JPS61231998A - Ｌ−フエニルアラニンを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニンの製造方法に関　　　　
。

し、詳しくは酵素を水の存在下にＮ−７シルフエニルア
ラニンアルキルエステルのＬ体に作用さぞることによっ
てＬ−フェニルアラニンを製造する方法に関する。

本発明の方法によって得られるＬ−フェニルアラニンは
必須アミノ酸の】ｆｉでリシ、栄養上または医薬用途上
ｉｓな物質である。

〔従来の技術〕

従来、Ｌ−フェニルアラニン前駆体に酵素を作用させる
ことによってＬ−フェニルアラニンを製造する種々の方
法が知られている。例えば、Ｌ−フェニルアラニン前駆
体に加水分解酵素を作用させることによってＬ−フェニ
ルアラニンを製造する方法として、Ｎ−アシル−ＤＬ−
フェニル７−ｙ二ンにアミノアシラーゼを作用させるこ
とによシＮ−アシルーＬ−フェニルアラニンのミｔ−選
択的に加水分解してＬ−フェニルアラニンに変換する方
法（Ｂｕｌｌ、　Ａｇｒ、　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　
Ｊａｐａｎ、　２１　、３００（１９５７）９Ｍ）、Ｄ
Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルにエステラーゼ
を作用させることによ、９Ｌ−フェニルアラニンアルキ
ルエステルのミラ選択的に加水分解して 一＝、Ｌ−フ ェニルアラニンに変換する方法（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、ｔ２０３．７５５（３９５３）参照〕、５−
ベンジルヒダントインをヒダントイナーゼの作用によシ
加水分解してＬ−フェニルアラニンに変換する方法（％
公昭５４−２２７４号公報参照）などが知られているＣ
また別法として、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルアラニン
メチルエステルにセリンプロテイナーセまたはエステラ
ーゼを作用させることによりＮ−アシル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルのみを選択的に加水分解してＮ
−アシル−Ｌ−７二二ルアラニンに変換し、これを未反
応のＮ−アシル−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステル
カラ分離したのち塩酸を用いて加水分解することによっ
てＬ−フェニルアラニンＫｉ換する方法も知られている
〔特公昭５７−３５９５６号公報および５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ３０４］（１９８３）参照〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕

アミノアシラーゼ、エステラーゼなどの加水分解酵素に
は中性付近の条件下において高い加水分解活性を発揮す
るものが多い。かかる加水分解酵素をＮ−アシル−ＤＬ
−フェニルアラニンマ、たはＤＬ−フェニルアラニンア
ルキルエステルのヨウな酸性または塩基性のＬ−フェニ
ルアラニン前駆体に作用させる場合には、予め原料溶液
に塩基または酸を添加することによって原料溶液の田を
中性付近に調整することが必要でおる。これらの反応に
よって得られる反応混合液には、目的とするＬ−フェニ
ルアラニン以外に未反応のＮ−アシル−Ｄ−フェニルア
ラニンマタはＤ−フェニルアラニンアルキルエステルが
上記塩基または酸と塩を形成して存在している。通常、
Ｌ−フェニルアラニンはかかる反応混合液から晶析分離
されるが、前述の塩がＬ−フェニルアラニンと共に析出
し易いため、Ｌ−フェニルアラニンを充分に高い純度で
得るためには煩雑な分離工程が必要である。まり上記の
Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルアラニンを原料とするＬ−
フェニルアラニンの製造方法においては、反応系中にお
いてＮ−アシル−ＤＬ−フェニルアラニンと塩基との塩
が酵素の活性を阻害する傾向にめシ、酵素活性の低下が
著しい。さらに、ＤＬ−フェニルアラニンアルキルエス
テルを原料とするＬ−フェニルアラニンの製造方法−お
いては、原料としてＤＬ−フェニルアラニンの低級アル
キルエステルを使用することがＬ−７二二ルアラニンの
生成が速やかとなシ好ましいが、この原料はエステラー
ゼの作用によらない加水分解反応によＪＤＬ−フェニル
アラニンに変換され易いため、かかる原料を使用する場
合には得られるＬ−フェニルアラニンの光学純度を充分
高くすることが難しい。

