【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
本発明は、一本鎖組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに精製ゼラチンを添加することによつ
て、血栓溶解剤として利用される組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの安定化をはかり、長期間
の保存においても活性が低下しない組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター組成物を得る方法に関す
るものである。
（従来技術）
従来、プラスミノーゲンアクチベーターとして
は、人尿または腎臓細胞の組織培養液より抽出精
製したウロキナーゼが使用されている。しかし、
ウロキナーゼは、そのプラスミノーゲンアクチベ
ーター活性によつて血栓溶解作用を示す以外に、
血中のフイプリノーゲン、α2−プラスミンインヒ
ビター、プラスミノーゲンを低下させるために、
これを血中に投与すると、出血や過耐性
（tachyphylaxis）を起す欠点がある。
また、ウロキナーゼはフイブリンに対する親和
性をもたないので、治療に際し、必要な効果を得
るには大量に投与する場合が多く、内出血等の副
作用が発現することが知られている。
すなわち、ウロキナーゼによつて循環血液中で
生成されるプラスミンは、血中のプラスミンイン
ヒビターと結合して速やかに失活するため、治療
効果をあげるためには、これらの大量に投与し
て、血中のプラスミンインヒビターの量を上回る
プラスミンを生成する必要がある。しかし、大量
のプラスミンが生成されるとフイブリノーゲンを
分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフイブリンに親和性が高く、
フイブリン上でプラスミンを生成することができ
れば、循環血液中のプラスミンインヒビターの影
響を受けることなく、少量でフイブリンを分解す
ることができ、循環血液中のフイブイノーゲンを
分解する作用も弱くなる。かかる実情からフイブ
リン親和性が高く、少量かつ血栓溶解活性が高
く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている。
このようなプラスミノーゲンアクチベーターと
して、人または動物の子宮、腎、肺、小腸、包
皮、血管壁などの組織、これら組織由来の正常細
胞培養液または腫瘍細胞培養液中に存在する組織
プラスミノーゲンアクチベーター（以下「ｔ−
PA」と称する）が注目され、血栓溶解剤として
の開発が期待されている。
ｔ−PAは免疫学的活性およびフイブリンに対
する新和性の点でウロキナーゼと相違している。
そして、ｔ−PAはウキロナーゼに対する抗体と
は反応せず、フイブリンと強固に結合し、また、
血中においてフイブリンの存在下でアクチベータ
ーとしての強い活性を発現するものである。した
がつて、ｔ−PAはウキロナーゼと異なり、上述
の如き副作用がなく、少量で充分な血栓溶解活性
を有する、ウキロナーゼに代わる医薬品としての
期待が大きいものである。
本発明に用いるｔ−PAは、人または動物由来
組織またはこれら組織由来の組織培養液、あるい
は遺伝子操作法によりｔ−PA産生能を有する哺
乳動物細胞または微生物の培養物から抽出精製す
ることができる。そのような例を挙げれば、ｔ−
PA産生能を有する細胞、たとえば、人胎児の腎、
腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎児
由来の正常二倍体細胞、人の胎盤由来の細胞、あ
るいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、
皮膚由来の正常二倍体細胞、人黒色腫細胞または
類似の性質を有する腫瘍細胞等、特に好ましく
は、人胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体
細胞を用いた組織倍養液を用いることができる。
代表的な培養方法については、参考例に例示す
る。
人体に投与するｔ−PAとしては、人の正常細
胞由来のｔ−PAが望ましい。
本発明に用いるｔ−PAの精製法の例としては、
フイブリンを結合させたセフアロースを用いるフ
イブリンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、カルボキシメチル基を結合させたセフアロー
スを用いるCMセフアロースカラムクロマトグラ
フイー、リジンを結合させたセフアロースを用い
るリジンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、亜鉛キレートセフアロースを用いる配位子交
換クロマトグラフイー、コンカナバリンＡを結合
させたセフアロースを用いるレクチンカラムクロ
マトグラフイー、本発明物質と特異的に結合する
抗体を結合した抗体アフイニテイークロマトグラ
フイー、架橋したデキストラン粒子を用いるゲル
過を挙げることができる。
その具体的な分離精製法の一例を挙げれば、人
胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体細胞を
用いた組織培養液を硫酸アンモニウムを加えて、
生ずる沈殿を酢酸緩衝液で溶解し、同一の緩衝液
で透析してカルボキシメチルセフアロースカラム
に吸着させる。これを塩化ナトリウムの濃度を上
げて溶出させ、限外過にて濃縮し、トリス塩酸
緩衝液にて透析してリジンセフアロースカラムに
吸着させる。これをε−アミノカプロン酸を溶出
溶媒として用いて得られる溶出液を、再び限外
過にて濃縮する。濃縮液をセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社登録商標）を用いてゲル過を
することにより、本発明に用いるプラスミノーゲ
ンアクチベーターが得られる。
かくして得られるｔ−PAは、ポリペプタイド
鎖が一本鎖のものと、精製の過程で蛋白質分解酸
素の作用を受けてポリペプタイド鎖が二本鎖にな
つているものとの混合物で得られる場合が多い。
一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの変換が起る
と、Boc−Phe−Ser−Arg−MCAなどの合成基
質分解活性が著しく上昇する。二本鎖ｔ−PAは
