JPH05284993A - モノクロナル抗体 - Google Patents
モノクロナル抗体Info
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- JPH05284993A JPH05284993A JP4208553A JP20855392A JPH05284993A JP H05284993 A JPH05284993 A JP H05284993A JP 4208553 A JP4208553 A JP 4208553A JP 20855392 A JP20855392 A JP 20855392A JP H05284993 A JPH05284993 A JP H05284993A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 マウスの骨髄腫系統からの細胞およびエイメ
リア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ．ｔｅｎｅｌｌａ）のメ
ロゾイトで前もって免疫化したマウスからの脾細胞の融
合により形成されたハイブリドーマにより生産され： （ａ） エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）の
スポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と特異的に反応
し： （ｂ）ほぼ１５〜３５０ｋｄの範囲の分子量を有するエ
イメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）
の抗原と特異的に反応する：モノクロナル抗体。 【効果】 特定のエイメリア種メロゾイト抗原の単離、
同定に有利である。
リア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ．ｔｅｎｅｌｌａ）のメ
ロゾイトで前もって免疫化したマウスからの脾細胞の融
合により形成されたハイブリドーマにより生産され： （ａ） エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）の
スポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と特異的に反応
し： （ｂ）ほぼ１５〜３５０ｋｄの範囲の分子量を有するエ
イメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）
の抗原と特異的に反応する：モノクロナル抗体。 【効果】 特定のエイメリア種メロゾイト抗原の単離、
同定に有利である。
Description
【０００１】本発明は、寄生虫エイメリア・テネラ（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイト（ｍｅｒ
ｏｚｏｉｔｅｓ）およびスポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏ
ｉｔｅｓ）に対して特異的に反応するモノクロナル（ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を得ることに関する。エイメ
リア・テネラ（Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ）に対する抗体を
生産するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の培養
物を記載する。メロゾイトの抗原を同定し、特性づけ
る。これらの抗原は、ある種のモノクロナル抗体と一緒
に、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）の予防
および処置に有効である。本発明の抗原は、コクシジウ
ム症に対するワクチンとして有用である。背景として、
コクシジウム症は種々の原生動物の寄生虫により引き起
こされる動物の病気である。鳥類のコクシジウム症は、
エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の種々の種により引き
起こされる食用飼鳥類の破壊的な病気である。この病気
は、無性および有性の両者の段階から成る複雑な生活環
を有する。ニワトリは、糞便に一般に関連する自由に生
きる接合子嚢の摂取後に、この病気に初めに感染する。
接合子嚢は、ニワトリの消化管中で発育して侵入的な無
性のスポロゾイトになる。スポロゾイトは上皮細胞に侵
入感染し、発育してシゾント（ｓｃｈｉｚｏｎｔｓ）と
して知られる多核の構造体になる。各シゾントは成熟
し、究極的にメロゾイトとして知られる侵入的な無性の
構造体を遊離する。これらのメロゾイトは、感染された
細胞を残し、そして他の上皮細胞を再び侵す。スポロゾ
イトおよびメロゾイトを含む多数の侵入的な無性段階
は、コクシジウム症の病理学の多くの原因となる。メロ
ゾイトが配偶子母細胞に分化するとき、コクシジウム症
の有性サイクルが開始される。配偶子合体（ｆｅｒｔｉ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こり、そして接合子嚢として知
られる配偶子合体の生産物は糞便中に放出される。こう
して、寄生虫の生活環が完結される。ニワトリにおい
て、代表種のエイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔ
ｅｎｅｌｌａ）の生活環がは約７〜９日で完結する。
ｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイト（ｍｅｒ
ｏｚｏｉｔｅｓ）およびスポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏ
ｉｔｅｓ）に対して特異的に反応するモノクロナル（ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を得ることに関する。エイメ
リア・テネラ（Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ）に対する抗体を
生産するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の培養
物を記載する。メロゾイトの抗原を同定し、特性づけ
る。これらの抗原は、ある種のモノクロナル抗体と一緒
に、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）の予防
および処置に有効である。本発明の抗原は、コクシジウ
ム症に対するワクチンとして有用である。背景として、
コクシジウム症は種々の原生動物の寄生虫により引き起
こされる動物の病気である。鳥類のコクシジウム症は、
エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の種々の種により引き
起こされる食用飼鳥類の破壊的な病気である。この病気
は、無性および有性の両者の段階から成る複雑な生活環
を有する。ニワトリは、糞便に一般に関連する自由に生
きる接合子嚢の摂取後に、この病気に初めに感染する。
接合子嚢は、ニワトリの消化管中で発育して侵入的な無
性のスポロゾイトになる。スポロゾイトは上皮細胞に侵
入感染し、発育してシゾント（ｓｃｈｉｚｏｎｔｓ）と
して知られる多核の構造体になる。各シゾントは成熟
し、究極的にメロゾイトとして知られる侵入的な無性の
構造体を遊離する。これらのメロゾイトは、感染された
細胞を残し、そして他の上皮細胞を再び侵す。スポロゾ
イトおよびメロゾイトを含む多数の侵入的な無性段階
は、コクシジウム症の病理学の多くの原因となる。メロ
ゾイトが配偶子母細胞に分化するとき、コクシジウム症
の有性サイクルが開始される。配偶子合体（ｆｅｒｔｉ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こり、そして接合子嚢として知
られる配偶子合体の生産物は糞便中に放出される。こう
して、寄生虫の生活環が完結される。ニワトリにおい
