JPH0527391B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フエニルアラニンの製造方法に関
し、詳しくは酵素を水の存在下にＮ−アシルフエ
ニルアラニンアルキルエステルのＬ体に作用させ
ることによつてＬ−フエニルアラニンを製造する
方法に関する。 本発明の方法によつて得られるＬ−フエニルア
ラニンは必須アミノ酸の１種であり、栄養上また
は医薬用途上重要な物質である。 〔従来の技術〕 従来、Ｌ−フエニルアラニン前駆体に酵素を作
用させることによつてＬ−フエニルアラニンを製
造する種々の方法が知られている。例えば、Ｌ−
フエニルアラニン前駆体に加水分解酵素を作用さ
せることによつてＬ−フエニルアラニンを製造す
る方法として、Ｎ−アシル−DL−フエニルアラ
ニンにアミノアシラーゼを作用させることにより
Ｎ−アシル−Ｌ−フエニルアラニンのみを選択的
に加水分解してＬ−フエニルアラニンに変換する
方法〔Bull.Agr.Chem.Soc.Japan，21，300
（1957）参照〕、DL−フエニルアラニンアルキル
エステルにエステラーゼを作用させることにより
Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステルのみを選
択的に加水分解してＬ−フエニルアラニンに変換
する方法〔J.Biol.Chem.、203、755（1953）参
照〕、５−ベンジルヒダントインをヒダントイナ
ーゼの作用により加水分解してＬ−フエニルアラ
ニンに変化する方法（特公昭54−2274号公報参
照）などが知られている。また別法として、Ｎ−
アシル−DL−フエニルアラニンメチルエステル
にセリンプロテイナーゼまたはエステラーゼを作
用させることによりＮ−アシル−Ｌ−フエニルア
ラニンメチルエステルのみを選択的に加水分解し
てＮ−アシル−Ｌ−フエニルアラニンに変換し、
これを未反応のＮ−アシル−Ｄ−フエニルアラニ
ンメチルエステルから分離したのち塩酸を用いて
加水分解することによつてＬ−フエニルアラニン
に変換する方法も知られている〔特公昭57−
35956号公報およびSynthesis1041（1983）参照〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 アミノアシラーゼ、エステラーゼなどの加水分
解酵素には中性付近の条件下において高い加水分
解活性を発揮するものが多い。かかる加水分解酵
素をＮ−アシル−DL−フエニルアラニンまたは
DL−フエニルアラニンアルキルエステルのよう
な酸性または塩基性のＬ−フエニルアラニン前駆
体に作用させる場合には、予め原料溶液に塩基ま
たは酸を添加することによつて原料溶液のPHを中
性付近に調整することが必要である。これらの反
応によつて得られる反応混合液には、目的とする
Ｌ−フエニルアラニン以外に未反応のＮ−アシル
−Ｄ−フエニルアラニンまたはＤ−フエニルアラ
ニンアルキルエステルが上記塩基または酸と塩を
形成して存在している。通常、Ｌ−フエニルアラ
ニンはかかる反応混合液から晶析分離されるが、
前述の塩がＬ−フエニルアラニンと共に析出し易
いため、Ｌ−フエニルアラニンを充分に高い純度
で得るためには煩雑な分離工程が必要である。ま
た上記のＮ−アシル−DL−フエニルアラニンを
原料とするＬ−フエニルアラニンの製造方法にお
いては、反応系中においてＮ−アシル−DL−フ
エニルアラニンと塩基との塩が酵素の活性を阻害
する傾向にあり、酵素活性の低下が著しい。さら
に、DL−フエニルアラニンアルキルエステルを
原料とするＬ−フエニルアラニンの製造方法にお
いては、原料としてDL−フエニルアラニンの低
級アルキルエステルを使用することがＬ−フエニ
ルアラニンの生成が速やかとなり好ましいが、こ
の原料はエステラーゼの作用によらない加水分解
反応によりDL−フエニルアラニンに変換され易
いため、かかる原料を使用する場合には得られる
Ｌ−フエニルアラニンの光学純度を充分高くする
ことが難しい。 ５−ベンジルヒダントンにヒダントイナーゼを
作用させることによつてＬ−フエニルアラニンを
製造する方法には、原料である５−ベンジルヒダ
ントインが高価であるばかりでなく、用いられる
ヒダンタイナーゼの活性が充分ではないという欠
