JPH05276997A - カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット - Google Patents
カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キットInfo
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- JPH05276997A JPH05276997A JP7980192A JP7980192A JPH05276997A JP H05276997 A JPH05276997 A JP H05276997A JP 7980192 A JP7980192 A JP 7980192A JP 7980192 A JP7980192 A JP 7980192A JP H05276997 A JPH05276997 A JP H05276997A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 直接的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なカ
ンピロバクター属細菌の検出に用いるオリゴヌクレオチ
ドを提供する。 【構成】 配列表の配列番号１に示す核酸配列を有する
か、またはそれらの相補的配列を有するカンピロバクタ
ー属細菌検出用オリゴヌクレオチド、および該ヌクレオ
チドを標識化した標識オリゴヌクレオチドおよび該オリ
ゴヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドを使用す
る試料中のカンピロバクター属細菌の検出法および検出
用試薬キット。
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ドを提供する。 【構成】 配列表の配列番号１に示す核酸配列を有する
か、またはそれらの相補的配列を有するカンピロバクタ
ー属細菌検出用オリゴヌクレオチド、および該ヌクレオ
チドを標識化した標識オリゴヌクレオチドおよび該オリ
ゴヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドを使用す
る試料中のカンピロバクター属細菌の検出法および検出
用試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はカンピロバクター（Camp
ylobacter ）属細菌を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
ylobacter ）属細菌を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
【０００２】
【従来の技術】カンピロバクター属細菌は、イヌ、ヤ
ギ、ニワトリ、ウシなどの家畜の病原菌であって、流
産、下痢症などを起こすことで知られている。ヒトの下
痢症の起炎菌としては主にカンピロバクター・ジェジュ
ニ(C.jejuni)、カンピロバクター・コリ(C.coli)などが
知られている。これらの細菌は食中毒原因菌として認め
られている。これらの細菌はもともとイヌ、七面鳥、ヤ
ギ、ブタ、ニワトリなどの腸管に生存しており、食肉を
汚染する場合もあり、食品検査の項目としても注目を集
めている。食品を摂取してから発病までの潜伏期間は平
均して、２〜５日、症状は下痢、腹痛、発熱、嘔吐など
の胃腸炎症状である。また場合によっては菌血症を起こ
すことがあり、臨床上重要な菌である。カンピロバクタ
ー属細菌の培養には一般にスキロー培地などの特殊な培
地を用い、酸素濃度が３〜１０％の絶対微好気性条件を
必要とするなど、その培養は容易ではない。またこの細
菌は死滅しやすく、材料を採取した後、２〜３時間以内
に検査する必要がある。一般に下痢などの患者から便検
体を採取しても直ちに検査することは困難である。特に
外来患者、食中毒などの場合は検体採取後１〜２日経過
した検体を検査することになる。これらの場合カンピロ
バクター属菌はほとんど死滅しており、検査結果に大き
く影響することになる。最近、カンピロバクター・ピロ
リ(C.pylori)がヒトの胃・十二指腸粘膜から分離され、
潰瘍との関係が論じられているが、この細菌が下痢症と
関連があるとの報告はない。最近の研究ではカンピロバ
クター・ピロリはカンピロバクター属としては扱わない
でヘリコバクター(Helicobacter)属として分類されてい
る。 カンピロバクター属細菌の病原性の原因は充分解
明されておらず、毒素などの因子は判っていない。近
年、ＤＮＡプローブを初めとする遺伝子診断による細菌
の同定や毒素遺伝子の検出が多くなされている。カンピ
ロバクター属細菌の場合一般にリボゾーマルＲＮＡをコ
ードする遺伝子がプローブとして使用されている。この
リボゾーマルＲＮＡの遺伝子配列は既に発表されている
（例えばジャーナル・オブ・バクテリオロジー Journal
of Bacteriology;169巻2173頁1987年）。またカンピロ
バクター属細菌検出用の核酸フラグメントも公知である
（特開平 2-84200号公報、特開平2-154700号公報、特開
平3-112498号公報）。これらの配列はカンピロバクター
・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバク
ター・コリ（C. coli ）の検出用であり、その他のカン
ピロバクター属細菌の検出には適当でない。
ギ、ニワトリ、ウシなどの家畜の病原菌であって、流
産、下痢症などを起こすことで知られている。ヒトの下
痢症の起炎菌としては主にカンピロバクター・ジェジュ
ニ(C.jejuni)、カンピロバクター・コリ(C.coli)などが
知られている。これらの細菌は食中毒原因菌として認め
られている。これらの細菌はもともとイヌ、七面鳥、ヤ
ギ、ブタ、ニワトリなどの腸管に生存しており、食肉を
汚染する場合もあり、食品検査の項目としても注目を集
めている。食品を摂取してから発病までの潜伏期間は平
均して、２〜５日、症状は下痢、腹痛、発熱、嘔吐など
の胃腸炎症状である。また場合によっては菌血症を起こ
すことがあり、臨床上重要な菌である。カンピロバクタ
ー属細菌の培養には一般にスキロー培地などの特殊な培
地を用い、酸素濃度が３〜１０％の絶対微好気性条件を
必要とするなど、その培養は容易ではない。またこの細
菌は死滅しやすく、材料を採取した後、２〜３時間以内
に検査する必要がある。一般に下痢などの患者から便検
体を採取しても直ちに検査することは困難である。特に
外来患者、食中毒などの場合は検体採取後１〜２日経過
した検体を検査することになる。これらの場合カンピロ
バクター属菌はほとんど死滅しており、検査結果に大き
く影響することになる。最近、カンピロバクター・ピロ
リ(C.pylori)がヒトの胃・十二指腸粘膜から分離され、
潰瘍との関係が論じられているが、この細菌が下痢症と
関連があるとの報告はない。最近の研究ではカンピロバ
クター・ピロリはカンピロバクター属としては扱わない
でヘリコバクター(Helicobacter)属として分類されてい
る。 カンピロバクター属細菌の病原性の原因は充分解
明されておらず、毒素などの因子は判っていない。近
年、ＤＮＡプローブを初めとする遺伝子診断による細菌
の同定や毒素遺伝子の検出が多くなされている。カンピ
ロバクター属細菌の場合一般にリボゾーマルＲＮＡをコ