天然型一本鎖ｔ−PAが分解して生じた生成物で
あるから、人体に投与するには好ましくなく、血
栓治療薬として用いる場合は、生体内に存在する
天然型一本鎖ｔ−PAが望ましい。
一本鎖ｔ−PAを得るには、前述の精製各工程
にアプロチニン等の蛋白分解酵素阻害剤を添加し
て操作を行えばよい。
（発明が解決しようとする問題点）
前記のように、二本鎖ｔ−PAは人体に投与す
るには好ましくなく、血栓治療薬として用いる場
合は、生体内に存在する天然型一本鎖ｔ−PAが
望ましいのであるが、一本鎖ｔ−PAは製剤化す
る際の熱処理などによつて、二本鎖ｔ−PAへの
変換が進行するので、この変換を防止して、安定
に保持できるようにすることが要求される。
（問題を解決するための手段）
本発明者らは、前記の問題点を解決するために
鋭意研究を行なつた結果、酸処理ゼラチンを添加
すれば、プラスミノーゲンアクチベーター活性に
影響を及ぼすことなく、一本鎖ｔ−PAの変換を
防止できることを見出し、本発明に到達した。
本発明で用いる酸処理ゼラチンは、日本薬局方
に記載の注射用の精製ゼラチンであり、酸処理を
行つて精製した等電点7.0〜9.0を有するものであ
り、人体に投与する場合には、抗原性の問題を回
避するために、低分子のものが望ましく、平均分
子量の範囲が3000〜50000、より好ましくは4000
〜20000のものが望ましい。
酸処理ゼラチンの使用量は、一本鎖ｔ−PAの
活性、蛋白質量等に関係なく、一定量添加すれば
安定化効果が得られるので、種々の濃度で設定で
きるが、通常、一本鎖ｔ−PA10〜50000単位を含
む溶液中に、0.05〜10％（ｗ／ｖ）の範囲で使用
すれば、本発明の効果を達成することができる。
一本鎖ｔ−PAは凍結乾燥により粉末化し製品
とされるが、この場合においても、酸処理ゼラチ
ンを添加しておくことにより、活性の低下は殆ん
どみられない。酸処理ゼラチンの添加量は、最終
投与時の混入濃度を考慮して、通常、製剤当り、
0.5〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
かくして得られた一本鎖ｔ−PA製剤は、長期
間保存しても一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへ
の変換は進行せず極めて安定である。
なお、ｔ−PAの力価測定は次の方法で行なつ
た（以下の実験についても同じ）。
95％凝固のフイブリノーゲン（プラスミノーゲ
ン含量約50カゼイン単位／ｇ凝固蛋白）を原料と
して作製した寒天加フイブリン平板を用い、ウロ
キナーゼを標準品とするプレート法で測定した。
本発明に用いるｔ−PA溶液を、１％ゼラチン、
0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％窒化ナトリウム
を含む0.067Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で希釈
し、フイブリン平板上で10IU／mlのウキロナー
ゼと同じ溶解窓を示す本発明に用いるｔ−PA溶
液の濃度を10IU／mlとした。
また、合成基質に対する水解活性は、次の方法
で測定した。すなわち、本発明に用いるｔ−PA
（100U／ml）50μに、0.1M塩化ナトリウムを含
む0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）450μに溶
解した合成基質（Boc−Phe−Ser−Arg−MCA）
0.1ｍＭを加え、37℃で15分間反応させる。20％
酢酸0.5mlを加え反応を停止させ、これを励起波
長370nｍ、スリツト幅5nｍ、螢光波長460nｍ、
スリツト幅5nｍで生ずるアミノメチルクマリン
（AMC）を測定し、水解活性を求めた。
参考例
ヒト胎児肺細胞を500ml容スピナーフラスコに
105cells／mlの密度で2.5mg／ml濃度のサイトデツ
クス（細胞培養用ビーズ担体、フアルマシア社
登録商標）と共に植え込み、37℃、５％の炭酸ガ
スを含む空気中で、成育培地として10％ウシ胎児
血清を含むメジウムMEMを300ml添加し、
60rpmの回転数で撹拌しながら懸濁培養する。８
日間培養し、細胞を充分増殖させた後、生理食塩
水で細胞が接着したビーズ担体を洗浄し、血清を
含まない0.5％ラクトアルブミン水解物を含むメ
ジウム199 300mlにおきかえ、60rpmの回転数で
撹拌しながら培養する。５日間毎に、この培地を
交換しながら25日培養し、一本鎖ｔ−PAを含む
培養液を回収する。
得られた培養液1.5を抗ウロキナーゼIg−Ｇセ
フオロースカラム通過後、フイブリンセフアロー
スカラム（1.5φ×12cm）に吸着させる。0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5M塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5Mアルギニン溶液で溶出し、ｔ−PAの活性を
有する部分の溶液65mlを集める。ｔ−PAの活性
は68U／ml、比活性は1020U／A280であつた。
この溶液を0.1％ツイン80および25KIU／mlア
プロチニンを含む生理食塩水に透析後、コンカナ
バリンＡセフアロースカラム（1φ×25cm）に吸
着させ、1M塩化ナトリウム、0.1％ツイン80およ
び25KIU／mlアプロチニンを含む0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で洗浄後、当該溶液から0.4Mメチ
ルマンノシド、2Mロダンアンモニウム、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）まで直線的に濃度
を変え、ｔ−PAを溶出する。得られた溶液は流
量31ml、ｔ−PAの活性は102U／ml、比活性は
6500U／A280であつた。得られた溶液を限外
過で濃縮し、セフアデツクスＧ−150でゲル過
して、活性を有する部分を15ml回収した。活性は
151U／ml、比活性は13100U／A280であつた。
得られたｔ−PAはSDSポリアクリルアミド電
気泳動による分析で、１％ドデジタル硫酸ナトリ
ウム、１％β−メルカプトエタノールおよび20％
グリセリン存在下、100℃５分間の還元処理で分
解しないことから、一本鎖であることが確められ
た。
（発明の効果）
後記実施例の結果から明らかなように、本発明
