JPH0527607B2 - - Google Patents
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- JPH0527607B2 JPH0527607B2 JP59102708A JP10270884A JPH0527607B2 JP H0527607 B2 JPH0527607 B2 JP H0527607B2 JP 59102708 A JP59102708 A JP 59102708A JP 10270884 A JP10270884 A JP 10270884A JP H0527607 B2 JPH0527607 B2 JP H0527607B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- chain
- fibrin
- solution
- cells
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
- G03C—PHOTOSENSITIVE MATERIALS FOR PHOTOGRAPHIC PURPOSES; PHOTOGRAPHIC PROCESSES, e.g. CINE, X-RAY, COLOUR, STEREO-PHOTOGRAPHIC PROCESSES; AUXILIARY PROCESSES IN PHOTOGRAPHY
- G03C1/00—Photosensitive materials
- G03C1/005—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein
- G03C1/04—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein with macromolecular additives; with layer-forming substances
- G03C1/047—Proteins, e.g. gelatine derivatives; Hydrolysis or extraction products of proteins
- G03C2001/0471—Isoelectric point of gelatine
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、一本鎖組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに精製ゼラチンを添加することによつ
て、血栓溶解剤として利用される組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの安定化をはかり、長期間
の保存においても活性が低下しない組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター組成物を得る方法に関す
るものである。 （従来技術） 従来、プラスミノーゲンアクチベーターとして
は、人尿または腎臓細胞の組織培養液より抽出精
製したウロキナーゼが使用されている。しかし、
ウロキナーゼは、そのプラスミノーゲンアクチベ
ーター活性によつて血栓溶解作用を示す以外に、
血中のフイプリノーゲン、α2−プラスミンインヒ
ビター、プラスミノーゲンを低下させるために、
これを血中に投与すると、出血や過耐性
（tachyphylaxis）を起す欠点がある。 また、ウロキナーゼはフイブリンに対する親和
性をもたないので、治療に際し、必要な効果を得
るには大量に投与する場合が多く、内出血等の副
作用が発現することが知られている。 すなわち、ウロキナーゼによつて循環血液中で
生成されるプラスミンは、血中のプラスミンイン
ヒビターと結合して速やかに失活するため、治療
効果をあげるためには、これらの大量に投与し
て、血中のプラスミンインヒビターの量を上回る
プラスミンを生成する必要がある。しかし、大量
のプラスミンが生成されるとフイブリノーゲンを
分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフイブリンに親和性が高く、
フイブリン上でプラスミンを生成することができ
れば、循環血液中のプラスミンインヒビターの影
響を受けることなく、少量でフイブリンを分解す
ることができ、循環血液中のフイブイノーゲンを
分解する作用も弱くなる。かかる実情からフイブ
リン親和性が高く、少量かつ血栓溶解活性が高
く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている。 このようなプラスミノーゲンアクチベーターと
して、人または動物の子宮、腎、肺、小腸、包
皮、血管壁などの組織、これら組織由来の正常細
胞培養液または腫瘍細胞培養液中に存在する組織
プラスミノーゲンアクチベーター（以下「ｔ−
