JPS6072827A - エイメリア種のメロゾイトに対して反応性の抗原およびモノクロナル抗体 - Google Patents
エイメリア種のメロゾイトに対して反応性の抗原およびモノクロナル抗体Info
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- JPS6072827A JPS6072827A JP59170519A JP17051984A JPS6072827A JP S6072827 A JPS6072827 A JP S6072827A JP 59170519 A JP59170519 A JP 59170519A JP 17051984 A JP17051984 A JP 17051984A JP S6072827 A JPS6072827 A JP S6072827A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、寄生虫エイメリア・テネラ（旦土皿ｅｒｉａ
ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイト （ｍｅｒｏｚｏｉｔ
ｅｓ）およびスポロゾイト（ｓｐ。
ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイト （ｍｅｒｏｚｏｉｔ
ｅｓ）およびスポロゾイト（ｓｐ。
ｒｏｚｏｉｔｅｓ）に対して特異的に反応するモノクロ
ナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を得ることに関する
。エイメリアφテネラ（旦ユ −Ｖ」ｎｅｌｌａ）に対
する抗体を生産するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｆｄｏｍ
ａ） の培養物を記載する。メロゾイトの抗原を同定し
、特性づける。これらの抗原は、ある種のモノクロナル
抗体と一緒に、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉ
ｓ）の予防および処置に有効である。本発明の抗原は、
コクシジウム症に対するワクチンとして有用である。
ナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を得ることに関する
。エイメリアφテネラ（旦ユ −Ｖ」ｎｅｌｌａ）に対
する抗体を生産するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｆｄｏｍ
ａ） の培養物を記載する。メロゾイトの抗原を同定し
、特性づける。これらの抗原は、ある種のモノクロナル
抗体と一緒に、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉ
ｓ）の予防および処置に有効である。本発明の抗原は、
コクシジウム症に対するワクチンとして有用である。
背景として、コクシジウム症は種々の原生動物の寄生虫
により引き起こされる動物の病気である。鳥類のコクシ
ジウム症は、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の種々の
種により引き起こされる食用飼鳥類の破壊的な病気であ
る。この病気は、無性および有性の両者の段階から成る
複雑な生活環を有する。ニワトリは、糞便に一般に関連
する自由に生きる接合子嚢の摂取後に、この病気に初め
に感染する。接合子嚢は、ニワトリの消化管中で発育し
て侵入的な無性のスポロゾイトになる。
により引き起こされる動物の病気である。鳥類のコクシ
ジウム症は、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の種々の
種により引き起こされる食用飼鳥類の破壊的な病気であ
る。この病気は、無性および有性の両者の段階から成る
複雑な生活環を有する。ニワトリは、糞便に一般に関連
する自由に生きる接合子嚢の摂取後に、この病気に初め
に感染する。接合子嚢は、ニワトリの消化管中で発育し
て侵入的な無性のスポロゾイトになる。
スポロゾイトは上皮細胞に侵入感染し１発育してシゾン
ト（ｓｃｈｉｚｏｎｔｓ）として知られる多核の構造体
になる。各シゾントは成熟し、究極的にメロゾイトとし
て知られる侵入的な無性の構造体を遊離する。これらの
メロゾイトは、感染された細胞を残し、そして他の上皮
細胞を再び侵す。スポロゾイトおよびメロゾイトを含む
多数の侵入的な無性段階は、コクシジウム症の病理学の
多くの原因となる。メロゾイトが配偶子母細胞に分化す
るとき、コクシジウム症の有性サイクルが９− 開始される。配偶子合体（ｆｅｒｔ ｉ １ｉｚａｔｔ
ｏｎ）が起こり、そして接合子嚢として知られる配偶子
合体の生産物は糞便中に放出される。こうして、寄生虫
の生活環が完結される。ニワトリにおいて、代表種のエ
イメリア會テネラ（旦↓凹ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）
ｃ７）生活環かは約７〜９日で完結する。
ト（ｓｃｈｉｚｏｎｔｓ）として知られる多核の構造体
になる。各シゾントは成熟し、究極的にメロゾイトとし
て知られる侵入的な無性の構造体を遊離する。これらの
メロゾイトは、感染された細胞を残し、そして他の上皮
細胞を再び侵す。スポロゾイトおよびメロゾイトを含む
多数の侵入的な無性段階は、コクシジウム症の病理学の
多くの原因となる。メロゾイトが配偶子母細胞に分化す
るとき、コクシジウム症の有性サイクルが９− 開始される。配偶子合体（ｆｅｒｔ ｉ １ｉｚａｔｔ
ｏｎ）が起こり、そして接合子嚢として知られる配偶子
合体の生産物は糞便中に放出される。こうして、寄生虫
の生活環が完結される。ニワトリにおいて、代表種のエ
イメリア會テネラ（旦↓凹ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）
ｃ７）生活環かは約７〜９日で完結する。
エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓ上玉ユ）により家禽
産業へ与えられる莫大な経済的損失のため、前記寄生虫
に対するワクチンは高度に望ましい６寄生虫の生活環は
複雑であり、かつ各段階に存在する抗原の量は変動する
ため、不活性化した寄生虫または殺した寄生虫は不変の
免疫性を過去において発生しないことが観察されてきた
。この問題の１つの解決法は、特定の抗原を寄生虫から
単離し、特性づけ、そしてそれらを十分な量で投ｌｐ
して免疫化剤として作用させることである。好ましくは
、このような抗原はすべての重要な種による感染に対す
る保護を提供するであろう。エイｌＯ− メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の種、ならびに同一種
の生活環の異る段階、は共通の抗原および特別の抗原を
有することが知られている［ＣｅｒＨａ、Ｚ、）−０１
ｉａ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉ ｃａ （Ｐｒａｑｕ
ｅ）１７：１３５−１４０（１９７０）；Ｄａｖｉｓ
ｅ↓ ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏ １．３４：８７９−８８