によれば、一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの
変換が防止され、安定に保持される。
（実施例）
実験例
(1) ゼラチンの種類による効果
0.15M塩化ナトリウム、0.02％ツイン80を含
む水溶液に、一本鎖ｔ−PA100U／mlとなるよ
うに添加する。この溶液に安定化剤として種々
のゼラチンを添加し、37℃でインキユベート
し、０日、２日、５日にフイブリン平板法にて
活性残存率を測定し、また、合成基質Boc−
Phe−Ser−Ang−MCAに対する水解活性を測
定した。
結果を第１表に示す。
(Field of Industrial Application) The present invention aims to stabilize tissue plasminogen activator used as a thrombolytic agent by adding purified gelatin to single-stranded tissue plasminogen activator, The present invention relates to a method for obtaining a tissue plasminogen activator composition whose activity does not decrease even during long-term storage. (Prior Art) Conventionally, urokinase extracted and purified from human urine or tissue culture fluid of kidney cells has been used as a plasminogen activator. but,
In addition to exhibiting thrombolytic effects through its plasminogen activator activity, urokinase also has
To lower fipurinogen, α 2 -plasmin inhibitor, and plasminogen in the blood,
When administered into the blood, it has the disadvantage of causing bleeding and hypertolerance (tachyphylaxis). Furthermore, since urokinase has no affinity for fibrin, large doses are often administered in order to obtain the desired effect during treatment, which is known to cause side effects such as internal bleeding. In other words, plasmin produced in the circulating blood by urokinase binds to plasmin inhibitors in the blood and is rapidly deactivated. Therefore, in order to increase the therapeutic effect, it is necessary to administer large amounts of plasmin to reduce the amount of plasmin in the blood. It is necessary to generate plasmin in excess of the amount of plasmin inhibitor. However, when a large amount of plasmin is produced, it degrades fibrinogen and causes the side effect of bleeding tendency. On the other hand, it has a high affinity for fibrin,
If plasmin can be generated on fibrin, fibrin can be degraded in small amounts without being affected by plasmin inhibitors in the circulating blood, and the effect of decomposing fibrinogen in the circulating blood will also be weakened. Under these circumstances, there is a demand for a thrombolytic agent that has high fibrin affinity, is available in small amounts, has high thrombolytic activity, and has few side effects. Such plasminogen activators include tissue plasminose present in tissues such as the uterus, kidney, lung, small intestine, foreskin, and blood vessel walls of humans or animals, and in normal cell culture medium or tumor cell culture medium derived from these tissues. Gen activator (hereinafter referred to as “t-
(referred to as "PA") is attracting attention, and its development as a thrombolytic agent is expected. t-PA differs from urokinase in its immunological activity and affinity for fibrin.