PA」と称する）が注目され、血栓溶解剤として
の開発が期待されている。 ｔ−PAは免疫学的活性およびフイブリンに対
する新和性の点でウロキナーゼと相違している。
そして、ｔ−PAはウキロナーゼに対する抗体と
は反応せず、フイブリンと強固に結合し、また、
血中においてフイブリンの存在下でアクチベータ
ーとしての強い活性を発現するものである。した
がつて、ｔ−PAはウキロナーゼと異なり、上述
の如き副作用がなく、少量で充分な血栓溶解活性
を有する、ウキロナーゼに代わる医薬品としての
期待が大きいものである。 本発明に用いるｔ−PAは、人または動物由来
組織またはこれら組織由来の組織培養液、あるい
は遺伝子操作法によりｔ−PA産生能を有する哺
乳動物細胞または微生物の培養物から抽出精製す
ることができる。そのような例を挙げれば、ｔ−
PA産生能を有する細胞、たとえば、人胎児の腎、
腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎児
由来の正常二倍体細胞、人の胎盤由来の細胞、あ
るいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、
皮膚由来の正常二倍体細胞、人黒色腫細胞または
類似の性質を有する腫瘍細胞等、特に好ましく
は、人胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体
細胞を用いた組織倍養液を用いることができる。
代表的な培養方法については、参考例に例示す
る。 人体に投与するｔ−PAとしては、人の正常細
胞由来のｔ−PAが望ましい。 本発明に用いるｔ−PAの精製法の例としては、
フイブリンを結合させたセフアロースを用いるフ
イブリンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、カルボキシメチル基を結合させたセフアロー
スを用いるCMセフアロースカラムクロマトグラ
フイー、リジンを結合させたセフアロースを用い
るリジンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、亜鉛キレートセフアロースを用いる配位子交
換クロマトグラフイー、コンカナバリンＡを結合
させたセフアロースを用いるレクチンカラムクロ
マトグラフイー、本発明物質と特異的に結合する
抗体を結合した抗体アフイニテイークロマトグラ
フイー、架橋したデキストラン粒子を用いるゲル
過を挙げることができる。 その具体的な分離精製法の一例を挙げれば、人
胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体細胞を
用いた組織培養液を硫酸アンモニウムを加えて、
生ずる沈殿を酢酸緩衝液で溶解し、同一の緩衝液
で透析してカルボキシメチルセフアロースカラム
に吸着させる。これを塩化ナトリウムの濃度を上
げて溶出させ、限外過にて濃縮し、トリス塩酸
緩衝液にて透析してリジンセフアロースカラムに
吸着させる。これをε−アミノカプロン酸を溶出
溶媒として用いて得られる溶出液を、再び限外
過にて濃縮する。濃縮液をセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社登録商標）を用いてゲル過を
することにより、本発明に用いるプラスミノーゲ
ンアクチベーターが得られる。 かくして得られるｔ−PAは、ポリペプタイド
鎖が一本鎖のものと、精製の過程で蛋白質分解酸
素の作用を受けてポリペプタイド鎖が二本鎖にな
つているものとの混合物で得られる場合が多い。
一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの変換が起る
と、Boc−Phe−Ser−Arg−MCAなどの合成基
質分解活性が著しく上昇する。二本鎖ｔ−PAは
天然型一本鎖ｔ−PAが分解して生じた生成物で
あるから、人体に投与するには好ましくなく、血
栓治療薬として用いる場合は、生体内に存在する
天然型一本鎖ｔ−PAが望ましい。 一本鎖ｔ−PAを得るには、前述の精製各工程
にアプロチニン等の蛋白分解酵素阻害剤を添加し
て操作を行えばよい。 （発明が解決しようとする問題点） 前記のように、二本鎖ｔ−PAは人体に投与す
るには好ましくなく、血栓治療薬として用いる場
合は、生体内に存在する天然型一本鎖ｔ−PAが
望ましいのであるが、一本鎖ｔ−PAは製剤化す
る際の熱処理などによつて、二本鎖ｔ−PAへの
変換が進行するので、この変換を防止して、安定
に保持できるようにすることが要求される。 （問題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために
鋭意研究を行なつた結果、酸処理ゼラチンを添加
すれば、プラスミノーゲンアクチベーター活性に
影響を及ぼすことなく、一本鎖ｔ−PAの変換を