点がある。 また、Ｎ−アシル−DL−フエニルアラニンメ
チルエステルにセリンプロテイナーゼまたはエス
テラーゼを使用させ、生成したＮ−アシル−Ｌ−
フエニルアラニンを未反応のＮ−アシル−Ｄ−フ
エニルアラニンメチルエステルから分離した後、
塩酸を用いて加水分解することによつてＬ−フエ
ニルアラニンを製造する方法は、Ｎ−アシルフエ
ニルアラニンメチルエステルにおけるエステル残
基の加水分解と酸アミド残基の加水分解とを独立
に実施するため工程が煩雑になるという欠点を有
する。 しかして、本発明の目的は、安価なＬ−フエニ
ルアラニン前駆体を原料として用い、これに加水
分解酵素を作用させることによつて高純度のＬ−
フエニルアラニンを簡便に取得しうる工業的に有
利なＬ−フエニルアラニンの製造法を提供するこ
とにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、(1)アスペルギ
ルス（Aspergillus）属に属する糸状菌に由来す
るアミノアシラーゼを、水および水と実質的に混
和しない有機溶媒の存在下に一般式（） （式中、R¹は低級アルキル基を表わし、R²は水
素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子を表
わす。） で示されるＮ−アシルフエニルアラニンアルキル
エステル（以下、これをAPAEと略称する）のＬ
体に作用させることによりＬ−フエニルアラニン
を生成させ、得られる反応混合液からＬ−フエニ
ルアラニンの結晶を分離し、酵素を含む水層を、
酵素をAPAEのＬ体に作用させる工程に循環使用
することを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製
造方法、並びに(2)アスペルギルス（Aspergillus）
属に属する糸状菌に由来するアミノアシラーゼ
を、水の存在下にAPAEのＬ体に作用させること
によりＬ−フエニルアラニンを生成させ、得られ
る反応混合液に実質的に混和しない有機溶媒を接
触させることによつて、反応混合液から残存する
APAEのＬ体もしくはＤ体またはこれらの混合物
を有機層に抽出分離することを特徴とするＬ−フ
エニルアラニンの製造方法を提供することによつ
て達成される。 前記一般式（）におけるR¹およびR²を詳し
く説明する。R¹は低級アルキル基を表わし、具
体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、
イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、
sec−ブチル基などの直鎖状または分岐状の低級
アルキル基である。R²は水素原子；メチル基、
エチル基などの低級アルキル基；または塩素原
子、真素原子などのハロゲン原子を表わす。
APAEとしては具体的にはＮ−アセチルフエニル
アラニンメチルエステル、Ｎ−アセチルフエニル
アラニンエチルエステル、Ｎ−アセチルフエニル
アラニンイソプロピルエステル、Ｎ−アセチルフ
エニルアラニンｎ−ブチルエステラなどのＮ−ア
セチルフエニルアラニンアルキルエステル；Ｎ−
プロピオニルフエニルアラニンメチルエステル、
Ｎ−プロピオニルフエニルアラニンエチルエステ
ル、Ｎ−プロピオニルフエニルアラニンｎ−ブチ
ルエステルなどのＮ−プロピオニルフエニルアラ
ニンアルキルエステル；Ｎ−（ｎ−ブチリル）フ
エニルアラニンメチルエステル、Ｎ−（ｎ−ブチ
リル）フエニルアラニンエチルエステルなどのＮ
−（ｎ−ブチリル）フエニルアラニンアルキルエ
ステル；Ｎ−クロロアセチルフニルアラニンメチ
ルエステル、Ｎ−クロロアセチルフエニルアラニ
ンエチルエステル、Ｎ−クロロアセチルフエニル
アラニンイソプロピルエステル、Ｎ−クロロアセ
チルフエニルアラニンｎ−ブチルエステルなどの
Ｎ−クロロアセチルフエニルアラニンアルキルエ
ステル；Ｎ−プロモアセチルフエニルアラニンメ
チルエステル、Ｎ−プロモアセチルフエニルアラ
ニンエチルエステルなどのＮ−プロモアセチルフ
エニルアラニンアルキルエステルなどが挙げられ
る。これらのAPAEのＬ体を本発明の方法におい
て原料として用いる。前記一般式（）において
R¹が炭素数５以上のアルキル基であるかまたは
