JPS6350748A - 酵素電極システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、酵素電極システムに関する。さらに詳しく
は、過酸化水素電極方式の酵素電極を用いてなり、試料
中の特定成分の濃度を迅速かつへ躊度で選択的に定量分
析できる酵素電櫓システムに関する。

〈口）従来の技術 近年、酵素の有する基質特異性をうまく利用して、試料
中の特定成分の濃度を迅速かつ正確に定量する手段とし
て、酵素電極が注目を浴びている。

この酵素電極の内、基質が酵素存在下で、溶存酸素を消
費し過酸化水素を生成するという反応においては、酸素
減少機を捕らえる酸素電極方式と、生成する過酸化水素
を捕らえる過酸化水素電極方式とがある。

上記酸素電極方式は、酸素透過性膜を酸素電極表面に装
着しこの膜に酸素発生系を有する酵素を固定化した酵素
電極を用いるものであり、電極系と検液とを完全に分離
できる利点がある。そして、最近、酸素発生系を有する
酵素の固定化膜として電解重合法により形成される高分
子薄膜を用いる提案もなされている〔［電解合成酵素膜
の酸素透過性と分子識別機能」、電気化学協会第５３回
大会講演要旨集Ｃ２ｏ３（１９８６）　）。

一方、過酸化水素電極方式は、電極表面に過酸化水素が
到達する必要があるため、検液が透過しうる膜を用い、
これに過酸化水素発生系を有する酵素を固定化して過酸
化水素ミル１．：被着して描成されている。従って検液
が電極表面と接触することとなり、検液中に含まれる種
々の還元性物質により妨害電流が生ずる欠点がある。こ
の点に関し、最近、この妨害電流を除く手段として、２
本の作用電極（過酸化水素電極）を用い、一方に酵素を
光重合高分子膜で固定化し、他方には酵素を固定化して
いない又は失活した酵素を固定化してなる光重合高分子
膜を被覆して、これらの作用゛電極の差動出力を検出す
る方法が提案されている〔高津一部ｅｔａ１、「差動出
力型グルコースセンサー」、電気学会研究会資料（１９
８５年））。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら、前記電解重合による酵素固定化膜を用い
た酸素電極方式の酵素電極の基質応答性における直線性
の限界は１００＋＋＋ｇ　／ｄｌ程度までと狭く、これ
を越える基質濃度の検体の３１！Ｉ定に大きな誤差を生
じ、希釈操作を予め必要とするという問題点があった。

一方、差動出力検出方式を用いた前記過酸化水素電極方
式のＦｆ素電極システムにおいても、良好な応答性はせ
いぜい１００１１１（１／ｄｌ程度までであり、上記と
同様な問題点があった。

この発明は、かかる従来の問題点を解消すべくなされた
ものであり、ことに基質応答性が改善された酵素電極シ
ステムを提供しようとするものである。

（ニ）問題点を解決するだめの手段 本発明者は、鋭意研究を行なった結果、酸素電極方式の
酵素電極において酸素透過性の酵素工程化膜の媒体とし
て用いる電解重合高分子薄膜を、前記差動出力検出−過
酸化水素電極方式の酵素電極システムにおける過酸化水
素発生酵素の固定化膜の媒体として用いることにより、
基質応答性が著しく改善される事実を見出し、この発明
に到達した。

かくしてこの発明によれば、（Ｊ過酸化水素電極の感応
部上に、電解重合高分子薄膜からなる過酸化水素発生酵
素の固定化高分子膜を備えてなる第１作用電極と、＋ｂ
＋過酸化水素電極の感応部上に、電解重合高分子薄膜か
らなり酵素を固定化していない又は失活した過酸化水素
発生酵素を固定化した高分子膜を備えてなる第２作用電
極と、（ｃ）上記第１作用電極及び第２作用電極と電解
系を溝成する対極と、＋ｄ＋第１作用電極による電解電
流と、第２作用電極による電解電流との出力差を検出す
る差動出力検出系を具備してなる酵素電極システムが提
供される。