ードする遺伝子がプローブとして使用されている。この
リボゾーマルＲＮＡの遺伝子配列は既に発表されている
（例えばジャーナル・オブ・バクテリオロジー Journal
of Bacteriology;169巻2173頁1987年）。またカンピロ
バクター属細菌検出用の核酸フラグメントも公知である
（特開平 2-84200号公報、特開平2-154700号公報、特開
平3-112498号公報）。これらの配列はカンピロバクター
・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバク
ター・コリ（C. coli ）の検出用であり、その他のカン
ピロバクター属細菌の検出には適当でない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、直接
的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なカンピロバクター
属細菌の検出に用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供
することである。
的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なカンピロバクター
属細菌の検出に用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供
することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはカンピロバ
クター属細菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子に関して種々
の検討を重ねた結果、カンピロバクター属細菌の検出に
適当なオリゴレオチドを得、それを用いた検出方法を確
立し、本発明を完成させるに至った。
クター属細菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子に関して種々
の検討を重ねた結果、カンピロバクター属細菌の検出に
適当なオリゴレオチドを得、それを用いた検出方法を確
立し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、カンピロバクター属
細菌に特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、配列表
・配列番号１（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴ
はウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示す核酸配列
を有するか、またはそれらに相補的な配列を有するカン
ピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドおよび上
記カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドを
標識化した標識オリゴヌクレオチドである。
細菌に特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、配列表
・配列番号１（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴ
はウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示す核酸配列
を有するか、またはそれらに相補的な配列を有するカン
ピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドおよび上
記カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドを
標識化した標識オリゴヌクレオチドである。
【０００６】また本発明は該カンピロバクター属細菌検
出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸
プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交
雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中
のカンピロバクター属細菌の検出法、または該カンピロ
バクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核
酸プライマーとするか、または標識化して得られた標識
プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、
プライマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を測
定することを特徴とする試料中のカンピロバクター属細
菌の増幅、検出法である。
出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸
プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交
雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中
のカンピロバクター属細菌の検出法、または該カンピロ
バクター属細菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核
酸プライマーとするか、または標識化して得られた標識
プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、
プライマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を測
定することを特徴とする試料中のカンピロバクター属細
菌の増幅、検出法である。
【０００７】さらに本発明はカンピロバクター属細菌に
特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、配列表・配列
番号１（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されてもよい）に示す核酸配列を有す
るか、またはそれらに相補的な配列を有するオリゴヌク
レオチドあるいは該オリゴヌクレオチドを標識化した標
識核酸オリゴヌクレオチドをプローブとして含むカンピ
ロバクター属細菌検出用試薬キットおよび上記オリゴヌ
クレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、または
標識化して得られた標識核酸オリゴヌクレオチドを標識
核酸プライマーとして含有するカンピロバクター属細菌
の増幅、検出用試薬キットである。
特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、配列表・配列
番号１（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されてもよい）に示す核酸配列を有す
るか、またはそれらに相補的な配列を有するオリゴヌク
レオチドあるいは該オリゴヌクレオチドを標識化した標
識核酸オリゴヌクレオチドをプローブとして含むカンピ
ロバクター属細菌検出用試薬キットおよび上記オリゴヌ
クレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、または
標識化して得られた標識核酸オリゴヌクレオチドを標識
核酸プライマーとして含有するカンピロバクター属細菌
の増幅、検出用試薬キットである。
【０００８】本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
の標識を導入することにより標識オリゴヌクレオチドを
得る。標識結合方法は通常の方法に従う。例えばリンカ
ーアームを有するヌクレトチドを配列表・配列番号１の
配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することに
より酵素を標識化することができる (Nucleic Acids Re
search,14,6115,1986 参照）。その一例として 5位にリ
ンカーアームを有するウリジンを特表昭60-500717 号公
報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学
合成し、上記オリゴヌクレオチドに導入することもでき
る。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識して
もよい。また標識は糖、リン酸基、塩基部分への結合で
あってもよい。
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
の標識を導入することにより標識オリゴヌクレオチドを
得る。標識結合方法は通常の方法に従う。例えばリンカ
ーアームを有するヌクレトチドを配列表・配列番号１の
配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することに
より酵素を標識化することができる (Nucleic Acids Re
search,14,6115,1986 参照）。その一例として 5位にリ
ンカーアームを有するウリジンを特表昭60-500717 号公
報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学
合成し、上記オリゴヌクレオチドに導入することもでき
る。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識して
もよい。また標識は糖、リン酸基、塩基部分への結合で
あってもよい。
【０００９】本発明のオリゴヌクレオチドを用いてカン
ピロバクター属細菌を検出する場合、（１）オリゴヌク
レオチドをプローブとして試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ
と交雑させ、交雑物を検出する方法、または（２）オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして試料中のＤＮＡまた
はＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等により伸長
反応を行い、得られた伸長物から目的核酸を検出する方
法がある。これらの場合、上述のようにオリゴヌクレオ
チドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵
素基質、放射性物質、不溶性担体などの標識を導入する
ことにより容易に目的物の検出が可能となる。標識オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、試料との
ハイブリダイゼーション後に、標識を適当な測定法で測
定することにより目的核酸を検出することができる。オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、ＤＮ
Ａポリメラーゼ等による遺伝子増幅（ＰＣＲ；特開昭62
-281号公報参照）を行なうことによりカンピロバクター
属細菌のみの遺伝子を特異的に増幅することができる。
ＰＣＲに際しては反応時に放射性標識ヌクレオチドを取
り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して
特異なバンドを検出することで容易にカンピロバクター
属細菌を検出することができる。また前述の標識オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物を直
接検出することも可能である。
ピロバクター属細菌を検出する場合、（１）オリゴヌク
レオチドをプローブとして試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ
と交雑させ、交雑物を検出する方法、または（２）オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして試料中のＤＮＡまた
はＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等により伸長
反応を行い、得られた伸長物から目的核酸を検出する方
法がある。これらの場合、上述のようにオリゴヌクレオ
チドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物質、発光物質、酵
素基質、放射性物質、不溶性担体などの標識を導入する
ことにより容易に目的物の検出が可能となる。標識オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、試料との
ハイブリダイゼーション後に、標識を適当な測定法で測
定することにより目的核酸を検出することができる。オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、ＤＮ
Ａポリメラーゼ等による遺伝子増幅（ＰＣＲ；特開昭62
-281号公報参照）を行なうことによりカンピロバクター
属細菌のみの遺伝子を特異的に増幅することができる。
ＰＣＲに際しては反応時に放射性標識ヌクレオチドを取
り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して
特異なバンドを検出することで容易にカンピロバクター
属細菌を検出することができる。また前述の標識オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物を直
接検出することも可能である。
【００１０】本発明のオリゴヌクレオチドは固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。またオリゴヌクレオチドをビオチ
ンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン結合
担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイにお
いてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを用
いれば、該オリゴヌクレオチドで特異的な測定が可能と
なり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低くて
もなんら問題はない。本発明のオリゴヌクレオチドまた
は標識オリゴヌクレオチドを試料中のＤＮＡまたはＲＮ
Ａと交雑反応させるハイブリダーゼーションバッファー
としては、例えば 5xSSC, 0.5%ウシ血清アルブミン、0.
