JPH05292995A - モノクローナル抗体，その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトＮＧＦ蛋白質に結合するモノクローナル抗
体を開発する。 【構成】ヒトＮＧＦと反応し、ヒトＮＧＦのＮ末端部分
を認識しないＮＧＦ蛋白質に対するモノクローナル抗体
を製造した。 【効果】ヒトＮＧＦ蛋白質に特異的に結合するので、測
定用試薬などとして有利に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子(本明細書
において、ＮＧＦと略称することもある。)蛋白質に対
するモノクローナル抗体,その製造法および用途に関す
る。さらに、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】神経成長因子(nerve growth factar,Ｎ
ＧＦ)はレヴィ モンタルチーニ(Levi-Monntalcini)
〔アニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイ
エンス( Ann. N. Y. Acad. Sci )５５,３３０ (１９５
２)〕およびコーエン（Cohen）ら〔プロシージングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ)４
０,１０１４(１９５４)〕によっ て発見され、末梢神経
系の分化、成長および生存に必須な栄養因子である。最
近、ＮＧＦは中枢神経系において、コリン作動性ニュー
ロンの生存を維持する作用を有することが明らかにされ
ており〔ヘフティー(Hefti),ジャーナル オブニューロ
サイエンス（Journal of Neuroscience）６，２１５５
（１９８６）；畠 中（Hatanaka)等、ディベロプメント
オブ ブレイン リサーチ(Dev. Brain Res.)３９,８
５(１９８８)〕、アルツハイマー病と何らかの関連があ
る因子とし て注目されている。また、老齢ラットの脳
内にＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が認められる
〔ネイチャー(Nature),３２９,６５(１９８９)〕ことか
ら、老人性痴ほうの治療薬としても期待されている。

【０００３】雄マウス顎下腺より単離されたＮＧＦ(７
Ｓ ＮＧＦ)は、α、β、γの３種のサブユニットから
なる複合体(α₂βγ₂)であり、そのうちのβサブユニッ
トにのみＮＧＦ活性が認められている。βサブユニット
(βＮＧＦ、２.５Ｓ ＮＧＦ)は１１８個のアミノ酸か
らなる同一のポリペプチドの２量体であり、そのアミノ
酸配列はアルゲレッティ(Argeletti)とブラッドショウ
(Bradshaw)〔プロシージングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユーエスーエー(Pro
c.Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ),６８,２４１７(１９７
１)〕によって決定されている。

【０００４】スコット(Scott)らはマウスβＮＧＦのア
ミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いて、マウス顎下腺cＤＮＡライブラリ
ーから、マウスβＮＧＦのクローニングに成功した〔ネ
イチャー(Nature),３０２,５３８ (１９８３)〕。さら
にアルリッチ(Ullrich)らはマウスβＮＧＦ cＤＮＡを
プローブとして用いて、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリ
ーからＮＧＦ遺伝子をクローニングし、その塩基配列か
ら推定したヒトＮＧＦのアミノ酸配列がマウスＮＧＦの
それと９０％の相同性を有することを示した〔ネイチャ
ー(Nature),３０ ３,８２１(１９８３)〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このようなヒトＮＧＦ
遺伝子はクローニングされているが、生体からヒトＮＧ
Ｆが検出や単離がなされた報告はほとんどない。ヒトＮ
ＧＦが生体から検出されない理由の１つとして、今まで
主として抗マウスＮＧＦ抗体を用いていたためと考えら
れる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記実情にかんがみ、本
発明者らはＮＧＦの実用的な測定手段を見い出すべく種
々検討した結果、その測定を可能ならしめるＮＧＦに対
するモノクローナル抗体を作製し、これに基づいてさら
に研究した結果、本発明を完成した。 (1)、 ヒトＮＧＦと反応し、ヒトＮＧＦのＮ末端部分を
認識しないＮＧＦ蛋白質に対するモノクローナル抗体，
(2)、 上記(1)記載のモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ,(3)、 上記(2)記載のハイブリドーマを液体
培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることを特徴
とする上記(1)記載のモノクローナル抗体の製造法,およ
び(4)、 上記(1)記載のモノクローナル抗体を用いて免疫
学的測定法を行なうことを特徴とするＮＧＦ蛋白質の検
出および（または）定量法である。

【０００７】哺乳動物に免疫するＮＧＦ蛋白質として
は、動物由来のＮＧＦであればいずれでもよいが、生物
活性が認められるβサブユニットがより好ましい。ま
た、そのムテイン（mutein）でもよい。 動物由来のＮＧＦの代表例としては、たとえば、マウス
のＮＧＦ〔Levi-Monntalcini R. ら,J. Exp.Zool. １１
６：３２１(１９５１)；Varon S. ら,Biochemistry
６：２２０２（１９６７）〕,ヘビ毒由来ＮＧＦ〔Angel
etti R. H.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA ６５：６６８
(１９７０)〕,モルモットＮＧＦ〔 HarperG. P. ら, Na
ture ２７９：１６０（１９７９）〕およびヒト胎盤由
来のＮＧＦ〔Goldstein L. D.ら,Neurochem. Res.３：
１７５(１９７８)〕などがあげられる。ＮＧＦとしては
マウスβＮＧＦ cＤＮＡをプローブとして用いて、ヒト
ゲノムＤＮＡライブラリーからＮＧＦ遺伝子をクローニ
ングし、その塩基配列から推定したアミノ酸配列〔 Ulr
ich A. ら,Nature３０３：８２１(１９８３)〕を有する
ポリペプチドが好ましい。

【０００８】ヒトのＮＧＦを得るには、たとえば上述の
ＮＧＦ蛋白質のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有する発現ベクターを作製し、適当な宿
主細胞に導入してＮＧＦを産生させればよい。発現ベク
ターとしては、例えば、(イ)ヒト白血球ＤＮＡより作製
されたゲノムライブラリーで宿主を形質転換し、(ロ)得
られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方
法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーション法、により目的とするＤＮＡを含有するプ
ラスミドを単離し、(ハ)そのプラスミドから目的とする
クローン化ＤＮＡを切り出し、(ニ)該クローン化ＤＮＡ
をビークル中のプロモーターの下流に連結する、ことに
より製造することができる。

【０００９】このようにして得られた発現ベクターを、
適当な宿主（例、大腸菌,枯草菌,酵母,動物細胞）に組
み込み、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ヒトのＮＧＦを製造することができる。上記ヒトＮ
ＧＦ蛋白質としては、ヒトＮＧＦのムテインをも含まれ
る。該ヒトＮＧＦムテインとしては、本来、元のペプチ
ドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであ
り、したがって該変異としては、アミノ酸の付加,構成
アミノ酸の欠損,他のアミノ酸への置換が挙げられる。 該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。該構成アミノ酸の欠
損としては、少なくとも１個のＮＧＦ構成アミノ酸が欠
損しているものが挙げられる。該他のアミノ酸への置換
としては、少なくとも１個のＮＧＦ構成アミノ酸が別の
アミノ酸で置換されているものが挙げられる。

【００１０】ＮＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加
しているムテインにおける少なくとも１個のアミノ酸と
しては、ペプチドを発現する際に用いられる開始コドン
に基因するメチオニンや、シグナルペプチドは含まれな
いものである。付加されているアミノ酸の数としては、
少なくとも１個であるが、ＮＧＦの特徴を失わない限り
何個でもよい。さらに好ましくは、ＮＧＦと相同性(ホ
モロジー)が認められており、同様の活性を示すタンパ
クのアミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。
ＮＧＦの少なくとも１個のＮＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムテインにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＮＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。ＮＧＦの少なくとも１個のＮＧＦ構成アミノ酸が
別のアミノ酸で置換されているムテインにおける置換さ
れる前の少なくとも１個のＮＧＦ構成アミノ酸の数とし
ては、ＮＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

【００１１】置換される前の構成アミノ酸の例として
は、システイン,システイン以外のものが挙げられる。
システインが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシステイン以外のものとしては、アスパラギン
酸,アルギニン,グリシン,バリンなどが挙げられる。 置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイシ
ン,チロシン,フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプトフ
ァン,セリン,スレオニン,メチオニンなどが挙げられ
る。特に、セリン,スレオニンが好ましい。置換される
前の構成アミノ酸がシステイン以外のものである場合に
は、置換された別のアミノ酸としては、たとえば、アミ
ノ酸の親水性,疎水性あるいは電荷の点で、置換される
前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。具体例
には置換される前のアミノ酸がアスパラギン酸の場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としてアスパラギン,ス
レオニン,バリン,フェニルアラニン,アルギニンなどが
挙げられるが、特にアスパラギン,アルギニンが好まし
い。置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置
換されたあとのアミノ酸としてグルタミン,スレオニン,
ロイシン,フェニルアラニン,アスパラギン酸が挙げられ
るが、特にグルタミンが好ましい。置換される前の構成
アミノ酸がグリシンである場合には、置換されたあとの
アミノ酸としては、スレオニン,ロイシン,フェニルアラ
ニン,セリン,グルタミン酸,アルギニンなどが挙げら
れ、特にスレオニンが好ましい。置換される前の構成ア
ミノ酸がセリンである場合には、置換されたあとのアミ
ノ酸としては、メチオニン,アラニン,ロイシン,システ
イン,グルタミン,アルギニン,アスパラギン酸などが挙
げられ、特にメチオニンが好ましい。置換される前の構
成アミノ酸がバリンである場合には、置換されたあとの
アミノ酸としては、セリン,ロイシン,プロリン,グリシ
ン,リジン,アスパラギン酸などが挙げられ、特にセリン
が好ましい。置換される前の元の構成アミノ酸として
は、アスパラギン酸,アルギニン,グリシン,セリン,バリ
ンが好ましい。置換されたあとのアミノ酸としては、ア
スパラギン,グルタミン,アルギニン,スレオニン,メチオ
ニン,セリン,ロイシンが好ましい。