て、代表種のエイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔ
ｅｎｅｌｌａ）の生活環がは約７〜９日で完結する。
【０００２】エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐ
ｐ．）により家禽産業へ与えられる莫大な経済的損失の
ため、前記寄生虫に対するワクチンは高度に望ましい。
寄生虫の生活環は複雑であり、かつ各段階に存在する抗
原の量は変動するため、不活性化した寄生虫または殺し
た寄生虫は不変の免疫性を過去において発生しないこと
が観察されてきた。この問題の１つの解決法は、特定の
抗原を寄生虫から単離し、特性づけ、そしてそれらを十
分な量で投与して免疫化剤として作用させることであ
る。好ましくは、このような抗原はすべての重要な種に
よる感染に対する保護を提供するであろう。エイメリア
（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の種、ならびに同一種の生活
環の異る段階、は共通の抗原および特別の抗原を有する
ことが知られている〔Ｃｅｒｎａ，Ｚ，Ｆｏｌｉｓ Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｐｒａｑｕｅ）１７：１
３５−１４０（１９７０）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ
ｌ.，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：８７９−８８８（１９７
８）；Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１
２−１２２（１９５９）；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．５：７９−９２（１９６２）；およびＴ
ａｎｉｅｌｉａｎ ｅｔ ａｌ.，Ａｃｔａ Ｐａｒａ
ｓｉｔｏｌ．Ｙｕｇｏｓｌ．７：７９−８４（１９７
６）〕。また、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）への免疫
性の発現は種特異的であり、そして家禽のある種におい
て、有意の系統特異的免疫性が存在することが知られて
いる〔Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｔ．Ｋ．；Ｉｎ Ｌｏｎｇ，
Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｖｉａｎ Ｃｏ
ｃｃｉｄｉｏｓｉｓ，ｐｐ．５７−１２５，Ｐｒｏｃ．
１３ｔｈ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．Ｓｙｍｐ．（１９
７８）；Ｊｏｙｎｅ ｒ，Ｌ．Ｐ．，Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．５９：７２５−７３２（１９６９）；Ｌｏｎｇ，
Ｐ．Ｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６９：３３７−３４７
（１９７４）；およびＬｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒ
ａｓｅｔｏｌ．７９：４５１−４５７（１９７９）〕。
現在、鳥類または哺乳類の宿主において防御免疫を刺激
することができるエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種の免
疫原はまだ単離あるいは同定されてきていない。このよ
うなエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の免疫原は、コクシ
ジウム症に対して有効な免疫化を提供するように思われ
る。
ｐ．）により家禽産業へ与えられる莫大な経済的損失の
ため、前記寄生虫に対するワクチンは高度に望ましい。
寄生虫の生活環は複雑であり、かつ各段階に存在する抗
原の量は変動するため、不活性化した寄生虫または殺し
た寄生虫は不変の免疫性を過去において発生しないこと
が観察されてきた。この問題の１つの解決法は、特定の
抗原を寄生虫から単離し、特性づけ、そしてそれらを十
分な量で投与して免疫化剤として作用させることであ
る。好ましくは、このような抗原はすべての重要な種に
よる感染に対する保護を提供するであろう。エイメリア
（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の種、ならびに同一種の生活
環の異る段階、は共通の抗原および特別の抗原を有する
ことが知られている〔Ｃｅｒｎａ，Ｚ，Ｆｏｌｉｓ Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｐｒａｑｕｅ）１７：１
３５−１４０（１９７０）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ
ｌ.，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：８７９−８８８（１９７
８）；Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１
２−１２２（１９５９）；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．５：７９−９２（１９６２）；およびＴ
ａｎｉｅｌｉａｎ ｅｔ ａｌ.，Ａｃｔａ Ｐａｒａ
ｓｉｔｏｌ．Ｙｕｇｏｓｌ．７：７９−８４（１９７
６）〕。また、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）への免疫
性の発現は種特異的であり、そして家禽のある種におい
て、有意の系統特異的免疫性が存在することが知られて
いる〔Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｔ．Ｋ．；Ｉｎ Ｌｏｎｇ，
Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｖｉａｎ Ｃｏ
ｃｃｉｄｉｏｓｉｓ，ｐｐ．５７−１２５，Ｐｒｏｃ．
１３ｔｈ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．Ｓｙｍｐ．（１９
７８）；Ｊｏｙｎｅ ｒ，Ｌ．Ｐ．，Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．５９：７２５−７３２（１９６９）；Ｌｏｎｇ，
Ｐ．Ｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６９：３３７−３４７
（１９７４）；およびＬｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒ
ａｓｅｔｏｌ．７９：４５１−４５７（１９７９）〕。
現在、鳥類または哺乳類の宿主において防御免疫を刺激
することができるエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種の免
疫原はまだ単離あるいは同定されてきていない。このよ
うなエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の免疫原は、コクシ
ジウム症に対して有効な免疫化を提供するように思われ
る。
【０００３】リンパ球のハイブリドーマ技術の開発は、
エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の抗原に対して特
異的な抗体を比較的大量に生産する道具を提供する。特
異的抗体生産性細胞（脾細胞）を骨髄腫の細胞と融合す
ることにより、もとの感作抗原に対して特異的に向けら
れたモノクロナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を