R²が水素原子、低級アルキル基またはハロゲン
原子のいずれでもないＮ−アシルフエニルアラニ
ンアルキルエステルのＬ体を原料として用いる場
合には、酵素の作用による加水分解速度が不充分
となり、好ましい反応成績を得ることができな
い。なお、本発明の方法において原料として
APAEのＬ体を単独で用いてもよいし、これを
APAEのＤ体との混合物で用いてもよいが、合成
手段によつて工業的に容易に得られるAPAEのラ
セミ体に用いるのが簡便である。 本発明の方法において用いる酵素は、−（中略）
−または東京化成株式会社製アミノアシラーゼ）
などが例示される。」を「本発明の方法において
用いるアスペルギルス属に属する糸状菌に由来す
るアミノアシラーゼは、APAEのＬ体を選択的に
加水分解してＬ−フエニルアラニンを生成する能
力を有しており、その加水分解活性は優れてい
る。上記のアミノアシラーゼは、工業生産されて
おり、容易に入手することができる。かかる酵素
としては、天野製薬株式会社製アシラーゼ「アマ
ノ」または東京化成株式会社製アミノアシラーゼ
などが例示される。本発明の方法におけるＬ−フ
エニルアラニン生成反応は水層のみからなる均一
系または水層と有機層とからなる不均一系の反応
系中で行われる。酵素は通常、水層中における濃
度が約0.01〜３重量％の範囲内になる量で使用さ
れる。かかる酵素はそのまま反応系中に添加して
使用することもできるが、酵素を共有結合法、架
橋法、包接法など公知の固定化方法により担体に
固体化して得られる固定化酵素を使用することも
できる。かかる担体の具体例としては、ジエチル
アミノエチルセフアデツクス、カラギーナン、ポ
リアクリルアミド、ゼラチン、フイブロイン、ア
ルギン酸塩、ジエチルアミノエチルセルロース、
多孔性ガラス、活性アルミナ、ヒドロキシアパタ
イト、イオン交換樹脂、ポリエチレングリコール
またはポリプロピレングリコールのジアクリレー
トなどをプレポリマーとする光硬化性樹脂などを
挙げることができる。 本発明の方法における反応系に存在させる水の
量は特に限定されないが、APAEの濃度が飽和溶
解度以下になるような量で用いることも、また飽
和溶解度を越えるような量で用いることもでき
る。後者の場合には、反応系はAPAEの飽和水溶
液と未溶解のAPAEとが不均一な液−固二相を形
成するが、本発明の方法を実施するうえで支障と
なることはない。なお、APAEの水に対する飽和
溶解度は、APAEがＮ−アセチルフエニルアラニ
ンメチルエステルである場合、23℃において1.26
ｇ／100ml水である。 本発明の方法における反応系に水以外に有機溶
媒を共存させることもできる。水に混和性の有機
溶媒を共存させる場合には、水層におけるAPAE
の溶解性を向上させることができる。従つて、水
混和性の有機溶媒を使用する場合には、酵素を含
む水層にAPAEをより高い濃度で溶存させること
ができ、これによつてＬ−フエニルアラニンをよ
り効率的に生成させることが可能となる。水混和
性の有機溶媒としてはメタノール、エタノール、
プロパノールなどの低級アルコール；アセトン、
メチルエチルケトンのような炭素数４以下のケト
ン；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状
エーテル；エチレングリコール、ジエチレングリ
コール、エチレングリコールジメチルエーテル、
ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエ
チレングリコールモノブチルエーテルなどのアル
キレングリコールまたはそのモノエーテルもしく
はジエーテルなどが例示される。また、反応系に
水に実質的に混和しない有機溶媒を共存させる場
合には、反応系は水層と有機層の二層系を形成す
る。この反応系において原料であるAPAEは主と
して有機層に分配されることから、用いる有機溶
媒の種類および使用量を選択することにより、酵
素の存在する水層中でのAPAEの濃度をAPAEが
充分に酵素と接触しうるとともにAPAEが酵素に
及ぼす活性阻害効果を制御しうるような好適な一
定の濃度に維持することができる。かかる水非混
和性の有機溶媒を使用する場合には、Ｌ−フエニ
ルアラニンを速やかに生成させることができるの
みならず、酵素の活性を長期にわたつて安定に維