【００１２】上記の置換においては、２以上の置換を同
時に行なってもよい。特に、２または３個の構成アミノ
酸が置換されるのが好ましい。上記のムテインは、上記
した付加,欠損,置換の２つまたは３つが組み合わさった
ものでもよい。該ムテインを製造するためには、特定部
位指向性変異誘発技術(Sitedirected mutagenesis)が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサ
ー(Lather, R. F.)及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq,
J. P.),ジェネティック・エンジニアリング(Genetic E
ngineering)、アカデミックプレス社(１９８３年)第３
１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指
示された変異誘発はエム・スミス（Smith, M.)及びエス
・ギラム（Gillam, S.)、ジェネティック・エンジニア
リング：原理と方法、プレナムプレス社(１９８１年)３
巻１−３２頁に示されている。

【００１３】該ムテインをコードする構造遺伝子を製造
するためには、たとえば、(a) ＮＧＦの構造遺伝子の１
本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異株オリゴヌクレオ
チドプライマーと雑種形成させる(この１本鎖で代替え
すべきシステイン用コドン、又は場合によりこのコドン
と対合をつくるアンチセンス・トリプレットを包含する
領域に対して上記プライマーは相補的なものである。但
し、当該コドンの他のアミノ酸暗号化用コドン、又は場
合によりアンチセンス・トリプレットとの不一致はこの
限りでない。)、(b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマ
ーを伸長させ、突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)
を形成させる、及び(c) この突然変異性ヘテロ二量体を
複製する。次に、突然変異化された遺伝子を運搬するフ
ァージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。

【００１４】このようにして得られたプラスミドで適当
な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培地に培養
することにより、ムテインを製造することができる。本
発明における抗原としてのＮＧＦの構成アミノ酸が欠損
したムテインとしては、ＮＧＦのアミノ酸配列のうちの
アミノ酸の個数が１００個以上のものからなるムテイン
が好ましく、さらに好ましくは１１０個以上のムテイン
があげられる。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、ヒトＮＧＦ蛋白質を哺乳動物に免疫し、得られた脾
臓細胞と哺乳動物のリンパ球様細胞とを細胞融合させ、
次いでクローン化することにより製造される。該ＮＧＦ
蛋白質を免疫するに際しては、ＮＧＦ蛋白質をキャリヤ
ー蛋白との複合体としてから、これを免疫に用いてもよ
い。該キャリヤー蛋白としては、たとえばウシ血清アル
ブミン,ウシサイログロブリン,ヘモシアニンなどが挙げ
られる。キャリヤー蛋白複合体を用いる場合に、キャリ
ヤー蛋白とＮＧＦ蛋白質とのカップリング比率は、約
０.１〜３０倍(キャリヤー／ＮＧＦ蛋白質：重量比)で
用いられる。望ましくは約０.５〜５倍が用いられる。
また、ハプテンとキャリヤーとのカプリングには、種々
の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒド
やカルボジイミド等が好都合に用いられる。

【００１６】ＮＧＦ蛋白質または蛋白複合体を用いて免
疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モ
ルモット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、
モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが
好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、
皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下等のいずれのルー
トからでも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈
内に(とりわけ皮下)注入するのが好ましい。また、免疫
間隔,免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であ
るが、たとえば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫
後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾
臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は１回に
ペプチド量として、マウス当り約０.１μg以上、好まし
くは約１０μg〜３００μg用いることが望ましい。又、
脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の
上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合実験を行う
ことが望ましい。

【００１７】上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融
合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
(ＨＧＰＲＴ^-)や、 チミジンキナーゼ欠損(ＴＫ^-)の様な
マーカーを持った適切な同種または異種(好ましくは同
種)のミエローマ[例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ１(市森
他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド ８
０ ５５ (１９８５)]等の、リンパ球様細胞株との間
で融合させる。例えばケラーおよびミルスタイ ンらの
方法[ネイチャー(Nature)２５６：４９５(１９７５)]に
準じて融合させることにより製造される。たとえばミエ
ローマ細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、たとえばイ
スコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地
(以下ＩＨ 培地と称する。)に懸濁させ、センダイウイ
ルス,ポリエチレングリコール(PE Ｇ)等の融合剤が用い
られる。もちろんジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)その
他 の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの
重合度は、ふつう約１０００〜６０００,時間は約０.５
〜３０分,濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、
好ましい条件の一例として、ＰＥＧ ６０００を約３５
〜５５％で約４〜１０分 処理することにより、効率よ
く融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン培地[ＨＡＴ培地；ネイ
チャー,２５６,４ ９５(１９７５)]等を用いて、選択的
に増殖させることが出来る。

【００１８】増殖して来た細胞の培養上清は、目的とす
る抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行う
ことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行
うことが出来る。即ち、この場合には、まず第１段階と
して免疫したペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジ
オイムノアッセイ(ＲＩＡ)法またはエンザイムイムノア
ッセイ(ＥＩＡ)法等の方法で調べることが出来るが、こ
れらの方法についても種々の変法が可能である。好まし
い測定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法につ
いて述べる。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサ
ギ抗マウスイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリ
ングさせておき、これに測定したい培養上清や、マウス
の血清を加え、一定時間、定温(約４〜４０℃を示す。
以下においても同様。）で反応させる。この後、反応物
をよく洗った後、酵素で標識したペプチド(酵素とペプ
チドを常法に従いカプリングさせた後精製)を加え、一
定時間,定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵
素基質を加え、一定時間,定温で反応させ、その後、生
成発色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来
る。

【００１９】選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた
ペプチドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、
限界希釈法等によりクローニングを行うことが望まし
い。クローン化された細胞の上清について同様にスクリ
ーニングを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすこと
により、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。

【００２０】このようにしてクローン化されたハイブリ
ドーマを、液体培地中で増殖させる。具体的には例え
ば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０[Moore,G.
E., et.al. ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（ J. Am.Med. Assoc.)１９９,５
４９(１９６７)]に約０.１〜４０％の牛血清を加えた培
地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養す
ることにより、培養液から該モノクローナル抗体を得る
ことができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞
を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得する
ことが出来る。このためには、例えばマウスの場合、ミ
ネラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／c 等のマ
ウスに約１×１０⁴〜１×１０⁷個、好ましくは約５×１
０⁵〜２×１０⁶個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、
約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液
を採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分
画,ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー等
により、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブ
リンとして単離することが出来る。

【００２１】このようにして、ＮＧＦ蛋白質に対するモ
ノクローナル抗体が得られる。本発明のモノクローナル
抗体にあっては、免疫原のペプチドのＮＧＦ蛋白質と特
異的に結合する。 なお、本発明のモノクローナル抗体
は、製造時に用いた免疫原のペプチドとは異なるＮＧＦ
蛋白質と結合する場合もある。本発明のモノクローナル
抗体は、ヒトＮＧＦと反応し、しかもヒトＮＧＦのＮ末
端部分を認識しないものである。たとえば、ヒトＮＧＦ
のＮ末端から第１番目〜第１５番目のアミノ酸配列に存
在する抗原決定を認識しないものである。本発明のモノ
クローナル抗体は、ＮＧＦ蛋白質に結合することから、
ＮＧＦ蛋白質測定用試薬として極めて有用である。さら
に生体臓器、組織中のＮＧＦ蛋白質の測定を容易にする
ことは、ＮＧＦ蛋白質に関する基礎知見(例えば生体内
分布)を得る上からも極めて有用である。生体臓器,組織
中のＮＧＦ蛋白質の検出には通常酵素免疫測定法(ＥＩ
Ａ法)などによる定量、あるいは蛍光抗体法やラジオイ
ムノアッセイ法(ＲＩＡ法)が用いられる。特に、ＥＩＡ
法が好ましい。またこれらの臓器,組織中に存在するＮ
ＧＦ蛋白質の大きさを知るにはタンパクのウエスタンブ
ロッティング法が有効である。この方法は臓器，組織由
来の粗抽出液あるいはその部分精製試料をアクリルアミ
ド電気泳動した後、メンブランフィルターにトランスフ
ァーし、ＨＲＰ結合抗ＮＧＦ蛋白質抗体で検出する。

【００２２】さらに該抗体とＮＧＦ蛋白質との結合能を
利用し、抗体アフィニティーカラムを作製してＮＧＦ蛋
白質の精製の試薬として利用することもできる。 ＮＧ
Ｆ蛋白質を検出,定量するために用いられる抗体分子
は、ＩgＧでもよく、または、そのフラクション｛例、F
(ab´)₂，Fab´ もしくはFab｝であっても良い。なかで
も、標識剤を直接結合させる抗体分子はFab´ であるこ
とが好ましい。本発明のモノクローナル抗体は、ＮＧＦ
蛋白質の免疫化学的測定法における試薬として用いるこ
とができる。該ＮＧＦ蛋白質の免疫化学的測定法によっ
て、生体組織や体液中のＮＧＦ蛋白質の量を測定するこ
とができ、これにより、たとえば種々の組織や体液中の
ＮＧＦ蛋白質を測定することにより、中枢神経系疾患の
診断に役立つと考えられる。

【００２３】上記免疫学的測定法において、二種の抗体
を用いる測定法を行なうに際しては、一方の抗体として
本発明のモノクローナル抗体を用い、他方の抗体とし
て、本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体を用いることができる。ＮＧＦ蛋白質の測定方法に
おいて用いられる担体上に保持された抗体における担体
としては、例えば、ゲル粒子(例、アガロースゲル[例、
セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ(ファルマシア・
ファインケミカル社(スエーデン)製)]、デキストランゲ
ル[例、セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−
１００、セファデックスＧ−２００(ファルマシア・フ
ァインケミカル社(スエーデン)製)]、ポリアクリルアミ
ドゲル[例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６
０、バイオゲルＰ−１００(バイオラッド・ラボラトリ
ーズ社(米国)製)]、セルロース粒子[例、アビセル(旭化
成製)、イオン交換セルロース(例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース)]、物理的
吸着剤[例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッド、アミ
ノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド)、
シリコン片、スチレン系樹脂(例、ポリスチレン球、ポ
リスチレン粒子)、イムノアッセイ用プレート（例、ヌ
ンク社(デンマーク)製]、イオン交換樹脂｛例、弱酸性
陽イオン交換樹脂[例、アンバーライトＩＲＣ−５０(ロ
ーム・アンド・ハース社(米国)製)、ゼオカーブ２２６
(パームチット社(西ドイツ)製)]、弱塩基性陰イオン交
換樹脂[例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス
３(ダウケミカル社(米国)製]｝などが挙げられる。