5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウムを
含む緩衝液などがある。交雑条件は、通常の条件に従
う。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。またオリゴヌクレオチドをビオチ
ンで標識し、ハイブリダイゼーション後、アビジン結合
担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイにお
いてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを用
いれば、該オリゴヌクレオチドで特異的な測定が可能と
なり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低くて
もなんら問題はない。本発明のオリゴヌクレオチドまた
は標識オリゴヌクレオチドを試料中のＤＮＡまたはＲＮ
Ａと交雑反応させるハイブリダーゼーションバッファー
としては、例えば 5xSSC, 0.5%ウシ血清アルブミン、0.
5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウムを
含む緩衝液などがある。交雑条件は、通常の条件に従
う。
【００１１】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。 実施例１ (1) オリゴヌクレオチドの合成 リンカーアームを有するカンピロバクター属細菌検出用
のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機380A型 (アプラ
イド・バイオシステムズ社) を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は、以下のとおりであ
る。 5'-ATCCGAACTGGGACAXATTTTATAGATT-3' 該配列中、Ｘは 5位にリンカーアームを有するウリジン
を示す。このＸは特表昭60-500717 号公報に開示された
合成法によりデオキシウリジンから化学合成により調製
し、オリゴヌクレオチドに導入した。該配列は配列表・
配列番号１の配列の一部のＴをＸに置換したものであ
る。合成されたリンカーオリゴヌクレチドは 27%アンモ
ニア水で55℃,4時間脱保護処理を施した後、陰イオン交
換高速液体クロマトグラフィーMono-Q FPRC(ファルマシ
ア社) を用いて精製した。0.2 μmol スケールの合成を
行い、約11.5A260(260nmにおける吸光度により求めた絶
対量) のリンカーオリゴヌクオレチドを得た。
する。 実施例１ (1) オリゴヌクレオチドの合成 リンカーアームを有するカンピロバクター属細菌検出用
のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機380A型 (アプラ
イド・バイオシステムズ社) を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は、以下のとおりであ
る。 5'-ATCCGAACTGGGACAXATTTTATAGATT-3' 該配列中、Ｘは 5位にリンカーアームを有するウリジン
を示す。このＸは特表昭60-500717 号公報に開示された
合成法によりデオキシウリジンから化学合成により調製
し、オリゴヌクレオチドに導入した。該配列は配列表・
配列番号１の配列の一部のＴをＸに置換したものであ
る。合成されたリンカーオリゴヌクレチドは 27%アンモ
ニア水で55℃,4時間脱保護処理を施した後、陰イオン交
換高速液体クロマトグラフィーMono-Q FPRC(ファルマシ
ア社) を用いて精製した。0.2 μmol スケールの合成を
行い、約11.5A260(260nmにおける吸光度により求めた絶
対量) のリンカーオリゴヌクオレチドを得た。
【００１２】(2) 酵素標識オリゴヌクレオチドの合成 上記リンカーオリゴヌクレオチドとそのリンカーアーム
を介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を文献
(Nucleic Acids Research,14,6115,1986)に従って以下
のとおり行なった。リンカーオリゴヌクレオチド 1.0 A
260 を 0.2M NaHCO3 60μl に溶解し、ここへスベリン
酸ジスクシニミジル（DSS ）1.25mgを加えて室温、２分
間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0) で平衡
化したSephadex G-25(ファルマシア) カラム (1cm φx3
0cm)でゲル濾過して過剰のDSS を除去した。末端のアミ
ノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更
にモル比で2倍等量のアルカリ性ホスファターゼ (ベー
リンガー・マンハイム社)(100mM NaHCO3, 3M NaCl に溶
解したもの) と室温、16時間反応させることでアルカリ
性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標
識プローブは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ
ーMono-Q FPLC （ファルマシア社）を用いて精製した。
標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ
（アミコン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。
を介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を文献
(Nucleic Acids Research,14,6115,1986)に従って以下
のとおり行なった。リンカーオリゴヌクレオチド 1.0 A
260 を 0.2M NaHCO3 60μl に溶解し、ここへスベリン
酸ジスクシニミジル（DSS ）1.25mgを加えて室温、２分
間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0) で平衡
化したSephadex G-25(ファルマシア) カラム (1cm φx3
0cm)でゲル濾過して過剰のDSS を除去した。末端のアミ
ノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更
にモル比で2倍等量のアルカリ性ホスファターゼ (ベー
リンガー・マンハイム社)(100mM NaHCO3, 3M NaCl に溶
解したもの) と室温、16時間反応させることでアルカリ
性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標
識プローブは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ
ーMono-Q FPLC （ファルマシア社）を用いて精製した。
標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ
（アミコン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。
【００１３】(3) 酵素標識オリゴヌクレオチドの検討 得られたアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブの
感度を以下の方法により検討した。菌株を1.5%寒天を含
むスキロー培地に接種し37℃で一晩培養した。生育した
コロニーを滅菌つまようじでナイロン膜に少量塗り付
け、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を固定し
た。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック(B
RL社) に膜を移し、25μｌのアルカリ性ホスファターゼ
標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーションバッ
ファー (5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、 0.5% ポリ
ビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム) 5ml を
加えてポリシーラーでシールし、50℃15分間プレハイブ
リダイゼーションを行なった。膜をポリバッグから取り
出し、洗浄液-1(1xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム)で5
0℃、 5分間で 2回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2(1x
SSC, 1%トリトン X-100) で50℃、 5分間で 2回、室温
5分間で 2回振とう洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSSC)で
室温 5分間で 2回振とう洗浄した。膜を新しいハイブリ
ダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M Tris-HCl,
0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3mg/ml ニトロブルーテトラ
ゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフェリールホス
フェート pH7.5）を入れ、ポリシーラーでシールし、37
℃で3 時間インキュベートした。アルカリ性ホスファタ
ーゼにより生じる紫色色素のスポットを目視により判定
した。結果を下記表１に示す。
感度を以下の方法により検討した。菌株を1.5%寒天を含
むスキロー培地に接種し37℃で一晩培養した。生育した
コロニーを滅菌つまようじでナイロン膜に少量塗り付
け、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を固定し
た。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック(B
RL社) に膜を移し、25μｌのアルカリ性ホスファターゼ
標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーションバッ
ファー (5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、 0.5% ポリ
ビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム) 5ml を
加えてポリシーラーでシールし、50℃15分間プレハイブ
リダイゼーションを行なった。膜をポリバッグから取り
出し、洗浄液-1(1xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム)で5
0℃、 5分間で 2回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2(1x
SSC, 1%トリトン X-100) で50℃、 5分間で 2回、室温
5分間で 2回振とう洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSSC)で
室温 5分間で 2回振とう洗浄した。膜を新しいハイブリ
ダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M Tris-HCl,
0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3mg/ml ニトロブルーテトラ
ゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフェリールホス
フェート pH7.5）を入れ、ポリシーラーでシールし、37
℃で3 時間インキュベートした。アルカリ性ホスファタ
ーゼにより生じる紫色色素のスポットを目視により判定
した。結果を下記表１に示す。
【００１４】
【表１】 感度９１％、特異性８６％と良好な結果を得た。
【００１５】参考例１ 実施例１で得られたアルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブの特異性をカンピロバクター属細菌以外の細菌
種を用いてクロスハイブリダイゼーションの有無を調べ
ることにより検討した。細菌は臨床分離株を用い、適当
な培地で増殖させ、実施例１と同様の方法で測定した。
結果はどの菌も陰性であった。下記表２に結果を示す。
プローブの特異性をカンピロバクター属細菌以外の細菌
種を用いてクロスハイブリダイゼーションの有無を調べ
ることにより検討した。細菌は臨床分離株を用い、適当
な培地で増殖させ、実施例１と同様の方法で測定した。
結果はどの菌も陰性であった。下記表２に結果を示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【発明の効果】本発明によりカンピロバクター属細菌の
検出を迅速、簡便に特異的且つ高感度で実施することが
可能となった。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応
のプライマーとしても、直接検出用のプローブとしても
用いることが可能である。特に増幅反応では高い検出感
度のため少量の検体からでもカンピロバクター属細菌を
検出することが可能で、その臨床的意義は大きい。
検出を迅速、簡便に特異的且つ高感度で実施することが
可能となった。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応
のプライマーとしても、直接検出用のプローブとしても
用いることが可能である。特に増幅反応では高い検出感