防止できることを見出し、本発明に到達した。 本発明で用いる酸処理ゼラチンは、日本薬局方
に記載の注射用の精製ゼラチンであり、酸処理を
行つて精製した等電点7.0〜9.0を有するものであ
り、人体に投与する場合には、抗原性の問題を回
避するために、低分子のものが望ましく、平均分
子量の範囲が3000〜50000、より好ましくは4000
〜20000のものが望ましい。 酸処理ゼラチンの使用量は、一本鎖ｔ−PAの
活性、蛋白質量等に関係なく、一定量添加すれば
安定化効果が得られるので、種々の濃度で設定で
きるが、通常、一本鎖ｔ−PA10〜50000単位を含
む溶液中に、0.05〜10％（ｗ／ｖ）の範囲で使用
すれば、本発明の効果を達成することができる。 一本鎖ｔ−PAは凍結乾燥により粉末化し製品
とされるが、この場合においても、酸処理ゼラチ
ンを添加しておくことにより、活性の低下は殆ん
どみられない。酸処理ゼラチンの添加量は、最終
投与時の混入濃度を考慮して、通常、製剤当り、
0.5〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。 かくして得られた一本鎖ｔ−PA製剤は、長期
間保存しても一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへ
の変換は進行せず極めて安定である。 なお、ｔ−PAの力価測定は次の方法で行なつ
た（以下の実験についても同じ）。 95％凝固のフイブリノーゲン（プラスミノーゲ
ン含量約50カゼイン単位／ｇ凝固蛋白）を原料と
して作製した寒天加フイブリン平板を用い、ウロ
キナーゼを標準品とするプレート法で測定した。
本発明に用いるｔ−PA溶液を、１％ゼラチン、
0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％窒化ナトリウム
を含む0.067Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で希釈
し、フイブリン平板上で10IU／mlのウキロナー
ゼと同じ溶解窓を示す本発明に用いるｔ−PA溶
液の濃度を10IU／mlとした。 また、合成基質に対する水解活性は、次の方法
で測定した。すなわち、本発明に用いるｔ−PA
（100U／ml）50μに、0.1M塩化ナトリウムを含
む0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）450μに溶
解した合成基質（Boc−Phe−Ser−Arg−MCA）
0.1ｍＭを加え、37℃で15分間反応させる。20％
酢酸0.5mlを加え反応を停止させ、これを励起波
長370nｍ、スリツト幅5nｍ、螢光波長460nｍ、
スリツト幅5nｍで生ずるアミノメチルクマリン
（AMC）を測定し、水解活性を求めた。 参考例 ヒト胎児肺細胞を500ml容スピナーフラスコに
105cells／mlの密度で2.5mg／ml濃度のサイトデツ
クス（細胞培養用ビーズ担体、フアルマシア社
登録商標）と共に植え込み、37℃、５％の炭酸ガ
スを含む空気中で、成育培地として10％ウシ胎児
血清を含むメジウムMEMを300ml添加し、
60rpmの回転数で撹拌しながら懸濁培養する。８
日間培養し、細胞を充分増殖させた後、生理食塩
水で細胞が接着したビーズ担体を洗浄し、血清を
含まない0.5％ラクトアルブミン水解物を含むメ
ジウム199 300mlにおきかえ、60rpmの回転数で
撹拌しながら培養する。５日間毎に、この培地を
交換しながら25日培養し、一本鎖ｔ−PAを含む
培養液を回収する。 得られた培養液1.5を抗ウロキナーゼIg−Ｇセ
フオロースカラム通過後、フイブリンセフアロー
スカラム（1.5φ×12cm）に吸着させる。0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5M塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5Mアルギニン溶液で溶出し、ｔ−PAの活性を
有する部分の溶液65mlを集める。ｔ−PAの活性
は68U／ml、比活性は1020U／A280であつた。 この溶液を0.1％ツイン80および25KIU／mlア
プロチニンを含む生理食塩水に透析後、コンカナ
バリンＡセフアロースカラム（1φ×25cm）に吸
着させ、1M塩化ナトリウム、0.1％ツイン80およ
び25KIU／mlアプロチニンを含む0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で洗浄後、当該溶液から0.4Mメチ
ルマンノシド、2Mロダンアンモニウム、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）まで直線的に濃度
を変え、ｔ−PAを溶出する。得られた溶液は流