【００２４】担体に抗体を保持させるには、公知の常套
手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻(１９
７１年)、第６９６頁に記載されているブロムシアン
法、グルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、
より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させても
よい。標識剤を結合させた抗体における標識剤として
は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが
挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素として
は、安定で非活性の大きなものが好ましく、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることができ
るが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼ
としては、種々の起源のものを用いることができるが、
その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップル、イ
チジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどから得られ
るペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽
出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(horse
radish peroxidase)(ＨＲＰ)が好ましい。ペルオキシダ
ーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子としてのFab
´のチオール基を利用するために、あらかじめペルオキ
シダーゼにマレイミド基を導入したものを用いると好都
合である。マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する
方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマ
レイミド基を導入することができる。そのためには、Ｎ
−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレート誘導
体を用いることができ、好ましくは、Ｎ−(γ−マレイ
ミドブチルオキシ)サクシイミド(ＧＭＢＳと略称するこ
ともある)などが良い。従って、マレイミド基とペルオ
キシダーゼとの間に一定の基が入っていることとなって
もよい。 ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させるに
は、両者を、pＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ない
し５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させるこ
とによって行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐ
Ｈ７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用い
られる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５
[ファルマシア・ファインケミカル社(スエーデン)製]、
バイオゲルＰ−２[バイオラッド・ラボラトリーズ社(米
国)製]などが挙げられる。

【００２５】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ６.０の
５mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１
Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得ら
れたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。該ゲル
クロマトグラフィーを行う際に用いられる担体として
は、例えば、セファデックスＧ−２５[ファルマシア・
ファインケミカル社(スエーデン)製]、バイオゲルＰ−
２[バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製]などが挙
げられる。

【００２６】さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を
導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良
い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させ
るには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行なうことが
でき、また、自体公知のグルタルアルデヒド法,過ヨウ
素酸法,水溶性カルボジイミド法などが用いられる。本
発明の測定系における被検試料としては、尿、血清、血
獎、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液
またはその培養上清が挙げられる。 本発明の測定方法
の例として、標識剤がペルオキシダーゼの場合について
以下に具体的に説明するが、ペルオキシダーゼに限定さ
れるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきＮＧＦ
蛋白質含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った
後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＮＧ
Ｆ蛋白質抗体との結合物を加えて反応させる。

【００２７】この本測定系における被検試料としては、
尿、血清、血獎、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や
菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のＮＧＦ蛋白質の標準溶
液に対してあらかじめ行い、ＮＧＦ蛋白質と吸光度もし
くは蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。 ：未知量のＮＧＦ蛋白質を含む分析対象物(被検試料)
について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線に
あてはめ、分析対象物中のＮＧＦ蛋白質の量を測定す
る。

【００２８】ＮＧＦ蛋白質に対するモノクローナル抗体
とキャリア用蛋白との複合体を免疫原として得られた抗
体を用いてＮＧＦ蛋白質を精製することができる。これ
には、該抗体を用いてアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーを行なうことにより行なうことができる。該ア
フィニティーカラムクロマトグラフィーは、たとえば、
該抗体を適切な担体にカップリングさせ、これをカラム
に充填し、ＮＧＦ蛋白質を含む溶液をカラムに通し吸着
させ、次いで溶出させることにより行なうことができ
る。

【００２９】該担体としては、たとえば、先に記載され
た担体と同様のものが挙げられる。とりわけゲル粒子や
各種合成樹脂が好都合に用いられる。たとえばＣＮＢr
−activated Sepharose ４Ｂ(ファルマシア・ファイン
ケミカル社製),アフィゲル−１０,アフィゲル１５(バイ
オラッド・ラボラトリーズ社製)などが挙げられる。

【００３０】抗体を担体にカップリングさせるには、公
知の常套手段を応用し得るが、たとえば“代謝”,第８
巻(１９７１年),第６９６頁に記載されているブロムシ
アン法,グルタールアルデヒド法が挙げられる。また、
水溶性カルボジイミドを用いる方法、活性エステル法な
ども用いることができるが、より簡単な方法として物理
的に担体表面に吸着させてもよい。

【００３１】このようにして得られた抗体カラムを用い
て精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充てんし
た抗体カラムに中性付近の緩衝液中のＮＧＦ蛋白質を吸
着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特
異的に吸着されたＮＧＦ蛋白質を溶出させる。特異的に
吸着されたＮＧＦ蛋白質を溶出するには、たとえば、低
pＨもしくは高pＨの緩衝液,高濃度の塩を含有する緩衝
液を用いて行なわれる。

【００３２】該低pＨの緩衝液としては、たとえばpＨ
２.３の０.１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液，pＨ１.８の
０.１Ｍ第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液などが挙
げられる。該高pＨの緩衝液としては、たとえばpＨ１１
のアンモニア水,pＨ１１.７の０.２Ｍホウ酸ナトリウム
緩衝液などが挙げられる。該高濃度の塩を含有する緩衝
液としては、たとえば６Ｍグアニジン塩酸溶液,７Ｍ尿
素溶液などが挙げられる。上記の溶出は、バッチ法でも
よく、またカラムを用いる方法でもよい。抗原の溶出液
はたとえば透析して精製する。たとえば低pＨの緩衝液
で溶出した時は、たとえば０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（pＨ１０.５）,高 pＨの緩衝液で溶出した時は、た
とえば０.１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（pＨ３.０）で中
性化したのち、たとえば０.１％ＮaＮ₃を含む０.０２Ｍ
リン酸食塩緩衝液（pＨ８.０）に対して透析する。また
高濃度の塩を含有する緩衝液で溶出した抗原液は直接に
上記のリン酸食塩緩衝液に透析して保存することもでき
る。また、上記溶出液または透析液を凍結乾燥して得ら
れた凍結乾燥標品として保存することもできる。このよ
うにして精製されたＮＧＦ蛋白質は、極めて高単位のも
のであり、たとえば、神経細胞成長作用を有するので、
各種神経障害の治療に有効に利用できる。以上のように
して得られるヒトＮＧＦ蛋白質は、脳、神経系の研究に
用いる試薬として有用であり、また老人性痴ほうの治療
薬としても期待される。

【００３３】ヒトＮＧＦ蛋白質をこれらの研究のために
用いるには、たとえばヒトＮＧＦ蛋白質を動物細胞培養
用培地１ｍｌあたり約０.１〜１,０００ng／ｍｌ、さら
に好ましくは約１〜１００ngとなる量を加えることが好
ましい。本発明明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、 ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇ，Ｇly :グリシン Ａ，Ａla :アラニン Ｖ，Ｖal :バリン Ｌ，Ｌeu :ロイシン Ｉ，Ｉle :イソロイシン Ｓ，Ｓer :セリン Ｔ，Ｔhr :スレオニン Ｃ，Ｃys :システイン Ｍ，Ｍet :メチオニン Ｅ，Ｇlu :グルタミン酸 Ｄ，Ａsp :アスパラギン酸 Ｋ，Ｌys :リジン Ｒ，Ａrg :アルギニン Ｈ，Ｈis :ヒスチジン Ｆ，Ｐhe :フェニールアラニン Ｙ，Ｔyr :チロシン Ｗ，Ｔrp :トリプトファン Ｐ，Ｐro :プロリン Ｎ，Ａsn :アスパラギン Ｑ，Ｇln :グルタミン Ｃlz :２−クロロベンジルオキシカルボニル ＢrZ :２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂzl :ベンジル Ｂoc :t−ブトキシカルボニル 後述の参考例６で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｄ３１−
１０は平成１年１１月１５日から財団法人発酵研究所
(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０２１７として寄託され
ている。また該微生物は平成１年１２月７日に通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７４として寄託されている。後述
の実施例１で得られた次のハイブリドーマは、平成２年
４月５日からＩＦＯに次のＩＦＯ番号で示す受託番号と
して寄託されており、また平成２年８月２４日からＦＲ
Ｉに次の FERM BP番号で示す受託番号として寄託されて
いる。 NGFA−133 IFO 50239 FERM BP−3078 NGFB−260 IFO 50240 FERM BP−３０７９

【００３４】

【実施例】以下に、参考例、実施例を挙げて、本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
ることはない。 参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（１） ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０⁴クローンずつ撒いた。プラーグをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド−Ｎ)上に移した後、０.
５Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣｌ溶液に６分間浸し、フ
ァージＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍ Ｔris−ＨＣｌ
(pＨ８.０)−１.５Ｍ ＮaＣｌ溶液に６分間浸した。本
メンブランを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２
時間処理することによりＤＮＡをメンブランに固定し
た。一方、既知〔ウルリッチ(Ullrich, A.)ら、ネイチ
ャー(Nature)３０３,８２１(１９８３)〕のヒトＮＧＦ
遺伝子を参考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ
(０.３８kb)を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキ
ット(ニッポンジーン社)を用いて³²Ｐで標識したものを
プローブとした。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識
プローブを含む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ
ＮaＣｌ,０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム),５×Den- ha
rdt´s,０.５％ＳＤＳ,２０μg／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ溶液中１０ｍｌ中で６５℃、１６時間、保温した。反
応後、フィルターを２×ＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ溶液中で
室温で５分ずつ３回、１×ＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ溶液中
で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾
燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反
応するクローンを検索した。この方法により得られたク
ローンλβＬＮ２１１３よりデイヴィス(Davis)らの方
法(Davis ら、〔アドバンスト・バクテリアル・ジェネ
ティクス(Advanced Bacterial Genetics)〕，Cold Spri
ng Harbor Laboratory １９８０)によりファージＤＮＡ
を抽出した。

【００３５】次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで
切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り
出し、プラスミドpＢluescriptIIＫ(トーヨーボーより
購入)のＳmaＩ,ＡpaＩ部位を挿入し、プラスミドpＮＧ
ＦＰ１０７Ｇを得た。挿入された部分の塩基配列をシー
クナーゼ(トーヨーボー)を用いて決定した（配列表：配
列番号１）（〔図１〕および〔図２〕の連続したも
の）。決定された塩基配列はネイチャー(Nature),３０
３,８２１(１９８３)に記載されている配列と、蛋白コ
ード領域では完全に一致した。上記のファージλβＬＮ
２１１３ＤＮＡを制限酵素ＢgｌIIで切断し、ヒトＮＧ
Ｆを含むＤＮＡ断片(１.８kb)を単離した。 一方、動
物細胞用の発現ベクターpＫＳＶ−１０（ファルマシ
ア）を制限酵素ＢgｌIIで切断し、上記のヒトＮＧＦを
遺伝子を含むＤＮＡ断片(１.８kb)とＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒア コリ
（Escherichia coli）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピ
シリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒア コリ(E
scherichia coli)ＤＨ１／pＭＮＧＦ１０１から単離し
たプラスミドをpＭＮＧＦ１０１と命名した〔図３〕。

