JPH0529062B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野 この発明は、酵素電極システムに関する。さら
に詳しくは、過酸化水素電極方式の酵素電極を用
いてなり、試料中の特定成分の濃度を迅速かつ高
精度で選択的に定量分析できる酵素電極システム
に関する。

(ロ) 従来の技術 近年、酵素の有する基質特異性をうまく利用し
て、試料中の特定成分の濃度を迅速かつ正確に定
量する手段として、酵素電極が注目を浴びてい
る。

この酵素電極の内、基質が酵素存在下で、溶存
酵素を消費し過酸化水素を生成するという反応に
おいては、酸素減少量を捕らえる酸素電極方式
と、生成する過酸化水素を捕らえる過酸化水素電
極方式とがある。

上記酸素電極方式は、酸素透過性膜を酸素電極
表面に装着しこの膜に酸素発生系を有する酵素を
固定化した酵素電極を用いるものであり、電極系
と検液とを完全に分離できる利点がある。そし
て、最近、酸素発生系を有する酵素の固定化膜と
して電解重合法により形成される高分子薄膜を用
いる提案もなされている〔「電解合成酵素膜の酸
素透過性と分子識別機能」、電気化学協会第53回
大会講演要旨集Ｃ 203（1986）〕。

一方、過酸化水素電極方式は、電極表面に過酸
化水素が到達する必要があるため、検液が透過し
うる膜を用い、これに過酸化水素発生系を有する
酵素を固定化して過酸化水素電極に被着して構成
されている。従つて検液が電極表面と接触するこ
ととなり、検液中に含まれる種々の還元性物質に
より妨害電流が生ずる欠点がある。この点に関
し、最近、この妨害電流を除く手段として、２本
の作用電極（過酸化水素電極）を用い、一方に酵
素を光重合高分子膜で固定化し、他方には酵素を
固定化していない又は失活した酵素を固定化して
なる光重合高分子膜を被覆して、これらの作用電
極の差動出力を検出する方法が提案されている
〔高津一郎etal、「差動出力型グルコースセンサ
ー」、電気学会研究会資料（1985年）〕。

(ハ) 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、前記電解重合による酵素固定化
膜を用いた酸素電極方式の酵素電極の基質応答性
における直線性の限界は100mg／dl程度までと狭
く、これを越える基質濃度の検体の測定に大きな
誤差を生じ、希釈操作を予め必要とするという問
題点があつた。

一方、差動出力検出方式を用いた前記過酸化水
素電極方式の酵素電極システムにおいても、良好
な応答性はせいぜい100mg／dl程度までであり、
上記と同様な問題点があつた。

この発明は、かかる従来の問題点を解消すべく
なされたものであり、ことに基質応答性が改善さ
れた酵素電極システムを提供しようとするもので
ある。

(ニ) 問題点を解決するための手段 本発明者は、鋭意研究を行なつた結果、酸素電
極方式の酵素電極において酸素透過性の酵素工程
化膜の媒体として用いる電解重合高分子腹膜を、
前記差動出力検出−過酸化水素電極方式の酵素電
極システムにおける過酸化水素発生酵素の固定化
膜の媒体として用いることにより、基質応答性が
著しく改善される事実を見出し、この発明に到達
した。

かくしてこの発明によれば、(a)過酸化水素電極
の感応部上に、電解重合高分子薄膜からなる過酸
化水素発生酵素の固定化高分子膜を備えてなる第
１作用電極と、(b)過酸化水素電極の感応部上に、
電解重合高分子薄膜からなり酵素を固定化してい
ない又は失活した過酸化水素発生酵素を固定化し
た高分子膜を備えてなる第２作用電極と、(c)上記
第１作用電極及び第２作用電極と電解系を構成す
る対極と、(d)第１作用電極による電解電流と、第
２作用電極による電解電流との出力差を検出する
差動出力検出系を具備してなる酵素電極システム
が提供される。

