリプトフアンオペ
ロンを含むDNA断片（Ｔ画分）を、まず、この
Ｔ画分の切り出しに用いたと同じ制限酵素で処理
したプラスミドpBR322と一緒にし、T4フアージ
由来のリガーゼのようなリガーゼを作用させて、
プラスミドpBR322に上記Ｔ画分が組み込まれた
プラスミドを作成する。次いで、このプラスミド
を制限酵素Eco Ｒで開裂させ、上記のように
して調製されたmini Ｆ断片と一緒にし、リガー
ゼを作用させて結合させることにより、目的とす
るプラスミドpMTY−２を得ることができる。 なお、プラスミドpMTY−２の具体的調製法
については後記実施例１で詳細に説明する。 このようにして調製される本発明のプラスミド
は、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際して娘
細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安
定であるという優れた特性を有する。 従つて、本発明のプラスミドはトリプトフアン
の製造において工業的に応用することが大いに期
待される。トリプトンフアンの製造に際しては、
本発明のプラスミドで宿主が形質転換される。こ
の形質転換に利用できる宿主菌としては、例え
ば、大腸菌、枯草菌、サツカロマイセス等が考え
られるが、これらの中でも大腸菌（エシエリヒ
ア・コリ）が好ましい。更に、これらの宿主菌を
トリプトフアン要求性変異株としたものが特に好
ましいものである。 また、これらの宿主菌に対する本発明のプラス
ミドの導入はそれ自体公知の方法、例えばM.
Mandel、A.Higa；J.Mol.Biol.53、159（1970）
等の文献に記載の方法で行なうことができる。 このようにして形質転換された宿主菌はそれ自
体公知の方法で培養することにより、トリプトフ
アンシンターゼを菌体内に十分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はDL−セリンとからＬ
−トリプトフアンを製造する際の酵素反応に利用
することができる。培養された菌体を該酵素反応
に利用する場合、該菌体はそのままで使用するこ
とができるが、該菌体を超音波処理等で破砕した
破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した
抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理し
て酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用する
こともでき、さらに、該菌体又はこれら処理物は
必要により固定化して用いることもできる。 該菌体又はその処理物の存在下でのインドール
とＬ−又はDL−セリンとの反応は、通常の酵素
反応と同様に例えば0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0〜
9.0）あるいは水（PH7.0〜9.0）の等の溶媒中で、
約20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃の温度で
通常約10〜約72時間行なわれる。 インドールとＬ−又はDL−セリンの反応時の
使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれ
を0.1〜20％（wt／vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。また、該菌体又はその処理物の使
用量も特に制限されるものではないが、一般に１
〜10％（wt／vol）の濃度で使用することができ
る。 なお、上記形質転換された菌の培養は宿主菌の
種類によつて異なるが、一般には、通常用いられ
る合成或いは天然培地を用い行なうことができ
る。しかして炭素源としては、グルコース、グリ
セロール、フラクトース、シユクロース、糖密等
の種々の炭水化物が使用できる。また、窒素源と
しては、トリプトン、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機
窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。 培養は、振盪培養或いは通気撹拌深部培養など
の好気的条件下に行うことができる。培養温度は
一般に20〜50℃であり、培地中の培地のPHは中性
または微アルカリ性附近に維持することが望まし
い。培養期間は、通常１〜５日である。 上記のような培養方法によつて得られた菌体又
はその処理物を用いてインドールとＬ−、又は
DL−セリンを反応せしめて得られる、反応液中
に生成したＬ−トリプトフアンの分離・精製は、
イオン交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理
等の公知の方法により行うことができる。 また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主
菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも
利用することができる。すなわち、本発明のプラ
スミドで形質転換した宿主をインドールを含む培
地で培養すれば、培地中にＬ−トリプトフアンが
生産蓄積し、これを採取することによりＬ−トリ
プトフアンを製造することができる。 実施例 １ プラスミドpMTY−２の造成 (A) mini Ｆ断片の調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12菌株（ATCC15153）
を１のＬ培地（Bactoトリプトン10ｇ、酵母
エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース１ｇ、水
１；PH7.2）に接種し、約37℃で約４時間振盪
培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行
ない且つドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添
加して溶菌させた。この溶菌液を32000×ｇで
40分間遠心分離処理し、上清を分画し、次いで
塩化セシウム−エチジウムプロマイド平衡密度
勾配遠心分離処理を行なつた後、透析処理によ
り、Ｆ因子プラスミドを含む溶液を分取した。
この溶液にエタノール沈殿を行ない、最終的に