生産することが可能である〔Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２５６：４
９５−４９７（１９７５）〕。前記寄生虫に対するモノ
クロナル抗体が得られる場合、感染された家禽または感
染しやすい家禽に対するこのような抗体を準備し、こう
してある程度の受動免疫をもつ宿主有機体を得ることが
可能であろう。モノクロナル抗体を生産するこのような
ハイブリドーマの培養物がいったん得られると、種々の
手順により、このような抗体を利用して、特定の抗原を
単離し、同定することが可能であり、前記抗原をワクチ
ンとして利用して能動免疫の系をもつ宿主有機体を提供
することができるであろう。ハイブリドーマの培養物お
よびモノクロナル抗体に関する種々の特許が知らててい
る（すなわち、米国特許第４，１７２，１２４号；同第
４，１９６，２６５号；同第４，２７１，１４５号；同
第４，３６１，５４９号；同第４，６３１，５５０号；
同第４，３６４，９３２号；同第４，３６４，９３３
号；同第４，３６４，９３４号；同第４，３６４，９３
５号；同第４，３６４，９３６号；同第４，３８１，２
９２号；および同第４，３８１，２９５号）。
エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の抗原に対して特
異的な抗体を比較的大量に生産する道具を提供する。特
異的抗体生産性細胞（脾細胞）を骨髄腫の細胞と融合す
ることにより、もとの感作抗原に対して特異的に向けら
れたモノクロナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を
生産することが可能である〔Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２５６：４
９５−４９７（１９７５）〕。前記寄生虫に対するモノ
クロナル抗体が得られる場合、感染された家禽または感
染しやすい家禽に対するこのような抗体を準備し、こう
してある程度の受動免疫をもつ宿主有機体を得ることが
可能であろう。モノクロナル抗体を生産するこのような
ハイブリドーマの培養物がいったん得られると、種々の
手順により、このような抗体を利用して、特定の抗原を
単離し、同定することが可能であり、前記抗原をワクチ
ンとして利用して能動免疫の系をもつ宿主有機体を提供
することができるであろう。ハイブリドーマの培養物お
よびモノクロナル抗体に関する種々の特許が知らててい
る（すなわち、米国特許第４，１７２，１２４号；同第
４，１９６，２６５号；同第４，２７１，１４５号；同
第４，３６１，５４９号；同第４，６３１，５５０号；
同第４，３６４，９３２号；同第４，３６４，９３３
号；同第４，３６４，９３４号；同第４，３６４，９３
５号；同第４，３６４，９３６号；同第４，３８１，２
９２号；および同第４，３８１，２９５号）。
【０００４】動物の飼育の領域、より詳しくは食用飼鳥
類の産業におけるコクシジウム症の経済的効果の前述の
考察に照して、原生動物の寄生虫の抑制は高度に望まし
い。したがって、本発明の目的は、寄生虫のエイメリア
・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイトに対し
て得られた新規なかつ有用なモノクロナル抗体を提供す
ることである。他の目的は、家禽のコクシジウム症を抑
制するためのワクチンとして有用なエイメリア・テネラ
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）の特定の抗原を単離しかつ同
定することである。これらの目的は以下の説明から明ら
かとなり、とくに特許請求の範囲に記述されている。
類の産業におけるコクシジウム症の経済的効果の前述の
考察に照して、原生動物の寄生虫の抑制は高度に望まし
い。したがって、本発明の目的は、寄生虫のエイメリア
・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイトに対し
て得られた新規なかつ有用なモノクロナル抗体を提供す
ることである。他の目的は、家禽のコクシジウム症を抑
制するためのワクチンとして有用なエイメリア・テネラ
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）の特定の抗原を単離しかつ同
定することである。これらの目的は以下の説明から明ら
かとなり、とくに特許請求の範囲に記述されている。
【０００５】エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔ
ｅｎｅｌｌａ）は、ニワトリの盲腸に感染する種であ
り、感染した動物における血液の重い病変を起こす、と
くに破壊的な寄生虫である。エイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）はその生活環において２つのメロゾ
イト段階を有し、それらの段階はそれぞれ第１世代およ
び第２世代のメロゾイトと表示される。エイメリア・テ
ネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）に対する免疫は、その生
活環の無性のメロゾイト段階の間に発現することが知ら
れている〔Ｌｏｎｇ，Ｐ．（ｅｄ.），Ｔｈｅ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｃｏｃｃｉｄ ｉａ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８２）〕。
ｅｎｅｌｌａ）は、ニワトリの盲腸に感染する種であ
り、感染した動物における血液の重い病変を起こす、と
くに破壊的な寄生虫である。エイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）はその生活環において２つのメロゾ
イト段階を有し、それらの段階はそれぞれ第１世代およ
び第２世代のメロゾイトと表示される。エイメリア・テ
ネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）に対する免疫は、その生
活環の無性のメロゾイト段階の間に発現することが知ら
れている〔Ｌｏｎｇ，Ｐ．（ｅｄ.），Ｔｈｅ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｃｏｃｃｉｄ ｉａ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８２）〕。
【０００６】エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌ
ａ）のメロゾイトの調製物は、後述の手順に従い、マウ
スを免疫化して、究極的にモノクロナル抗体を発生させ
るために使用される。これらのモノクロナル抗体を使用
して前記寄生虫の抗原を同定する。これらのモノクロナ
ル抗体をさらに評価して、前記寄生虫の生体内の生長を
中和するそれらの能力をアッセイする。エイメリア（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ）の少なくとも１種の種と反応し、あるい
はメロゾイトまたはスポロゾイトと反応するモノクロナ
ル抗体を引き出し、そして前記寄生虫の生長の中和を示
す抗原は、防御抗原と考えられる。防御抗原は、家禽類
のコクシジウム症に対するワクチンの開発のための潜在
的な候補と見なされる。
ａ）のメロゾイトの調製物は、後述の手順に従い、マウ
スを免疫化して、究極的にモノクロナル抗体を発生させ
るために使用される。これらのモノクロナル抗体を使用
して前記寄生虫の抗原を同定する。これらのモノクロナ
ル抗体をさらに評価して、前記寄生虫の生体内の生長を
中和するそれらの能力をアッセイする。エイメリア（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ）の少なくとも１種の種と反応し、あるい
はメロゾイトまたはスポロゾイトと反応するモノクロナ
ル抗体を引き出し、そして前記寄生虫の生長の中和を示
す抗原は、防御抗原と考えられる。防御抗原は、家禽類
のコクシジウム症に対するワクチンの開発のための潜在