In addition, t-PA does not react with antibodies against ukironase, binds tightly to fibrin, and
It exhibits strong activity as an activator in the presence of fibrin in the blood. Therefore, unlike ukironase, t-PA does not have the above-mentioned side effects and has sufficient thrombolytic activity even in small doses, and has high expectations as a pharmaceutical alternative to ukironase. The t-PA used in the present invention can be extracted and purified from human or animal-derived tissues, tissue culture fluids derived from these tissues, or cultures of mammalian cells or microorganisms capable of producing t-PA by genetic engineering. . To give such an example, t-
Cells capable of producing PA, such as human fetal kidney,
Normal diploid cells from the intestine, lungs, heart, ureter, skin, foreskin, and whole fetus, cells from the human placenta, or human kidney, intestine, lung, thyroid, heart, ureter,
A tissue culture solution using normal diploid cells derived from the skin, human melanoma cells, or tumor cells with similar properties, particularly preferably normal diploid cells derived from the kidney, lung, or foreskin of a human fetus. Can be used.
Typical culture methods are illustrated in Reference Examples. As t-PA to be administered to the human body, t-PA derived from normal human cells is desirable. As an example of the method for purifying t-PA used in the present invention,
Fibrin Sepharose column chromatography using Sepharose bound to fibrin, CM Sepharose column chromatography using Sepharose bound to a carboxymethyl group, Lysine Sepharose column chromatography using Sepharose bound to lysine, Ligand exchange chromatography using zinc chelate sepharose, lectin column chromatography using sepharose bound to concanavalin A, antibody affinity chromatography bound to an antibody that specifically binds to the substance of the present invention, cross-linking Examples include gel filtration using dextran particles. To give an example of a specific separation and purification method, ammonium sulfate is added to a tissue culture solution using normal diploid cells derived from human fetal kidney, lung, or foreskin.
The resulting precipitate is dissolved in an acetate buffer, dialyzed against the same buffer, and adsorbed onto a carboxymethyl-Sepharose column. This is eluted by increasing the concentration of sodium chloride, concentrated by ultrafiltration, dialyzed against Tris-HCl buffer, and adsorbed onto a lysine-Sepharose column. The eluate obtained by using ε-aminocaproic acid as an elution solvent is again concentrated by ultrafiltration. Concentrate with Cefacryl S-200
The plasminogen activator used in the present invention can be obtained by gel filtration using (Pharmacia registered trademark). The t-PA obtained in this manner is obtained as a mixture of a single polypeptide chain and a polypeptide chain that has become double stranded due to the action of proteolytic oxygen during the purification process. There are many.