量31ml、ｔ−PAの活性は102U／ml、比活性は
6500U／A280であつた。得られた溶液を限外
過で濃縮し、セフアデツクスＧ−150でゲル過
して、活性を有する部分を15ml回収した。活性は
151U／ml、比活性は13100U／A280であつた。 得られたｔ−PAはSDSポリアクリルアミド電
気泳動による分析で、１％ドデジタル硫酸ナトリ
ウム、１％β−メルカプトエタノールおよび20％
グリセリン存在下、100℃５分間の還元処理で分
解しないことから、一本鎖であることが確められ
た。 （発明の効果） 後記実施例の結果から明らかなように、本発明
によれば、一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの
変換が防止され、安定に保持される。 （実施例） 実験例 (1) ゼラチンの種類による効果 0.15M塩化ナトリウム、0.02％ツイン80を含
む水溶液に、一本鎖ｔ−PA100U／mlとなるよ
うに添加する。この溶液に安定化剤として種々
のゼラチンを添加し、37℃でインキユベート
し、０日、２日、５日にフイブリン平板法にて
活性残存率を測定し、また、合成基質Boc−
Phe−Ser−Ang−MCAに対する水解活性を測
定した。 結果を第１表に示す。
ベーターに精製ゼラチンを添加することによつ
て、血栓溶解剤として利用される組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの安定化をはかり、長期間
の保存においても活性が低下しない組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター組成物を得る方法に関す
るものである。 （従来技術） 従来、プラスミノーゲンアクチベーターとして
は、人尿または腎臓細胞の組織培養液より抽出精
製したウロキナーゼが使用されている。しかし、
ウロキナーゼは、そのプラスミノーゲンアクチベ
ーター活性によつて血栓溶解作用を示す以外に、
血中のフイプリノーゲン、α2−プラスミンインヒ
ビター、プラスミノーゲンを低下させるために、
これを血中に投与すると、出血や過耐性
（tachyphylaxis）を起す欠点がある。 また、ウロキナーゼはフイブリンに対する親和
性をもたないので、治療に際し、必要な効果を得
るには大量に投与する場合が多く、内出血等の副
作用が発現することが知られている。 すなわち、ウロキナーゼによつて循環血液中で
生成されるプラスミンは、血中のプラスミンイン
ヒビターと結合して速やかに失活するため、治療
効果をあげるためには、これらの大量に投与し
て、血中のプラスミンインヒビターの量を上回る
プラスミンを生成する必要がある。しかし、大量
のプラスミンが生成されるとフイブリノーゲンを
分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフイブリンに親和性が高く、
フイブリン上でプラスミンを生成することができ
れば、循環血液中のプラスミンインヒビターの影
響を受けることなく、少量でフイブリンを分解す
ることができ、循環血液中のフイブイノーゲンを
分解する作用も弱くなる。かかる実情からフイブ
リン親和性が高く、少量かつ血栓溶解活性が高
く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている。 このようなプラスミノーゲンアクチベーターと
して、人または動物の子宮、腎、肺、小腸、包
皮、血管壁などの組織、これら組織由来の正常細
胞培養液または腫瘍細胞培養液中に存在する組織
プラスミノーゲンアクチベーター（以下「ｔ−
PA」と称する）が注目され、血栓溶解剤として
の開発が期待されている。 ｔ−PAは免疫学的活性およびフイブリンに対
する新和性の点でウロキナーゼと相違している。
そして、ｔ−PAはウキロナーゼに対する抗体と
は反応せず、フイブリンと強固に結合し、また、
血中においてフイブリンの存在下でアクチベータ
ーとしての強い活性を発現するものである。した
がつて、ｔ−PAはウキロナーゼと異なり、上述
の如き副作用がなく、少量で充分な血栓溶解活性
を有する、ウキロナーゼに代わる医薬品としての
期待が大きいものである。 本発明に用いるｔ−PAは、人または動物由来
組織またはこれら組織由来の組織培養液、あるい
は遺伝子操作法によりｔ−PA産生能を有する哺
乳動物細胞または微生物の培養物から抽出精製す
ることができる。そのような例を挙げれば、ｔ−
PA産生能を有する細胞、たとえば、人胎児の腎、
腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎児
由来の正常二倍体細胞、人の胎盤由来の細胞、あ
るいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、
皮膚由来の正常二倍体細胞、人黒色腫細胞または