この発明における電解重合高分子薄膜は、過酸化水素電
極となりうる各種貴金属（白金、金等）やカーボン電極
を電解用電極として用い、これを重合用七ツマ−の電解
質溶液中に浸漬した状態で電解を行なって重合を進行さ
せることにより形成することができる。上記王台用モノ
マーとしては、水溶性でかつ水溶液中で重合しうるちの
であればよく、水酸基ヤアミノ基等の官能基を有する芳
香族系化合物が適しており例えば、アニリン、〇−フェ
ニレンジアミン、フェノール等が挙げられる。

ただし、ビロール、チオフェンのような非水溶性のモノ
マーであっても非水溶媒系電解買中で重合しうるちのも
適用可能である。なお、電解を円滑に進行させるために
適当な支持塩が添加するのが適しており、ことに非水溶
媒系で重合を行なう場合には必要である。また上記過酸
化水素電極は、棒状のものに限らず、例えば、絶縁基板
上に愚者された膜状のものであってもよい。電極の形状
の如何を問わず、均一な高分子薄膜を形成することがで
き、用途に応じた形の酵素電極を作製し用いることがで
きる点も、この発明の一つの利点である。

この発明における第１作用電極シは、過酸化水素発生酵
素の酵素反応により生ずる過酸化水素量に対応する電解
電流を検出するための主電極である。

かかる第１作用電極は、前記した電解重合による手法に
より過酸化水素電極の感応部上に高分子薄膜を形成する
に際し、モノマーの電解質溶液中に、所定の過酸化水素
発生酵素を含有させておくことにより、簡便かつ効率的
に作製することができる。

この際の電解重合は、室温等の緩和な温度下で行なうの
が適しており、酵素の活性をできるだけ低下させないよ
うに、０℃付近で行なうのが好ましい。また電解条件は
、定電位法、電位走査法のいずれを用いてもよい。ただ
し、場合によっては、高分子薄膜を形成した後、この表
面に、例えばシッフ塩基法等の公知の固定化法で過酸化
水素発生酵素を固定化してもよい。ことに非水溶媒系電
解重合膜を用いる場合には、この方法が適している。

上記固定化高分子膜の厚みは、約０．１〜０．５膚が璃
当である。厚みが薄すぎると厚み制御が困棄１でかつ感
度も低下し易く、また厚みが厚すぎると過酸化水素の電
極面への到達が阻害され易くまた、電解重合による製造
自体困難で好ましくない。

この発明における第２作用電極は、検液中の種々の還元
性物質による電解電流への影響を検出するための補助電
極であり、酵素反応による過酸化水素の発生を防止すべ
く、上記酵素を固定化していないか、又は失活した上記
酵素を固定化してなる電極重合高分子薄膜を過酸化水素
電極の感応部上に形成してなる。ここで失活したＶｆ累
の固定化は、前記第１作用電極と同様な方法で電極表面
上へ固定化高分子膜を形成した後、例えば酵素が失活す
るに足りうる温度（例えば１００℃程度）′ｃ加熱する
ことにより簡便に行なうことができる。

この発明における過酸化水素発生酵素とは、過酸化水素
を発生する反応系を有するものであり、例えば、グルコ
ースを基質とするグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が
代表的であり、これ以外の酵素／基質の組合せとしては
、ウリカーゼ／尿耐、乳酸オキシダーゼ／乳酸、シュウ
酸オキシダーゼ／シュウ酸、アミノ酸オキシダーゼ／ア
ミノ酸、モノアミンオキシダーゼ／モノアミン、ピルビ
ン酸オキシダーゼ／ピルビン酸、アルコールオキシダー
ゼ／アルコール、ガラクトースオキシダーゼ／ガラクト
ース等が挙げられる。これらの酵素は、検出を意図する
物質（基質）に対応して選択される。