８ （１９７８）；Ｒｏｓｅ、Ｍ、Ｅ、、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、２：１１２−１２２（１９５９）；Ｒｏｓｅ ｅ↓
ａ ｌ 、 、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ 、 ５ ： ７９
−９２ （１９６２）；およびＴａｎ１ｅｌｉａｎ ｅ
↓ Ａ１、、Ａｃｔａ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、Ｙｕｇ。
産業へ与えられる莫大な経済的損失のため、前記寄生虫
に対するワクチンは高度に望ましい６寄生虫の生活環は
複雑であり、かつ各段階に存在する抗原の量は変動する
ため、不活性化した寄生虫または殺した寄生虫は不変の
免疫性を過去において発生しないことが観察されてきた
。この問題の１つの解決法は、特定の抗原を寄生虫から
単離し、特性づけ、そしてそれらを十分な量で投ｌｐ
して免疫化剤として作用させることである。好ましくは
、このような抗原はすべての重要な種による感染に対す
る保護を提供するであろう。エイｌＯ− メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の種、ならびに同一種
の生活環の異る段階、は共通の抗原および特別の抗原を
有することが知られている［ＣｅｒＨａ、Ｚ、）−０１
ｉａ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉ ｃａ （Ｐｒａｑｕ
ｅ）１７：１３５−１４０（１９７０）；Ｄａｖｉｓ
ｅ↓ ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏ １．３４：８７９−８８
８ （１９７８）；Ｒｏｓｅ、Ｍ、Ｅ、、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、２：１１２−１２２（１９５９）；Ｒｏｓｅ ｅ↓
ａ ｌ 、 、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ 、 ５ ： ７９
−９２ （１９６２）；およびＴａｎ１ｅｌｉａｎ ｅ
↓ Ａ１、、Ａｃｔａ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、Ｙｕｇ。
ｓｌ、ヱ： ７９−８４ （１９７６）］。また、エイ
メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）への免疫性の発現は種特異的
であり、モして家禽のある種において、有意の系統特異
的免疫性が存在することが知られている［Ｊｅｆｆｅｒ
ｓ、Ｔ、に、；Ｉｎ Ｌ。
メリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）への免疫性の発現は種特異的
であり、モして家禽のある種において、有意の系統特異
的免疫性が存在することが知られている［Ｊｅｆｆｅｒ
ｓ、Ｔ、に、；Ｉｎ Ｌ。
ｎｇ、Ｐ、Ｌ、ｅｔ ａｌ、（ｅｄｓ−）、Ａｖｊａｎ
Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ、ｐｐ、５７−１２５、Ｐｒ
ｏｃ、１３ｔｈ ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ 、Ｓｙｍｐ、
（１９７８） ；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｌ、Ｐ、、Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ、５９ニア２５−７３２ （１９６９）；Ｌｏ
ｎｇ、Ｐ、Ｌ、。
Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ、ｐｐ、５７−１２５、Ｐｒ
ｏｃ、１３ｔｈ ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ 、Ｓｙｍｐ、
（１９７８） ；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｌ、Ｐ、、Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ、５９ニア２５−７３２ （１９６９）；Ｌｏ
ｎｇ、Ｐ、Ｌ、。
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、６９：３３７−３４７ （１９７
４）；およびＬｏｎｇ ｅ↓ ａｌ、、Ｐａｒａｓｅｔ
ｏｌ、ヱ９：４５１−４５７ （１９７９）］。現在、
鳥類または哺乳類の宿主において防御免疫を刺激するこ
とができるエイメリア（旦ｉｍｅｒｉａ）種の免疫原は
まだ単離あるいは同定されてきていない。このようなエ
イメリア（旦ｉｍｅｒｉａ）の免疫原は、コクシジウム
症に対して有効な免疫化を提供するように思われる。
４）；およびＬｏｎｇ ｅ↓ ａｌ、、Ｐａｒａｓｅｔ
ｏｌ、ヱ９：４５１−４５７ （１９７９）］。現在、
鳥類または哺乳類の宿主において防御免疫を刺激するこ
とができるエイメリア（旦ｉｍｅｒｉａ）種の免疫原は
まだ単離あるいは同定されてきていない。このようなエ
イメリア（旦ｉｍｅｒｉａ）の免疫原は、コクシジウム
症に対して有効な免疫化を提供するように思われる。
リンパ球のハイブリドーマ技術の開発は、エイメリア（
Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の抗原に対して特異的な抗体を
比較的大量に生産する道具を提供する。特異的抗体生産
性細胞（牌細胞）を骨髄腫の細胞と融合することにより
、もとの感作抗原に対して特異的に向けられたモノクロ
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を生産すること
が可能である［Ｋ’ｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
。
Ｅｉｍｅｒｉａ）の種々の抗原に対して特異的な抗体を
比較的大量に生産する道具を提供する。特異的抗体生産
性細胞（牌細胞）を骨髄腫の細胞と融合することにより
、もとの感作抗原に対して特異的に向けられたモノクロ
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を生産すること
が可能である［Ｋ’ｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
。
Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）２５６：４９５−４９
７ （１９７５）］。前記寄生虫に対するモノクロナル
抗体が得られる場合、感染された家禽または感染しゃす
い家禽に対するこのような抗体を準備し、こうしである
程度の受動免疫をもつ宿主有機体を得ることが可能であ
ろう。モノクロナル抗体を生産するこのようなハイブリ
ドーマの培養物がいったん得られると、種々の手順によ
り、このような抗体を利用して、特定の抗原を単離し、
同定することが可能であり、前記抗原をワクチンとして
利用して能動免疫の系をもつ宿主有機体を提供すること
ができるであろう。ハイブリドーマの培養物およびモノ
クロナル抗体に関する種々の特許が知らてている（すな