類似の性質を有する腫瘍細胞等、特に好ましく
は、人胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体
細胞を用いた組織倍養液を用いることができる。
代表的な培養方法については、参考例に例示す
る。 人体に投与するｔ−PAとしては、人の正常細
胞由来のｔ−PAが望ましい。 本発明に用いるｔ−PAの精製法の例としては、
フイブリンを結合させたセフアロースを用いるフ
イブリンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、カルボキシメチル基を結合させたセフアロー
スを用いるCMセフアロースカラムクロマトグラ
フイー、リジンを結合させたセフアロースを用い
るリジンセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、亜鉛キレートセフアロースを用いる配位子交
換クロマトグラフイー、コンカナバリンＡを結合
させたセフアロースを用いるレクチンカラムクロ
マトグラフイー、本発明物質と特異的に結合する
抗体を結合した抗体アフイニテイークロマトグラ
フイー、架橋したデキストラン粒子を用いるゲル
過を挙げることができる。 その具体的な分離精製法の一例を挙げれば、人
胎児の腎、肺または包皮由来の正常二倍体細胞を
用いた組織培養液を硫酸アンモニウムを加えて、
生ずる沈殿を酢酸緩衝液で溶解し、同一の緩衝液
で透析してカルボキシメチルセフアロースカラム
に吸着させる。これを塩化ナトリウムの濃度を上
げて溶出させ、限外過にて濃縮し、トリス塩酸
緩衝液にて透析してリジンセフアロースカラムに
吸着させる。これをε−アミノカプロン酸を溶出
溶媒として用いて得られる溶出液を、再び限外
過にて濃縮する。濃縮液をセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社登録商標）を用いてゲル過を
することにより、本発明に用いるプラスミノーゲ
ンアクチベーターが得られる。 かくして得られるｔ−PAは、ポリペプタイド
鎖が一本鎖のものと、精製の過程で蛋白質分解酸
素の作用を受けてポリペプタイド鎖が二本鎖にな
つているものとの混合物で得られる場合が多い。
一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの変換が起る
と、Boc−Phe−Ser−Arg−MCAなどの合成基
質分解活性が著しく上昇する。二本鎖ｔ−PAは
天然型一本鎖ｔ−PAが分解して生じた生成物で
あるから、人体に投与するには好ましくなく、血
栓治療薬として用いる場合は、生体内に存在する
天然型一本鎖ｔ−PAが望ましい。 一本鎖ｔ−PAを得るには、前述の精製各工程
にアプロチニン等の蛋白分解酵素阻害剤を添加し
て操作を行えばよい。 （発明が解決しようとする問題点） 前記のように、二本鎖ｔ−PAは人体に投与す
るには好ましくなく、血栓治療薬として用いる場
合は、生体内に存在する天然型一本鎖ｔ−PAが
望ましいのであるが、一本鎖ｔ−PAは製剤化す
る際の熱処理などによつて、二本鎖ｔ−PAへの
変換が進行するので、この変換を防止して、安定
に保持できるようにすることが要求される。 （問題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために
鋭意研究を行なつた結果、酸処理ゼラチンを添加
すれば、プラスミノーゲンアクチベーター活性に
影響を及ぼすことなく、一本鎖ｔ−PAの変換を
防止できることを見出し、本発明に到達した。 本発明で用いる酸処理ゼラチンは、日本薬局方
に記載の注射用の精製ゼラチンであり、酸処理を
行つて精製した等電点7.0〜9.0を有するものであ
り、人体に投与する場合には、抗原性の問題を回
避するために、低分子のものが望ましく、平均分
子量の範囲が3000〜50000、より好ましくは4000
〜20000のものが望ましい。 酸処理ゼラチンの使用量は、一本鎖ｔ−PAの
活性、蛋白質量等に関係なく、一定量添加すれば
安定化効果が得られるので、種々の濃度で設定で
きるが、通常、一本鎖ｔ−PA10〜50000単位を含
む溶液中に、0.05〜10％（ｗ／ｖ）の範囲で使用
すれば、本発明の効果を達成することができる。 一本鎖ｔ−PAは凍結乾燥により粉末化し製品
とされるが、この場合においても、酸処理ゼラチ
ンを添加しておくことにより、活性の低下は殆ん
どみられない。酸処理ゼラチンの添加量は、最終
投与時の混入濃度を考慮して、通常、製剤当り、
0.5〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。 かくして得られた一本鎖ｔ−PA製剤は、長期
間保存しても一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへ
の変換は進行せず極めて安定である。 なお、ｔ−PAの力価測定は次の方法で行なつ
た（以下の実験についても同じ）。 95％凝固のフイブリノーゲン（プラスミノーゲ
ン含量約50カゼイン単位／ｇ凝固蛋白）を原料と
して作製した寒天加フイブリン平板を用い、ウロ
キナーゼを標準品とするプレート法で測定した。
本発明に用いるｔ−PA溶液を、１％ゼラチン、
0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％窒化ナトリウム
を含む0.067Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で希釈
し、フイブリン平板上で10IU／mlのウキロナー
ゼと同じ溶解窓を示す本発明に用いるｔ−PA溶
液の濃度を10IU／mlとした。 また、合成基質に対する水解活性は、次の方法
で測定した。すなわち、本発明に用いるｔ−PA
（100U／ml）50μに、0.1M塩化ナトリウムを含
む0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）450μに溶
解した合成基質（Boc−Phe−Ser−Arg−MCA）
0.1ｍＭを加え、37℃で15分間反応させる。20％
酢酸0.5mlを加え反応を停止させ、これを励起波
長370nｍ、スリツト幅5nｍ、螢光波長460nｍ、
スリツト幅5nｍで生ずるアミノメチルクマリン
（AMC）を測定し、水解活性を求めた。 参考例 ヒト胎児肺細胞を500ml容スピナーフラスコに
105cells／mlの密度で2.5mg／ml濃度のサイトデツ
クス（細胞培養用ビーズ担体、フアルマシア社
登録商標）と共に植え込み、37℃、５％の炭酸ガ
スを含む空気中で、成育培地として10％ウシ胎児
血清を含むメジウムMEMを300ml添加し、
60rpmの回転数で撹拌しながら懸濁培養する。８
日間培養し、細胞を充分増殖させた後、生理食塩
水で細胞が接着したビーズ担体を洗浄し、血清を
含まない0.5％ラクトアルブミン水解物を含むメ
ジウム199 300mlにおきかえ、60rpmの回転数で
撹拌しながら培養する。５日間毎に、この培地を
交換しながら25日培養し、一本鎖ｔ−PAを含む
培養液を回収する。 得られた培養液1.5を抗ウロキナーゼIg−Ｇセ
フオロースカラム通過後、フイブリンセフアロー
スカラム（1.5φ×12cm）に吸着させる。0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5M塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.5Mアルギニン溶液で溶出し、ｔ−PAの活性を
有する部分の溶液65mlを集める。ｔ−PAの活性
は68U／ml、比活性は1020U／A280であつた。 この溶液を0.1％ツイン80および25KIU／mlア
プロチニンを含む生理食塩水に透析後、コンカナ
バリンＡセフアロースカラム（1φ×25cm）に吸
着させ、1M塩化ナトリウム、0.1％ツイン80およ
び25KIU／mlアプロチニンを含む0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で洗浄後、当該溶液から0.4Mメチ
ルマンノシド、2Mロダンアンモニウム、0.1％ツ
イン80および25KIU／mlアプロチニンを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）まで直線的に濃度
を変え、ｔ−PAを溶出する。得られた溶液は流
量31ml、ｔ−PAの活性は102U／ml、比活性は
6500U／A280であつた。得られた溶液を限外
過で濃縮し、セフアデツクスＧ−150でゲル過
して、活性を有する部分を15ml回収した。活性は
151U／ml、比活性は13100U／A280であつた。 得られたｔ−PAはSDSポリアクリルアミド電
気泳動による分析で、１％ドデジタル硫酸ナトリ
ウム、１％β−メルカプトエタノールおよび20％
グリセリン存在下、100℃５分間の還元処理で分
解しないことから、一本鎖であることが確められ
た。 （発明の効果） 後記実施例の結果から明らかなように、本発明
によれば、一本鎖ｔ−PAから二本鎖ｔ−PAへの
変換が防止され、安定に保持される。 （実施例） 実験例 (1) ゼラチンの種類による効果 0.15M塩化ナトリウム、0.02％ツイン80を含
む水溶液に、一本鎖ｔ−PA100U／mlとなるよ
うに添加する。この溶液に安定化剤として種々
のゼラチンを添加し、37℃でインキユベート
し、０日、２日、５日にフイブリン平板法にて
活性残存率を測定し、また、合成基質Boc−
Phe−Ser−Ang−MCAに対する水解活性を測
定した。 結果を第１表に示す。
【表】
(2) (1)と同様に調製した溶液に、0.1％または１