５−ベンジルヒダントインにヒダントイナーゼを作用さ
せることによってＬ−フェニルアラニンを製造する方法
には、原料である５−ベンジルヒダントインが高価であ
るばかシでなく、用いられるヒダントイナーゼの活性が
充分ではないという欠点がある。

また、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルアラニンメチルエス
テルにセリンプロテイナーゼまたはエステラーゼを作用
させ、生成したＮ−アシル−Ｌ−フェニルアラニンを未
反応のＮ−アシル−Ｄ−フェニルアラニンメチルエステ
ルから分離した後、塩酸を用いて加水分解することによ
ってＬ−フェニルアラニンを製造する方法は、Ｎ−アシ
ルフェニルアラニンメチルエステルにおケルエステル残
基の加水分解と酸アミド残基の加水分解とを独立に実施
するため工程が煩雑になるという欠点を有する。

しかして、本発明の目的は、安価なし一フェニルアラニ
ン前駆体を原料として用い、これに加水分解酵素を作用
させることによって高純度のＬ−フェニルアラニンを簡
便に取得しうる工莱的に有利なＬ−フェニルアラニンの
製造法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば、上記の目的は、一般式（式中　Ｒ１は
低級アルキル基を表わし　Ｒ２は水素原子、低級アルキ
ル基または）・ロゲン原子を表わす。） で示されるＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステ
ル（以下、これ全ＡＰＡＥと称する）のＬ体を加水分解
してＬ−フェニルアラニンを生成する能力を有する酵素
を水の存在下に該ＡＰＡＥ。

Ｌ体に作用させることによｐＬ−フェニルアラニンを生
成させることを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造
方法を提供することによって達成される。

前記一般式（１）におけるＲ１およびＲ２を詳しく説明
する。Ｒ１は低級アルキル基を表わし、具体的にはメチ
ル基、エチル基、ｎ−プロピル基、インブチル基、ｎ−
ブチル基、インブチル基、５ｅｃ−ブチル基などの直鎖
状Ｉたは分岐状の低級アルキル基である。Ｒ２は水素原
子；メチル基、エチル基などの低級アルキル基；または
塩素原子、臭素原子などのハロゲン原子を表わす。ＡＰ
ＡＥとしては具体的にｒｌｉ、Ｎ−アセチルフェニルア
ラニンメチルエステル、Ｎ−アセチルフェニルアラニン
エチルエステル、Ｎ−アセテルフェニルアラニンイソグ
ロビルエステル、Ｎ−アセチルフェニルアラニンｎ−ス
テルエステルナトのＮ−アセチル７エ二ルアラ二ンアル
キルエステル；Ｎ−プロヒ、！−ニルフェニルアラニン
メチルエステル、Ｎ−７”ロピオニルフェニルアラニン
エテルエステル、Ｎ−プロピオニルフェニルアラニンｎ
−ブチルエステルなト（７）Ｎ−／’ロビオニルフェニ
ルアラニンアルキルエステル；Ｎ−（ｎ−ブチリル）フ
ェニルアラニンメチルエステル、Ｎ　（ｎ−ブチリル）
フェニルアラニンエチルエステルナトのＮ−（ｎ−ブチ
リル）フェニルアラニンアルキルエステル；Ｎ−クロロ
アセチルフェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−クロロ
アセチルフェニルアラニンエチルエステル、Ｎ−クロロ
アセチルフェニルアラニンイソグロビルエステル、Ｎ−
クロロアセチルフェニルアラニンｎ−ブチルエステルな
どのＮ−１０ロアセチルフェニルアラニンアルキルエス
テル；Ｎ−プロモアセテルフェニルアラニンメテルエス
テル、Ｎ−ブロモアセチルフェニルアラニンエチルエス
テルナトのＮ−７’ロモアセテルフエニルアラニンアル
キルエステルなどが挙げられる。これらのＡＰＡＥのＬ
体を本発明の方法における原料さして用いる。前記一般
式（１）においてＲ１が炭素数５以上のアルキル基であ
るかまたはＲ２が水素原子、低級アルキル基またはハロ
ゲン原子のいずれでもないＮ−アシルフェニルアラニン
アルキルエステルのＬ体を原料として用いる場合には、
酵素の作用による加水分解速度が不充分となシ、好まし
い反応成績を得ることができない。なお、本発明の方法
において原料としてＡＰＡＥＯＬ体を単独で用いてもよ
いし、これをＡＰＡＥの０体との混合物で用いてもよい
が、合成手段によって工業的に容易に得られるＡＰＡＥ
のラセミ体を用いるのが簡便である。