【００３６】参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築
(2) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦ１０７Ｇを制限
酵素ＢcｌＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子
を含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb
ＢcｌＩ−ＡpaＩ断片と化学合成アダプターＳＮ１（配
列表：配列番号２）,ＳＮ２（配列表：配列番号３）お
よびＳＮ３（配列表：配列番号４）(第４図参照)とを混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、ＢgｌIIで
切断することによって０.８kbＨindIII−ＢgｌII ＤＮ
Ａ断片が得られた。プラスミドpＳＶ２−gpt〔サイエン
ス(Science),２０９,１４２２(１９８０)〕を制限酵素
ＥcoＲＩとＨindIIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを
含む２.６kb ＥcoＲＩ−ＨindIII ＤＮＡ断片を単離し
た。次にプラスミドpＭＴＶdhfr〔ネイチャー (Natur
e),２９４,２２８(１９８１)〕よりpolyＡ付加領域を含
む１.６kb ＢgｌII−ＥcoＲＩ断片を単離した。上記の
ＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb ＥcoＲＩ−ＨindI
II ＤＮＡ断片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb Ｈind
III−ＢgｌII ＤＮＡ断片およびpolyＡ付加領域を含む
１.６kb ＢgｌII−ＥcoＲＩ断片をＴ４リガーゼで連結
した。この 反応液を用いてエシェリヒア コリ（Esche
richia coli）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン
耐性の形質転換体〔エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)ＤＨ１／pＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミ
ドをpＭＮＧＦ２０１と命名した〔図４〕。

【００３７】参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築
(3) 参考例２で得られたプラスミドpＭＮＧＦ２０１をＨind
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫlenowフラグメント
反応により平滑化したのち、ＢgｌIIで切断して約０.８
kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ３９９
（特開昭６１− ６３２８２に記載）をＥcoＲＩで切断
後、Ｋlenowフラグメント反応により平滑化したのち、
ＢgｌIIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。これ
ら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環
状化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。次に、ハム
スターＤＨＦＲ cＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４
８（特開昭６１−６３２８２に記載）をＣlaＩで切断後
アルカリ性フォスファターゼで処理し、ＣlaＩで切断し
たpＴＢ１０５４より分離精製された２.４kb ＤＮＡ断
片（ＭnＬＶＬＴＲ、ヒトＮＧＦ（hＮＧＦ）遺伝子、お
よびＳＶ４０ＤＮＡ由来スプライス領域、ポリ〔Ａ〕付
加領域を含む)と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応に
よりヒトＮＧＦ発現ベクターpＴＢ１０５８を構築した
〔図５〕。

【００３８】参考例４ ＣＨＯ細胞の形質転換 ファルコンシャーレ(直径６cm)に５％牛胎児血清を含む
ハム１２培地を入れ、ハムスターＤＨＦＲ^-ＣＨＯ細胞
を３７℃で一晩培養した。培養後、この細胞(７×１０⁵
個／ディッシュ)を、参考例３で得られたヒトＮＧＦ発
現ベクターpＴＢ１０５８(１０μg)を用いてグラハムら
の方法〔ウィロロジー(Virology)５２:４５６−４６７
(１９７３)〕に従って形質転換した。４時間３７℃で培
養後、新たな培地に代えて培養を続けた。２日後に、５
％透析牛胎児血清および３５μg／ｍｌのプロリンを含
むダルベッコ改変ＭＥＭ培養で液替えを行って、以後こ
の選択培地で培養を続けると約２〜３週間後に、ＤＭＦ
Ｒ⁺ となって増殖した細胞がコロニーを形成した。

【００３９】参考例５ 形質転換体のクローニングおよ
びヒトＮＧＦ遺伝子 の発現 参考例４で得た形質転換細胞のクローニングを、公知の
方法(例えばリミテッド ダイリューション法)に従って
行ない、形質転換体(クローン化されたもの)ＣＨＯ−Ｄ
５,ＣＨＯ−Ｄ４２および ＣＨＯ−Ｍ３６を得た。クロ
ーニング終了後は、各クローン細胞を、５％牛胎児血
清,３５μg／ｍｌプロリン,５０ＩＵ／ｍｌペニシリン,
５０μg／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改
変ＭＥＭ培地にて培養した。分離された各クローンの細
胞はリンブロディッシュにまき、細胞が約８０％コンフ
ルエントになった時、新しい培地と交換して、７２時間
培養後、培養上清中のＮＧＦをＥＩＡ〔ベーリンガー
社；バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.,１
５５,４８２(１９８８)〕で定量した。

【００４０】ヒトＮＧＦ生産量の高いクローンを〔表
１〕に示す。なお、形質転換されていないＣＨＯ細胞の
培養上清にはＮＧＦは検出されなかった。

【表１】 以上の結果から、ヒトＮＧＦ遺伝子を恒久的に発現する
ＣＨＯ細胞は該遺伝子を一時的に発現するＣＯＳ細胞よ
りも多量のヒトＮＧＦを生産することができることが明
らかになった。

【００４１】参考例６ ヒトＮＧＦ高生産ＣＨＯ細胞株 参考例５と同様の方法で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｄ
３１を１０nＭメソトレキセート（ＭＴＸ）を含むダル
ベッコ改変ＭＥＭ(５％牛胎児血清 ３５μg／ｍｌプロ
リンを含む)にて培養した。 このクローンは、 この濃度
のＭＴＸでは正常な増殖を示したので、 ＭＴＸ濃度を１
００nＭに挙げて継代し培養をつづけた。更に、 ＭＴＸ濃
度を１μＭとすると大半の細胞が死滅したが、３〜４日
に液替えを行って培養を続けると１０⁵個の細胞当り数
個の細胞がコロニー状に増殖をはじめた。これらの細胞
が十分増殖したのち、１０μＭ ＭＴＸの培養液にて継
代すると再び大半の細胞が死滅し、数個の細胞が、コロ
ニー状に増殖をはじめた。このようにして得られた細胞
は１０μＭ ＭＴＸ存在下に、安定した正常な増殖を示
し、又ＭＴＸを含まない培養液に戻して増殖させ数代継
代したのち、１０μＭ ＭＴＸ存在下に培養しても正常
に増殖した。 この１０μＭ ＭＴＸに耐性のＣＨＯ−Ｄ
３１−１０細胞(ＩＦＯ ５０２１７,ＦＥＲＭ ＢＰ−
２６７４)を参考例５と同じ条件で培養したところ、４m
g／ｌのヒトＮＧＦが培地中に生産されていることがＥ
ＩＡで分かった。

【００４２】参考例７ ヒトＮＧＦの単離(1) 参考例６で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を５％
ウシ胎児血清,３５μg／ｍｌプロリン,５０ＩＵ／ペニ
シリン,５０μg／ｍｌストレプトマイシン,１０μＭメ
ソトレキセートを含むダルベッコ改変培地で５％炭酸ガ
ス中で、３７℃,７日間大量に培養したところ、培地中
に２.４mg／ｌのヒトＮＧＦが生産されていることがＥ
ＩＡで分かった。培養液を遠心分離し、その培養上清
２.２ｌにＡＰＭＳＦを最終濃度０.１mＭになるように
添加し、０.２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正したのち遠心分
離した。得られた上清を０.１Ｍリン酸緩衝液pＨ６.０
−１mＭ ＥＤＴＡで平衡化させたＳ-Sepharoseカラム
(２.６cm×１４cm)に吸着させ、０.１Ｍリン酸緩衝液p
Ｈ６.０−０.１５Ｍ ＮaＣｌ−１mＭ ＥＤＴＡ−１０％
グリセロールで洗浄したのち、50mＭ Ｔris−ＨＣｌ p
Ｈ７.５−０.７Ｍ Ｎa Ｃｌ−１mＭ ＥＤＴＡ−１０％
グリセロールで溶出した。ヒトＮＧＦを含むフラクショ
ンを集め、ダイアフローセル(タイプＹＭ１０,アミコン
社)で約３０倍に濃縮した。得られた濃縮液を２０ mＭ
Ｔris−ＨＣｌ pＨ７.４−０.５Ｍ ＮaＣｌ−１mＭ Ｅ
ＤＴＡ−１０％グリセロールで平衡化させたSephacryl
Ｓ−１００ＨＲ(２００ｍｌ,１.６ cm×１００cm)でゲ
ルろ過した。ヒトＮＧＦを含むフラクションを集めセン
トリプレップ１０(アミコン社)で約1０倍に濃縮した。
得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦを精
製した。即ち、該濃縮液をＡsahipak ＯＤＰ−５０(１
０.０mmＩＤ×２５０mmＬ)カラムにかけ、０.１％トリ
フルオロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリルの濃度勾
配にかけ、ヒトＮＧＦの精製標品１.２ mg(アミノ酸分
析より)を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動および逆相ＨＰＬＣの結果、得られた組換え型ヒト
ＮＧＦの純度は９４％であった。こうして得られた精製
標品を０.１％ＳＤＳを含む、１６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、銀染色を行ったところ、１３キ
ロダルトン(kＤa)の単一なバンドが認められた。 また、
ウサギ抗マウスＮＧＦ抗体(Collabarative Research)と
アフィニティー精製ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ ＩgＧ(バ
イオラッド社、 米国)を用いたWesternブロッティングに
よって、 上記と同じ位置にバンドが認められた。得られ
た精製ヒトＮＧＦをガラス製加水分解用試験管にとり減
圧下で乾燥後、４％チオグチコール酸を含む５.７Ｎ塩
酸を加えて減圧下に封管したのち、１１０℃,２４時間
加水分解した。加水分解後、塩酸を除去し、残渣を０.
０２Ｎ塩酸に溶解してアミノ酸分析を実施した。その結
果を〔表２〕に示す。