わち、米国特許第４゜１７２．１２４号；同第４，１９
６，２６５号；同第４，２７１，１４５号；同第４，３
６１，５４９号；同第４，６３１，５５０号；同第４．
３１３− ６４．９３２号；同第４，３６４，９３３号；同第４，
３６４，９３４号；同第４，３８４，９３５号；同第４
，３８４，９３６号；同第４，３８１．２９２号；およ
び同第４，３８１，２９５号）。
７ （１９７５）］。前記寄生虫に対するモノクロナル
抗体が得られる場合、感染された家禽または感染しゃす
い家禽に対するこのような抗体を準備し、こうしである
程度の受動免疫をもつ宿主有機体を得ることが可能であ
ろう。モノクロナル抗体を生産するこのようなハイブリ
ドーマの培養物がいったん得られると、種々の手順によ
り、このような抗体を利用して、特定の抗原を単離し、
同定することが可能であり、前記抗原をワクチンとして
利用して能動免疫の系をもつ宿主有機体を提供すること
ができるであろう。ハイブリドーマの培養物およびモノ
クロナル抗体に関する種々の特許が知らてている（すな
わち、米国特許第４゜１７２．１２４号；同第４，１９
６，２６５号；同第４，２７１，１４５号；同第４，３
６１，５４９号；同第４，６３１，５５０号；同第４．
３１３− ６４．９３２号；同第４，３６４，９３３号；同第４，
３６４，９３４号；同第４，３８４，９３５号；同第４
，３８４，９３６号；同第４，３８１．２９２号；およ
び同第４，３８１，２９５号）。
動物の飼育の領域、より詳しくは食用飼鳥類の産業にお
けるコクシジウム症の経済的効果の前述の考察に照して
、原生動物の寄生虫の抑制は高度に９ましい、したがっ
て、本発明の目的は、寄生中のエイメリア・テネラ（旦
ユ ｔｅｎｅｌｌ、！りのメロゾイトに対して得られた
新規なかつ有用なモノクロナル抗体を提供することであ
る。他の目的は、家禽のコクシジウム症を抑制するため
のワクチンとして有用なエイメリア・テネラ（旦ユ ｔ
ｅｎｅｌｌａ）の特定の抗原を単離しかつ同定すること
である。これらの目的は以下の説明から明らかとなり、
とくに特許請求の範囲に記述されている。
けるコクシジウム症の経済的効果の前述の考察に照して
、原生動物の寄生虫の抑制は高度に９ましい、したがっ
て、本発明の目的は、寄生中のエイメリア・テネラ（旦
ユ ｔｅｎｅｌｌ、！りのメロゾイトに対して得られた
新規なかつ有用なモノクロナル抗体を提供することであ
る。他の目的は、家禽のコクシジウム症を抑制するため
のワクチンとして有用なエイメリア・テネラ（旦ユ ｔ
ｅｎｅｌｌａ）の特定の抗原を単離しかつ同定すること
である。これらの目的は以下の説明から明らかとなり、
とくに特許請求の範囲に記述されている。
エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎ−１４＝
ｅ ｌ ｌ ａ）は、ニワトリの盲腸に感染する種であ
り、感染した動物における血液の重い病変を起こす、と
くに破壊的な寄生虫である。エイメリアΦテネラ（Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ）はその生活環において２つのメロゾイ
ト段階を有し、それらの段階はそれぞれ第１１１）代お
よび第２世代のメロゾイトと表示される。エイメリア・
テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）に対する免疫は、その生
活環の無性のメロゾイト段階の間に発現することが知ら
れている［Ｌｏｎｇ、Ｐ、（ｅｄ、）、ＴｈｅＢｉｏｌ
ｏ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐ ｒｅｓｓ 、Ｂａ１ｔ ｉｍｏ
ｒｅ、Ｍｄ、（１９８２）］。
り、感染した動物における血液の重い病変を起こす、と
くに破壊的な寄生虫である。エイメリアΦテネラ（Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ）はその生活環において２つのメロゾイ
ト段階を有し、それらの段階はそれぞれ第１１１）代お
よび第２世代のメロゾイトと表示される。エイメリア・
テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）に対する免疫は、その生
活環の無性のメロゾイト段階の間に発現することが知ら
れている［Ｌｏｎｇ、Ｐ、（ｅｄ、）、ＴｈｅＢｉｏｌ
ｏ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐ ｒｅｓｓ 、Ｂａ１ｔ ｉｍｏ
ｒｅ、Ｍｄ、（１９８２）］。
エイメリア・テネラ（旦エ ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾ
イトの調製物は、後述の手順に従い、マウスを免疫化し
て、究極的にモノクロナル抗体を発生させるために使用
される。これらのモノクロナル抗体を使用して前記寄生
虫の抗原を同定する。これらのモノクロナル抗体をさら
に評価して、前記寄生虫の生体内の生長を中和するそれ
らの能力をアッセイする。エイメリア（Ｅｉｍｅｒ口）
の少なくとも１種の種と反応し、あるいはメロゾイトま
たはスポロゾイトと反応するモノクロナル抗体を引き出
し、そして前記寄生虫の生長の中和を示す抗原は、防御
抗原と考えられる。
イトの調製物は、後述の手順に従い、マウスを免疫化し
て、究極的にモノクロナル抗体を発生させるために使用
される。これらのモノクロナル抗体を使用して前記寄生
虫の抗原を同定する。これらのモノクロナル抗体をさら
に評価して、前記寄生虫の生体内の生長を中和するそれ
らの能力をアッセイする。エイメリア（Ｅｉｍｅｒ口）
の少なくとも１種の種と反応し、あるいはメロゾイトま
たはスポロゾイトと反応するモノクロナル抗体を引き出
し、そして前記寄生虫の生長の中和を示す抗原は、防御
抗原と考えられる。
防御抗原は、家禽類のコクシジウム症に対するワクチン
の開発のための潜在的な候補と見なされる。
の開発のための潜在的な候補と見なされる。
次の実施例により、本発明をさらに説明する。
抗体の量を評価するために、定量的放射線免疫アッセイ
を開発した。グルグルアルデヒド固定スポロゾイトまた
はメロゾイト［通常２〜５×１０５／ウエル（ｗｅｌｌ
）］を９６のつ、 ＪＬ／ ノポリ塩化ビニルすなわち
ｅｍｏｖａｗｅｌｌ■のペトリ冊（ｐｌａｔｅ）（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ）上−１４００Ｘｇにおいて１０分間遠心
して、有機体をウェルの底へ結合させた。ペトリ皿の底
へ付着するスポロゾイトまたはメロゾイトを、ハイブリ
ドーマの培養−ヒ澄み中で寄生虫またはモノクロナル抗
体で免疫化したマウスの血清試料と反応させた。抗体と
のインキュベーションを、４℃において１６〜１８時間
あるいは室温において２時間実施した。結合した抗体を
放射線標識第２抗体１８７、ｌ［これはに軽鎖（ｌｉｇ
ｈｔ ｃｈａｉｎ）に対して特異性のラットのモノクロ
ナル抗体である）で検出した。抗マウスに軽鎖抗体を、
３５Ｓ−メチオニンで生物学的に標識する［ＹｅＩｔｏ
ｎ、Ｄ、Ｅ、、ｅ↓ ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１
：５−１１ （１９８２）］、放射能を液体シンチレー
ションの計数により監視する。
を開発した。グルグルアルデヒド固定スポロゾイトまた