的な候補と見なされる。
【０００７】次の実施例により、本発明をさらに説明す
る。
る。
【０００８】
実施例 １定量的放射線免疫アッセイ 抗体の量を評価するために、定量的放射線免疫アッセイ
を開発した。グルタルアルデヒド固定スポロゾイトまた
はメロゾイト〔通常２〜５×１０5／ウェル（ｗｅｌ
ｌ）〕を９６のウェルのポリ塩化ビニルすなわちｅｍｏ
ｖａｗｅｌｌRのペトリ皿（ｐｌａｔｅ）（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ）上へ１４００×ｇにおいて１０分間遠心して、
有機体をウェルの底へ結合させた。ペトリ皿の底へ付着
するスポロゾイトまたはメロゾイトを、ハイブリドーマ
の培養上澄み中で寄生虫またはモノクロナル抗体で免疫
化したマウスの血清試料と反応させた。抗体とのインキ
ュベーションを、４℃において１６〜１８時間あるいは
室温において２時間実施した。結合した抗体を放射線標
識第２抗体１８７．１〔これはκ軽鎖（ｌｉｇｈｔｃｈ
ａｉｎ）に対して特異性のラットのモノクロナル抗 体
である）で検出した。抗マウスκ軽鎖抗体を、35Ｓ−メ
チオニンで生物学的に標識する〔Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｅ.，ｅｔ ａｌ.，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１：５−１１
（１９８２）〕。放射能を液体シンチレーションの計数
により監視する。引き続いて放射線免疫アッセイを、エ
イメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾ
イトから得られた表面膜へ適用して、免疫マウス血清中
の抗体と膜タンパク質との反応を確保する。
を開発した。グルタルアルデヒド固定スポロゾイトまた
はメロゾイト〔通常２〜５×１０5／ウェル（ｗｅｌ
ｌ）〕を９６のウェルのポリ塩化ビニルすなわちｅｍｏ
ｖａｗｅｌｌRのペトリ皿（ｐｌａｔｅ）（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ）上へ１４００×ｇにおいて１０分間遠心して、
有機体をウェルの底へ結合させた。ペトリ皿の底へ付着
するスポロゾイトまたはメロゾイトを、ハイブリドーマ
の培養上澄み中で寄生虫またはモノクロナル抗体で免疫
化したマウスの血清試料と反応させた。抗体とのインキ
ュベーションを、４℃において１６〜１８時間あるいは
室温において２時間実施した。結合した抗体を放射線標
識第２抗体１８７．１〔これはκ軽鎖（ｌｉｇｈｔｃｈ
ａｉｎ）に対して特異性のラットのモノクロナル抗 体
である）で検出した。抗マウスκ軽鎖抗体を、35Ｓ−メ
チオニンで生物学的に標識する〔Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｅ.，ｅｔ ａｌ.，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１：５−１１
（１９８２）〕。放射能を液体シンチレーションの計数
により監視する。引き続いて放射線免疫アッセイを、エ
イメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾ
イトから得られた表面膜へ適用して、免疫マウス血清中
の抗体と膜タンパク質との反応を確保する。
【０００９】実施例 ２ハイブリドーマ培養物の構成 ニワトリの腎細胞の一次培養物を、この分野で知られた
手順に従って、新しく嚢胞から出現した（ｅｘｃｙｓｔ
ｅｄ）スポロゾイトで感染させる。感染後５日に培地中
に放出されたメロゾイトを、３５０×ｇにおいて１０分
間遠心することにより収穫する。生まれてから１８週の
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロインドアジュバン
ト中の１×１０7の無傷または断片化エイメリア・テネ
ラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで腹腔内（ｉ．
ｐ．）免疫化する。動物を、初期の免疫化後、２×５週
の間隔で、培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中のメロゾイトを
２回腹腔内注射することにより促進（ｂｏｏｓｔ）す
る。各促進後３日に得られた血清を、直接免疫蛍光アッ
セイ（ＩＦＡ）および放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）に
より、エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メ
ロゾイトに対する抗体の存在について検査する。これら
のアッセイの両者は、グルタルアルデヒド固定寄生虫に
ついて実施する。
手順に従って、新しく嚢胞から出現した（ｅｘｃｙｓｔ
ｅｄ）スポロゾイトで感染させる。感染後５日に培地中
に放出されたメロゾイトを、３５０×ｇにおいて１０分
間遠心することにより収穫する。生まれてから１８週の
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロインドアジュバン
ト中の１×１０7の無傷または断片化エイメリア・テネ
ラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで腹腔内（ｉ．
ｐ．）免疫化する。動物を、初期の免疫化後、２×５週
の間隔で、培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中のメロゾイトを
２回腹腔内注射することにより促進（ｂｏｏｓｔ）す
る。各促進後３日に得られた血清を、直接免疫蛍光アッ
セイ（ＩＦＡ）および放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）に
より、エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メ
ロゾイトに対する抗体の存在について検査する。これら
のアッセイの両者は、グルタルアルデヒド固定寄生虫に
ついて実施する。
【００１０】ハイブリドーマは、確立された方法に従い
誘導する〔Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ.（１９８０），Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｄ．ｂｙ
Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ ＆ Ａ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ.，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１−９６〕。エイメリア・テ
ネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで免疫化した
２匹のマウスからの脾細胞を、３０％のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ １０００、Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）の存在下にＰ３骨髄腫、Ｐ３−×６３．Ａｇ
８．６５３の非分泌性（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ）
クローンと８分間融合する。融合した細胞を９６ウェル
の組織培養皿（Ｌｉｎｂｒｏ）中に分布させ、ＨＡＴ選
択培地〔Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１４５：７０９−７１０（１９６４）〕中で維
持する。ＨＡＴ培地は２０％の胎児子牛血清（Ｇｉｂｃ
ｏ）および１０％のＮＣＴＣ １０ （Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を含有する
ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変更イーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）培地中で調製する。ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ
ｓ）をインキュベーター内で３７℃および１０％のＣＯ
2において培養す る。
誘導する〔Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ.（１９８０），Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｄ．ｂｙ
Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ ＆ Ａ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ.，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１−９６〕。エイメリア・テ
ネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで免疫化した
２匹のマウスからの脾細胞を、３０％のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ １０００、Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）の存在下にＰ３骨髄腫、Ｐ３−×６３．Ａｇ
８．６５３の非分泌性（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ）
クローンと８分間融合する。融合した細胞を９６ウェル
の組織培養皿（Ｌｉｎｂｒｏ）中に分布させ、ＨＡＴ選
択培地〔Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１４５：７０９−７１０（１９６４）〕中で維
持する。ＨＡＴ培地は２０％の胎児子牛血清（Ｇｉｂｃ
ｏ）および１０％のＮＣＴＣ １０ （Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を含有する
ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変更イーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）培地中で調製する。ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ
ｓ）をインキュベーター内で３７℃および１０％のＣＯ
2において培養す る。
【００１１】培養物を、エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔ
ｅｎｅｌｌａ）メロゾイトと反応性の抗体について、Ｉ
ＦＡおよびＲＩＡ法により周期的にアッセイする。陽性
の培養物を、２４ウェルの組織培養皿のヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含まない培地中へ
移す。ハイブリドーマをラット胚線維芽供給細胞層の上
の軟質アガロース中でクローニングする〔Ｃｏｆｆｉｎ
ｓ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｉｓｏｌ.，７
９：４２９−４４０（１９７２）〕。陽性のハイブリド
ーマのクローンをサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）番
号で表示する（すなわち、クローン１５．８４．４は１
５．８４と表示するハイブリドーマのサブクローン＃４
である）。良好に特性づけられるサブクローンにより分
泌される免疫グルブリンの綱および亜綱を、寒天二重拡
散法により決定する。ハイブリドーマの洗浄剤（ＮＰ−
４０）可溶性の抽出液を、ウサギ抗マウス抗体試薬（Ｍ
ｅｌｏｙ）と一緒に使用する。
ｅｎｅｌｌａ）メロゾイトと反応性の抗体について、Ｉ
ＦＡおよびＲＩＡ法により周期的にアッセイする。陽性
の培養物を、２４ウェルの組織培養皿のヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含まない培地中へ
移す。ハイブリドーマをラット胚線維芽供給細胞層の上
の軟質アガロース中でクローニングする〔Ｃｏｆｆｉｎ
ｓ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｉｓｏｌ.，７
９：４２９−４４０（１９７２）〕。陽性のハイブリド
ーマのクローンをサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）番
号で表示する（すなわち、クローン１５．８４．４は１
５．８４と表示するハイブリドーマのサブクローン＃４
である）。良好に特性づけられるサブクローンにより分
泌される免疫グルブリンの綱および亜綱を、寒天二重拡
散法により決定する。ハイブリドーマの洗浄剤（ＮＰ−
４０）可溶性の抽出液を、ウサギ抗マウス抗体試薬（Ｍ
ｅｌｏｙ）と一緒に使用する。
【００１２】実施例 ３抗メロゾイトモノクロナル抗体の特性づけ ８種類の抗メロゾイトモノクロナル抗体の特性を表Iに
示す。モノクロナル抗体の大部分は、ＩＦＡならびにＲ
ＩＡによると、メロゾイトならびにスポロゾイトと反応
した。モノクロナル抗体１．９０および４．７６は、ス
ポロゾイトとＩＦＡにおいて反応せず、そしてＲＩＡに
おいて時には反応しなかった（表I中の＊参照）。モノ
クロナル抗体１５．８４はＩＦＡにおいてメロゾイトと
反応しなかったが、ＲＩＡにおいてスポロゾイトならび
にメロゾイトと等しく良好に反応した。表Ｉに要約した
データが示すように、抗メロゾイト融合から誘導された
モノクロナル抗体のすべてはエイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトならびにメロゾイト
と交差反応する。
示す。モノクロナル抗体の大部分は、ＩＦＡならびにＲ
ＩＡによると、メロゾイトならびにスポロゾイトと反応
した。モノクロナル抗体１．９０および４．７６は、ス
ポロゾイトとＩＦＡにおいて反応せず、そしてＲＩＡに
おいて時には反応しなかった（表I中の＊参照）。モノ
クロナル抗体１５．８４はＩＦＡにおいてメロゾイトと
反応しなかったが、ＲＩＡにおいてスポロゾイトならび
にメロゾイトと等しく良好に反応した。表Ｉに要約した
データが示すように、抗メロゾイト融合から誘導された
モノクロナル抗体のすべてはエイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトならびにメロゾイト
と交差反応する。
【００１３】
【表１】
【００１４】実施例 ４種々のスポロゾイトに対する抗メロゾイトモノクロナル
抗体の反応性 商業的に重要な５種類の球虫綱（ｃｏｃｃｉｄｉａ）の
種から誘導されたスポロゾイトに対してＩＦＡにより、
モノクロナル抗体をアッセイする。これらの実験からの
データを表ＩＩに要約する。エイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）から誘導されたスポロゾイトとＩＦ
Ａにおいて反応した６種類のモノクロナル抗体を使用し
て、種の交差反応性を研究する。結果が示すように、５
種類のモノクロナル抗体はエイメリア・ネカトリックス
（Ｅ. ｎｅｃａｔｒｉｘ）およびエイメリア・マクシ
マ（Ｅ. ｍａｘｉｍａ）と反応し、そして１種類のモ
ノクロナル抗体（１５．８４）は試験したすべてのエイ
メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の５種と反応した。
抗体の反応性 商業的に重要な５種類の球虫綱（ｃｏｃｃｉｄｉａ）の
種から誘導されたスポロゾイトに対してＩＦＡにより、
モノクロナル抗体をアッセイする。これらの実験からの
データを表ＩＩに要約する。エイメリア・テネラ（Ｅ.