度のため少量の検体からでもカンピロバクター属細菌を
検出することが可能で、その臨床的意義は大きい。
【００１８】
配列番号： 1 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..28 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンピロバクター属細菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 ATCCGAACTG GGACATATTT TATAGATT 28
列を有する。 配列 ATCCGAACTG GGACATATTT TATAGATT 28
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 熊谷 昇子 北海道札幌市東区北16条６−２−９ ラ・ ポール美香保Ａ705 (72)発明者 佐藤 美雪 兵庫県神戸市垂水区神陵台４−１−55− 307 (72)発明者 宝田 裕 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 柴田 秀司 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてい
てもよい。）に示す核酸配列を有するか、またはそれら
の相補的配列を有するカンピロバクター属細菌検出用オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載のカンピロバクター属細
菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化したカンピロバク
ター属細菌検出用標識オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１に記載のカンピロバクター属細
菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識
核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のカンピロバクター属細菌の検出法。 - 【請求項４】 請求項１のカンピロバクター属細菌検出
用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとする
かまたは標識化して得られた標識核酸プライマーを、試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させ、得られたプライマー伸長物を測定することを特徴
とする試料中のカンピロバクター属細菌の検出法。 - 【請求項５】 請求項１のカンピロバクター属細菌検出
用オリゴヌクレオチドを標識して得られた標識核酸プロ
ーブを含むことを特徴とする試料中のカンピロバクター
属細菌の検出用試薬キット。 - 【請求項６】 請求項１のカンピロバクター属細菌検出
用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして
含むかまたは標識化して得られた標識核酸プライマーを
含むことを特徴とするカンピロバクター属細菌の増幅、
検出用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7980192A JPH05276997A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7980192A JPH05276997A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276997A true JPH05276997A (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=13700324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7980192A Pending JPH05276997A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05276997A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1921158A1 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-14 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| US10932425B2 (en) | 2015-04-10 | 2021-03-02 | Eden Green Global Technologies Limited | Hydroponics |
| US11602106B2 (en) | 2018-07-06 | 2023-03-14 | Eden Green Global Technologies Limited | Hydroponics |
-
1992
- 1992-04-01 JP JP7980192A patent/JPH05276997A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1921158A1 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-14 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| JP2008118906A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
| US8207317B2 (en) | 2006-11-10 | 2012-06-26 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| US10932425B2 (en) | 2015-04-10 | 2021-03-02 | Eden Green Global Technologies Limited | Hydroponics |
| US12041892B2 (en) | 2015-04-10 | 2024-07-23 | Eden Green Global Technologies Limited | Hydroponic planter |
| US11602106B2 (en) | 2018-07-06 | 2023-03-14 | Eden Green Global Technologies Limited | Hydroponics |
| US12471546B2 (en) | 2018-07-06 | 2025-11-18 | Eden Green Global Technologies Limited | Hyrdoponics |
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