【００４３】

【表２】アミノ酸組成 1)Ａsp＋Ａsnを１３として計算した。 2)ヒトＮＧＦ遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配
列から計算した。 精製ヒトＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列を気相プロテイン
シーケンサー(アプライドバイオシステム社モデル４７
０Ａ)を用いて決定した。その結果を〔表３〕に示す。

【００４４】

【表３】Ｎ末端アミノ酸配列 ───────────────────────────── ＰＴＨ−アミノ酸 ＤＮＡより推定さ サイクル Residue pmole れるアミノ酸配列 ───────────────────────────── １ Ｓer ６０５ Ｓer ２ Ｓer ４９５ Ｓer ３ Ｓer ３８４ Ｓer ４ Ｈis ７８５ Ｈis ５ Ｐro ７０５ Ｐro ６ Ｉle ７６７ Ｉle ７ Ｐhe ８２９ Ｐhe ８ Ｈis ３４１ Ｈis ９ Ａrg ７００ Ａrg １０ Ｇly ４２５ Ｇly １１ Ｇlu ４７８ Ｇlu １２ Ｐhe ５１７ Ｐhe １３ Ｓer ９７ Ｓer １４ Ｖal ４６７ Ｖal １５ − Ｃys １６ Ａsp ２９７ Ａsp １７ Ｓer ５８ Ｓer １８ Ｖal ３９２ Ｖal １９ Ｓer ７３ Ｓer ２０ Ｖal ４７６ Ｖal ２１ Ｔrp ９５ Ｔrp ２２ − Ｖal ２３ Ｇly １６６ Ｇly ２４ Ａsp １７９ Ａsp ２５ Ｌys ２４５ Ｌys ２６ Ｔhr ７４ Ｔhr ２７ Ｔhr １０２ Ｔhr ２８ Ａla １７９ Ａla ─────────────────────────────

【００４５】精製ヒトＮＧＦ２.９nmoleを分析に用い
た。 ヒドラジン分解〔Natita ら、ジャーナル オブ バイ
オケミストリー(J. Biochem.),５９,１７０(１９６
６)〕で調べた精製ヒトＮＧＦのＣ末端アミノ酸はアラ
ニンであった。ＰＡＧ等電点電気泳動法(新版電気泳動
実験法、電気泳動学会編、分光堂、１９８９年)で調べ
た結果、得られたヒトＮＧＦの等電点はpＨ９−１０で
あり、マウスＮＧＦ(Collaborative Rese-arch Incorpo
rated)のそれとほぼ同じであった。ブレイン リサーチ
（Brain Research），１３３，３５０（１９７７），Ex
perimental Cell Research，１４５，１７９（１９８
３）および Journal of Neu-roscience Research,１７,
２５(１９８７)に記載されている方法に従い、ＰＣ１２
細胞の神経突起の伸長(neurite outgrowth)を指標にし
て、精製ヒトＮＧＦの活性を測定したところ、精製ヒト
ＮＧＦはマウス２.５Ｓ ＮＧＦの標準品(和光純薬)と同
程度の活性を示した。

【００４６】参考例８ 分子内ジスルフィド結合の解析 参考例７で得られた精製ヒトＮＧＦを用いて、その分子
内ジスルフィド結合の位置を決定した。凍結乾燥した精
製ヒトＮＧＦ(５３０μg)に０.２ｍｌの０.９％ＮaＣｌ
溶液と０.８ｍｌの０.０１ＭＨＣｌとを加えて溶解し
た。この溶液のpＨは２.２であった。これに重量比で１
／５０になるように、１mg／ｍｌのペプシン(Sigma社)
溶液を１０.６μｌ加えて、３７℃で２２時間反応させ
た。反応後９５０μｌを採取し、５０μｌの２５０mＭ
リン酸緩衝液(pＨ６.０)を加えて反応を停止したものを
ペプシン消化物とした。ペプシン消化物をＨＰＬＣに付
し、ペプチドマッピングを行った。ＴＳＫ−ゲルＯＤＳ
−１２０Ｔカラム(東ソー社、０.４６×２５cm)を用い
て、０.０５％ＴＦＡ(Ａ)および９９.９５％アセトニト
リル０.０５％ＴＦＡ(Ｂ)の混合物を以下の溶出プログ
ラムに従って流した。流速は１ｍｌ／min,検出波長は２
２０nmおよび２８０nm。 一方、ペプシン消化物５０μｌに１００mＭ ＤＴＴ溶
液を１０μｌ加え、室温で３時間放置してジスルフィド
結合を還元したサンプルを同じようにＨＰＬＣに付し、
ペプチドマッピングを行った。これら２つのペプチドマ
ッピングを比較することにより、ジスルフィド結合を有
するペプチドを固定した後、このペプチドを単離し、気
相プロテインシークエンサー末端(ＡＢＩ社)アミノ酸配
列を分析した。その結果、本ペプチドは次に示す３つの
ペプチドを含み、かつ３個のジスルフィド結合を持つ大
きなペプチドであることがわかった。

【００４７】 13 15 20 Ｓ−Ｖ−Ｃ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｖ （配列表：配列番号５）

【００４８】 54 58 60 65 70 Ｆ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｒ−Ｇ 73 −Ｉ−Ｄ−Ｓ− （配列表：配列番号６） 102 105 110 115 Ｉ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−Ｌ−Ｓ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｖ−Ｒ 120 −Ｒ−Ａ （配列表：配列番号７）

【００４８】次に、このペプチド（２０６０pmol）を減
圧下に濃縮乾固した後０.３ｍｌの５０mＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ６．０）に溶解した。 この溶液に０.４８μg
(１４pmol）のサーモライシン(和光純薬工業(株))を加
えて、３７℃で２０時間反応させた後、上記と同一の条
件下で、ＨＰＬＣに付し、ペプチドマッピングを行っ
た。ただし、以下の溶出プログラムを使用した。

【００４９】さらに、ジスルフィド結合の位置を決定す
るために、上記ペプチドをＤＴＴで還元処理したサンプ
ルを同じようにＨＰＬＣに付し、ペプチドマッピングを
行った。ペプチドマッピングの比較から、ジスルフィド
結合を含む３個のフラグメント(フラグメント−１、フ
ラグメント−２、フラグメント−３)を固定し、それぞ
れ取得した。フラグメント−１、フラグメント−２、お
よびフラグメント−３のアミノ末端アミノ酸配列を分析
した。その結果を〔表４〕に示す。一方、これらのフラ
グメントを過ギ酸で酸化し、システイン残基をシステイ
ン酸に変換した後、アミノ酸分析を行った結果、いずれ
のフラグメントにも２残基ずつのシステイン酸が検出さ
れた。

【００５０】

【表４】 これらの結果から、精製ヒトＮＧＦのジスルフィド結合
の位置は、Ｃys¹⁵−Ｃys⁸⁰, Ｃys⁵⁸−Ｃys¹⁰⁸およびＣy
s⁶⁸−Ｃys¹¹⁰であると結論された。 参考例９ ヒトＮＧＦ Ｎ末（１− １５）ペプチドＨ−
Ｓer Ｓer Ｓer ＨisＰro Ｉle Ｐhe Ｈis Ａrg Ｇly Ｇ
lu Ｐhe Ｓer Ｖal Ｃys ＯＨ（配列表：配列番号８）
の合成 ヒトＮＧＦのＮ末ペプチドの合成は自動ペプチド合成機
４３０Ａ(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いた
固相合成法にて行なった。プログラムは「スタ ンダー
ド」を用いた。基本的な合成過程等は、メリーフィール
ド アールビー(Merri field, R. B.)(１９６９)アドバ
ンス オブ エンザイモロジー(Adv. Enzymol.)３２,２
２１−２９６の方法に準じている。レジンにはＢoc−Ｃ
ys(ＭeＢzl)・ＰＡＭ−Ｐ(０.５m mol／g)を用い、カル
ボキシル末端から順次合成した。Ｂoc−アミノ酸として
Ｂoc−Ｖal,Ｂoc−Ｓer(Ｂzl),Ｂoc−Ｐhe,Ｂoc−Ｇlu
(ＯＢzl),Ｂoc−Ｇly, Ｂoc−Ａrg(Ｔos),Ｂoc−Ｈis
(Ｔos),Ｂoc−Ｉle,Ｂoc−Ｐroを用いた。アミノ末端Ｓ
erまで合成したのち、ペプチドレジンを合成機から取り
出し、乾燥した。ペプチドレジン１gに１.５ｍｌのp−
クレゾールおよび０.５ｍｌの１,２−エタンジオチール
を加え、さらに約８ｍｌの液体フッ化水素を加えて、０
℃で２時間反応させた。反応終了後、デシケーター中で
フッ化水素を減圧除去し、０.１％の２−メルカプトエ
タノールを含むジエチルエーテルで、続いてジエチルエ
ーテルで洗い、大部分の混在試薬を除去した。ペプチド
を１０ｍｌの３％酢酸で抽出し、ろ過により抽出液中に
混入しているレジンを除いた。 ろ液をセファデックス
（Sephadex）Ｇ−２５を用いるゲルろ過により精製し
た。ゲルろ過条件は、カラムサイズ２．８×６０cm；検
出波長２３０nm；溶媒３％酢酸；流速４０ｍｌ／hrであ
った。