はメロゾイト［通常２〜５×１０５／ウエル（ｗｅｌｌ
）］を９６のつ、 ＪＬ／ ノポリ塩化ビニルすなわち
ｅｍｏｖａｗｅｌｌ■のペトリ冊（ｐｌａｔｅ）（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ）上−１４００Ｘｇにおいて１０分間遠心
して、有機体をウェルの底へ結合させた。ペトリ皿の底
へ付着するスポロゾイトまたはメロゾイトを、ハイブリ
ドーマの培養−ヒ澄み中で寄生虫またはモノクロナル抗
体で免疫化したマウスの血清試料と反応させた。抗体と
のインキュベーションを、４℃において１６〜１８時間
あるいは室温において２時間実施した。結合した抗体を
放射線標識第２抗体１８７、ｌ［これはに軽鎖（ｌｉｇ
ｈｔ ｃｈａｉｎ）に対して特異性のラットのモノクロ
ナル抗体である）で検出した。抗マウスに軽鎖抗体を、
３５Ｓ−メチオニンで生物学的に標識する［ＹｅＩｔｏ
ｎ、Ｄ、Ｅ、、ｅ↓ ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１
：５−１１ （１９８２）］、放射能を液体シンチレー
ションの計数により監視する。
引き続いて放射線免疫アッセイを、エイメリア・テネラ
（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトから得られた
表面膜へ適用して、免疫マウス血清１７− 中の抗体と膜タンパク質との反応を確保する。
（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトから得られた
表面膜へ適用して、免疫マウス血清１７− 中の抗体と膜タンパク質との反応を確保する。
ニワトリの腎細胞の一次培養物を、この分野で知られた
手順に従って、新しく嚢胞から出現した（ｅｘｃｙｓｔ
ｅｄ）スポロゾイトで感染させる。感染後５日に培地中
に放出されたメロゾイトを、３５０Ｘｇにおいて１０分
間遠心することにより収穫する。生まれてから１８週の
雌のＢＡＬＢ ／ ｃマウスを、完全フロインドアジュ
バント中のｌＸｌ０？の無傷または断片化エイメリア・
テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで腹腔内（ｉ
、ｐ、）免疫化する。動物を、初期の免疫化後、２×５
週の間隔で、培地１９９（ＧｉｂｃＯ）中のメロゾイト
を２同腹腔内注射することにより促進（ｂｏｏｓｔ）す
る。各促進後３日に得られた血清を、直接免疫蛍光アッ
セイ（Ｉ ＦＡ）および放射線免疫アッセイ（ＲＩ Ａ
）により、エイメリア舎テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）
メロ１８− ゾイトに対する抗体の存在について検査する。これらの
アッセイの両者は、グルタルアルデヒド固定寄生虫につ
いて実施する。
手順に従って、新しく嚢胞から出現した（ｅｘｃｙｓｔ
ｅｄ）スポロゾイトで感染させる。感染後５日に培地中
に放出されたメロゾイトを、３５０Ｘｇにおいて１０分
間遠心することにより収穫する。生まれてから１８週の
雌のＢＡＬＢ ／ ｃマウスを、完全フロインドアジュ
バント中のｌＸｌ０？の無傷または断片化エイメリア・
テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトで腹腔内（ｉ
、ｐ、）免疫化する。動物を、初期の免疫化後、２×５
週の間隔で、培地１９９（ＧｉｂｃＯ）中のメロゾイト
を２同腹腔内注射することにより促進（ｂｏｏｓｔ）す
る。各促進後３日に得られた血清を、直接免疫蛍光アッ
セイ（Ｉ ＦＡ）および放射線免疫アッセイ（ＲＩ Ａ
）により、エイメリア舎テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）
メロ１８− ゾイトに対する抗体の存在について検査する。これらの
アッセイの両者は、グルタルアルデヒド固定寄生虫につ
いて実施する。
ハイブリドーマは、確立された方法に従い誘導する［Ｋ
ｗａｎ ｅ↓ ａｌ、（１９８０）、Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｄ。
ｗａｎ ｅ↓ ａｌ、（１９８０）、Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｄ。
ｂｙ Ｊ、に、Ｓｅｔｌｏｗ ＆ Ａ、Ｈｏ１ｌａｎｄ
ｅｒ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ
、、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ、３１−９６１゜エイメリ
ア・テネラ（旦ユ ｔｅｎｅ土ユ」）メロゾイトで免疫
化した２匹のマウスからの牌細胞を、３０％のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ １０００．Ｂａｋｅｒ Ｃｈ
ｅ ｍ １ｃａｌ）の存在下にＰ３骨髄腫、Ｐ３−Ｘ
６３ 。
ｅｒ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ
、、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ、３１−９６１゜エイメリ
ア・テネラ（旦ユ ｔｅｎｅ土ユ」）メロゾイトで免疫
化した２匹のマウスからの牌細胞を、３０％のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ １０００．Ｂａｋｅｒ Ｃｈ
ｅ ｍ １ｃａｌ）の存在下にＰ３骨髄腫、Ｐ３−Ｘ
６３ 。
Ａｇ８．６５３の非分泌性（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎ
ｇ）クローンと８分間融合する。融合した細胞を９６ウ
エルの組織培養＠（Ｌｉｎｂｒｏ）中に分布させ、ＨＡ
Ｔ選択培地［Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｗ、、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、↓ＡＪニア０９−７１０ （１９６４）］
中で維持する。ＨＡＴ培地は２０％の胎児子牛血清（Ｇ
ｉｂｃｏ）および１０％ｃ７）ＮＣＴＣｌ ０９ （Ｍ
ｉ ｃ ｒ ｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ）を含有するダルベコ（ＤｕＬｂｅｃｃｏ）の
変更イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中で調製する。ハイブ
リッド（ｈｙｂｒｉｄＳ）をインキュベーター内で３７
℃および１０％のＣＯ２において培養する。
ｇ）クローンと８分間融合する。融合した細胞を９６ウ
エルの組織培養＠（Ｌｉｎｂｒｏ）中に分布させ、ＨＡ
Ｔ選択培地［Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｗ、、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、↓ＡＪニア０９−７１０ （１９６４）］
中で維持する。ＨＡＴ培地は２０％の胎児子牛血清（Ｇ
ｉｂｃｏ）および１０％ｃ７）ＮＣＴＣｌ ０９ （Ｍ