この発明における電解重合高分子薄膜は、過酸
化水素電極となりうる各種貴金属（白金、金等）
やカーボン電極を電解用電極として用い、これを
重合用モノマーの電解質溶液中に浸漬した状態で
電解を行なつて重合を進行させることにより形成
することができる。上記重合用モノマーとして
は、水溶性でかつ水溶液中で重合しうるものであ
ればよく、水酸基やアミノ基等の官能基を有する
芳香族系化合物が適しており例えば、アニリン、
ｏ−フエニレンジアミン、フエノール等が挙げら
れる。ただし、ピロール、チオフエンのような非
水溶性のモノマーであつても非水溶媒系電解質中
で重合しうるものも適用可能である。なお、電解
を円滑に進行させるために適当な支持塩が添加す
るのが適しており、ことに非水溶媒系で重合を行
なう場合には必要である。また上記過酸化水素電
極は、棒状のものに限らず、例えば、絶縁基板上
に蒸着された膜状のもであつてもよい。電極の形
状の如何を問わず、均一な高分子薄膜を形成する
ことができ、用途に応じた形の酵素電極を作製し
用いることができる点も、この発明の一つの利点
である。

この発明における第１作用電極は、過酸化水素
発生酵素の酵素反応により生ずる過酸化水素量に
対応する電解電流を検出するための主電極であ
る。かかる第１作用電極は、前記した電解重合に
よる手法により過酸化水素電極の感応部上に高分
子薄膜を形成するに際し、モノマーの電解質溶液
中に、所定の過酸化水素発生酵素を含有させてお
くことにより、簡便かつ効率的に作製することが
できる。この際の電解重合は、室温等の緩和な温
度下で行なうのが適しており、酵素の活性をでき
るだけ低下させないように、０℃付近で行なうの
が好ましい。また電解条件は、定電位法、電位走
査法のいずれを用いてもよい。ただし、場合によ
つては、高分子薄膜を形成した後、この表面に、
例えばシツフ塩基法等の公知の固定化法で過酸化
水素発生酵素を固定化してもよい。ことに非水溶
媒系電解重合膜を用いる場合には、この方法が適
している。

上記固定化高分子膜の厚みは、約0.1〜0.5μｍ
が適当である。厚みが薄すぎると厚み制御が困難
でかつ感度も低下し易く、また厚みが厚すぎると
過酸化水素の電極面への到達が阻害され易くま
た、電解重合による製造自体困難で好ましくな
い。

この発明における第２作用電極は、検液中の
種々の還元性物質による電解電流への影響を検出
するための補助電極であり、酵素反応による過酸
化水素の発生を防止すべく、上記酵素を固定化し
ていないか、又は失活した上記酵素を固定化して
なる電極重合高分子薄膜を過酸化水素電極の感応
部上に形成してなる。ここで失活した酵素の固定
化は、前記第１作用電極と同様な方法で電極表面
上へ固定化高分子膜を形成した後、例えば酵素が
失活するに足りうる温度（例えば100℃程度）で
加熱することにより簡便に行なうことができる。

この発明における過酸化水素発生酵素とは、過
酸化水素を発生する反応系を有するものであり、
例えば、グルコースを基質とするグルコースオキ
シダーゼ（GOD）が代表的であり、これ以外の
酵素／基質の組合せとしては、ウリカーゼ／尿
酸、乳酸オキシダーゼ／乳酸、シユウ酸オキシダ
ーゼ／シユウ酸、アミノ酸オキシダーゼ／アミノ
酸、モノアミンオキシダーゼ／モノアミン、ピル
ビン酸オキシダーゼ／ピルビン酸、アルコールオ
キシダーゼ／アルコール、ガラクトースオキシダ
ーゼ／ガラクトース等が挙げられる。これらの酵
素は、検出を意図する物質（基質）に対応して選
択される。