本発明の方法において用いる酵素は、ＡＰＡＥのＬ体を
選択的に加水分解してＬ−フェニルアラニンを生成する
能力を有するものであれば、その起源、純度などは特に
限定されないが、動植物のホモジネート、微生物菌体、
その破砕物、抽出物などに含まれる酵素でもよい。かか
る酵素は、例えば、アスペルギルス（を匹Ｊ史亜）属、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　）属などに属
する糸状菌；アクｏ％バクター（ＡＣｈｒＯｍＯｂａＣ
ｔｅｒ　）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　）　Ｉｍ、ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕｓ
ｓ　）属、７／ｌ／カリゲネス（Ａｌｃａｌｉ　ｅｎｅ
ｓ　）真などに属する細菌；ストレプトミセス（慰旦匹
皐圧９）属などに属する放線菌などの微生物が生産する
アミノアシラーゼなとの酵素の中から好適なものを選ぶ
ことができる。特にアスペルギルス属に属する糸状菌か
ら取得されるアミノアシラーゼが加水分解活性に優れて
おシ好ましい。

本発明の方法において使用する上記のアミノアシラーゼ
などの酵素は工業生産されているものも多く、容易に入
手することができる。工業生型されている酵素としては
、アスペルギルス属に属する糸状菌起源の７ミノアシラ
ーゼ（天野製薬株式会社製アシラーセ「アマノ」または
東京化成株式会社製アミノアシラーゼ）などが例示され
る。本発明の方法におけるＬ−７二二ルアラニン生成反
応は水層のみからなる均−系または水層と有機層とから
なる不均一系の反応系中で行われる。酵素は通常、水層
中における濃度が約０．０１〜３重量％の範囲内になる
量で使用される。かかる酵素はそのまま反応系中に添加
して使用することもできるが、酵素を共有結合法、架橋
法、包接法など公知の固定化方法によシ担体に固定化し
て得られる固定化酵素を使用することもできる。かかる
担体の具体例としては、ジエチルアミンエチルセファデ
ックス、カラギーナン、ポリアクリルアミド、ゼラチン
、フィブロイン、アルギン酸塩、ジェテルルまたはポリ
プロピレングリコールのジアクリレートなどをグレホリ
マーとする光硬化性樹脂などを挙げることができる。

本発明の方法における反応系に存在させる水のｊｌは特
に限定されないが、ＡＰＡＥの濃度が飽和溶解度以下に
なるような量で用いることも、また飽和溶解度を越える
ような量で用いることもできる。後者の場合には１反応
系はＡＰＡＥの飽和水溶液と未溶解のＡＰＡＥとか不均
一な液−一二相を形成するが、本発明の方法を実施する
うえで支障となることはない。なお、ＡＰＡＥの水に対
する飽和溶解度は、ＡＰＡＥがＮ−アセチル７エユル７
？二ンメチルエステルである場合、２３℃において１．
２６ｙ／】００酎°水である。

本発明の方法における反応系に木取外に有機溶媒を共存
させることもでさる。水に混和性の有機溶媒を共存させ
る場合には、水層におけるＡＰＡＥの溶解性を向上さぜ
ることができる。従って、水混和性の有機溶媒を使用す
る場合には、酵素を含む水層ＫＡＰＡＥをよシ高い濃度
で溶存させることができ、これによってＬ−フェニルア
ラニンをより効率的に生成させることが可能となる。水
混和性の有機溶媒としてはメタノール、エタノール、プ
ロパツールなどの低級アルコール；アセトン、メチルエ
チルケトンのような炭素数４以下のケトン；テトラヒド
ロフラン、ジオキサンなとの環状エーテル；エチレング
リコール、ジエチレンクリコール、エチレングリコール
ジメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエー
テル、トリエテレングリコールモノプテルエーテルなど
のアルキレングリコールまたはそのモノエーテルもしく
はジエーテルなとが例示される。また、反応系に水に実
質的に混和しない有機溶媒を共存させる場合には、反応
系は水層と有機層の二層系を形成する。この反応系にお
いて原料であるＡＰＡＥは主として有機層に分配される
ことから、用いる有機溶媒の種類および使用量を選択す
ることによシ、酵素の存在する水層中でのＡＰＡＥの濃
度をＡＰＡＥか充分に酵素と接触しうるとともにＡＰＡ
Ｅが酵素に及ぼす活性阻害効果を抑制しうるような好適
な一定の濃度に維持することができる。かかる水非混和
性の有機溶媒を使用する場合には、Ｌ−フェニルアラニ
ンを速やかに生成させることができるの与ならず、酵素
の活性を長期にわたって安定に維持することかでさる。