なお、これらの酵素は二種以上用いられていてもよい。

ことに上記過酸化水素発生酵素の基質を産生しうる他の
種の酵素を組合せることにより、検出可能な物質の種類
を増加させることができる。

この例としては、スクロースを検出物質とするインベル
ターゼ／ムタロターゼ／ＧＯＤの組合せ、マルトースを
検出物質とするグルコアミラーゼ（又はマルターゼ）／
ＧＯＤの組合せ、コレステロールエステルを検出物質と
するコレステロールエステラーゼ／コレステロールオキ
シダーゼの組合せ、ホスファチジルコリンを検出物質と
するホスホリパーゼ／コリンオキシダーゼの組合せ等が
挙げられ、少なくとも最終的に過酸化水素を発生しうる
組合せであればよい。

この発明の酵素電極システムによる測定は、対極と各作
用電極との間の定電位電解における電解電流に基づいて
行なわれる。ここで電解電圧は、第１作用電極及び第２
作用電極の基体である員金屈電極やカーボン電極が、過
酸化水素電極とじて動くべく、過酸化水素が還元される
電位（通常、０．６Ｖ　ｖｓ　Ａｇ／Ａｇ０１以上）と
なるよう設定される。従って通常、銀−塩化銀ｆｆｒｆ
やカロメル電極等の参照電極を用いて電解電位をモニタ
ーし電解電位をポテンショスタット等で一定に制御した
状態で行なうのが適している。ただし、対極自体を参照
°電極として作用させることもでき、この場合にはとく
に専用の参照電極を用いる必要はない。

対極は、前記過酸化水素電極に適用しうる材Ｙゴと同じ
ものが使用できるが、第１．第２作用電極よりも面積の
広いものく通常１００倍以上）を用いるのが極間抵抗を
減少させる点で好ましく、例えば、白金電極よりも表面
積が著しく大ぎな白金黒電極を用いるのが適している。

また、第１作用電極による電解電流と、第２作用電極に
よる電解電流の出力差を検出する差動力出力検出系とし
ては、オペアンプ等を用いるのが適している。

（ホ）作　用 第１作用電極において、基質の存在下、固定化された酵
素により過酸化水素が発生し、これが電解重合高分子薄
膜を透過して過酸化水素電極表面で還元を受け、一定の
還元電流（電解電流）が流れる。一方、第２作用電極に
おいては、酵素による過酸化水素の発生は生じないが、
検体中に含まれる各種還元性物質が過酸化水素電極の表
面に達し、誤差分の電ｗｌ電流が流れる。そして差動出
力検出系において、第１作用電極における電解電流と第
２作用電極における電解電流との出力差が検出され、実
質的に発生過酸化水素弁、ひいては測定を意図する基５
１の濃度に対応する電解電流が得られることとなる。

（へン実施例 第１図は、この発明の酵素電極システムにおける各電極
構成の一例を示すものであり、Ａは模式図、Ｂは底面図
である。かかる各電極は以下のようにして構成した。

まず、円筒状の絶縁基板１（塩化ビニル樹脂製）先端に
、過酸化水素電極となる直径０．５ｍｍの白金線からな
る測定極２及び３並びに参照゛１七極５（Ａｇ／ＡｇＣ
ｌ電極）を埋込んで各感応部が露出するよう装着し、さ
らに先端部外周に白金製の対極４を装着した電極系を構
成した。この電極系を、モノマーである０、１Ｍアニリ
ン、及び２ｍａ、、、−’ｍｌグル］−ルールシダーゼ
（ＧＯＤ）を含む水溶液（ＰＨ７，０）に浸漬させ、ま
ず測定極２と対極４間での室温下約５分間の定電位電解
重合（１，２ＶＶＳΔｇ／△ｇｃｌ）により、測定極２
の先端露出面にポリアニリン−〇〇Ｄ固定化（包括）高
分子簿膜を形成した。次にこの先端を１００℃の水溶液
に５分間浸漬し、高分子１ｇＩ中のＧＯＤを失活させる
ことにより、第２作用電極を作製した。次いで測定極３
と対極４間での電解重合により上記と同様にして測定極
３の先端露出面にポリアニリン−〇〇Ｄ固定化（包括）
高分子ＦｎＷＡを形成して第１作用電極を設定した。図
中、６ａは失活したＧＯＤを固定化した高分子薄膜、６
ｂ１．ｔＧＯＤを固定化した高分子′ａＩＩｌを各々示
し、厚みは各々約０．３−であった。