When the conversion of single-chain t-PA to double-chain t-PA occurs, the activity of degrading synthetic substrates such as Boc-Phe-Ser-Arg-MCA increases significantly. Since double-chain t-PA is a product produced by the decomposition of natural single-chain t-PA, it is not suitable for administration to the human body. Type single-stranded t-PA is preferred. Single-chain t-PA can be obtained by adding a protease inhibitor such as aprotinin to each of the purification steps described above. (Problems to be Solved by the Invention) As mentioned above, double-chain t-PA is not preferable for administration to the human body, and when used as a therapeutic agent for blood clots, natural single-chain t-PA that exists in the body is -PA is desirable, but single-chain t-PA is converted to double-chain t-PA by heat treatment during formulation, so this conversion can be prevented to ensure stable retention. required to be able to do so. (Means for Solving the Problem) As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors found that adding acid-treated gelatin affects plasminogen activator activity. The present invention has been achieved by discovering that conversion of single-stranded t-PA can be prevented without causing any damage. The acid-treated gelatin used in the present invention is purified gelatin for injection as described in the Japanese Pharmacopoeia, and has an isoelectric point of 7.0 to 9.0 after being purified by acid treatment. In order to avoid antigenicity problems, low molecular weight ones are desirable, with an average molecular weight in the range of 3,000 to 50,000, more preferably 4,000.
~20000 is desirable. The amount of acid-treated gelatin used can be set at various concentrations, as a stabilizing effect can be obtained if a certain amount is added, regardless of the activity, protein content, etc. of single-chain t-PA. The effects of the present invention can be achieved by using it in a range of 0.05 to 10% (w/v) in a solution containing 10 to 50,000 units of t-PA. Single-chain t-PA is powdered by freeze-drying and made into a product, but even in this case, by adding acid-treated gelatin, there is almost no decrease in activity. The amount of acid-treated gelatin added is usually determined per formulation, taking into consideration the concentration of contaminants at the time of final administration.
0.5-5% (w/v) is preferred. The single-chain t-PA preparation thus obtained is extremely stable, with no progression of conversion from single-chain t-PA to double-chain t-PA even after long-term storage. Note that the titer of t-PA was measured by the following method (the same applies to the following experiments). Measurement was carried out using an agar-added fibrin plate prepared from 95% coagulated fibrinogen (plasminogen content: approximately 50 casein units/g coagulated protein) using a plate method using urokinase as a standard.
The t-PA solution used in the present invention contains 1% gelatin,
The t-PA solution used in the present invention, diluted with 0.067 M Tris-HCl buffer (PH 8.0) containing 0.1 M sodium chloride and 0.1% sodium nitride, shows the same dissolution window as 10 IU/ml ukilonase on fibrin plates. The concentration was 10 IU/ml. In addition, the hydrolysis activity for synthetic substrates was measured by the following method. That is, t-PA used in the present invention
Synthetic substrate (Boc-Phe-Ser-Arg-MCA) dissolved in 50μ (100U/ml) and 450μ of 0.05M Tris-HCl buffer (PH8.0) containing 0.1M sodium chloride.
Add 0.1mM and react at 37°C for 15 minutes. 20%
0.5 ml of acetic acid was added to stop the reaction, and the mixture was heated to an excitation wavelength of 370 nm, a slit width of 5 nm, and a fluorescence wavelength of 460 nm.
Aminomethylcoumarin (AMC) produced with a slit width of 5 nm was measured to determine the water-splitting activity. Reference example Human fetal lung cells in a 500ml spinner flask
They were implanted at a density of 10 5 cells/ml with a concentration of 2.5 mg/ml Cytodex (bead carrier for cell culture, registered trademark of Pharmacia) and grown at 37°C in air containing 5% carbon dioxide as a growth medium. Add 300 ml of medium MEM containing % fetal bovine serum,
Culture in suspension while stirring at a rotation speed of 60 rpm. 8
After culturing for one day and allowing the cells to proliferate sufficiently, wash the bead carrier with the cells attached with physiological saline, replace with 300 ml of medium 199 containing serum-free 0.5% lactalbumin hydrolyzate, and stir at 60 rpm. While cultivating. Culture is continued for 25 days while replacing the medium every 5 days, and a culture solution containing single-chain t-PA is collected. After passing 1.5 hours of the obtained culture solution through an anti-urokinase Ig-G Sepharose column, it is adsorbed onto a fibrin Sepharose column (1.5φ×12 cm). Contains 0.1% Twin 80 and 25 KIU/ml Aprotinin
Contains 0.1% Twin 80 and 25 KIU/ml aprotinin after thorough washing with 0.5M sodium chloride solution.