ｉ ｃ ｒ ｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ）を含有するダルベコ（ＤｕＬｂｅｃｃｏ）の
変更イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中で調製する。ハイブ
リッド（ｈｙｂｒｉｄＳ）をインキュベーター内で３７
℃および１０％のＣＯ２において培養する。
培養物を、エイメリア・テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅ ｌ １
ａ）メロゾイトと反応性の抗体について、ＩＦＡおよ
びＲＩＡ法により周期的にアッセイする。陽性の培養物
を、２４ウエルの組織培養皿のヒボキサンチン、アミノ
プテリンおよびチミジンを含まない培地中へ移す。ハイ
ブリドーマをラット胚線維芽供給細胞層の上の軟質アガ
ロース中でクローニングする［Ｃｏｆｆ１ｎｓ 旦↓ａ
１．．Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｐｈｙｉｓｏｌ、、７９： ４２
９−４４０ （１９７２）］。陽性のハイブリドーマの
クローンをサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）番号で表
示する（すなわち、クローン１５．８４．４は１５．８
４と表示するハイブリドーマのサブクローン＃４である
）。良好に特性づけられるサブクローンにより分泌され
る免疫グルプリンの綱および亜綱を、寒天二重拡散法に
より決定する。ハイブリドーマの洗怜剤（ＮＰ−４０）
可溶性の抽出液を、ウサギ抗マウス抗体試薬（Ｍｅｌｏ
ｙ）と一緒に使用する。
ａ）メロゾイトと反応性の抗体について、ＩＦＡおよ
びＲＩＡ法により周期的にアッセイする。陽性の培養物
を、２４ウエルの組織培養皿のヒボキサンチン、アミノ
プテリンおよびチミジンを含まない培地中へ移す。ハイ
ブリドーマをラット胚線維芽供給細胞層の上の軟質アガ
ロース中でクローニングする［Ｃｏｆｆ１ｎｓ 旦↓ａ
１．．Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｐｈｙｉｓｏｌ、、７９： ４２
９−４４０ （１９７２）］。陽性のハイブリドーマの
クローンをサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）番号で表
示する（すなわち、クローン１５．８４．４は１５．８
４と表示するハイブリドーマのサブクローン＃４である
）。良好に特性づけられるサブクローンにより分泌され
る免疫グルプリンの綱および亜綱を、寒天二重拡散法に
より決定する。ハイブリドーマの洗怜剤（ＮＰ−４０）
可溶性の抽出液を、ウサギ抗マウス抗体試薬（Ｍｅｌｏ
ｙ）と一緒に使用する。
８種類の抗メロゾイトモノクロナル抗体の特性を表Ｉに
示す。モノクロナル抗体の大部分は、ＩＦＡならびにＲ
ＩＡによると、メロゾイトならびにスポロゾイトと反応
した。モノクロナル抗体１．９０および４．７６は、ス
ポロゾイトとＩＦＡにおいて反応せず、モしてＲＩＡに
おいて時には反応しなかった（表Ｉ中の本参照）。モノ
クロナル抗体１５．８４はＩＦＡにおいてメロゾイト２
１− と反応しなかったが、ＲＩＡにおいてスポロゾイトなら
びにメロゾイトと等しく良好に反応した。
示す。モノクロナル抗体の大部分は、ＩＦＡならびにＲ
ＩＡによると、メロゾイトならびにスポロゾイトと反応
した。モノクロナル抗体１．９０および４．７６は、ス
ポロゾイトとＩＦＡにおいて反応せず、モしてＲＩＡに
おいて時には反応しなかった（表Ｉ中の本参照）。モノ
クロナル抗体１５．８４はＩＦＡにおいてメロゾイト２
１− と反応しなかったが、ＲＩＡにおいてスポロゾイトなら
びにメロゾイトと等しく良好に反応した。
表■に要約したデータが示すように、抗メロゾイト融合
から誘導されたモノクロナル抗体のすべてはエイメリア
中テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトなら
びにメロゾイトと交差反応する。
から誘導されたモノクロナル抗体のすべてはエイメリア
中テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロゾイトなら
びにメロゾイトと交差反応する。
２２−
支施諮Ａ
商業的に重要な５種類の球虫綱（ｃｏｃｃｉｄｉａ）の
種から誘導されたスポロゾイトに対してＩＦＡにより、
モノクロナル抗体をアッセイする。これらの実験からの
データを表Ｈに要約する。エイメリアＯテネラ（旦ユ
ｔｅｎｅｌ１３）から誘導されたスポロゾイトとＩＦＡ
において反応した６種類のモノクロナル抗体を使用して
、種の交差反応性を研究する。結果が示すように、５種
類のモノクロナル抗体はエイメリア・ネカトリックス（
Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ）およびエイメリア−マクシマ（
旦ユ ｍａｘｉｍａ） と反応し、そして１種類のモノ
クロナル抗体（１５、８４）は試験したすべてのエイメ
リア（Ｅｉｍｅ ｒ ｉ ａ）の５種と反応した。
種から誘導されたスポロゾイトに対してＩＦＡにより、
モノクロナル抗体をアッセイする。これらの実験からの
データを表Ｈに要約する。エイメリアＯテネラ（旦ユ
ｔｅｎｅｌ１３）から誘導されたスポロゾイトとＩＦＡ
において反応した６種類のモノクロナル抗体を使用して
、種の交差反応性を研究する。結果が示すように、５種
類のモノクロナル抗体はエイメリア・ネカトリックス（
Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ）およびエイメリア−マクシマ（
旦ユ ｍａｘｉｍａ） と反応し、そして１種類のモノ
クロナル抗体（１５、８４）は試験したすべてのエイメ
リア（Ｅｉｍｅ ｒ ｉ ａ）の５種と反応した。
２４−
２４９−
３
火蕪掬ｊ
モノクロナＪし抗体をアッセイする生体内手順を利用し
て、モノクロナル抗体を評価する。エイメリア・テネラ
（旦エ ｔｅｎｅｌｌａ）スポロゾイトと反応する３種
類のモノクロナル抗体をこのアンセイにより評価する。
て、モノクロナル抗体を評価する。エイメリア・テネラ
（旦エ ｔｅｎｅｌｌａ）スポロゾイトと反応する３種
類のモノクロナル抗体をこのアンセイにより評価する。
３種類の異るハイブリドーマから誘導された熱不活性化
腹水症体液を用いて、新しく単離したスポロゾイトを無
菌条件下で、インキュベーションする。インキュベーシ
ョン期間は室温において１時間である。次いで、スポロ
ゾイトを生まれてから３週のニワトリの盲腸に外利的手
順により導入する。インキュベーション後５日間、寄生
虫の発育を起こさせる。この期間の終りにおいて、病変
を記録して感染の程度を評価する。これらの実験の結果
を、モノクロナル抗体により提供された保護％として表
わし、そして表■に示す。これらのデータが示すように
、各抗体はこの試験系のある条件下で少なくとも部分的
２６− ５ に保護を与える。
腹水症体液を用いて、新しく単離したスポロゾイトを無
菌条件下で、インキュベーションする。インキュベーシ
ョン期間は室温において１時間である。次いで、スポロ
ゾイトを生まれてから３週のニワトリの盲腸に外利的手
順により導入する。インキュベーション後５日間、寄生
虫の発育を起こさせる。この期間の終りにおいて、病変