か刀る水非混和性の有機溶媒としては、塩化メチレン、
四塩化炭素、二塩化エチレン、クロロベンゼンなどのハ
ロゲン化炭化水素；ベンゾニトリル１プロピオニトリル
なとの炭素数３以上のニトリル；酢酸エチル、酢酸ブチ
ル、グロビオン酸メチル、アジピン酸ジエチルなどの炭
素数４以上のカルホン酸エステル；ジエチルケトン、メ
チルインブチルケトン、３−ヘプタノン、アセトフェノ
ンなどの炭素数５以上のケトン；エチルグロビルエーテ
ル、アニソール、シフデルエーテル、フエネトール、ジ
フェニルエーテルなどの炭素数５以上のエーテル；ベン
ゼン、トルエン、キシレンナトｏ炭素ｉ６以上の芳香ｉ
炭化水素；ｎ−ヘキサノール、ｎ−一オクタノールなど
の炭素数６以上のアルコール；リン酸トリｎ−ブチル、
リン酸トリｎ−オクチルなどの炭素数８以上のリン酸ト
リエステル；　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、ジメチルベ
ンジルアミンなどの窒素原子に結合する置換基のうち少
なくとも１つが芳香族炭化水素基である炭素数８以上の
第３級アミンなとが例示される０これらのうち特ＫＬ−
フェニルアラニンの生成が速やかである点において、四
塩化炭素、アジピン酸ジエチル、メチルイソブチルケト
ン、３−ヘプタノン、アニソール、フエネトール、ｎ−
オクタツール、リン酸トリｎ−ブチル、リン酸トリｎ−
オクチル、Ｎ、　Ｎ−ジメチルアニリンなどを用いるの
が好ましい。かかる水非混和性の有機溶媒を使用する場
合、反応系中の有機層と水層の容積比は特に限定されな
いが、通常約１／１０〜３／１の範囲内でろシ、原料で
あるＡＰＡＥの有機溶媒に対する溶解度にもよるが約】
／１０〜１／】の範囲内であることが好ましい。

本発明の方法に３けるＬ−フェニルアラニンの生成反応
は使用する酵素が充分に高い加水分解活性を発揮しうる
田条件下において実施させることが望ましい。反応系中
の水層の州は、使用する酵素の種類によっても異なるが
、通常約４〜１０の範囲内、好ましくは５〜９の範囲内
、特に好ましくは６〜８の範囲内である。水層の田を調
整するために、酵素活性に悪い影響を及ぼさない範囲内
において、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸すどの有機酸；
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムな
どのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物ま
たは炭酸塩：アンモニア；トリエチルアミンなとの有機
アミン；またはリン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、Ｍｃｌ
　１ｖａｉｎｅ氏緩衝液などの緩衝液を反応系に添加す
ることができる０本発明の方法においては、ＡＰＡＥＯ
Ｌ体の加水分解によシ副生ずる酢酸などのカルボン酸が
反応の進行に伴って反応系中に蓄積するため、反応系に
おける水増のＦｌ′Ｉが低下する傾向かめる。