持することができる。かかる水非混和性の有機溶
媒としては、塩化メチレン、四塩化炭素、二塩化
エチレン、クロロベンゼンなどのハロゲン化炭化
水素；ベンゾニトリル、プロピオニトリルなどの
炭素数３以上のニトリル；酢酸エチル、酢酸ブチ
ル、プロピオン酸メチル、アジピン酸ジエチルな
どの炭素数４以上のカルボン酸エステル；ジエチ
ルケトン、メチルイソブチルケトン、３−ヘプタ
ノン、アセトフエノンなどの炭素数５以上のケト
ン；エチルプロピルエーテル、アニソール、ジブ
チルエーテル、フエネトール、ジフエニルエーテ
ルなどの炭素数５以上のエーテル；ベンゼン、ト
ルエン、キシレンなどの炭素数６以上の芳香族炭
化水素；ｎ−ヘキサノール、ｎ−オクタノールな
どの炭素数６以上のアルコール；リン酸トリｎ−
ブチル、リン酸トリｎ−オクチルなどの炭素数８
以上のリン酸トリエステル；Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、ジメチルベンジルアミンなどの窒素原子
に結合する置換基のうち少なくとも１つが芳香族
炭化水素基である炭素数８以上の第３級アミンな
どが例示される。これらのうち特にＬ−フエニル
アラニンの生成が速やかである点において、四塩
化炭素、アジピン酸ジエチル、メチルイソブチル
ケトン、３−ヘプタノン、アニソール、フエネト
ール、ｎ−オクタノール、リン酸トリｎ−ブチ
ル、リン酸トリｎ−オクチル、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アニリンなどを用いるのが好ましい。かかる水非
混和性の有機溶媒を使用する場合、反応系中の有
機層と水層の容積比は特に限定されないが、通常
約１／10〜３／１の範囲内であり、原料である
APAEの有機溶媒に対する溶解度にもよるが約
１／10〜１／１の範囲内であることが好ましい。 本発明の方法におけるＬ−フエニルアラニンの
生成反応は使用する酵素が充分に高い加水分解活
性を発揮しうるPH条件下において実施させること
が望ましい。反応系中の水層のPHは、使用する酵
素の種類によつても異なるが、通常約４〜10の範
囲内、好ましくは５〜９の範囲内、特に好ましく
は６〜８の範囲内である。水層のPHを調整するた
めに、酵素活性に悪い影響を及ぼさない範囲内に
おいて、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；ギ
酸、酢酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸な
どの有機酸；水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化バリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリ
ウム、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩；
アンモニア；トリエチルアミンなどの有機アミ
ン；またはリン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、
McIlvaine氏緩衝液などの緩衝液を反応系に添加
することができる。本発明の方法においては、
APAEのＬ体の加水分解により副生する酢酸など
のカルボン酸が反応の進行に伴つて反応系中に蓄
積するため、反応系における水層のPHが低下する
傾向がある。前記の緩衝液は、かかる反応中にお
ける水層のPH低下を抑制しうるため特に好まし
い。また、Ｌ−フエニルアラニンの生成反応は使
用する酵素が活性を発揮しうるに最適な温度を選
んで実施することが好ましいが、通常約20〜60℃
の温度範囲内、好ましくは35〜40℃の温度範囲内
において行われる。なお、反応系に少量の金属イ
オンを存在させることにより酵素の活性が向上す
る場合がある。特にコバルトイオンを反応系中に
存在する溶液に対して約10^-4〜10^-2モル／の範
囲内で存在させることが好ましい。 本発明の方法においては、Ｌ−フエニルアラニ
ンの生成反応を撹拌式、振とう式などの混合方法
によるバツチ方式で行うことができるが、反応の
進行とともに原料であるAPAEのＬ体、水、酵素