Elute with 0.5M arginine solution and collect 65 ml of the solution containing the active part of t-PA. The activity of t-PA was 68 U/ml, and the specific activity was 1020 U/A280. This solution was dialyzed against physiological saline containing 0.1% Twin 80 and 25 KIU/ml aprotinin, and then adsorbed onto a concanavalin A sepharose column (1φ x 25 cm) containing 1M sodium chloride, 0.1% Twin 80 and 25 KIU/ml aprotinin. After washing with 0.01M phosphate buffer (PH7.0), the solution contained 0.4M methylmannoside, 2M rhodan ammonium, 0.1% Twin 80 and 25 KIU/ml aprotinin.
Change the concentration linearly to 0.01M phosphate buffer (PH7.0) to elute t-PA. The flow rate of the obtained solution was 31 ml, the activity of t-PA was 102 U/ml, and the specific activity was
It was 6500U/A280. The resulting solution was concentrated by ultrafiltration and gel-filtered through Sephadex G-150 to collect 15 ml of the active portion. The activity is
The specific activity was 151 U/ml and 13100 U/A280. The obtained t-PA was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis using 1% sodium dodigital sulfate, 1% β-mercaptoethanol and 20%
It was confirmed that it was single-stranded because it did not decompose after reduction treatment at 100°C for 5 minutes in the presence of glycerin. (Effects of the Invention) As is clear from the results of Examples described below, according to the present invention, conversion of single-chain t-PA to double-chain t-PA is prevented and stably maintained. (Example) Experimental example (1) Effect of gelatin type Single-stranded t-PA is added to an aqueous solution containing 0.15M sodium chloride and 0.02% Twin 80 at a concentration of 100 U/ml. Various gelatins were added to this solution as a stabilizer, and the solution was incubated at 37°C. The residual activity was measured using the fibrin plate method on days 0, 2, and 5.
The hydrolysis activity against Phe-Ser-Ang-MCA was measured. The results are shown in Table 1.
【表】
(2) (1)と同様に調製した溶液に、0.1％または１
％の安定化剤を添加し、４℃に保存し、０日、
10日、20日にPA活性および合成基質水解活性
を(1)と同様にして測定した。
なお、コントロールは無添加、比較としてア
ルブミンを添加したもの用いた。
結果を第２表に示す。[Table] (2) Add 0.1% or 1% to the solution prepared in the same manner as (1).
% stabilizer was added and stored at 4°C for 0 days.
On the 10th and 20th, PA activity and synthetic substrate hydrolysis activity were measured in the same manner as in (1). Note that as a control, no additive was used, and as a comparison, a sample with albumin added was used. The results are shown in Table 2.
【表】
以上の結果から、一本鎖ｔ−PAに酸処理ゼラ
チンを添加することにより、二本鎖への変換が防
止され、安定に保持されていることがわかる。一
方、安定化剤として知られているアルブミンに
は、この変換防止効果はなかつた。また、ｔ−
PAのPA活性に対しては影響しないことが明らか
である。
製剤例
組織プラスミノーゲンアクチベーアー 24000単位
酸処理ゼラチン 20mg
アンニトール 100mg
塩化ナトリウム 7.8mg
リン酸ナトリウム 15.4mg
上記成分を注射用蒸留水２mlに溶解し、無菌バ
イアルに入れ、−30℃〜−40℃で２時間予備凍結
し、−30℃〜＋20℃、真空度0.05〜0.1Torrで35時
間、一次乾燥し、次いで、30℃、真空度0.01〜
0.05Torrで５時間、二次乾燥して、注射用バイ
アルを製造した。[Table] From the above results, it can be seen that by adding acid-treated gelatin to single-stranded t-PA, conversion to double-stranded t-PA is prevented and stably maintained. On the other hand, albumin, which is known as a stabilizer, had no effect on preventing this conversion. Also, t-
It is clear that PA has no effect on PA activity. Formulation example Tissue plasminogen activator 24000 units Acid-treated gelatin 20mg Annitol 100mg Sodium chloride 7.8mg Sodium phosphate 15.4mg Dissolve the above ingredients in 2ml of distilled water for injection, place in a sterile vial, and place at -30℃ to -40℃ Preliminary freezing for 2 hours at -30°C to +20°C and 35 hours of vacuum at a vacuum level of 0.05 to 0.1 Torr, followed by primary drying at 30°C and a vacuum level of 0.01 to 0.1 Torr.
Secondary drying was performed at 0.05 Torr for 5 hours to produce injection vials.