この電極構成体を用いたこの発明の酵素電極システム（
グルコース濃度検出装置）の溝成図を第３図に示し、か
つ回路図を第４図に示した。

上記酵素電極システムを用いて、グルコース濃度に対す
る応答電流の変化を測定した結果を第５図に示した。な
お、検液は、ＰＨ７，０，３７℃かつ無撹拌の条件下で
行ない、電解電位は＋〇、７Ｖ　ＶＳＡｇ／ＡｇＣ１に
設定して行なった。

このように、グルコース濃度的５００ｍａ／　ｄｉまで
直線性が良好な検量線が得られ、せいぜい１００１ｇ／
ｄｌ程度が直線性の限界であった従来の酵素°電極法に
比して応答性が著しく改善されていることが判明した。

また、同様な酵素電極システムを繰返し作製して応答性
を調べたところ、再現性も良好であり、電解重合法によ
り酵素固定化が再現性良く行なえることも判明した。

また、妨害物質としてアスコルビン酸を含有する検液並
びに尿酸を含有する検液を用いて測定を行なったところ
、これらの酸化電流が第２作用電極及び相殺回路により
相殺され、実質的にグルコースのみに応答することも判
明した。

また、もう一つの実施例として、第１図における参照電
極を、対極が兼ね、一つの白金電極とした場合の模式図
を、第２図に示す。この電極系の場合も、同様な測定が
可能であるが、対極である白金電極を白金黒電極にした
方が、より安定な測定が可能であった。

（ト）発明の効果 この発明の酵素電極システムによれば、以下のごとき効
果を得ることができる。

■　従来の酸素電極方式や過酸化水素電極方式に比して
、基質応答性を著しく向上することができる。

■　過酸化水素電極方式であるため、酵素電極方式のよ
うに、検液を最初にａ素で飽和させる等の煩雑さがない
。

■　電解電流の差動出力を検出しているため、妨害物質
の影響を受けず、測定の正確度が高い。

■　酵素の固定化膜が、電解重合により行なわれている
ため、極めて薄くかつ■現性の良く作製することができ
、膜厚調整も容易であり、しかも電極の大きさや形状等
に左右されず任意の電極に酵素固定化することができ、
酵素電極やそのシステムの設計の自由度、ことに微小化
における自由度が著しく向上する。

■　電解重合膜による固定化のため、高分子膜厚が伯の
重合膜に比して薄膜化されており、測定感度も優れてい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の酵素電極システムにおける各電橋
構成の一例を示すもので第１図△は断面模式図、第１図
Ｂはその底面図である。第２図は、同じく他の例を示す
ものであり、第２図Ａは断面模式図、第２図Ｂはその底
面図である。第３図はこの発明の酵素電極システムを例
示する構成説明図であり、第４図はその対応回路図であ
る。第５図はこの発明の酵素電極システムによる基質濃
度と応答電流との関係を例示するグラフ図である。 １・・・・・・絶縁基板、　　２，３・・・・・・測定
極、４・・・・・・対極、　　　　　５・・・・・・参
照電極、５ａ、５ｂ・・・・・・高分子薄膜。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）過酸化水素電極の感応部上に、電解重合高分
   子薄膜からなる過酸化水素発生酵素の固定化高分子膜を
   備えてなる第１作用電極と、 （ｂ）過酸化水素電極の感応部上に、電解重合高分子薄
   膜からなり酵素を固定化していない又は失活した過酸化
   水素発生酵素を固定化した高分子膜を備えてなる第２作
   用電極と、 （ｃ）上記第１作用電極及び第２作用電極と電解系を構
   成する対極と、 （ｄ）第１作用電極による電解電流と、第２作用電極に
   よる電解電流との出力差を検出する差動出力検出系、 を具備してなる酵素電極システム。