などを反応系に添加しかつ生成したＬ−フエニル
アラニンを含む反応混合液の全部または一部を反
応系から抜取る方法による連続方式で行うことも
できる。反応系に水非混和性の有機溶媒を共存さ
せない場合には、APAEの１体を含む水溶液を固
定化酵素を充填したカラムに流通させることによ
つて連続的に反応を行うこともできる。 得られた反応混合液からのＬ−フエニルアラニ
ンの分離に際しては、例えばＬ−フエニルアラニ
ンの水および有機溶媒の両者に対する溶解性の低
さを利用することによつてＬ−フエニルアラニン
を容易に晶析分離することができる。また、反応
混合液から未反応のAPAEのＬ体またはこれと
APAEのＤ体との混合物を回収することもでき
る。反応混合液からのAPAEの回収は、水と水非
混和性の有機溶媒とから二層系におけるAPAEの
有機層への高い分配性を利用することによつて行
われる。すなわち、水非混和性の有機溶媒の不存
在下にＬ−フエニルアラニンの生成反応を実施す
る場合、必要に応じて、得られる反応混合液から
APAEのＬ体の加水分解によつて副生する低級ア
ルコールなどを蒸留法などによつて除去したの
ち、蒸留残留液を水非混和性の有機溶媒と接触さ
せることによりAPAEを有機層に抽出分離するこ
とができる。また、水非混和性の有機溶媒の存在
下にＬ−フエニルアラニンの生成反応を実施する
場合、得られる反応混合液はすでにAPAEを含む
有機層とＬ−フエニルアラニンおよび酵素を含む
水層との不均一層を形成しているため、分液する
ことによりこれらを容易に分離することができ
る。上述の反応混合液からのＬ−フエニルアラニ
ンの分離およびAPAEの分離の順序は限定される
ことなく、どちらの分類操作を先に行つてもよ
い。Ｌ−フエニルアラニンを晶析分離したのちの
水層中には活性を有する酵素および低濃度のＬ−
フエニルアラニンが存在している。このため、か
かる酵素を含む水層を反応媒体として反応系に循
環し再使用することが有利である。特に水および
水非混和性の有機溶媒の存在下に反応を行う場合
には、前述したように反応中において酵素は活性
低下を受けにくいため、上記水層の循環使用を行
うことが実用上好ましい。 一方、APAEは前述のようにして有機層中に回
収されるが、Ｌ−フエニルアラニンの生成反応が
APAEのＬ体を消費する反応であるため、APAE
中のＬ体のＤ体に対する比率は原料として使用し
たAPAEにおけるその比率に比べて低い。回収さ
れたAPAE中に含まれる未反応のＬ体はそのまま
原料として反応系に循環し再使用することができ
るが、APAE中のＬ体の比率が50％よりも低い場
合には、該APAEを塩基の存在下における処理な
どの公知のラセミ化反応に付することによつてラ
セミ体に変換したのち、これを原料として使用す
ることが有利である。回収されたAPAEをそのま
ままたはラセミ化したのち原料として循環再使用
するに先立ち、該APAEを有機層から分離するこ
とは必ずしも必要ではない。すなわち、水および
水非混和性の有機溶媒の存在下に反応を行う場合
には、反応混合液から分離したAPAEを含む有機
層をそのまま反応に循環することが可能である。 このようにして分離されたＬ−フエニルアラニ
ンは極めて高い光学純度を有する。 〔実施例〕 以下、実施例および参考例により本発明を説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例 １ McIlvaine氏緩衝液（PH７）100mlと1.5ｍＭ塩
化コバルト水溶液50mlの混合液Ｎ−アセチル−
DL−フエニルアラニンメチルエステル2.0ｇを溶
解した。この溶液を容量0.5の反応器に移し、
アスペルギルス属に属する糸状菌起源のアミノア
シラーゼ（天野製薬株式会社製アシラーゼ「アマ
ノ」）0.25ｇを投入し、37℃にて振とうしつつ12
時間反応を行つた。反応終了後、液体クロマトグ
ラフイーにより反応混合液（PHは6.15であつた）
の分析を行つた結果、Ｎ−アセチルフエニルアラ
ニンメチルエステルの残存量は1.0ｇ（仕込みＮ
−アセチル−DL−フエニルアラニンメチルエス
テルに対して50モル％）であり、Ｌ−フエニルア
ラニンの生成量は0.73ｇ（消費されたＮ−アセチ
ル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルに対し