前記の緩衝液は、かかる反応中における水層の田低下を
抑制しうるため特に好ましい。また、Ｌ−フェニルアラ
ニンの生成反応は使用する酵素が活性を発揮しうるに最
適な温度を選んで実施することが好ましいが、通常約２
０〜６０℃の温度範囲内、好ましくは３５〜４０℃の温
度範囲内において行われる。なお、反応系に少量の金属
イオンを存在させることによシ酵素の活性が向上する場
合がある。特にコバルトイオンを反応系中に存在する溶
液に対して約１０−４〜１０−２モル／ｌの範凹内で存
在さぜることか好ましい。

本発明の方法においては、Ｌ−フェニルアラニンの生成
反応を攪拌式、振とり式などの混合方法によるパッチ方
式で行うことができるが、反応の進行とともに原料でる
るＡＰＡＥＯＬ体、水、酵素などを反応系に添加しかつ
生成したＬ−７二二ルアラニンを含む反応混合液の全部
または一部を反応系から抜取る方法による連続方式で行
うこともできる。反応系に水非混和性の有機溶媒を共存
させない場合には、ＡＰＡＥのＬ体を含む水溶液を固定
化酵素を充填したカラムに流通させることによって連続
的に反応を行うこともできる。

得られた反応混合液からのＬ−７エニルアラニンの分離
に際しては、例えばＬ−フェニルアラニンの水および有
機溶媒の両者に対する溶解性の低さを利用することによ
ってＬ−７エニルアラニンを容易に晶析分離することが
できる。また、反応混合液から未反応のＡＰＡＥＯＬ体
またはこれとＡＰＡＥＯＤ体との混合物を回収すること
もでさる○反応混合液〃・らのＡＰＡＥの回収は、水と
水非混和性の有機溶媒とからなる二層系におけるＡＰＡ
Ｅの有機層への高い分配性をオリ用することによって行
われる。すなわち、水非混和性の有機溶媒の不存在下に
Ｌ−フェニルアラニンの生成反応を実施する場合、必要
に応じて、得られる反応混合液からＡＰＡＥＯＬ体の加
水分解によって副生ずる低級アルコールなどを蒸留法な
どによって除去したのち、蒸Ｗ残留液を水非混和性の有
機溶媒と接触さぜることによりＡＰＡＥを有機層に抽出
分離することができる。また、水非混和性の有機溶媒の
存在下にＬ−フェニルアラニンの生成反応を実施する場
合、得られる反応混合液はすてにＡＰＡＥを含む有機層
とＬ−フェニルアラニンおよび酵素を含む水層との不均
一層を形成しているため、分液することによシこれらを
容易に分離することができる。上述の反応混合液からの
Ｌ−フェニルアラニンの分離およびＡＰＡＥの分離の順
序は限定されることなく、どちらの分離操作を先に行っ
てもよいＯＬ−フェニルアラニンを晶析分離したのちの
水層中には活性を有する酵素および低盪度のＬ−フェニ
ルアラニンが存在している。

このため、かかる＃素を含む水層を反応媒体として反応
系に循環し再使用することが有利である。

特に水および水非混和性の有機溶媒の存在下に反応を行
う場合には、前述したように反応中において酵素は活性
低下を受けにくいため、上記水層の循環使用を行９こと
が実用上好ましい。

−万、ＡＰＡＥは前述のようにして有機層中に回収され
るが、Ｌ−フェニルアラニンの生成反応がＡＰＡＥＯＬ
体を消費する反応であるため、ＡＰＡＥ中のＬ体の９体
に対下る比率は原料として使用し７ｔＡＰＡＥにおける
その比率に比べて低い。回収されπＡＰＡＥ中に含１ｎ
る未反応のＬ体はそのま１原料として反応系に循環し再
使用することができるが、ＡＰＡＥ中のＬ体の比率が５
０％！、Ｄも低い場合には、該ＡＰＡＥを塩基の存在下
における処理などの公知のラセミ化反応に付することＫ
よってラセミ体に変換したのち、これを原料として使用
することが有利である。回収されたＡＰＡＥをそのｉ！
ままたはラセミ化したのち原料として循環再使用するに
先立ち、該ＡＰＡＥを有機層から分離することは必ずし
も必要ではない。すなわち、水および水非混和性の有機
溶媒の存在下に反応を行う場合には、反応混合液から分
離したＡＰＡＥを含む有機層をそのまま反応に循環する
ことが可能である。