ｔｅｎｅｌｌａ）から誘導されたスポロゾイトとＩＦ
Ａにおいて反応した６種類のモノクロナル抗体を使用し
て、種の交差反応性を研究する。結果が示すように、５
種類のモノクロナル抗体はエイメリア・ネカトリックス
（Ｅ. ｎｅｃａｔｒｉｘ）およびエイメリア・マクシ
マ（Ｅ. ｍａｘｉｍａ）と反応し、そして１種類のモ
ノクロナル抗体（１５．８４）は試験したすべてのエイ
メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の５種と反応した。
【００１５】
【表２】
【００１６】実施例 ５生体内中和のアッセイ モノクロナル抗体をアッセイする生体内手順を利用し
て、モノクロナル抗体を評価する。エイメリア・テネラ
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）スポロゾイトと反応する３種
類のモノクロナル抗体をこのアッセイにより評価する。
３種類の異るハイブリドーマから誘導された熱不活性化
腹水症体液を用いて、新しく単離したスポロゾイトを無
菌条件下でインキュベーションする。インキュベーショ
ン期間は室温において１時間である。次いで、スポロゾ
イトを生まれてから３週のニワトリの盲腸に外科的手順
により導入する。インキュベーション後５日間、寄生虫
の発育を起こさせる。この期間の終りにおいて、病変を
記録して感染の程度を評価する。これらの実験の結果
を、モノクロナル抗体により提供された保護％として表
わし、そして表ＩＩＩに示す。これらのデータが示すよ
うに、各抗体はこの試験系のある条件下で少なくとも部
分的に保護を与える。
て、モノクロナル抗体を評価する。エイメリア・テネラ
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）スポロゾイトと反応する３種
類のモノクロナル抗体をこのアッセイにより評価する。
３種類の異るハイブリドーマから誘導された熱不活性化
腹水症体液を用いて、新しく単離したスポロゾイトを無
菌条件下でインキュベーションする。インキュベーショ
ン期間は室温において１時間である。次いで、スポロゾ
イトを生まれてから３週のニワトリの盲腸に外科的手順
により導入する。インキュベーション後５日間、寄生虫
の発育を起こさせる。この期間の終りにおいて、病変を
記録して感染の程度を評価する。これらの実験の結果
を、モノクロナル抗体により提供された保護％として表
わし、そして表ＩＩＩに示す。これらのデータが示すよ
うに、各抗体はこの試験系のある条件下で少なくとも部
分的に保護を与える。
【００１７】
【表３】
【００１８】実施例 ６抗原の特性づけ モノクロナル抗体により認識されるエイメリア・テネラ
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）を、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により、次いでニトロセ
ルロースのブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）手順に
より同定する〔Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ
ｅｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：
４３５０−４３５４（１９７９）〕。
（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）を、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により、次いでニトロセ
ルロースのブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）手順に
より同定する〔Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ
ｅｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：
４３５０−４３５４（１９７９）〕。
【００１９】エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌ
ａ）のスポロゾイトおよびメロゾイトを、１５５ミリモ
ルのＮＨ4Ｃｌ、１．５ミリモルのＭｇＡｃ2、３０μｇ
／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤のルーペプチン（ｌｅｕｐ
ｅｐｔｉｎ）およびアンチペイン（ａｎｔｉｐａｉ
ｎ）、４ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルお
よびアプロチニン（２トリプシン阻害単位／ｍｌ）を含
有する１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の
１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で溶解（ｌｙｓ
ｅ）しかつ抽出する。この溶解手順は、０℃における３
０分のインキュベーションおよび引き続く２，５００×
ｇの３０分の遠心を含む。沈殿物を廃棄し、次いで、可
溶化された物質をゲル電気泳動に使用する。２−メルカ
プトエタノールで還元した試料のＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動を、７〜１５％のポリアクリルアミ
ドの勾配ゲル上の不連続のトリスグリシン系中で実施す
る。
ａ）のスポロゾイトおよびメロゾイトを、１５５ミリモ
ルのＮＨ4Ｃｌ、１．５ミリモルのＭｇＡｃ2、３０μｇ
／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤のルーペプチン（ｌｅｕｐ
ｅｐｔｉｎ）およびアンチペイン（ａｎｔｉｐａｉ
ｎ）、４ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルお
よびアプロチニン（２トリプシン阻害単位／ｍｌ）を含
有する１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の
１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で溶解（ｌｙｓ
ｅ）しかつ抽出する。この溶解手順は、０℃における３
０分のインキュベーションおよび引き続く２，５００×
ｇの３０分の遠心を含む。沈殿物を廃棄し、次いで、可
溶化された物質をゲル電気泳動に使用する。２−メルカ
プトエタノールで還元した試料のＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動を、７〜１５％のポリアクリルアミ
ドの勾配ゲル上の不連続のトリスグリシン系中で実施す
る。
【００２０】ＳＤＳ ＰＡＧＥ分離したタンパク質を、
ニトロセルロースフィルター上に電気泳動的に４５分間
移す。次いで、ニトロセルロースフィルターを、腹水症
の体液（１〜１００倍希釈）またはハイブリドーマから
の使用済みの培養流体と４℃において１６〜１８時間反
応させる。正常のウサギの血清を１０％の濃度ですべて
の抗体とのインキュベーションにおいてインキュベーシ
ョンした。結合したモノクロナル抗体は、125Ｉ標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ）と反応させることによって検出する。第
２抗体との反応は、通常室温において３〜５時間であ
る。結合しない第２抗体を洗浄により除去する。次い
で、ニトロセルロースフィルターを、コダック（Ｋｏｄ
ａｋ）Ｘ線フィルムＸＡＲ−５またはＳＢ−５で露光す
る。
ニトロセルロースフィルター上に電気泳動的に４５分間
移す。次いで、ニトロセルロースフィルターを、腹水症
の体液（１〜１００倍希釈）またはハイブリドーマから
の使用済みの培養流体と４℃において１６〜１８時間反
応させる。正常のウサギの血清を１０％の濃度ですべて
の抗体とのインキュベーションにおいてインキュベーシ
ョンした。結合したモノクロナル抗体は、125Ｉ標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ）と反応させることによって検出する。第
２抗体との反応は、通常室温において３〜５時間であ