て98モル％）であつた。Ｎ−アセチルフエニルア
ラニンの副生は痕跡量であつた。反応混合液を加
熱することによつてアミノアシラーゼを凝縮さ
せ、アミノアシラーゼを遠心分離した。得られた
溶液を酢酸ブチル50mlずつを用いて３回抽出する
ことにより、Ｎ−アセチルフエニルアラニンメチ
ルエステルを定量的に回収した。抽出残液（水
層）を減圧下に濃縮して15mlの水溶液とし、これ
に晶析操作を行うことによつて0.45ｇのＬ−フエ
ニルアラニンを結晶として取得した。得られたＬ
−フエニルアラニンの光学純度は99％であつた。 参考例 McIlvaine氏緩衝液（PH７）100ml、1.5ｍＭ塩
化コバルト水溶液50mlおよびメタノール50mlを混
合し、その溶液にＮ−アセチル−DL−フエニル
アラニンメチルエステル４ｇを溶解した以外は実
施例１と同一の条件下にＮ−アセチル−DL−フ
エニルアラニンメチルエステルの酵素加水分解反
応を実施した。反応終了時の反応混合液のPHは
6.70であつた。液体クロマトグラフイーを用いた
分析によれば、Ｎ−アセチルフエニルアラニンメ
チルエステルの残存量は2.20ｇ（仕込みＮ−アセ
チル−DL−フエニルアラニンメチルエステルに
対して55モル％）であり、Ｌ−フエニルアラニン
の生成量は1.30ｇであつた。さらに反応混合液に
晶析操作を施してＬ−フエニルアラニン結晶を得
た。得られたＬ−フエニルアラニンの光学純度は
99％であつた。 参考例 ２ アスペルギルス属に属する糸状菌起源のアミノ
アシラーゼ（東京化成株式会社製アミノアシラー
ゼ）0.25ｇをリン酸緩衝液（PH7.0）５mlに溶解
後、50重量％アクリルアミド水溶液４ml、４重量
％Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド水溶液
４ml、５重量％ジメチルアミノプロピオニトリル
水溶液2.5mlおよび2.5重量％ペルオキソ硫酸カリ
ウム水溶液2.5mlを順次添加し、撹拌混合したの
ち約１時間静置し寒天状ゲルを得た。このゲルを
小片（１辺の長さが約３mmの立方体）に切断し、
McIlvaine氏緩衝液（PH7.0）にて充分に洗浄し
た。アミノアシラーゼとして上記のようにして得
られたポリアクリルアミド固定化アミノアシラー
ゼを用いた以外は実施例１と同一の条件下に反応
を実施した。反応終了時における反応混合液のPH
は6.20であつた。液体クロマトグラフイーを用い
た分析によれば、Ｎ−アセチルフエニルアラニン
メチルエステルの残存量は1.0ｇ（仕込みＮ−ア
セチル−DL−フエニルアラニンメチルエステル
に対して50モル％）であり、Ｌ−フエニルアラニ
ンの生成量は0.72ｇ（消費されたＮ−アセチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルに対して96
モル％）であつた。 参考例 ３ McIlvaine氏緩衝液（PH８）10mlおよび1.5ｍＭ
塩化コバルト水溶液５mlの混合液に実施例１で用
いたものと同じアミノアシラーゼを25mg溶解し、
得られた水溶液を100mlの反応器に移した。Ｎ−
アセチル−DL−フエニルアラニンメチルエステ
ル1.0ｇを３−ヘプタノン５mlに溶解して得られ
た溶液を反応器中の水溶液に添加した。反応器中
の二層を形成した溶液を37℃にて振とうすること
によつて12時間反応させた。反応終了時における
水層のPHは4.95であつた。水層および３−ヘプタ
ノン層を液体クロマトグラフイーおよびガスクロ
マトグラフイーを用いて分析した結果、水層中に
はＬ−フエニルアラニン0.32ｇ（仕込みＮ−アセ
チル−DL−フエニルアラニンメチルエステルに
対し42モル％）、Ｎ−アセチルフエニルアラニン
0.037ｇ（仕込みＮ−アセチル−DL−フエニルア
ラニンメチルエステルに対して4.0％）、メタノー
ル0.055ｇ、酢酸0.050ｇおよびＮ−アセチルフエ
ニルアラニンメチルエステル0.09ｇが存在し、３
−ヘプタノン層中にはＮ−アセチルフエニルアラ
ニンメチルエステル0.44ｇ、メタノール0.013ｇ
および痕跡量のＬ−フエニルアラニン、Ｎ−アセ
チルフエニルアラニン、酢酸が存在していること
が判明した。 参考例 ４〜18 参考例３においてＮ−アセチル−DL−フエニ