を記録して感染の程度を評価する。これらの実験の結果
を、モノクロナル抗体により提供された保護％として表
わし、そして表■に示す。これらのデータが示すように
、各抗体はこの試験系のある条件下で少なくとも部分的
２６− ５ に保護を与える。
２７−
尖施剣ｊ
モノクロナル抗体により認識されるエイメリア争テネラ
（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）を、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により、次いでニトロセル
ロースのプロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）手順によ
り同定する［Ｔ。
（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）を、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により、次いでニトロセル
ロースのプロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）手順によ
り同定する［Ｔ。
ｗｂｉｎ ｅよ ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｄ、Ｎａｔｌ 、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、（ＵＳＡ）ヱ６：４３５０−４３
５４ （１９７９）］。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、（ＵＳＡ）ヱ６：４３５０−４３
５４ （１９７９）］。
エイメリア・テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のスポロ
ゾイトおよびメロゾイトを、１５５ミリモルのＮＨ４Ｃ
ｌ、１．５ミリモルのＭｇＡｃ２．３０Ｊｊ−ｇ／ｍｌ
のプロテアーゼ阻害剤のルーペプチン（Ｉｅｕｐｅｐｔ
ｉｎ）およびアンチペイン（ａｎｔ ｉ ｐａｉ ｎ）
、４ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルおよび
アプロチニン（２トリプシン阻害中位／ ｍ ｌ ）を
含有する１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中
の１％Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ−４０（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で溶解（ｌｙｓ
ｅ）Ｌかつ抽出する。この溶解手順は、０℃における３
０分のインキュベーションおよび引き続（２，５００Ｘ
ｇの３０分の遠心を含む。沈殿物を廃棄し、次いで、可
溶化された物質をゲル電気泳動に使用する。２−メルカ
プトエタノールで還元した試料のＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動を、７〜１５％のポリアクリルアミ
ドの勾配ゲル−Ｌの不連続のトリスグリシン系中で実施
する。
ゾイトおよびメロゾイトを、１５５ミリモルのＮＨ４Ｃ
ｌ、１．５ミリモルのＭｇＡｃ２．３０Ｊｊ−ｇ／ｍｌ
のプロテアーゼ阻害剤のルーペプチン（Ｉｅｕｐｅｐｔ
ｉｎ）およびアンチペイン（ａｎｔ ｉ ｐａｉ ｎ）
、４ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルおよび
アプロチニン（２トリプシン阻害中位／ ｍ ｌ ）を
含有する１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中
の１％Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ−４０（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で溶解（ｌｙｓ
ｅ）Ｌかつ抽出する。この溶解手順は、０℃における３
０分のインキュベーションおよび引き続（２，５００Ｘ
ｇの３０分の遠心を含む。沈殿物を廃棄し、次いで、可
溶化された物質をゲル電気泳動に使用する。２−メルカ
プトエタノールで還元した試料のＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動を、７〜１５％のポリアクリルアミ
ドの勾配ゲル−Ｌの不連続のトリスグリシン系中で実施
する。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分離したタンパク質を、ニトロセルロ
ースフィルター−Ｌに電気泳動的に４５分間移す。次い
で、ニトロセルロースフィルターを、腹水症の体液（ｉ
−ｔｏｏ倍希釈）またはｌ＼イブリドーマからの使用済
みの培養流体と４℃において１６〜１８時間反応させる
。正常のウサギの血清を１０％の濃度ですべての抗体と
のインキュベーションにおいてインキュベーションした
。結合したモノクロナル抗体は、１２５Ｉ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ）と反応させることによって検出する。第２抗体
との反応は、通常室温において３〜５時間である。結合
しない第２抗体を洗浄により除去する。次いで、ニトロ
セルロースフィルターを、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘｍ
フィルムＸＡＲ−５または５Ｂ−５で露光する。
ースフィルター−Ｌに電気泳動的に４５分間移す。次い
で、ニトロセルロースフィルターを、腹水症の体液（ｉ
−ｔｏｏ倍希釈）またはｌ＼イブリドーマからの使用済
みの培養流体と４℃において１６〜１８時間反応させる
。正常のウサギの血清を１０％の濃度ですべての抗体と
のインキュベーションにおいてインキュベーションした
。結合したモノクロナル抗体は、１２５Ｉ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ）と反応させることによって検出する。第２抗体
との反応は、通常室温において３〜５時間である。結合
しない第２抗体を洗浄により除去する。次いで、ニトロ
セルロースフィルターを、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘｍ
フィルムＸＡＲ−５または５Ｂ−５で露光する。
別法として、プロット（ｂｌｏｔ）を、ＢＬＩＳＡ法に
より、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ結合ウサギ抗
マウスＩ ｇＧ （Ｍｆ ｌ ｅ ｓ）およびクロロナ
フトール（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＢ２Ｏ２（Ｂａｋｅ
ｒ）を基質として使用して展開する。タンパク質の抗原
の分子量を分子量標準に関して決定する。
より、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ結合ウサギ抗
マウスＩ ｇＧ （Ｍｆ ｌ ｅ ｓ）およびクロロナ