このようにして分離されたＬ−フェニルアラニンは極め
て高い光学純度を有する。

〔実施例〕

以下、実施例によシ本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ Ｍｃ　Ｉ　１ｖａｉｎｅ氏緩衝液（ＰＨ７）　１００ｒ
ｔｘｌ！と１．５ｍＭ塩化コバルト水溶液５０ｘｔｌの
混合液にＮ−アセテルー〇Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステル２、Ｏｆを溶解した。この溶液を容量０．５ｔ
の反応器に移し、アスペルギルス属に属する糸状菌起源
のアミノアシラーゼ（天野製薬株式会社製アシラーゼ「
アマノＪ）ｏ、２ｓｐを投入し、３７℃にて振とうしつ
つ１２時間反応を行った。反応終了後、液体クロマトグ
ラフィーによシ反応混合液（田は６．１５であった）の
分析を行った結果、Ｎ−アセチルフェニルアラニンメチ
ルエステルの残存量は１゜０２（仕込みＮ−アセテルー
ＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルに対して５０モ
ルｑ６）でめ）、Ｌ−フェニルアラニンの生成量は０．
７３ｔ（消費されたＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステルに対して９８モル％）であっりＯＮ−
アセチルフェニルアラニラの副生は痕跡量でおった。反
応混合液を加熱することによってアミノアシラーゼを凝
縮させ、アミノアシラーゼを遠心分離した。得られ九溶
液を酢酸ブチル５０罰ずつを用いて３回抽出することに
よ勺、Ｎ−アセチルフェニルアラニンメチルエステルを
定量的に回収した。抽出残液（水／Ｉ）を減圧下に濃縮
して１５ｍ１の水溶液とし、これに晶析操作を行うこと
によって０．４５　？のＬ−フェニルアラニンを結晶と
して取得した。得られたＬ−フェニルアラニンの光学純
度は９９％であった。

実施例２ Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｆ１７　）　１ｏ　ｏａ
ｔ、　　１．５ｍＭｍ化コバルト水浴液５０１およびメ
タノール５０ｔｎｅを混合し、その溶液にＮ−アセテル
ーＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル４ｔを溶解シ
た以外は実施例１と同一の味件下にＮ−７セテルーＤＬ
−フェニルアラニンメチルエステルノ酵素加水分解反応
を実施した。反応終了時の反応混合液の田は６．７０で
めった。液体クロマトグラフィーを用いた分析によれば
、Ｎ−アセチルフェニルアラニンメチルエステルの残存
量は２．２０ｆ（仕込みＮ−アセチル−〇Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルに対して５５モル％）で６す、
Ｌ−フェニルアラニンの生成量は１．３０ｆでめった。

さらに反応混合液に晶析操作を施してＬ−フェニルアラ
ニン結晶を得た。得られたＬ−フェニルアラニンの光学
純度は９９％であった。

実施例３ アスペルギルス属に属する糸状菌起源のアミノアシラー
ゼ（東京化成株式会社表アミノアシラーゼ）０．２５Ｆ
をリン酸緩衝液（ｐｉ　７．０　）　５　ｔｘｌに溶解
後、５０１ｎ％アクリルアミド水溶液４＊ｌｓ４重ｆ％
Ｎ、Ｎ’−メチレンヒスアクリルアミド水溶液４ｒｘ／
ｊ、５重１ｉ％ジメチルアミノプロビオニトリル水溶液
２．５　ｄおよび２．５．ｉｋ％ベルオキソ硫酸カリク
ム水溶液２．５Ｎを順次添加し、攪拌混合したのち約１
時間静置し寒天状ゲルを得た。このゲルを小片（１辺の
長さが約３餌の立方体）に切断し、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ
氏緩衝液（ＰＨ７，０）にて充分に洗浄した。アミノア
シラーゼとして上記のようにして得られたポリアクリル
アミド固定化アミノアシラーゼを用いた以外は実施例１
と同一の条件下に反応を実施した。反応終了時に嘔ける
反応混合液の州は６．２０であった。液体クロマトグラ
フィーを用いた分析によれば、Ｎ−アセチルフェニルア
ラニンメチルエステルの残存量は１．Ｏｆ（仕込みＮ−
アセテルーＤＬ−フェニルアラニンメナルエステルに対
して５０モル％）で１７、Ｌ−フェニルアラニンの生成
量は０．７２ｔ（消費されたヘーアセテルーＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステルに対して９６モル％）であっ
た。