る。結合しない第２抗体を洗浄により除去する。次い
で、ニトロセルロースフィルターを、コダック（Ｋｏｄ
ａｋ）Ｘ線フィルムＸＡＲ−５またはＳＢ−５で露光す
る。
【００２１】別法として、ブロット（ｂｌｏｔ）を、Ｂ
ＬＩＳＡ法により、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ
結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｉｌｅｓ）およびクロロ
ナフトール（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＢ2Ｏ2（Ｂａｋｅ
ｒ）を基質として使用して展開する。タンパク質の抗原
の分子量を分子量標準に関して決定する。
ＬＩＳＡ法により、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ
結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｉｌｅｓ）およびクロロ
ナフトール（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＢ2Ｏ2（Ｂａｋｅ
ｒ）を基質として使用して展開する。タンパク質の抗原
の分子量を分子量標準に関して決定する。
【００２２】モノクロナル抗体１８．８４により認識さ
れた抗原を例示する。モノクロナル抗体１５．８４は、
１３０±２０ｋｄの概算分子量の二重のもの（ｄｏｕｂ
ｌｅｔ）と反応する。しかしながら、１００ｋｄ程度の
タンパク質の分子量の推定を、使用する分子量標準に依
存して変動させて行った。１３０±２０ｋｄ種に加え
て、１５．８４も３００±５０ｋｄの見掛け分子量を有
する帯（ｂａｎｄ）と反応する。より大きい分子量の帯
は約１５〜２０％の抗原を構成し、そして多分１３０±
２０ｋｄ種の凝集物または重合体の形態である。タンパ
ク質抗原と反応しないことが知られているモノクロナル
抗体と用いる対照実験を使用して、抗メロゾイト抗体の
特異性を証明する。さらに、他の対照が証明するよう
に、モノクロナル抗体は寄生虫特異性であり、宿主特異
性のタンパク質と反応しない。
れた抗原を例示する。モノクロナル抗体１５．８４は、
１３０±２０ｋｄの概算分子量の二重のもの（ｄｏｕｂ
ｌｅｔ）と反応する。しかしながら、１００ｋｄ程度の
タンパク質の分子量の推定を、使用する分子量標準に依
存して変動させて行った。１３０±２０ｋｄ種に加え
て、１５．８４も３００±５０ｋｄの見掛け分子量を有
する帯（ｂａｎｄ）と反応する。より大きい分子量の帯
は約１５〜２０％の抗原を構成し、そして多分１３０±
２０ｋｄ種の凝集物または重合体の形態である。タンパ
ク質抗原と反応しないことが知られているモノクロナル
抗体と用いる対照実験を使用して、抗メロゾイト抗体の
特異性を証明する。さらに、他の対照が証明するよう
に、モノクロナル抗体は寄生虫特異性であり、宿主特異
性のタンパク質と反応しない。
【００２３】種々の抗体により認識される抗原の分子量
のデータを、表ＩＶに要約する。有意の特徴は、エイメ
リア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトにお
いて分子量≦２０ｋｄまたは＞１００ｋｄの範囲の免疫
原抗体の存在である。
のデータを、表ＩＶに要約する。有意の特徴は、エイメ
リア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトにお
いて分子量≦２０ｋｄまたは＞１００ｋｄの範囲の免疫
原抗体の存在である。
【００２４】
【表４】 表 ＩＶ 分子量のデータの要約 抗メロゾイト モノクロナル抗体 抗原の概算分子量 Ｍ１（１．９０） ３００±５０ｋｄ Ｍ２（４．７６） Ｍ６（１０．８４） １３０±２０ｋｄ Ｍ８（１５．８４） Ｍ３（２．０３） Ｍ４（１３．９０） １８±３ｋｄ Ｍ５（１０．０８） Ｍ７（８．０３） ――――――――――――――――――――――――――― モノクロナル抗体１５．８４は中和性抗体と考えられ、
そして認識された抗原は防御抗原と考えられる。さら
に、１５．８４はエイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅ
ｌｌａ）のメロゾイトおよびスポロゾイトならびにエイ
メリア・マクシマ（Ｅ. ｍａｘｉｍａ）、エイメリア
・ネカトリックス（Ｅ. ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメ
リア・アセルブリナ（Ｅ. ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）お
よびエイメリア・ブルネッチ（Ｅ. ｂｒｕｎｅｔｔ
ｉ）から単離されたスポロゾイトと交差反応する。
そして認識された抗原は防御抗原と考えられる。さら
に、１５．８４はエイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅ
ｌｌａ）のメロゾイトおよびスポロゾイトならびにエイ
メリア・マクシマ（Ｅ. ｍａｘｉｍａ）、エイメリア
・ネカトリックス（Ｅ. ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメ
リア・アセルブリナ（Ｅ. ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）お
よびエイメリア・ブルネッチ（Ｅ. ｂｒｕｎｅｔｔ
ｉ）から単離されたスポロゾイトと交差反応する。
【００２５】前述の新規な抗体、１．９０、１５．８
４、１３．９０、１０．８４、８．０３および２．０３
は、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ，１２３０１ Ｐａｒ
ｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．２０８５２）に受託され、そ
してその永久的収集物に加えられた。番号１．９０は番
号ＨＢ８３３６を割当てられた。番号１５．８４は番号
ＨＢ８３３５を割当てられた。番号１３．９０は番号Ｈ
Ｂ８３３７を割当てられた。番号１０．８４は番号ＨＢ
８３８７を割当てられた。番号８．０３は番号ＨＢ８３
８８を割当てられ、そして番号２．０３は番号ＨＢ８３
８９を割当てられた。これらの抗体の利用は、特許およ
び商標の局長により３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４および３
５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２に従って権利を与えられること
決定されたものにとって、本願の係属中において可能で
あり、そしてＨＢ８３３３、ＨＢ８３３６、ＨＢ８３３
７、ＨＢ８３８７、ＨＢ８３８８、およびＨＢ８３８９
の公衆への入手可能性のすべての制限は本願へ特許が付
与されたとき最終的に排除される。
４、１３．９０、１０．８４、８．０３および２．０３
は、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ，１２３０１ Ｐａｒ
ｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．２０８５２）に受託され、そ
してその永久的収集物に加えられた。番号１．９０は番
号ＨＢ８３３６を割当てられた。番号１５．８４は番号
ＨＢ８３３５を割当てられた。番号１３．９０は番号Ｈ
Ｂ８３３７を割当てられた。番号１０．８４は番号ＨＢ
８３８７を割当てられた。番号８．０３は番号ＨＢ８３
８８を割当てられ、そして番号２．０３は番号ＨＢ８３
８９を割当てられた。これらの抗体の利用は、特許およ
び商標の局長により３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４および３
５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２に従って権利を与えられること
決定されたものにとって、本願の係属中において可能で
あり、そしてＨＢ８３３３、ＨＢ８３３６、ＨＢ８３３
７、ＨＢ８３８７、ＨＢ８３８８、およびＨＢ８３８９
の公衆への入手可能性のすべての制限は本願へ特許が付
与されたとき最終的に排除される。
【００２６】番号１．９０、ＨＢ８３３６、１５．８