なお、これらの酵素は二種以上用いられていて
もよい。ことに上記過酸化水素発生酵素の基質を
産生しうる他の種の酵素を組合せることにより、
検出可能な物質の種類を増加させることができ
る。この例としては、スクロースを検出物質とす
るインベルターゼ／ムタロターゼ／GODの組合
せ、マルトースを検出物質とするグルコアミラー
ゼ（又はマルターゼ）／GODの組合せ、コレス
テロールエステルを検出物質とするコレステロー
ルエステラーゼ／コレステロールオキシダーゼの
組合せ、ホスフアチジルコリンを検出物質とする
ホスホリパーゼ／コリンオキシダーゼの組合せ等
が挙げられ、少なくとも最終的に過酸化水素を発
生しうる組合せであればよい。

この発明の酵素電極システムによる測定は、対
極と各作用電極との間の定電位電解における電解
電流に基づいて行なわれる。ここで電解電圧は、
第１作用電極及び第２作用電極の基体である貴金
属電極やカーボン電極が、過酸化水素電極として
働くべく、過酸化水素が還元される電位（通常、
0.6V vs Ag／AgCl以上）となるよう設定され
る。従つて通常、銀−塩化銀電極やカロメル電極
等の参照電極を用いて電解電位をモニターし電解
電位をポテンシヨスタツト等で一定に制御した状
態で行なうのが適している。ただし、対極自体を
参照電極として作用させることもでき、この場合
にはとくに専用の参照電極を用いる必要はない。

対極は、前記過酸化水素電極に適用しうる材質
と同じものが使用できるが、第１、第２作用電極
よりも面積の広いもの（通常100倍以上）を用い
るのが極間抵抗を減少させる点で好ましく、例え
ば、白金電極よりも表面積が著しく大きな白金黒
電極を用いるのが適している。

また、第１作用電極による電解電流と、第２作
用電極による電解電流の出力差を検出する差動力
出力検出系としては、オペアンプ等を用いるのが
適している。

(ホ) 作用 第１作用電極において、基質の存在下、固定化
された酵素により過酸化水素が発生し、これが電
解重合高分子薄膜を透過して過酸化水素電極表面
で還元を受け、一定の還元電流（電解電流）が流
れる。一方、第２作用電極においては、酵素によ
る過酸化水素の発生は生じないが、検体中に含ま
れる各種還元生物質が過酸化水素電極の表面に達
し、誤差分の電解電流が流れる。そして差動出力
検出系において、第１作用電極における電解電流
と第２作用電極における電解電流との出力差が検
出され、実質的に発生過酸化水素分、ひいては測
定を意図する基質の濃度に対応する電解電流が得
られることとなる。

(ヘ) 実施例 第１図は、この発明の酵素電極システムにおけ
る各電極構成の一例を示すものであり、Ａは模式
図、Ｂは底面図である。かかる各電極は以下のよ
うにして構成した。

まず、円筒状の絶縁基板１（塩化ビニル樹脂
製）先端に、過酸化水素電極となる直径0.5mmの
白金線からなる測定極２及び３並びに参照電極５
（Ag／AgCl電極）を埋込んで各感応部が露出す
るように装着し、さらに先端部外周に白金製の対
極４を装着した電極系を構成した。この電極系
を、モノマーである0.1Mアニリン、及び２mg／
mlグルコールオキシダーゼ（GOD）を含む水溶
液（PH7.0）に浸漬させ、まず測定極２と対極４
間での室温下約５分間の定電位電解重合（1.2V
vs Ag／AgCl）により、測定極２の先端露出面
にポリアニリン−GOD固定化（包括）高分子薄
膜を形成した。次にこの先端を100℃の水溶液に
５分間浸漬し、高分子薄膜中のGODを失活させ
ることにより、第２作用電極を作製した。次いで
測定極３と対極４間での電解重合により上記と同
様にして測定極３の先端露出面にポリアニリン−
GOD固定化（包括）高分子薄膜を形成して第１
作用電極を設定した。図中、６ａは失活した
GODを固定化した高分子薄膜、６ｂはGODを固
定化した高分子薄膜を各々示し、厚みは各々約
0.3μｍであつた。