％の安定化剤を添加し、４℃に保存し、０日、
10日、20日にPA活性および合成基質水解活性
を(1)と同様にして測定した。 なお、コントロールは無添加、比較としてア
ルブミンを添加したもの用いた。 結果を第２表に示す。
％の安定化剤を添加し、４℃に保存し、０日、
10日、20日にPA活性および合成基質水解活性
を(1)と同様にして測定した。 なお、コントロールは無添加、比較としてア
ルブミンを添加したもの用いた。 結果を第２表に示す。
【表】
以上の結果から、一本鎖ｔ−PAに酸処理ゼラ
チンを添加することにより、二本鎖への変換が防
止され、安定に保持されていることがわかる。一
方、安定化剤として知られているアルブミンに
は、この変換防止効果はなかつた。また、ｔ−
PAのPA活性に対しては影響しないことが明らか
である。 製剤例 組織プラスミノーゲンアクチベーアー 24000単位 酸処理ゼラチン 20mg アンニトール 100mg 塩化ナトリウム 7.8mg リン酸ナトリウム 15.4mg 上記成分を注射用蒸留水２mlに溶解し、無菌バ
イアルに入れ、−30℃〜−40℃で２時間予備凍結
し、−30℃〜＋20℃、真空度0.05〜0.1Torrで35時
間、一次乾燥し、次いで、30℃、真空度0.01〜
0.05Torrで５時間、二次乾燥して、注射用バイ
アルを製造した。
チンを添加することにより、二本鎖への変換が防
止され、安定に保持されていることがわかる。一
方、安定化剤として知られているアルブミンに
は、この変換防止効果はなかつた。また、ｔ−
PAのPA活性に対しては影響しないことが明らか
である。 製剤例 組織プラスミノーゲンアクチベーアー 24000単位 酸処理ゼラチン 20mg アンニトール 100mg 塩化ナトリウム 7.8mg リン酸ナトリウム 15.4mg 上記成分を注射用蒸留水２mlに溶解し、無菌バ
イアルに入れ、−30℃〜−40℃で２時間予備凍結
し、−30℃〜＋20℃、真空度0.05〜0.1Torrで35時
間、一次乾燥し、次いで、30℃、真空度0.01〜
0.05Torrで５時間、二次乾燥して、注射用バイ
アルを製造した。
Claims (1)
- １ 一本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター
に酸処理ゼラチンを添加することを特徴とする一
本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーターの安定
化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59102708A JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59102708A JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60248621A JPS60248621A (ja) | 1985-12-09 |
| JPH0527607B2 true JPH0527607B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=14334765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59102708A Granted JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60248621A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62292729A (ja) * | 1986-06-12 | 1987-12-19 | Toyobo Co Ltd | ヒト子宮組織由来プラスミノ−ゲン活性化因子製剤 |
| WO2011149016A1 (ja) * | 2010-05-26 | 2011-12-01 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 血栓溶解酵素含有複合体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58224687A (ja) * | 1982-06-24 | 1983-12-27 | Toubishi Yakuhin Kogyo Kk | プラスミノ−ゲン活性化酵素剤及びその新規製造方法 |
-
1984
- 1984-05-23 JP JP59102708A patent/JPS60248621A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60248621A (ja) | 1985-12-09 |
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