４、ＨＢ８３３５、および１３．９０、ＨＢ８３３７は
すべてＡＴＣＣに１９８３年８月１６日に受託された。
番号１０．８４、ＨＢ８３８７、８．０３、ＨＢ８３８
８、および２．０３、ＨＢ８３８９はＡＴＣＣに１９８
３年１０月２０日に受託された。
４、ＨＢ８３３５、および１３．９０、ＨＢ８３３７は
すべてＡＴＣＣに１９８３年８月１６日に受託された。
番号１０．８４、ＨＢ８３８７、８．０３、ＨＢ８３８
８、および２．０３、ＨＢ８３８９はＡＴＣＣに１９８
３年１０月２０日に受託された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ロージー・ビツク−ハル・ウオン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08854 ピスカタウエイ・ロスホールブールバード 16 (72)発明者 パライア・タマナ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07730 ハズレツト・ビレツジグリーンウエイ８
Claims (5)
- 【請求項１】 マウスの骨髄腫系統からの細胞およびエ
イメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ． ｔｅｎｅｌｌ
ａ）のメロゾイトで前もって免疫化したマウスからの脾
細胞の融合により形成されたハイブリドーマにより生産
され； （ａ） エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）の
スポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と特異的に反応
し； （ｂ） ほぼ１５〜３５０ｋｄの範囲の分子量を有する
エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａ）の抗原と特異的に反応する； モノクロナル抗体。 - 【請求項２】 Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞
およびエイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）の
メロゾイトで前もって免疫化したマウスからの脾細胞の
融合により形成されたハイブリドーマにより生産された
特許請求の範囲第１項記載のモノクロナル抗体。 - 【請求項３】 クローン番号１．９０で表示されかつＡ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３３６として受託されたハイブリ
ドーマにより生産され；クローン番号４．７６で表示さ
れたハイブリドーマにより生産され；クローン番号２．
０３で表示されかつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８９とし
て受託されたハイブリドーマにより生産され；クローン
番号１３．９０で表示されかつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８
３３７として受託されたハイブリドーマにより生産さ
れ；クローン番号１０．０８で表示されたハイブリドー
マにより生産され；クローン番号１０．８４で表示され
かつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８７として受託されたハ
イブリドーマにより生産され；クローン番号８．０３で
表示されかつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８８として受託
されたハイブリドーマにより生産され；あるいはクロー
ン番号１５．８４で表示されかつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ
８３３５として受託されたハイブリドーマにより生産さ
れた特許請求の範囲第２項記載のモノクロナル抗体。 - 【請求項４】 工程： （ａ） エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）
のメロゾイトでマウスを免疫化し； （ｂ） 前記マウスから脾臓を取り出し、そして脾細胞
の懸濁液をつくり； （ｃ） 前記脾細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤
の存在下に融合させ； （ｄ） 融合した細胞を、融合しない骨髄腫細胞の生長
を支持しない媒質中で別々のウェル中で希釈しかつ培養
し； （ｅ） ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄み
を、エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）のメ
ロゾイトおよびスポロゾイトと反応性の抗体の存在につ
いて評価し； （ｆ） エイメリア・テネラ（Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ）
のメロゾイトまたはスポロゾイトと反応性の抗体を生産
するハイブリドーマを選択し、そしてそれをクローニン
グし；そして （ｇ） 抗体を前記クローンから回収する； ことを特徴とする方法により生産された、エイメリア・
テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイ
トまたはメロゾイトの抗原と反応するモノクロナル抗
体。 - 【請求項５】 ハイブリドーマのクローンＮｏ．１．９
０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３３６）、４．７６、２．
０３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８９）、１３．９０
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８３３７）、１０．０８、１０．８
４（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ８３８７）、８．０３（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＨＢ８３８８）または１５．８４（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＨＢ８３３５）を適当な媒質中で培養し、そし
て前記ハイブリドーマの培養物の上澄みから抗体を回収
することを特徴とするエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｓｐｐ．）のスポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と反
応するモノクロナル抗体の生産方法；あるいはマウスに
Ｎｏ．１．９０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３３６）、
４．７６、２．０３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８
９）、１３．９０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．８３３７）、１
０．０８、１０．８４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８
７）、８．０３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３８８）また
は１５．８４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８３３５）と表示
されるハイブリドーマの培養物を注入し、そして前記抗
原を前記マウスの腹水または血清から回収することによ
り生産されたエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐ
ｐ．）のスポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と反応す
る特許請求の範囲第１項記載のモノクロナル抗体。
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