【００５１】ペプチドを含むフラクションを集めて凍結
乾燥し、得られた粉末標品について逆相高速液体クロマ
トグラフィーによりさらに精製した。カラムＹＭＣパッ
ク、Ａ−３２４ ＯＤＳ １０×２５０nm；カラム温度２
５℃；溶出溶媒Ａ ０.１％−トリフルオロ酢酸水−９
９.９％蒸留水；溶出溶媒Ｂ ０.１％−トリフルオロ酢
酸水−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム ０分
(９０％Ａ＋１０％Ｂ),３０分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)；
溶出速度１.６ｍｌ／分,検出波長２３０nm。本条件下で
保持時間２９.１４分に溶出された主ピーク画分を集め
て、バイオラッドＡＧ １×８(ＡcＯＨ型、１.８×５c
m)のカラムに通し、洗液も集め、アセトニトリルを留去
した後、凍結乾燥した。白色粉数７６mgを得た。薄層ク
ロマトグラフィー：Ｒf＝０.７１(アビセルゲルプレー
ト；展開溶媒；n−ブタノール：ＡcＯＨ：ピリジン：水
＝３０：２０：６：４)。 エルマン ジー エル(Elman,
G.L.)(１９５９)アーキテクチュアル バイオケミスト
リー アンド バイオフィジクス(Arch. Biochem. Biop
hys.)８２,７０−７７法による遊離のＳＨ基の定量：９
８％。 アミノ酸分析値 Ｓer 3.99(4); Ｇlu 1.00(1); Ｐro
0.98(1); Ｇly 1.19(1);1/2Ｃys 0.84(1H); Ｖal 1.03
(1); Ile 1.01(1); Ｐhe 2.12(2H); Ｈis 1.84(2); Ａr
g 0.94(1)。 回収率 ７１.１％。１／２Ｃysは過ギ酸酸
化法により定量した。カッコ内は理論値を示す。

【００５２】参考例１０ ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドと
ウシ血清アルブミン との複合体の作 製 ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)(１３２mg)を３ｍｌの０.
１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.５)に溶解した。 この溶液に１
１.２mgのＮ−(γ−マレイミドブチルオキシ)サクシン
イミド(ＧＭＢＳ)を含有するジメチルアミド溶液(２０
０μｌ)をスターラーで撹拌しながら滴下し、３０℃で
３０分間反応を行った。反応液を０.１Ｍリン酸緩衝液
（pＨ６.５)−０.１Ｍ ＮaＣｌで溶出液とした Sephade
x Ｇ−２５(１.５×３０cm)で精製し、マレイミド基が
導入されたＢＳＡ(マレイミド化ＢＳＡ)を得た。 上記のマレイミド化ＢＳＡ(２０mg)を０.１Ｍリン酸緩
衝液(pＨ６.５)−０.１Ｍ ＮaＣｌに溶解した。一方、
上記参考例９で得られたヒトＮＧＦＮ末ペプチド(５mg)
を０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ６.０)−５mＭ ＥＤＴＡに
溶解した。両溶液を混合し(全容量５ｍｌ以下)、３０℃
で６０分間反応を行い、ＰＢＳを加えてヒトＮＧＦ Ｎ
末ペプチドとＢＳＡとの複合体を含む溶液１２ｍｌを得
た。本溶液を１.５ｍｌづつ分注し、ウサギの免疫に使
用した。

【００５３】参考例１１ 抗ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド
抗体の作製 上記参考例１０で得られたヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドと
ＢＳＡとの複合体をFreundのcomplete adjuvantとよく
混合し、 その混合物をウサギの皮下に注射した。以後、
２週間おきに上記複合体とFreundのincomplete adjuvan
tとの混合物を同じウサギに注射した。 上記のようにして免疫したウサギから採取して得られた
血液を遠心分離し、抗血清を得た。得られた抗血清の抗
体価をヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド抗原とするＥＬＩＳＡ
で測定した結果、高い抗体価が認められた。上記の抗血
清を硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、抗ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドポ
リクローナル抗体を得た。

【００５４】実施例１ (1) 免 疫：ＢＡＬＢ／c マウス(♀８週令)に対し、生
理食塩水０.１５ｍｌに溶解させた５０μgの抗原ヒトＮ
ＧＦ(参考例７で得られたもの)と同量のフロインド完全
アジュバント(Difco社)を混合して皮下に注射した。 ２
週間後に同量の抗原と０.１５ｍｌのフロインド不完全
アジュバントの混合物を皮下に再投与した。さらにその
２週後、４週後,６週後に同様の追加免疫を行ない、５
次免疫の２週後生理食塩水に溶かした７５μgのヒトＮ
ＧＦを静脈内に接種した。

【００５５】(2) 細胞融合：上記(1)で得られた免疫マ
ウスより、抗原最終投与の３日後脾臓を摘出し、細胞融
合に用いる細胞を得た。この細胞は、イスコフ培地とハ
ムＦ−１２培地を１：１の比率で混合した培地（以下、
ＩＨ培地と略す)に懸濁した。マウスミエローマ細胞Ｐ
３−Ｘ６３−Ａg・８ＵＩは１０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で５％炭酸ガス,９５％空気の条
件で継代培養した。細胞融合は、ケーラーおよびミルス
タインらが確立した方法[ケーラー,Ｇ.およびミルスタ
イン,Ｃ.；ネイチャー(Nature)２５６,４９５(１９７
５)]に準じて行った。 上記ミエローマ細胞２.４×１０⁷
個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ球１.２
×１０⁸個を混合し、遠沈し、０.３ｍｌのＩＨ培地に溶
解した４５％ポリエチレングリコール６０００(以下Ｐ
ＥＧ６０００と称する。)を滴下した。ＰＥＧ６０００の
溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下した。８分
後３７℃に予温した ＩＨ培地を１分間に０.５ｍｌずつ
加え１０ｍｌとした後、室温で６００回転１５分遠心し
上清を除去した。 この細胞沈澱物を２０％仔牛血清を含
むＩＨ培地２００ｍｌに懸濁し、９６穴ウエルマイクロ
プレート(ヌンク社)に１００μｌずつ ７６８ウエル植
えつけた。 １日後、ＨＡＴ(ヒポキサンチン１×１０
^−４Ｍ,アミノプテリン４×１０^-7Ｍ,チミジン１.６×
１０^-5Ｍ)を含んだＩＨ培地(２０％仔牛血清含有)(以下
ＨＡＴ培地と称する。)を各ウエルに１００μｌずつ添
加し、 さらに３日おきに、培地の１／２量をＨＡＴ培地
と交換した。このようにして生育した細胞は雑種細胞で
ある。

【００５６】(3) 抗体産生細胞の検索：参考例７記載の
方法で精製されたリコンビナントヒトＮＧＦを１０μg
／ｍｌになるように０.０１Ｍ炭酸緩衝液(pＨ８.５)で
希釈し、その１００ μｌを９６穴ウエルイムノプレー
ト(ヌンク社製)の各ウエルに入れ４℃一夜放置し、固層
にヒトＮＧＦを結合させた。０.１５Ｍ ＮaＣｌを含有
する０.０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)で洗浄した後、
余剰の結合部位をふさぐため、１％ウシ血清アルブミン
(ＢＳＡ)を含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液を２００μ
ｌずつウエルに注入して、 使用時まで冷所に保存した。
以上のようにして得られたヒトＮＧＦを結合した９６穴
ウエルイムノプレートに、雑種細胞培養上清を１００μ
ｌずつ加え室温で２時間インキュベートした。培養上清
を除去、洗浄後２次抗体として西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(ＨＲＰ)標識抗マウスＩgＧヤギ抗体(カッペル社)
を加え室温で２時間インキュベートした。２次抗体を除
去し、よくウエルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質
溶液(０.０２％ Ｈ₂Ｏ₂と０.１５％ o−フェニレンジア
ミンを含むpＨ５.５のクエン酸ナトリウム緩衝液)を１
００μｌ加え、 ２５℃で１０分反応させ、２Ｎ−硫酸１
００μｌを加えることにより酵素反応を停止した後、マ
イクロプレート用自動比色計(ＭＴＰ−３２,コロナ社
製)を用い、４９２nmにおける吸光度を測定した(ＥＬＩ
ＳＡ法)。この方法により２ウエルに結合抗体の存在が
観察された。

【００５７】(4) 雑種細胞のクローニング：これらのウ
エル中の細胞を、１ウエルあたり０.５個となるよう
に、予め５×１０⁴個／ウエルのマウス胸腺細胞と栄養
細胞としてまいておいた ９６ウエルマイクロプレート
にまき、クローニングを行った。その結果、それぞれの
ウエルから代表的なクローン細胞各１を得、合計２のク
ローン細胞、すなわちＮＧＦＡ−１３３(ＩＦＯ ５０
２３９,ＦＥＲＭ ＢＰ−３０７８),ＮＧＦＢ−２６０
(ＩＦＯ ５０２４０,ＦＥＲＭ ＢＰ−３０７９)を得
た。

【００５８】(5) 抗体の製造：上記(4)においてクロー
ニングによって得られた２種のハイブリドーマクローン
をそれぞれあらかじめ０.５ｍｌのミネラルオイルを腹
腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／c マウスの腹腔内に１
匹あたり１×１０⁶個接種することにより腹水化を行な
った。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０日後、腹水
を採取した。得られたそれぞれの腹水約１０ｍｌから、
ステーリンら〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミ
ストリー,２５６,９７５０−９７５４(１９８１)〕の方
法に準じてモノクローナル抗体を精製した。まず腹水か
らフイブリン様物質を除去するため１０,０００回転１
５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水(ＰＢＳ：８.
１mＭ−Ｎa₂ＨＰＯ₄,１.５mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄,２７mＭ Ｋ
Ｃｌ,１３７mＭ ＮaＣｌ,pＨ７.２)で２８０nmの紫外部
吸収(Ａ₂₈₀)が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。
希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の
濃度になるように加え、４℃で撹拌しながら６０分間塩
析を行い、その後遠心(１０,０００回転,１５分 間)を
行なって沈澱物を得た。 沈澱物を５０mＭ ＮaＣｌ含有
２０mＭトリス緩衝 溶液(pＨ７.９)に溶融し、同溶液２
ｌに対して透析を行った。 ２時間後、２ｌの新しい同じ
透析液に換え、 さらに１５時間透析を行った。透析後、
沈澱を除去するため１０,０００回転１５分間遠心を行
い、上清をＡ₂₈₀の値が２０〜３０の濃度になるように
調製した。このサンプルを充分量の５０mＭ−ＮaＣｌ含
有トリス緩衝溶液で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥセル
ロースカラム(ワットマンＤＥ₅₂)にかけ、５０mＭ Ｎa
Ｃｌ含有トリス緩衝溶液でよく洗った後、 ５０mＭ−５
０ ０mＭ ＮaＣｌを含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用
いて１.５ｍｌ／分の流出速度で分画を行って素通り分
画を濃縮し、それぞれの精製モノクローナル抗体ＮＧＦ
Ａ−１３３およびＮＧＦＢ−２６０を得た。抗体の純度
の確認にはラエムリらの方法〔ネイチャー,２２７,６８
０−６８５(１９７０)〕に準じてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を用いた。すなわち、硫安塩析し、
ＤＥＡＥセルロースカラムで素通りした画分を、２−メ
ルカプトエタノールで還元し、アクリルアミド濃度１０
％のゲルを用いて１８０ボルトで２.５時間泳動を行っ
た。その結果、いずれのモノクローナル抗体も分子量５
２Ｋ前後にＨ鎖,２８Ｋ前後にＬ鎖の２つのバンドが認
められた。