フトール（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＢ２Ｏ２（Ｂａｋｅ
ｒ）を基質として使用して展開する。タンパク質の抗原
の分子量を分子量標準に関して決定する。
モノクロナル抗体１８．８４により認識された抗原を例
示する。モノクロナル抗体１５．８４は、１３０±２０
ｋｄの概算分子量の二重のもの（ｄｏｕｂｌｅｔ）と反
応する。しかしながら。
示する。モノクロナル抗体１５．８４は、１３０±２０
ｋｄの概算分子量の二重のもの（ｄｏｕｂｌｅｔ）と反
応する。しかしながら。
３ｌ−
１００ｋｄ程度のタンパク質の分子量の推定を。
使用する分子量標準に依存して変動させて行った。１３
０±２０ｋｄ種に加えて、１５．８４も３００±５０ｋ
ｄの見掛は分子量を有する帯（ｂａｎｄ）と反応する。
０±２０ｋｄ種に加えて、１５．８４も３００±５０ｋ
ｄの見掛は分子量を有する帯（ｂａｎｄ）と反応する。
より大きい分子量の帯は約１５〜２０％の抗原を構成し
、そして多分１３０±２０ｋｄ種の凝集物または重合体
の形態である。タンパク質抗原と反応しないことが知ら
れているモノクロナル抗体と用いる対照実験を使用して
、抗メロゾイト抗体の特異性を証明する。さらに、他の
対照が証明するように、モノクロナル抗体は寄生虫特異
性であり、宿主特異性のタンパク質と反応しない。
、そして多分１３０±２０ｋｄ種の凝集物または重合体
の形態である。タンパク質抗原と反応しないことが知ら
れているモノクロナル抗体と用いる対照実験を使用して
、抗メロゾイト抗体の特異性を証明する。さらに、他の
対照が証明するように、モノクロナル抗体は寄生虫特異
性であり、宿主特異性のタンパク質と反応しない。
種々の抗体により認識される抗原の分子量のデータを、
表■に要約する。有意の特徴は、エイメリア争テネラ（
旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトにおいて分子量≦２
０ｋｄまたは〉１００ｋｄの範囲の免疫原抗体の存在で
ある。
表■に要約する。有意の特徴は、エイメリア争テネラ（
旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）メロゾイトにおいて分子量≦２
０ｋｄまたは〉１００ｋｄの範囲の免疫原抗体の存在で
ある。
３２−
靜
分ユｌソシ二色曵麦約
抗メロゾイト
モノクロナル抗体 症凰五祖１勿］量
Ｍｌ（１，９０）
３００±５０ｋｄ
Ｍ２ （４，７６）
Ｍ６（１０，８４）
１３０±２０ｋｄ
Ｍ８（１５，８４）
Ｍ３ （２，０３）
Ｍ４ （１３、９０）
１８±３ｋｄ
Ｍ５（１０，０８）
モノクロナル抗体１５．８４は中和性抗体と考えられ、
そして認識された抗原は防御抗原と考えられる。さらに
、１５．８４はエイメリア参テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌ
ｌａ）のメロゾイトおよびスポロゾイトならびにエイメ
リア・マクシマ（旦エ ｍａｘｉｍａ）、エイメリア争
ネカトリックス（Ｅ−ｎｅｃａｔ ｒｉｘ）、ｘイメリ
アφアセルブリナ（Ｅ、ａｃｅｒｖｕｌｉｎＡ）および
エイメリア・ブルネッチ（旦ユ 旦」ｕｎｅｔｔｉ）か
ら単離されたスポロゾイトと交差反応する。
そして認識された抗原は防御抗原と考えられる。さらに
、１５．８４はエイメリア参テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌ
ｌａ）のメロゾイトおよびスポロゾイトならびにエイメ
リア・マクシマ（旦エ ｍａｘｉｍａ）、エイメリア争
ネカトリックス（Ｅ−ｎｅｃａｔ ｒｉｘ）、ｘイメリ
アφアセルブリナ（Ｅ、ａｃｅｒｖｕｌｉｎＡ）および
エイメリア・ブルネッチ（旦ユ 旦」ｕｎｅｔｔｉ）か
ら単離されたスポロゾイトと交差反応する。
前述の新規な抗体、■、９０．１５．８４，１３．９０
．１０．８４．８．０３および２．０３は、アメリカン
ｅタイプ・カルチャーコレクショ：／（ＡＴＣＣ）（ｔ
ｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｎ。
．１０．８４．８．０３および２．０３は、アメリカン
ｅタイプ・カルチャーコレクショ：／（ＡＴＣＣ）（ｔ
ｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｎ。
１２３０ｔ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ
ｖｉ ｌｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ。
ｖｉ ｌｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ。
Ａ、２０８５２）に受託され、そしてその永久的収集物
に加えられた。番号１．９０は番号ＨＢ８３３６を割当
てられた。番号１５．８４は番号ＨＢ８３３５を割当て
られた。番号１３．９０は番号ＨＢ８３３７を割当てら
れた。番号１０．８４は番号ＨＢ８３８７を割当てられ
た。番号８．０３は番号）ＩＢ８３８８を割当てられ、
そして番号２．０３は番号１（Ｂ８３８９を割当てられ
た。これらの抗体の利用は、特許および商標の局長によ
り３７ Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，１４および３５ Ｕ。
に加えられた。番号１．９０は番号ＨＢ８３３６を割当
てられた。番号１５．８４は番号ＨＢ８３３５を割当て
られた。番号１３．９０は番号ＨＢ８３３７を割当てら
れた。番号１０．８４は番号ＨＢ８３８７を割当てられ
た。番号８．０３は番号）ＩＢ８３８８を割当てられ、
そして番号２．０３は番号１（Ｂ８３８９を割当てられ
た。これらの抗体の利用は、特許および商標の局長によ
り３７ Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，１４および３５ Ｕ。
Ｓ、Ｃ，１２２に従って権利を与えられること決定され
たものにとって、本願の係属中において可能であり、そ
してＨＢ８３３３、ＨＢ８３３６、ＨＢ８３３７、ＨＢ
８３８７、ＨＢ８３８Ｂ、およびＨＢ８３８９の公衆へ
の入手可能性のすべての制限は本願へ特許が打手された
とき最終的に排除される。
たものにとって、本願の係属中において可能であり、そ
してＨＢ８３３３、ＨＢ８３３６、ＨＢ８３３７、ＨＢ
８３８７、ＨＢ８３８Ｂ、およびＨＢ８３８９の公衆へ
の入手可能性のすべての制限は本願へ特許が打手された
とき最終的に排除される。
番号１．９０，１（Ｂ８３３６．１５．８４．ＨＢ８３
３５、および１３．９０、ＨＢ８３３７はすべてＡＴＣ
Ｃに１９８３年８月１６日に受託さ３５− れた。番号１０．８４、ＨＢ８３８７．８．０３、ＨＢ
８３８８．および２．０３、ＨＢ８３８９はＡＴＣＣに
１９８３年１０月２０日に受託された。
３５、および１３．９０、ＨＢ８３３７はすべてＡＴＣ
Ｃに１９８３年８月１６日に受託さ３５− れた。番号１０．８４、ＨＢ８３８７．８．０３、ＨＢ
８３８８．および２．０３、ＨＢ８３８９はＡＴＣＣに
１９８３年１０月２０日に受託された。
特許出願人 アメリカン中サイアナミド・カンパ３６一
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｌ、マウスの骨髄腫系統からの細胞およびエイメリア・