実施例４ ＭｃＩ　１ｖａｉ　ｎｅ氏緩衝液（ＰＨ８）１０ｄおよ
び１．５ｍＭ塩化コバルト水溶液５１１７の混合液に実
施例１で用いたものと同じアミノアシラーゼを２５１Ｍ
１！解し、得られた水溶液を１ＱＱｄの反応器に移した
。

Ｎ−アセチル−〇Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
１．Ｏ２を３−へブタノン５１に溶解して得られた溶液
を反応器中の水浴液に添加した。反応器中の二層を形成
した溶液を３７℃にて振とりすることによって】２時間
反応させた。反応終了時における水層のＦｌ（は４．９
５でめった。水層および３−ヘプタノン層を液体クロマ
トグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを用いて分
析した結果。

水層中にはＬ−フェニルアラニン０．３２ｆ（仕込みＮ
−アセテルー〇Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルに
対し４２モル％）、Ｎ−アセテル７工ニルアラニン０．
０３７ｆ（仕込与Ｎ−７セテルーＤＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステルに対して４．０％）、メタノール０．
０５５５’、酢酸０．０５（ｌおよびＮ−アセチルフェ
ニルアラニンメチルエステル０．０９　ｆが存在し、３
−ヘプ？ン層中にはＮ−アセテルフェニルアラニンメテ
ルエステル０．４４２、メタノール０．Ｏ］３Ｆおよび
仮跡童のＬ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチルフェニル
アラニン、酢酸が存在していることか判明した。

実施例５〜１９ 実施例４においてＮ−７セチルーＤＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステル１．Ｏｆの代、？に第１表に示すＡＰ
ＡＥのラセミ体１．Ｏｆを用い、かつ３−ヘプタノンの
代シに第１表に示す水非混和性の有機溶媒５ＩＥ／を用
いる以外は同様にして反応を行い、得られた反応混合物
における水層の田測定および水層の液体クロマトグラフ
ィー測定を行った。

その結果を第１表に示す。なお、表中、Ｒ１およびＲ２
は一般式（１）　Ｋ＄−けるそれらに相当する。

第　　　　１　　　　表 】）＃素として実施例３で用いたものと同じアミノアシ
ラーゼ０．２５２を使用した。

実施例２０ 実施例４と同様にしてＮ−アセテルーＤＬ−７二二ルア
ラニンメテルエステルを水増および３−ヘプタノン層か
らなる二層系の灰石系中で反応させたのち、得られた反
応混合液から３−ヘプタノン層を分液によシ除去した。

得られたＬ−７二二ルアラニンおよびアミノアシラーゼ
などを溶解している水層に１規足の水酸化ナトリウム水
溶液を加えて水層の田を８に調節した。この水層にＮ−
アセテルー〇Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル１２
と３−へブタノン５ｔ／と刀・らなる溶液を加え、得ら
れた二層系の混合液を実施例４と同様にして３７℃の温
度で１２時間振とうすることによシ反応を繰シ返した（
繰返し１回め）。反応終了時における水層の…は５．５
０でアシ、水層および３−ヘプｊり層からなる反応混合
液を室温まで冷却したところ過飽和分（０，１１Ｆ）の
Ｌ−７二二ルアラニンが水層側に析出した。Ｌ−フェニ
ルア液によ）除去した。得られた水層を上述の方法と同
様にしてＦ！Ｆ４ｖ！４節［８）訃よびＮ−７セチルー
ＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルの３−へブタノ
ン溶液との混合下における反応に付したのち、析出した
Ｌ−フェニルアラニンの結晶を０．１５ｆＦ別した（繰
返し２回め）０このようにしてｒ液中のアミノアシラー
ゼを含む水層を使用すること罠よって州調節、反応およ
びＬ−フェニルアラニンの分離をさらに繰返した。繰返
し３回め、４回めおよび５回めにおけるＬ−フェニルア
ラニンの取得量は各々０．１６　Ｆ、　０．１３９およ
び０．１２２であった。上述の繰返し１回めから５回め
までに得られたし一フェニルアラニンの結晶（合計０．
６７９）を合せてメタノールを用いて洗浄した。