約20μｇのＦ因子プラスミドを採取した。 次に、miniF断片の調製に際して、上記のＦ
因子プラスミドを5μｇとり、制限酵素である
Eco Ｒを37℃、１時間作用させて該Ｆ因子
プラスミドDNA鎖を切断し、約9.1KbのminiF
断片を含むDNA溶液を調製した。 (B) フアージφ80ptの調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を100
mlのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、37
℃で約４時間振盪した培養物の0.2mlと、フア
ージφ80（ATCC11456a−B1）水溶液（105ケ／
ml）の0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒
天沫）中に混合したのち、Ｌ培養寒天プレート
上に重層する。該ブレートを37℃にて約５時間
培養するとブラーク（溶菌斑）を生じ、さらに
２〜３日間37℃にて培養を継続すると、プラー
ク中にフアージφ80溶原菌の生育コロニーを生
ずる。該溶原菌をＬ培地にて37℃で４時間培養
画、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗沫し
たのち、紫外線照射（400〜800ergs／mm2、10〜
20秒）による溶原フアージの誘発によりフアー
ジφ80pt（トリプトフアンオペロンを含むフア
ージDNA）を調製する。 (C) トリプトフアンオペロンを含むDNA断片の
調製 大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１
の培地（組成は前記と同じ）に接種し、約37
℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に25％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液10mlと上記で調製し
たフアージφ80pt溶液を1011ケ／mlの濃度で添
加し（moi 20）、５時間振盪を継続後常法通り
ロロホルムの添加により、フアージφ80ptを大
量に調製した〔T.Maniatis、E.F.Fritsch、
Sambrook；”Molecularcloning”（1982）
p.76〜80Cold Spring Harbor Laboratory参
照〕。 次に取得したフアージφ80pt溶液をトリス緩
衝液（PH7.8）にて透析後、フエノール法によ
り、DNA抽出法〔上記“Molecular Cloning”
p.85参照〕によつてフアージDNAを抽出精製
し、これに制限酵素BamHを与え30℃で30
分間反応させ、トリプトフアンオペロンを含む
DNA断片を得た。 (D) プラスミドpMTY−２の造成 前記(C)で得たトリプトフアンオペロンを含む
DNA断片に制限酵素Sal、Xhoを37℃にて
１時間反応させ、次いで65℃で５分間熱処理し
て制限酵素Sal、Xhoを失活させた後、同
様に制限酵素Salで処理したプラスミド
pBR322を添加混合し、ATP（アデノシントリ
フオスフエート）およびDTT（ジネオスレイト
ール）を加え、さらにT4フアージ由来のDNA
リガーゼ（DNA結合作用を有する；宝酒造(株)
製「T4DNAリガーゼ」）を添加した後、12℃
で24時間反応を行つた。次いで65℃で５分間熱
処理して、DNAリガーゼを失活させた後、こ
の反応液を用いてエシエリヒア・コリＫ−12系
株（トリプトフアン要求性変異体）を常法（S.
N.Cohen：Proc、Natl.Acad.Soi69、2110−
2114、1972）に従い形質転換させ、形質転換株
〔Trp要求性の消失、すなわちプラスミド上の
トリプトフアンオペロンにより生合成可能とな
り、最少培地（K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、
MgSO4・7H2O0.1ｇ、（NH4）2SO41ｇ、グルコ
ース２ｇ、純水１）上にて生育可能となつた
菌株〕を得た。この菌株を常法に従い液体培養
し、培養液よりプラスミドを精製分離した。 次に、このトリプトフアンオペロンを含むプ
ラスミドに制限酵素EcoRを37℃にて１時間
反応させ、次いで65℃で５分間加熱処理して
EcoRを失活させた後、前記(A)で得たmini−
Ｆ断片を添加混合し、ATPおよびDTTを加え
さらにDNAリガーゼを添加した後、12℃で24
時間反応を行なつた。次いで65℃で５分間熱処
理してDNAリガーゼを失活させた後、この反
応液を用いてエシエリヒア・コリＫ−12系株
（トリプトフアン要求性変異株）を常法に従い
形質転換させ、アンピシリンが50μｇ／mlの割
合で添加してあるＬ培地（Bacto−トリプトン
10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース
１ｇ、水１：PH7.2）に接種し、37℃にて18
時間振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を
洗浄後、最少培地（組成は前記と同じ）に塗抹
して形質転換株を得た。この菌株を常法に従い
液体培養し、培養液よりプラスミドを精製分離
した。 得られたプラスミドpMTY−２は添付の第
１図に示した制限地図を有する。プラスミド
pMTY−２のこの制限地図は、罫線酵素EcoR
、BamH、Sal等を単独もしくは組み合
わせて用いて処理した後、アガロースゲル電気
泳動にて確認した。このプラスミドpMTY−
２を保持する形質転換株は、エシエリヒア・コ
リK12 YK2004として、茨城県つくば市東１丁
目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究
所に、昭和59年９月７日付で受託番号：微工研
菌寄第7838号にて寄託されている（昭和63年２
月15日付でブタペスト条約に基く国際寄託に移
管；受託番号：FERM BP−1732）。 実施例 ２ 形質転換株の安定性 前記の最少培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、実
施例１で得た形質転換株を植菌し、37℃にて24時
間振盪培養を行なつた後、同様にして調製したＬ
培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃
で15分間滅菌したものに１ml当たり50cellsの割
合になるように植継し、同じく37℃にて24時間振