テネラ（Ｅｊｍｅｒｆａ ｔｅｎｅｌｌｌ）のメロゾイ
トで前もって免疫化したマウスからの牌細胞の融合によ
り形成されたハイブリドーマにより生産され； （ａ） ＝イメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ 王」１ユ）の
スポロゾイトまたはメロゾイ トの抗原と特異的に反応し； （ｂ） はぼ１５〜３５０ｋｄの範囲の分子量を有する
エイ２メリア・テネラ（旦±１ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａ）（７）抗原と特異的に反応する； モノクロナル抗体。 ２、Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞およびエイ
メリア・テネラ（見よ ｔｅｎｅｌ１３）のメロゾイト
で前もって免疫化したマウスからの牌細胞の融合により
形成されたハイブリドーマにより生産された特許請求の
範囲第１項記載のモノクロナル抗体。 ３、クローン番号１．９０で表示されかつＡＴＣＣＮｏ
、ＨＢ８３３６として受託されたハイブリドーマにより
生産され；クローン番号４．７６で表示されたハイブリ
ドーマにより生産され；クローン番号２．０３で表示さ
れかつＡＴＣＣＮｏ 、ＨＢ８３８９として受託された
ハイブリドーマにより生産され；クローン番号１３．９
０で表示されかつＡＴｃｃ Ｎｏ、ＨＢ８３３７として
受託されたハイブリドーマにより生産され：クローン番
号１０．０８で表示されたハイブリドーマにより生産さ
れ；クローン番号１０．８４で表示されかつＡＴｃｃ
Ｎｏ、ＨＢ８３８７として受託されたハイブリドーマに
より生産され：クローン番号８．０３で表示されかつＡ
ＴＣＣＮｏ 、ＨＢ８３８８として受託されたハイブリ
ドーマにより生産され：あるいはクローン番号１５ 、
８４テ表示されかつＡＴｃｃ Ｎｏ、ＨＢ８３３５とし
て受託されたハイブリドーマにより生産された特許請求
の範囲第２項記載のモノクロナル抗体。 ４．１程： （ａ） エイメリア・テネラ（旦ユ ｔｅｎｅ土↓」）
のメロゾイトでマウスを免疫 化し； （ｂ） 前記マウスから神職を取り出し、そして牌細胞
の懸濁液をつくり； （ｃ） 前記牌細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤
の存在下に融合させ； （ｄ） 融合した細胞を、融合しない骨髄腫細胞の生長
を支持しない媒質中で別々の ウェル中で希釈しかつ培養し； （ｅ） ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄みを
、エイメリア・テネラ（旦ユ ｔｅｎｅｌｌａ）のメロゾイトおよ びスポロゾイトと反応性の抗体の存在 について評価し； （ｆ） エイメリアφテネラ（旦ユ ｔｅｎｅ上↓」）
のメロゾイトまたはスポロゾ イトと反応性の抗体を生産するハイブ リドーマを選択し、そしてそれをク ローニングし；そして （ｇ） 抗体を前記クローンから回収する；ことを特徴
とする方法により生産された、エイメリア・テネラ（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｔ ｅ ｎｅ ｌ １３）のスポロゾイ
トまたはメロゾイトの抗原と反応するモノクロナル抗体
。 ５、ハイブリドーマツクローフＮｏ、１．９０（ＡＴＣ
ＣＮｏ 、ＨＢ８３３６） 、４．７６．２．０３ （
ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３８９）、１３．９０（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、８３３７）、１０゜０８．１０．８４ （ＡＴＣ
ＣＮｏ、ＨＢ８３８７）、８．０３（ＡＴＣＣＮｏ、Ｈ
Ｂ８３８８）または１５．８４ （ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ
８３３５）を適当な媒質中で培養し、そして前記ハイブ
リドーマの培養物の上澄みから抗体を回収することを特
徴とするエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ １上上ユ）の
スポロゾイトまたはメロゾイトの抗原と反応するモノク
ロナル抗体の生産方法；あるいはマウスにＮｏ 、１．
９０ （ＡＴＣＣＮｏ 、ＨＢ８３３６）、４．７Ｂ、
２．０３（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３８９）、１３．９０
（Ａ 。 ＴＣＣＮｏ、８３３７）、１０．０８．１０゜８４（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３８７）、８．０３（ＡＴＣＣＮｏ
、ＨＢ８３８８）または１５．８４ （ＡＴＣＣＮｏ、
ＨＢ８３３５）と表示されるハイブリドーマの培養物を
注入し、そして前記抗原を前記マウスの腹水または血清
から回収することを特徴とするエイメリア種（ｌ土旦」
工ｉａ 王上ｌユ）のスポロゾイトまたはメロゾイトの
抗原と反応するモノクロナル抗体の生産方法。 ＝５− ６、特許請求の範囲第５項記載の方法の各々により生産
されたモノクロナル抗体。 ７、洗浄剤含有緩衝液の存在下に可溶性であり、エイメ
リア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）のメ
ロゾイトの抗原として存在し、そしてほぼ３００±５０
ｋｄの分子量を有するハイブリドーマのクローン１．９
０ （ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３３６）および４．７６に
より分泌された抗メロゾイトモノクロナル抗体と特異的
に反応性であり；はぼ１３０±２０ｋｄの分子量を有す
るハイブリドーマのクローン１Ｏ−８４（ＡＴＣＣＮｏ
、）ｌＢ８３３７）および１５．８４（ＡＴＣＣＮｏ
、ＨＢ８３３５）により分泌された抗メロゾイトモノク
ロナル抗体と特異的に反応性〒あり；あるいはほぼ１８
±３ｋｄの分子量を有するハイブリドーマのクローンｔ
ｏ、ｏａ、８．０３（ＡＴＣＣＮｏ、１（Ｂ８３８８）
、２．０３ （ＡＴＣＣＮｏ、Ｈ’Ｂ８３８９）および
１３．９０ （ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３３７）＝６− により分泌された抗メロゾイトモノクロナル抗体と特Ｕ
的１こ反応性である、抗原性、免疫原性、タンパク質性
実在物。 ８、安定剤および／または製薬学的に許容されうる補助
剤をさらに含有する特許請求の範囲第７項記載のワクチ
ン。 ９、工程： （ａ） エイメリアφテネラ（旦エ ｔｅｎｅ上↓」）
のスポロゾイトおよび／また はメロゾイトを抽出し、そして可溶化 し； （ｂ’） クロマトグラフィーおよび親和性カラムの方
法を包含するが、これらに限定 されない単離および精製の方法によ り、可溶化された物質を分離して、精 製された抗原を得る； ことにより調製された特許請求の範囲第７項記載の抗原
ワクチン。 １０、本発明のモノクロナル抗体により同定された１種
または２種以上の抗原に家畜種を暴露することを特徴と
するエイメリア種（ＥｉｍｅｒｉＡ 主上上ユ）の感染
を防除する方法。
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