ルアラニンメチルエステル1.0ｇの代りに第１表
に示すAPAEのラセミ体1.0ｇを用い、かつ３−
ヘプタンノンの代りに第１表に示す水非混和性の
有機溶媒５mlを用いる以外は同様にして反応を行
い、得られた反応混合物いにおける水層のPH測定
および水層の液体クロマトグラフイー測定を行つ
た。その結果を第１表に示す。なお、表中、R¹
およびR²は一般式（）におけるそれらに相当
する。

〔発明の効果〕

本発明によれば上記の実施例から明らかなとお
りAPAEのＬ体から光学純度の高いＬ−フエニル
アラニンを高収率で製造することができる。また
本発明によれば、Ｌ−フエニルアラニンを高い光
学純度を有する結晶として反応混合液から析出さ
せることができるため、生成したＬ−フエニルア
ラニンを煩雑な、しかも相当量のユーテイリテイ
消費を伴う分離、精製操作を要することなく極め
て容易に取得することができる。また本発明によ
れば、反応系中における酵素の活性を長期間にわ
たつて維持することができ、反応混合液から回収
した酵素を循環再使用することが可能である。さ
らに本発明によれば、反応混合液から残存する
APAEを容易に回収でき、原料として再使用する
ことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルス（Aspergillus）属に属する
   糸状菌に由来するアミノアシラーゼを、水および
   水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下に一般
   式 （式中、R¹は低級アルキル基を表わし、R²は水
   素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子を表
   わす。） で示されるＮ−アシルフエニルアラニンアルキル
   エステルのＬ体に作用させることによりＬ−フエ
   ニルアラニンを生成させ、得られる反応混合液か
   らＬ−フエニルアラニンの結晶を分離し、酵素を
   含む水層を、酵素をＮ−アシルフエニルアラニン
   アルキルエステルのＬ体に作用させる工程に循環
   使用することを特徴とするＬ−フエニルアラニン
   の製造方法。 ２ アスペルギルス（Aspergillus）属に属する
   糸状菌に由来するアミノアシラーゼを、水の存在
   下に一般式 （式中、R¹は低級アルキル基を表わし、R²は水
   素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子を表
   わす。） で示されるＮ−アシルフエニルアラニンアルキル
   エステルのＬ体に作用させることによりＬ−フエ
   ニルアラニンを生成させ、得られる反応混合液に
   水と実質的に混和しない有機溶媒を接触させるこ
   とによつて、反応混合液から残存するＮ−アシル
   フエニルアラニンアルキルエステルのＬ体もしく
   はＤ体またはこれらの混合物を有機層に抽出分離
   することを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製
   造方法。 ３ 酵素を作用させるＮ−アシルフエニルアラニ
   ンアルキルエステルのＬ体としてＮ−アシルフエ
   ニルアラニンアルキルエステルのＬ体とＮ−アシ
   ルフエニルアラニンアルキルエステルのＤ体との
   混合物を用いる特許請求の範囲第１項または第２
   項記載の製造方法。 ４ 混合物がＮ−アシルフエニルアラニンアルキ
   ルエステルのラセミ体である特許請求の範囲第３
   項記載の製造方法。 ５ 有機溶媒がハロゲン化炭化水素、炭素数３以
   上のニトリル、炭素数４以上のカルボン酸エステ
   ル、炭素数５以上のケトン、炭素数５以上のエー
   テル、炭素数６以上の芳香族炭化水素、炭素数６
   以上のアルコール、炭素数８以上のリン酸トリエ
   ステルおよび窒素原子に結合する置換基のうち少
   なくとも１つが芳香族炭化水素基である炭素数８
   以上の第三級アミンからなる群より選ばれる少な
   くとも一種の有機溶媒である特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の製造方法。