この電極構成体を用いたこの発明の酵素電極シ
ステム（グルコース濃度検出装置）の構成図を第
３図に示し、かつ回路図を第４図に示した。

上記酵素電極システムを用いて、グルコース濃
度に対する応答電流の変化を測定した結果を第５
図に示した。なお、検液は、PH7.0、37℃かつ無
攪拌の条件下で行ない、電解電位は＋0.7V vs
Ag／AgClに設定して行なつた。

このように、グルコース濃度約500mg／dlまで
直線性が良好な検量線が得られ、せいぜい100
mg／dl程度が直線性の限界であつた従来の酵素電
極法に比して応答性が著しく改善されていること
が判明した。

また、同様な酵素電極システムを繰返し作製し
て応答性を調べたところ、再現性も良好であり、
電解重合法により酵素固定化が再現性良く行なえ
ることも判明した。

また、妨害物質としてアスコルビン酸を含有す
る検液並びに尿酸を含有する検液を用いて測定を
行なつたところ、これらの酸化電流が第２作用電
極及び相殺回路により相殺され、実質的にグルコ
ースのみに応答することも判明した。

また、もう一つの実施例として、第１図におけ
る参照電極を、対極が兼ね、一つの白金電極とし
た場合の模式図を、第２図に示す。この電極系の
場合も、同様な測定が可能であるが、対極である
白金電極を白金黒電極にした方が、より安定な測
定が可能であつた。

(ト) 発明の効果 この発明の酵素電極システムによれば、以下の
ごとき効果を得ることができる。

従来の酸素電極方式や過酸化水素電極方式に
比して、基質応答性を著しく向上することがで
きる。

過酸化水素電極方式であるため、酵素電極方
式のように、検液を最初に酵素で飽和させる等
の煩雑さがない。

電解電流の差動出力を検出しているため、妨
害物質の影響を受けず、測定の正確度が高い。

酵素の固定化膜が、電解重合により行なわれ
ているため、極めて薄くかつ再現性の良く作製
することができ、膜厚調整も容易であり、しか
も電極の大きさや形状等に左右されず任意の電
極に酵素固定化することができ、酵素電極やそ
のシステムの設計の自由度、ことに微小化にお
ける自由度が著しく向上する。

電解重合膜による固定化のため、高分子膜厚
が他の重合膜に比して薄膜化されており、測定
感度も優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の酵素電極システムにおけ
る各電極構成の一例を示すもので第１図Ａは断面
模式図、第１図Ｂはその底面図である。第２図
は、同じく他の例を示すものであり、第２図Ａは
断面模式図、第２図Ｂはその底面図である。第３
図はこの発明の酵素電極システムを例示する構成
説明図であり、第４図はその対応回路図である。
第５図はこの発明の酵素電極システムによる基質
濃度と応答電流との関係を例示するグラフ図であ
る。 １……絶縁基板、２，３……測定極、４……対
極、５……参照電極、６ａ，６ｂ……高分子薄
膜。

【特許請求の範囲】

１ 電解液を入れた測定セル内にサンプル液を供
給し、サンプル液中の測定対象物質を電解してサ
ンプル液中の測定対象物質の含有量を求める電量
分析方法において、同一容積の複数個の貫通孔を
有する非導電性の板と、該板の複数個の貫通孔と
夫々連通しうるように設けた複数個の貫通孔を有
する非導電性の板とを、これらの貫通孔が交互に
連通するように相対的に回転可能に密着圧接さ
せ、連通した一組の貫通孔を通して測定セル内の
電解液を循環させながら分析を行ない、その電量
分析の終了後、連通した別の組の貫通孔にサンプ
ル液を供給した後に、同一容積の貫通孔を有する
板を回転させて回転した板の貫通孔を非回転側の
板の貫通孔と連通させ、測定セルと連通状態とな
つた同一容積の貫通孔から測定セル内の電解液の
循環によりサンプル液を測定セルに注入し、同時
に測定セルと非連通状態となつた同一容積の貫通
孔から注入サンプル液の量に見合う量の電解液を
系外に排出し、これを繰返して行なうことを特徴
とする連続電量分析のサンプル液注入方法。 ２ 同一容積の複数個の貫通孔を有する非導電性