【００５９】(6) 抗体のサブクラスの測定：抗体のサブ
クラスは次の方法で測定した。即ち参考例７で得られた
リコンビナントヒトＮＧＦをコートした９６ウエルイム
ノプレートにクローン化されたそれぞれのハイブリドー
マ培養上清を１００μｌ入れ室温で２時間インキュベー
トした。培養上清を除去,洗浄後ウサギ抗マウスＩgＧ
１,ＩgＧ２a,ＩgＧ２b,ＩgＧ３,Ｋ鎖,λ鎖に対する抗体
(カッペル社)をそれぞれ１００μｌ入れ室温で２時間イ
ンキュベートした。それぞれの抗体を除去,洗浄後ＨＲ
Ｐ標識ヤギ抗ウサギＩgＧ抗体(カッペル社)を加え室温
で２時間インキュベートした。標識抗体を除去し、よく
洗浄した後、上記(3)記載の方法で酵素反応を行ない吸
光度を測定した。その結果、モノクローナル抗体ＮＧＦ
Ａ−１３３,ＮＧＦＢ−２６０はともにＩgＧ１・Ｋ型の
サブクラスであることが判明した。

【００６０】実施例２ (1) 抗体の酵素標識：精製ＮＧＦＢ−２６０抗体(１０.
８mg／ｍｌ)１.５ｍｌを０.１Ｍ ＮaＣｌを含む０.１Ｍ
酢酸緩衝液 (pＨ４.２)に対して４℃で４時間透析し、
ペプシン(シグマ社製、米国)(０.５mg)を加え、３７℃
で２０時間消化した。１Ｍ ＴrisでpＨを７にして反応
を止め、Ultrogel AcA ４４(ＩＢＦ社製、フランス)の
カラムで０.１５Ｍ ＮaＣｌを含む０.０２Ｍホウ酸緩衝
液(pＨ８.０)を溶出液として分離し、Ｆ(ab´)₂ を得
た。 これを１.１ｍｌに濃縮後、０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ
６.０)に対して４℃で４時間透析し、０.２Ｍメルカプ
トエチルアミン、５mＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍリン酸緩衝
液(pＨ６.０)０.１ｍｌを加えて、３７℃、９０分間還
元した。反応液をSephadex Ｇ−２５fine(ファルマシア
・ファインケミカル社製、スエーデン)(φ１×６０cm)
で５mＭ ＥＤＴＡ、 ０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ６.０)を
溶出液として分離し、Ｆab´画分を得た。一方、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)(ベーリンガーマンハイ
ム社製、西ドイツ)１０mgを１.４ｍｌの０.１Ｍリン酸
緩衝液(pＨ７.０)に溶かし、Ｎ−(γ−マレイミドブチ
ルオキシ)サクシンイミド(ＧＭＢＳ)２.１mgをＮ,Ｎ−
ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)１００μｌに溶かして加
え、３０℃で６０分間撹拌後、Sephadex Ｇ−２５fine
(φ１.２×６０cm)で０.１Ｍ リン酸緩衝液(pＨ７.０)
を溶出液として分離し、 マレイミド基の導入されたＨＲ
Ｐを得た(マレイミド化ＨＲＰ)。 Ｆab´とマレイミド化
ＨＲＰをモル比で１：１になるように混ぜ、４℃で２０
時間反応した。反応後を、Ultrogel AcA ４４のカラム
で０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)を溶出液として分離
し、酵素標識抗体(ＮＧＦＢ−２６０Ｆab´−ＨＲＰ)を
得た。

【００６１】(2) 抗体結合固相の作製：精製ＮＧＦＡ−
１３３抗体を１０μg／ｍｌになるよう０.０１Ｍ炭酸緩
衝液(pＨ８.５)で希釈し、その１００μｌを９６ウエル
イムノプレートの各ウエルに入れ４℃一夜放置し、固相
に抗体を結合させた。０.１５Ｍ ＮaＣｌを含有する０.
０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)で洗浄した後、１％ＢＳ
Ａを含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液を２００μｌずつ
ウエルに注入して、使用時まで冷所に保存した。

【００６２】(3) サンドイッチＥＩＡ法：種々の濃度に
調製したＮＧＦ溶液１００μｌを、抗体を結合させたウ
エルに入れ４℃で一夜インキュベートした。ＮＧＦ溶液
を除去後、１００倍に希釈した酵素標識抗体（ＮＧＦＢ
−２６０Ｆab´−ＨＲＰ）をウエル当たり１００μｌ加
え、室温で２時間インキュベートした。標識抗体を除去
後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例１記載と同様の方法
で以下酵素反応を行い４９２nmにおける吸光度を測定し
た。その結果、本測定系でのＮＧＦの検出限界は０.４
ng／ウエルであった〔図６〕。

【００６３】(4) モノクローナル抗体の中和活性：取得
したモノクローナル抗体−ＮＧＦの生物活性を中和する
かどうかはラット副腎髄質褐色細胞種由来ＰＣ−１２細
胞および鶏胚脊髄後根神経節を用いて検討した。 (a)ＰＣ−１２細胞を用いた検討：ヒトＮＧＦ １０ng／
ｍｌでprimingした１０⁴個のＰＣ−１２細胞を２４ウエ
ルのマイクロプレートに播種し、２ng／ｍｌのヒトＮＧ
Ｆの存在下に種々の濃度の実施例１記載のハイブリドー
マクローン細胞の培養上清を加え、ＰＣ−１２細胞の突
起形成に及ぼす影響を検討した。その結果ＮＧＦＡ−１
３３抗体を添加した場合突起形成が完全に抑制され〔表
５〕、本抗体はＮＧＦの生物活性を中和することが判明
した。

【表５】

【００６４】(b)神経節を用いた検討：Davies らの方法
［ ジャーナル オブ ニューロサイエンス（J. Neuros
ci.）6. 1897（1986）］に準じて受精８日目の鶏胚脊髄
神経節から得られた神経細胞を４８ウエルのマイクロプ
レートに４×１０³個／ウエルの割合で播種した。２ｎ
ｇ／ｍｌのヒトＮＧＦと種々の濃度（０.３，１，３，
１０，３０，１００ｎｇ／ｍｌ）の精製モノクローナル
抗体との混合物をウエルに添加し、neurite-outgrowth
に及ぼす影響を検討した。その結果、ＮＧＦＡ−１３３
抗体は３ｎｇ／ｍｌ以上で抑制現象を発揮し、３０ｎｇ
／ｍｌの添加で完全に抑制し、強い中和活性を有するこ
とが判明した。 (5) モノクローナル抗体の抗原組織部位：抗体がヒトＮ
ＧＦのＮ末端部を認識するのかどうかについて、次の方
法で検討した。参考例９で得られたヒトＮＧＦのＮ末ペ
プチドを１０μg／ｍｌになるように０.０１Ｍ炭酸緩衝
液(pＨ８.５)で希釈し、その１００μｌを９６ウエルイ
ムノプレートの各ウエルに入れ４℃一夜放置して固相に
ペプチドを結合させた。０.１５Ｍ ＮaＣｌを含有する
０.０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)で洗浄した後、余剰
の結合部位をふさぐため、１％ＢＳＡを含有する０.０
１Ｍリン酸緩衝液を ２００μｌずつウエルに注入して、
使用時まで冷所に保存した。 以上のように調製したプ
レートに、実施例１で得られた２種のクローン細胞の培
養上清を１００μｌずつ分注し、 実施例１−(3)記載と
同様の方法でＥＩＡを行ったが、モノクローナル抗体Ｎ
ＧＦＡ−１３３およびＮＧＦＢ−２６０の何れも、ペプ
チドに結合性を示さなかった。さらに、実施例１−(3)
記載と同様の方法でＮＧＦをコートした９６ウエルマイ
クロプレートに、上記抗体と種々の濃度(０.４〜５０μ
g／ｍｌ)に調製したＮ末ペプチドを加え、抗体のＮＧＦ
への結合がペプチドにより阻害されるかどうかを検討し
たが、いずれのペプチドの濃度でも阻害効果が認められ
なかった。以上の結果から、得られた２種のモノクロー
ナル抗体ＮＧＦＡ−１３３およびＮＧＦＢ−２６０は、
ヒトＮＧＦ Ｎ末端部１−１５アミノ酸以外に存在下す
る抗原決定基を認識するものと考えられた。

【００６５】(6) 抗ＮＧＦ Ｎ末ペプチド抗体とモノク
ローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ法：参考例１
１記載のヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドに対する精製ウサギ
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体ＮＧＦＡ−１
３３あるいはＮＧＦＢ−２６０によってヒトＮＧＦが定
量できるかどうかを以下の方法によって検討した。精製
ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド抗体を上記(2)記載と同様の方
法で１μg／ウエルの濃度になるよう結合させた９６ウ
エルイムノプレートの各ウエルに、種々の濃度に調製し
たＮＧＦ溶液を１００μｌ入れ、 室温で２時間インキュ
ベートした。ＮＧＦ溶液を除去後、１μg／ｍｌの濃度
に調製したモノクローナル抗体ＮＧＦＡ−１３３または
ＮＧＦＢ−２６０含有溶液を１００μｌ入れ、 室温で２
時間インキュベートした。抗体溶液を除去・洗浄後、１
００００倍に希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩgＧ
抗体(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー社)を
１００μｌ入れ室温で２時間反応させた後、よく洗浄を
行い上記(3)記載と同様の方法で酵素反応を行い４９２n
mにおける吸光度を測定した。 その結果、 本ＥＩＡ法で
のＮＧＦの検出限界は１５pg／ウエルと非常に低濃度で
の検出が可能であった〔図７〕。