洗浄後のＬ−フェニルアラニン（０，６５ｆ）の光学純
度を測定したところ光学純度は９８．９％であった。

実施例２１ 実施例２０において３−ヘプタノンの代シに５ｄのリン
酸トリｎ−オクチルを用いた以外は同様にしてＬ−フェ
ニルアラニンの生成反応を５回繰返した。洗浄後に得ら
れたＬ−フェニルアラニンの結晶は合計７２０岬であっ
た０ 実施例２２ 実施例２０において３−ヘプタノンの代りに５１の７ニ
ンールを用いた以外は同様にしてＬ−フェニルアラニン
の生成反応を５回繰返した。洗浄後に得られたＬ−フェ
ニルアラニンの結晶は合計６３０キでめった。

〔発明の効果〕

本発明によれば上記の実施例から明らかなとおｆｉＡＰ
ＡＥのＬ体から光学純度の高いＬ−フェニルアラニンを
高収率で製造することができる。また本発明によれば、
Ｌ−フェニルアラニンを高い光学純度を有する結晶とし
て反応混合液から析出させることができるため、生成し
たＬ−フェニルアラニンを填雑な、しかも相当量のユー
ティリティ消費を伴う分離、精製操作を要することなく
極めて容易に取得することができる。また本発明によれ
ば１反応系中における酵素の活性を長期間にわたって維
持することができ、反応混合液から回収した酵素を循環
再使用することが可能である。

さらに本発明によれば、反応混合液から残存するＡＰＡ
Ｅを容易に回収でき、原料として再使用することができ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１は低級アルキル基を表わし、Ｒ＾２は水
   素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子を表わす。 ） で示されるＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステ
   ルのＬ体を加水分解してＬ−フェニルアラニンを生成す
   る能力を有する酵素を水の存在下に該Ｎ−アシルフェニ
   ルアラニンアルキルエステルのＬ体に作用させることに
   よりＬ−フェニルアラニンを生成させることを特徴とす
   るＬ−フェニルアラニンの製造方法。 ２、酵素を作用させるＮ−アシルフェニルアラニンアル
   キルエステルのＬ体としてＮ−アシルフェニルアラニン
   アルキルエステルのＬ体とＮ−アシルフェニルアラニン
   アルキルエステルのＤ体との混合物を用いる特許請求の
   範囲第１項記載の製造方法。 ３、混合物がＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエス
   テルのラセミ体でるる特許請求の範囲第２項記載の製造
   方法。 ４、酵素がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
   属に属する糸状菌に由来するアミノアシラーゼである特
   許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ５、酵素をＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステ
   ルのＬ体に作用させて得られる反応混合液に水と実質的
   に混和しない有機溶媒を接触させることによつて、反応
   混合液から残存するＮ−アシルフェニルアラニンアルキ
   ルエステルのＬ体もしくはＤ体またはこれらの混合物を
   有機層に抽出分離する特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。 ６、酵素を水および水と実質的に混和しない有機溶媒の
   存在下にＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステル
   のＬ体に作用させる特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。 ７、有機溶媒がハロゲン化炭化水素、炭素数３以上のニ
   トリル、炭素数４以上のカルボン酸エステル、炭素数５
   以上のケトン、炭素数５以上のエーテル、炭素数６以上
   の芳香族炭化水素、炭素数６以上のアルコール、炭素数
   ８以上のリン酸トリエステルおよび窒素原子に結合する
   置換基のうち少なくとも１つが芳香族炭化水素基である
   炭素数８以上の第三級アミンからなる群より選ばれる少
   なくとも一種の有機溶媒である特許請求の範囲第５項ま
   たは第６項記載の製造方法。 ８、酵素をＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステ
   ルのＬ体に作用させて得られる反応混合液からＬ−フェ
   ニルアラニンの結晶を分離し、酵素を含む水層を、酵素
   をＮ−アシルフェニルアラニンアルキルエステルのＬ体
   に作用させる工程に循環使用する特許請求の範囲第６項
   記載の製造方法。