盪培養を行なつた。次に遠心分離を用いて集菌
し、菌体を洗浄後、アンピシリンを50μｇ／mlの
割合で添加したＬ培地および無添加のＬ培地とし
て調製した平板培地に一定量塗抹し、37℃にて１
日培養後生育コロニー数をカウントする。 この結果、アンピシリン添加および無添加培地
に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ
培地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まな
い最少培地に生育すること、すなわち該プラスミ
ドの高度の安定性を確認した。 参考例 １ Ｌ−トリプトフアンの製造 最小培地100mlを500ml用三角フラスコに分注
し、120℃で15分間滅菌処理したものに形質転換
株エシエリヒア・コリK12YK2004を植菌し37℃
にて１日振盪培養後、同様にして調製したＬ培地
500mlを５容三角フラスコに分注し、120℃で５
分間滅菌処理したものに10ml接種し、同じく37℃
にて５時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体
を回収し、これをインドール25ｇ、DL−セリン
100ｇおよびピリドキサールリン酸５mg、を含む
100ｍＭトリス緩衝液（PH7.8）500mlに懸濁し振
盪しながら37℃、24時間反応を行なつた。反応終
了後、液を10mlとりメタノール10mlを加えて激し
く撹拌した後、遠心分離により得た上澄液につい
て高速液体クロマトグラフイーで生成したＬ−ト
リプトフアンの分析を行なつたところ、22mg／ml
の生成が認められた。 反応終了液500mlに苛性ソーダ水溶液を加えて
PH10にしたのち、アンモニア型強酸性イオン交換
樹脂（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカ
ラムを通してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析出
させたのち、これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ
−トリプトフアンの結晶を7.7ｇを得た。 参考例 ２ 最小培地100mlを500ml容三角フラスコに分注
し、120℃で15分間滅菌処理したものに形質転換
株をエシエリヒア・コリK12YK2004を植菌し、
37℃にて１日振盪培養後、インドールアクリル酸
を100μｇ／mlの濃度で含有するＬ培地の500mlに
実施例３と同様、前培養物の10mlを接種し、37℃
にて５時間振盪培養した。遠心分離にて菌体を回
収したのち、参考例１と同様の操作にて反応を行
い、生成したＬ−トリプトフアンの分析を行つた
ところ、40mg／mlの生成が認められた。 反応終了液500mlから実施例３と同様の操作に
てＬ−トリプトフアンを精製回収したところ、結
晶として13.6ｇのＬ−トリプトフアンを得た。
第１図は本発明のプラスミドpMTY−２の制
限酵素地図である。
限酵素地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ トリプトフアンオペロンに由来するトリプト
フアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、
ColE1系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を
含むDNA断片を有することを特徴とするエシエ
リヒア・コリの細胞内で自律増殖可能なプラスミ
ド。 ２ トリプトフアンオペロンに由来するトリプト
フアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含む
DNA断片と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖
制御分配系を司る遺伝子を含むDNA断片と、
ColE1系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を
含むDNA断片を有するエシエリヒア・コリの細
胞内で自律増殖可能なプラスミドで形質転換され
たエシエリヒア・コリ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59225906A JPS61104789A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 新規プラスミド |
| DE8585113730T DE3585357D1 (de) | 1984-10-29 | 1985-10-29 | Plasmide. |
| EP85113730A EP0180192B1 (en) | 1984-10-29 | 1985-10-29 | Novel plasmids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59225906A JPS61104789A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 新規プラスミド |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5124781A Division JPH0673463B2 (ja) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104789A JPS61104789A (ja) | 1986-05-23 |
| JPH0579311B2 true JPH0579311B2 (ja) | 1993-11-02 |
Family
ID=16836738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59225906A Granted JPS61104789A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61104789A (ja) |
-
1984
- 1984-10-29 JP JP59225906A patent/JPS61104789A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61104789A (ja) | 1986-05-23 |
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