【００６６】実施例３ (1) 抗体の酵素標識：精製ＮＧＦＡ−１３３抗体（７ｍ
ｇ／ｍｌ）１．５ｍｌ、および参考例１１記載の精製ウ
サギ抗ヒトＮＧＦ Ｎ末端ペプチド抗体（２．５ｍｇ／
ｍｌ）１．５ｍｌを、それぞれ実施例２(1)記載と同様
の方法でＦａｂ´画分を得た後、マレイミド化ＨＲＰと
反応させ、酵素標識抗体ＮＧＦＡ−１３３Ｆａｂ´−Ｈ
ＲＰ、抗ヒトＮＧＦ（１−１５）Ｆａｂ´−ＨＲＰを取
得した。 (2) サンドイッチＥＩＡ 種々の濃度に調整したＮＧＦ溶液１００μｌを、実施例
２(2)記載のＮＧＦＡ−１３３抗体を結合させたウエル
に入れ４℃で一夜インキュベートした。ＮＧＦ溶液を除
去後１００倍に希釈したＮＧＦＡ−１３３−ＨＲＰまた
は抗ヒトＮＧＦ（１−１５）Ｆａｂ´−ＨＲＰをウエル
当たり１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートし
た。標識抗体を除去後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例
１記載と同様の方法で以下酵素反応を行い４９２ｎｍに
おける吸光度を測定した。その結果酵素標識体としてＮ
ＧＦＡ−１３３Ｆａｂ´−ＨＲＰを用いた場合、ＮＧＦ
の検出限界は０．９４ｐｇ／ウエル（図８）、抗ヒトＮ
ＧＦ（１−１５）Ｆａｂ´−ＨＲＰを用いた場合、その
検出限界は８．４ｐｇ／ウエルとなった。以上の結果よ
り、固相結合抗体としてＮＧＦＡ−１３３、酵素標識抗
体としてＮＧＦＡ−１３３抗体を用いるサンドイッチＥ
ＩＡシステムが最も高感度にＮＧＦを検出することが判
明した。また本ＥＩＡシステムがヒトＮＧＦと高い相同
性を示すヒト神経成長因子２（ポリペプチド（Ｉ））
〔ヒトＮＧＦ−２、改正ら：ヨーロッパ特許出願公開第
３８６,７５２号公報，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２
６６，１８９−１９１（１９９０）〕と反応性を示すか
どうかを検討したところ、ｈＮＧＦ−２が１μｇ／ｍｌ
の高濃度であっても全く反応性をしめさず〔図８〕、交
差反応性は、０．０１％以下であることが分かった。な
お、〔図８〕において、−○−のグラフはヒトＮＧＦ検
出感度の結果を、−○−を黒くぬった印のグラフは、ヒ
トＮＧＦ−２との反応性の結果をそれぞれ示す。

【００６７】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＮ
ＧＦ蛋白質と特異的に結合し、また結合能も高いのでヒ
トＮＧＦ測定用試薬などとして、有利に用いることがで
きる。また、本発明のモノクローナル抗体の一部は中和
活性を有しており、ＮＧＦの生体内での活性を知るため
の試薬として用いられる可能性がある。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：組織 配列： CCCGGGTTAC GCCTGTTGTC CCGGTATAAC CATTGCTAGC ACACCCTTTC CCTCTCAGAA 60 GTGCCCCGGT TTGAATGAAA CCTCTTCGTG ATCCCCTTGG GAGGTCAACT CTGAGGGACC 120 CAGAAACTGC CTTTTGACTG CATTTAGTAC TCCATGAAGT CACCCTCATT TCTTTTTCAT 180 TCCAGGTGCA TAGCGTA ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT TCG ATC ACA GCT 230 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala 1 5 10 TTT CTG ATC GGC ATA CAG GCG GAA CCA CAC TCA GAG AGC AAT GTC CCT 278 Phe Leu Ile Gly Ile Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro 15 20 25 GCA GGA CAC ACC ATC CCC CAA GTC CAC TGG ACT AAA CTT CAG CAT TCC 326 Ala Gly His Thr Ile Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser 30 35 40 CTT GAC ACT GCC CTT CGC AGA GCC CGC AGC GCC CCG GCA GCG GCG ATA 374 Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile 45 50 55 GCT GCA CGC GTG GCG GGG CAG ACC CGC AAC ATT ACT GTG GAC CCC AGG 422 Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg 60 65 66 70 CTG TTT AAA AAG CGG CGA CTC CGT TCA CCC CGT GTG CTG TTT AGC ACC 470 Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr 75 80 85 CAG CCT CCC CGT GAA GCT GCA GAC ACT CAG GAT CTG GAC TTC GAG GTC 518 Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val 90 95 100 GGT GGT GCT GCC CCC TTC AAC AGG ACT CAC AGG AGC AAG CGG TCA TCA 566 Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser 105 110 115 TCC CAT CCC ATC TTC CAC AGG GGC GAA TTC TCG GTG TGT GAC AGT GTC 614 Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val 120 125 130 AGC GTG TGG GTT GGG GAT AAG ACC ACC GCC ACA GAC ATC AAG GGC AAG 662 Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys 135 140 145 150 GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAG GTG AAC ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAA 710 Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys 155 160 165 CAG TAG TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC 758 Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser 170 175 180 GGG TGC CGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC TGG AAC TCA TAT TGT ACC ACG 806 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr 185 190 195 ACT CAC ACC TTT GTC AAG GCG CTG ACC ATG GAT GGC AAG CAG GCT GCC 854 Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala 200 205 210 TGG CGG TTT ATC CGG ATA GAT ACG GCC TGT GTG TGT GTG CTC AGC AGG 902 Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg 215 220 225 230 AAG GCT GTG AGA AGA GCC TGACCTGCCG ACACGCTCCC TCCCCCTGCC 950 Lys Ala Val Arg Arg Ala 235 CCTTCTACAC TCTCCTGGGC CC 972

【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： AGCTTGCCGC CACCATGTCC ATGTTGTTCT ACACTCT 37

【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： GATCAGAGTG TAGAACAACA TGGACATGGT GGCGGCA 37

【００７１】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： CAGATCTGGG CC 12

【００７２】配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【００７３】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys 5 10 15 Arg Gly Ile Asp Ser 20

【００７４】配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Arg 5 10 15 Val Arg Arg Ala

【００７５】配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。

【図２】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。

【図３】は、参考例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ１０１の構築図を示す。

【図４】は、参考例２で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ２０１の構築図を示す。

【図５】は、参考例３で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＴＢ１０５８の構築図を示す。

【図６】は、実施例２で得られた、モノクローナル抗体
を用いるサンドイッチＥＩＡによるヒトＮＧＦの検出感
度の結果を示す。

【図７】は、実施例２で得られた、モノクローナル抗体
とウサギ抗ヒトＮＧＦＮ末ペプチドポリクローナル抗体
とを用いるサンドイッチＥＩＡによるヒトＮＧＦの検出
感度の結果を示す。

【図８】は、実施例３で設定した、抗ＮＧＦＡ−１３３
抗体のＦａｂ´を固相および標識抗体として用いるサン
ドイッチＥＩＡによるヒトＮＧＦの検出感度の結果なら
びにヒトＮＧＦ−２との反応性の結果を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成３年１１月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６８】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：組織 配列： CCCGGGTTAC GCCTGTTGTC CCGGTATAAC CATTGCTAGC ACACCCTTTC CCTCTCAGAA 60 GTGCCCCGGT TTGAATGAAA CCTCTTCGTG ATCCCCTTGG GAGGTCAACT CTGAGGGACC 120 CAGAAACTGC CTTTTGACTG CATTTAGTAC TCCATGAAGT CACCCTCATT TCTTTTTCAT 180 TCCAGGTGCA TAGCGTA ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT TCG ATC ACA GCT 230 Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｌａ １
５ １０ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＡＡ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＴＣ ＣＣＴ ２７８ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ １５ ２０
２５ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＡＣ
ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＣＣ ３２６ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ ３０ ３５
４０ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＧＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＣＧＣ
ＡＧＣ ＧＣＣ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＡＴＡ ３７４ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ ４５ ５０
５５ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＣＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ
ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ４２２ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｒｇ ６０ ６５
７０ ７５ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ＣＴＣ ＣＧＴ ＴＣＡ
ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ４７０ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ８０
８５ ９０ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ
ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ５１８ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ ９５ １００
１０５ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＣＴ
ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＧＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ５６６ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １１０ １１ ５
１２０ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＴＣＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＣ ６１４ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ １２５ １３０
１３５ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ
ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ６６２ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ１４０ １４５
１５０ １５５ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＣ
ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ７１０ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ １６０
１６５ １７０ ＣＡＧ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＣＧＧ
ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＡＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＧＣ ７５８ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ １７５ １８０
１８５ ＧＧＧ ＴＧＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＡＣ
ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＧＴ ＡＣＣ ＡＣＧ ８０６ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １９０ １９ ５
２００ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＣＣ
ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＣ ８５４ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ ２０５ ２１０
２１５ ＴＧＧ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＣ
ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ９０２ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ２２０ ２２５
２３０ ２３５ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧ Ａ
ＣＡＣＧＣＴＣＣＣ ＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣ ９５０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ２４０ ＣＣＴＴＣＴＡＣＡＣ ＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣ ＣＣ
９７２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 15/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト神経成長因子(ＮＧＦ)と反応し、ヒ
   トＮＧＦのＮ末端部分を認識しないＮＧＦ蛋白質に対す
   るモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】モノクローナル抗体ＮＧＦＡ−１３３であ
   る請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】モノクローナル抗体ＮＧＦＢ−２６０であ
   る請求項１記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ。
5. 【請求項５】ハイブリドーマＮＧＦＡ−１３３である請
   求項４記載のハイブリドーマ。
6. 【請求項６】ハイブリドーマＮＧＦＢ−２６０である請
   求項４記載のハイブリドーマ。
7. 【請求項７】請求項４記載のハイブリドーマを液体培地
   中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることを特徴とす
   る請求項１記載のモノクローナル抗体の製造法。
8. 【請求項８】請求項１記載のモノクローナル抗体を用い
   て免疫学的測定法を行なうことを特徴とするＮＧＦ蛋白
   質の検出および（または）定量法。
9. 【請求項９】酵素免疫測定法を行なう請求項８記載の検
   出および（または）定量法。